Способ получения отхаркивающего средства

Изобретение относится к медицине. Жидкую вытяжку из травы душицы получают путем экстракции 40% этиловым спиртом при соотношении сырье : экстрагент 1:2,6 при 18-20°С в течение 144 часов в шести диффузорах. Изобретение позволяет реализовать указанное назначение. 2 ил., 4 табл.

 

Изобретение относится к медицине и касается способов получения препаратов из растительного сырья, которое может быть использовано для лечения бронхолегочных заболеваний, сопровождающихся сухим кашлем или кашлем с вязкой мокротой.

Известны отхаркивающие средства, увеличивающие активность моторики ворсинок реснитчатого эпителия трахеи - экстракт чабреца, экстракт алтея и другие [РЛС-Аптекарь /Под ред. Крылова Ю.Ф. - М.: 2001, - 1584 с.; Соколов С.Я. Фитотерапия и фитофармакология. - М.: ООО "Медицинское информационное агентство", 2000. - С.212-213, 303-330; Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2-х т. - М.: Медицина, 1988. - Т.1. - С.358-365].

Наиболее близким по природе происхождения (прототипом) является лекарственное средство - экстракт чабреца жидкий (галеновый препарат из травы чабреца - ФС 42-1399-89, регистрационное удостоверение 67/554/285), обладающий отхаркивающей активностью. Экстракт чабреца увеличивает активность моторики ворсинок реснитчатого эпителия трахеи, разжижает мокроту, оказывает спазмолитическое действие. Экстракт чабреца содержит флавоноиды (лютеолин, апигенин и их производные) [Симонян А.В. Флавоноловые гликозиды некоторых видов рода Thymus // ХПС. - 1972. - №6. - С.801] и эфирное масло. Известен способ получения отхаркивающего средства, экстракта чабреца жидкого, заключающийся в экстракции растительного сырья - травы чабреца 30% спиртом этиловым в соотношении 1:1. В экстрагент добавляют глицерин в количестве 10% от массы сырья. В качестве способа экстрагирования используют реперколяцию в модификации ВНИИФ. Процесс проводят в батарее из трех диффузоров. Измельченное сырье укладывают поровну в 3 перколятора, экстрагент делят на три равные части. Первую порцию сырья экстрагируют чистым экстрагентом (смесь глицерина и 30% этилового спирта), а каждую последующую (вторую, третью) экстрагируют вытяжкой, полученной при экстрагировании предыдущей порции сырья. Готовые порции вытяжки получают из третьего диффузора [Муравьев И.А. Технология лекарств. В 2-х т. - М.: Медицина, 1980. - T.1. - С.205]. Все три порции готовой вытяжки смешивают, отстаивают при температуре не выше 10°С не менее двух суток.

Препараты чабреца при длительном применении и передозировке могут вызывать гиперфункцию щитовидной железы [Палов М. Энциклопедия лекарственных растений. - М.: Мир, 1998. - С.279-281]. В этой связи длительное применение их нежелательно. Рекомендуется чередовать препараты чабреца с другими препаратами.

Вместе с тем перечень препаратов, обладающих отхаркивающим действием, ограничен [Машковский М.Д., 1988; РЛС-Аптекарь. 2001] из-за отсутствия соответствующей базы растений. Следовательно, расширение арсенала препаратов растительного происхождения, характеризующихся отхаркивающимися свойствами, является актуальной задачей.

Целью предлагаемого изобретения является разработка способа получения отхаркивающего средства из травы душицы, характеризующегося отсутствием тиреотоксического действия.

Поставленная задача достигается тем, что для получения целевого продукта исходное сырье - трава душицы (Origanum vulgare L., семейство Lamiaceae) экстрагируется 40% этиловым спиртом при температуре 18-20°С, при соотношении сырье : экстрагент 1:2,6 в течение 144 часов в шести диффузорах.

В литературе отсутствуют данные о возможности применения экстракта душицы в качестве отхаркивающего средства. Предлагаемое отхаркивающее средство можно использовать в медицинской практике для лечения бронхолегочных заболеваний, сопровождающихся судорожным кашлем с вязкой мокротой. Данное свойство явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники. Таким образом, предлагаемое решение соответствует критериям изобретения - "новизна", "изобретательский уровень", "промышленно применимо".

