Способ получения антимикробных пептидов с пониженной гемолитической активностью

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, к биохимии, конкретно к биологически активным пептидам латарцинами, обладающим антимикробным действием, которые могут найти применение в биотехнологии и медицине. Способ получения антимикробных пептидов латарцинов с пониженной гемолитической активностью химическим или биотехнологическим синтезом включает предварительное моделирование пространственной структуры исходного пептида латарцина с высокой гемолитической активностью в α-спиральной конформации и замену гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные в процессе синтеза, в ходе которого происходит замена гидрофобных аминокислот Ile⁷ и Phe¹⁰ на гидрофильные Gln⁷ и Lys¹⁰. При этом после моделирования пространственной структуры исходного пептида латарцина в α-спиральной конформации дополнительно проводят расчет гидрофобных свойств пептида с учетом молекулярного гидрофобного потенциала в каждой точке поверхности пептида, выявление гидрофобных кластеров и аминокислотных остатков, локализованных в них, с последующим определением наиболее эффективных гидрофильных аминокислотных остатков для использования в процессе синтеза. Способ позволяет получать пептиды со значительно сниженными гемолитическими свойствами, а также понизить цитотоксичность пептидов латарцинов. 3 табл., 2 ил.

 

Изобретение относится к биохимии, конкретно к биологически активным пептидам, обладающим антимикробным действием, которые могут найти применение в биотехнологии и медицине.

Стремительный рост числа структурно новых антибиотиков, вводимых в клиническую практику, наблюдавшийся в 40-50-х годах прошлого столетия, сменился длительным инновационным кризисом, который продолжается и сегодня [Walsh С. Where will new antibiotics come from? // Nat. Rev. Microbiol. - 2003. - Vol.1. - P.65-70]. Широкое применение антибиотиков в качестве лечебных препаратов вызывает быстрое накопление устойчивых форм микроорганизмов, у которых клинически существенная резистентность возникает за период от нескольких месяцев до нескольких лет. Распространены случаи устойчивости целого ряда патогенов человека (Enterococcus faecalis, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa. Salmonella typhi, Staphylococcus aureus. Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae и многих других) практически к любому из применяемых препаратов [Walsh С. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. // Nature. - 2000. - Vol. 406. - P.775-781].

По-видимому, принципиально новым классом природных антибиотиков, которые будут введены в клиническую практику, являются так называемые антимикробные пептиды [Finlay В.В., Hancock R.E.W. Can innate immunity be enhanced to treat microbial infections? // Nat. Rev. Microbiol. - 2004. - Vol