Применение в качестве экстрагента 40% спирта этилового обусловлено наиболее полным извлечением действующих веществ. Температурный режим, соотношение сырье : экстрагент, число диффузоров, время экспозиции являются оптимальными и подобраны экспериментальным путем.

Отхаркивающее средство получают следующим образом: измельченную траву душицы (Origanum vulgare L.) и экстрагент, 40% этиловый спирт делят на шесть равных частей. Первую порцию сырья экстрагируют чистым экстрагентом, а каждую последующую (вторую, третью, четвертую, пятую, шестую) экстрагируют вытяжкой, полученной при экстрагировании предыдущей порции сырья. Соотношение сырье : экстрагент при этом равно 1:2,6 с учетом поглощения сырья. Продолжительность процесса 144 часа. Полученное извлечение (жидкий экстракт) процеживают через 4 слоя марли, отстаивают при температуре не выше 10°С не менее 2-х суток. Выход экстракта по действующим веществам составляет 86%. Содержание флавоноидов в препарате (экстракт душицы 1:2,6), в пересчете на лютеолин, составляет 0,3±0,008%. Содержание флавоноидов в сырье - траве душицы при этом составляет 0,91%.

Пример конкретного выполнения способа.

Пример.

Приготовление экстракта проводили в шести перколяторах. В каждый из шести перколяторов укладывали измельченную траву душицы массой 6,5 кг. Объем экстрагента, вводимого в батарею перколяторов на каждой ступени экстракции, составлял 33,15 л. Объем каждого извлечения, отбираемого из шестого, головного перколятора, был равен 16,9 л.

1 день. В работу вводили перколяторы №1 и №2. В 8 часов утра в перколятор №1 заливали 33,15 л экстрагента - 40% спирта этилового и оставляли настаиваться до 16 часов.

В 16 часов открывали кран перколятора №1 и сливали извлечение - 16,9 л в сборник №1. В перколятор №1 вводят 33,15 л экстрагента 40% спирта этилового и продолжали сливать жидкую фазу до ее полного накопления в сборнике №1 объемом 33,15 л. После чего кран перколятора №1 закрывали, а извлечение из сборника №1 переливали в перколятор №2. Перколяторы №1 и №2 оставляли настаиваться до 8 часов утра следующего дня (около 16 часов).

2 день. В работу вводили перколяторы №3 и №4. В 8 часов утра открывали краны перколяторов №1 и №2 и проводили слив извлечений по 16,9 л. В перколятор №1 вводили 33,15 л экстрагента - 40% спирта этилового и продолжали слив извлечения до полного его накопления в сборник №1 объемом 33,15 л. После чего кран перколятора №1 закрывали. Извлечение из сборника №1 переносили в перколятор №2 и накапливали в сборнике №2 извлечение объемом 33,15 л, после чего закрывали кран перколятора №2. Извлечение из сборника №2 переносили в перколятор №3 и оставляли настаиваться до 16 часов.

В 16 часов открывали краны перколяторов №1-3 и проводили слив извлечений - по 16,9 л. В перколятор №1 вводили 33,15 л экстрагента - 40% спирта этилового и продолжали слив извлечения до его накопления в сборнике №1 объемом 33,15 л. После чего кран перколятора №1 закрывали. Извлечение из сборника №1 переносили в перколятор №2 и накапливали в сборнике №2 извлечение объемом 33,15 л, после чего закрывали кран перколятора №2. Слив извлечения из сборника №2 объемом 33,15 л переносили в перколятор №3 и накапливали в сборнике №3 извлечение объемом 33,15 л, после чего закрывали кран перколятора №3. Слив извлечения из сборника №3 объемом 33,15 л переносили в перколятор №4. Перколяторы №1-4 оставляли настаиваться до 8 часов утра следующего дня.

3 день. В работу вводили перколяторы №5 и №6. В 8 часов утра открывали краны перколяторов №1-4 и проводили слив извлечения. В перколятор №1 вводили 33,15 л экстрагента - 40% спирта этилового и продолжали слив извлечения до полного его накопления в сборник №1 объемом 33,15 л. После чего кран перколятора №1 закрывали. Извлечение из сборника №1 переносили в перколятор №2 и накапливали в сборнике №2 извлечение объемом 33,15 л, после чего закрывали кран перколятора №2. Извлечение из сборника №2 переносили в перколятор №3 и накапливали в сборнике №3 извлечение объемом 33,15 л, после чего закрывали кран перколятора №3. Извлечение из сборника №3 переносили в перколятор №4 и накапливали в сборнике №4 извлечение объемом 33,15 л, после чего закрывали кран перколятора № 4. Извлечение из сборника №4 переносили в перколятор №5. Перколяторы №1-5 оставляли настаиваться до 16 часов.

В 16 часов открывали краны перколяторов №1-5 и проводили слив из I-й порции извлечения. В перколятор №1 вводили 33,15 л экстрагента - 40% спирта этилового и продолжали слив извлечения до полного его накопления в сборник №1 объемом 33,15 л. После чего кран перколятора №1 закрывали. Извлечение из сборника №1 переносили в перколятор №2 и накапливали в сборнике №2 извлечение объемом 33,15 л, после чего закрывали кран перколятора №2. Извлечение из сборника №2 переносили в перколятор №3 и накапливали в сборнике №3 извлечение объемом 33,15 л после чего закрывали кран перколятора №3. Извлечение из сборника №3 переносили в перколятор №4 и накапливали в сборнике №4 извлечение объемом 33,15 л, после чего закрывали кран перколятора №4. Извлечение из сборника №4 переносили в перколятор №5 и накапливали в сборнике №5 извлечение объемом 33,15 л, после чего закрывали кран перколятора №5.

Слив извлечения из сборника №5 объемом 33,15 л переносили в перколятор №6. Перколяторы №1-6 оставляли настаиваться до 8 часов следующего дня.

4 день. Проводили съем 1 и 2 порции экстракта, выводили из работы перколяторы №1 и №2. В 8 часов утра открывали краны перколяторов №1-6 и проводили слив извлечений. Объем каждого извлечения составлял 16,9 л. Извлечение из сборника №6 переносили в отстойник. Перколятор №1 выводили из работы. Истощенное сырье из перколятора №1 разгружали и переносили в колбу для отгонки спирта. Извлечения из сборников №1-5, объемом каждое 16,9 л, переносили на очередную ступень экстракции, в перколяторы №2-6, и оставляли настаиваться до 16 часов.

В 16 часов открывали краны перколяторов №2-6 и проводили слив извлечений. Извлечение из сборника №6 переносили в отстойник. Перколятор №2 выводили из работы. Истощенное сырье из перколятора №2 разгружали и переносили в колбу для отгонки спирта. Извлечения из сборников №2-5, объемом каждое 16,9 л, переносили на очередную ступень экстракции в перколяторы №3-6 и оставляли настаиваться до 8 часов утра следующего дня.

5 день. Производили съем 3 и 4 порции экстракта, выводили из работы перколяторы №3 и №4. В 8 часов утра открывали краны перколяторов №3-6 и проводили слив извлечений. Объем каждого извлечения составлял 16,9 л. Извлечение из сборника №6 переносили в отстойник. Перколятор №3 разгружали и переносили истощенное сырье в колбу для отгонки спирта. Извлечения из сборников №3-5, объемом каждое 16,9 л, переносили на очередную ступень экстракции, перколяторы №4-6, и оставляли настаиваться до 16 часов.

В 16 часов открывали краны перколяторов №4-6 и проводили слив извлечений. Извлечение из сборника №6 переносили в отстойник, слив извлечения из сборника №4 объемом 16,9 л переносили в перколятор №5. Слив извлечения из сборника №5 объемом 16,9 л переносили в перколятор №6. Перколятор №4 разгружали и переносили истощенное сырье в колбу для отгонки спирта.

Перколяторы №5-6 оставляли настаиваться до 8 часов утра следующего дня.

6 день. Производили съем 5 и 6 порции экстракта, выводили из работы перколяторы №5 и №6. В 8 часов утра открывали краны перколяторов №5-6 и проводили слив извлечений. Объем каждого извлечения должен составлять 16,9 л. Извлечение из сборника №6 переносили в отстойник. Перколятор №5 выводили из работы. Истощенное сырье из перколятора №5 разгружали и переносили в колбу для отгонки спирта. Извлечения из сборников №5, объемом 16,9 л, переносили в перколятор №6 и оставляли настаиваться до 16 часов.

В 16 часов открывали кран перколятора №6 и проводили слив извлечения. Извлечение из сборника №6, объемом 16,9 л, переносили в отстойник. Перколятор №6 выводили из работы. Истощенное сырье из перколятора №6 разгружали и переносили в колбу для отгонки спирта. Все шесть извлечений объединяли - 101,4 л, перемешивали и отстаивали при температуре не выше 10°С в течение 2 суток, после чего отфильтровывали и проводили оценку качества.

Для установления отхаркивающих свойств экстракта душицы проведены 2 серии эксперимента. Отхаркивающий эффект экстрактов душицы и чабреца изучали по их влиянию на активность моторики ворсинок реснитчатого эпителия. Эти показатели характеризуют эвакуаторную способность секрета бронхов и являются важным компонентом поиска отхаркивающих средств.

Активность ворсинок эпителия сохраняется в течение нескольких часов после изоляции слизистой, что является основой постановки экспериментов in vitro на начальном этапе отбора активаторов транспортной функции эпителия.

Изучение отхаркивающего действия экстрактов проводили на модели изолированной трахеи крысы. Крыс массой 300-350 г забивали кровопусканием из брюшной аорты. Трахею освобождали от прилежащих тканей, иссекали между гортанью и ее бифуркацией и фиксировали к пластинке (9 см × 3,7 см × 0,3 см). Затем пластинку помещали в пластиковый бокс емкостью 350 мл с 250 мл раствора Тироде (состав раствора Тироде: натрия хлорида 8,0 г; калия хлорида 0,2 г; кальция хлорида 0,2 г; натрия гидрокарбоната 1,0 г; магния хлорида 0,1 г; натрия фосфата однозамещенного 0,05 г; глюкозы 1,0; воды очищенной до 1 л [Большая советская энциклопедия. - М., 1977. - Т.27. - С.355.]) и размещали на 0,1-1 см ниже поверхности раствора. Раствор Тироде сатурировали карбогеном с поддержанием постоянной температуры 37°С. Активность ворсинок ресничек определяли временем передвижения маковых зерен, помещенных на противоположный гортанному участок слизистой трахеи (см. фиг.1 и 2, на расстояние 5 мм. Базовую активность ворсинок определяли в 10 наблюдениях при использовании увеличительной приставки (×20). [Сернов Л.Н., Гацура В.В. Элементы экспериментальной фармакологии. - М., 2000. - С.79].

Исследуемые вещества добавляли в раствор Тироде, в котором находилась трахея. Затем в определенные интервалы времени регистрировали скорость передвижения зерен мака (см. фиг.1 и 2). В предварительных экспериментах на ограниченном количестве животных (по 1 особи) определили наиболее эффективные дозы. Для этого к инкубационной среде раствора Тироде (250 мл) прибавляли 10 мл, 20 мл, 30 мл и 40 мл стандартизованных исследуемых экстрактов душицы и чабреца. Результаты опытов приведены в табл.1.

Как показали результаты эксперимента (табл.1), наибольшую активность в уменьшении времени продвижения макового зерна по ворсинчатому эпителию трахеи крыс проявил экстракт душицы в дозе 20 мл на 250 мл инкубационной смеси и составлял 9 мин. Экстракт чабреца аналогичную активность проявил в дозе 40 мл на 250 мл инкубационной смеси и составлял также 9 мин. Поэтому для изучения действия экстрактов на статистически значимом количестве животных (по 10 в группе) мы выбрали дозы для душицы 20 мл на 250 мл инкубационной смеси и для чабреца дозу 40 мл на 250 мл инкубационной смеси.

Статистическую обработку результатов всех серий опытов проводили с использованием метода вариационной статистики с использованием коэффициента Стьюдента. В обоих изучаемых группах различия по отношению к контролю были статистически достоверны. Результаты исследований представлены в примерах 1, 2. Примеры отхаркивающей активности препарата.

Пример 1.

После нанесения экстракта травы душицы 1:2 на изолированную трахею крысы в дозе 20 мл на 250 мл инкубационной смеси время продвижения макового зерна по ворсинчатому эпителию трахеи крыс составило 11±3 мин по сравнению с контролем (21±4 мин) (таблица 2).

Пример 2.

После нанесения экстракта травы чабреца 1:1 на изолированную трахею крысы в дозе 20 мл на 250 мл инкубационной смеси время продвижения макового зерна по ворсинчатому эпителию трахеи крыс составляло 12±3 мин по сравнению с контролем (21±4 мин) (таблица 2).

Параллельно с изучением отхаркивающего действия экстракта травы душицы нами была изучена острая токсичность экстракта и спирта этилового 40%. Результаты исследования представлены в примерах 3 и 4.

Пример 3.

Опыты проводили на белых беспородных мышах массой 15-20 г. 40% спирт этиловый разводили водой очищенной в четыре раза, а затем вводили мышам в виде водного раствора внутрь через зонд из расчета на 1 кг массы тела животного. Изучались дозы 40% спирта этилового: 30; 35; 40; 45; 50 мг/кг. Наблюдение за животными проводили в течение 14 дней. На каждую дозу брали 6 животных. В I группе животных, получавших исследуемое вещество в дозе 30 мг/кг, за период наблюдения погибших животных не было. Во II группе погибло 2 животных (доза 35 мг/кг). В III группе (доза 40 мг/кг) погибло из 6 животных - 4, в IV группе (доза 45 мг/кг) - из 6 животных - 4. В V группе (доза 50 мг/кг) погибли все животные. Таким образом, исходя из расчетов по Керберу, острая токсичность составляет 39,2 мг/кг. Расчеты представлены в таблице 3.

Пример 4.

Опыты проводили на белых беспородных мышах массой 15-20 г. Экстракт травы душицы на 40% спирте этиловом разводили водой очищенной в четыре раза, а затем вводили мышам в виде водного раствора внутрь через зонд из расчета на 1 кг массы тела животного. Изучались дозы экстракта душицы: 35; 40; 45; 50 мг/кг. Наблюдение за животными проводили в течение 14 дней. На каждую дозу брали 6 животных. В I группе животных, получавших исследуемое вещество в дозе 30 мг/кг, за период наблюдения погибших животных не было. Во II группе погибло 2 животных (доза 35 мг/кг). В III группе (доза 40 мг/кг) погибло 50% животных (из 6 животных - 3), в IV группе (доза 45 мг/кг) - из 6 животных - 5. В V группе (доза 50 мг/кг) погибли все животные. Таким образом, исходя из расчетов по Керберу, острая токсичность составляет 39,2 мг/кг. Расчеты представлены в таблице 4.

Таким образом, токсичность экстракта травы душицы связана с токсичностью экстрагента - 40% спирта этилового. [Лечение острых отравлений / Под ред. М.Л.Тараховского - Киев: Здоровье, 1982. - С.7.; Методы определения токсичности и опасности химических веществ / Под ред. И.В.Саноцкого. - М.: Медицина, 1970. - С.16].

Таблица 1
Влияние экстрактов чабреца и душицы (10 мл, 20 мл, 30 мл и 40 мл) на время продвижения макового зерна по ворсинчатому эпителию трахеи крыс (в мин)
Контроль (раствор Тироде)	Экстракт душицы 1:2,6	Экстракт чабреца 1:1
Время продвижения макового зерна по эпителию, мин	Количество, мл	Время продвижения макового зерна по эпителию, мин	Количество, мл	Время продвижения макового зерна по эпителию, мин
19	10 мл	16	10 мл	18
19	20 мл	9	20 мл	15
19	30 мл	10	30 мл	12
19	40 мл	9	40 мл	9

Таблица 2
Влияние экстрактов душицы (20 мл) и чабреца (40 мл) на время продвижения макового зерна по ворсинчатому эпителию трахеи крыс (в мин)
Вещество	Количество, мл	Доза, мл на 250 мл инкубационной смеси	Время продвижения макового зерна по ворсинчатому эпителию трахеи крыс, мин
Контроль (раствор Тироде)	10	-	21±4
Экстракт душицы	10	20 мл	11±3
			Р*>0,05
Экстракт чабреца	10	40 мл	12±3
			P1**>0,05
Примечание: *Р - достоверность по отношению к контролю;
**Р1 - достоверность по отношению к душице.

Способ получения экстракта жидкого из растительного сырья, обладающего отхаркивающим действием, отличающийся тем, что экстрагируют траву душицы 40%-ным этиловым спиртом при соотношении сырье:экстрагент 1:2,6 в течение 144 ч в шести диффузорах при 18-20°С.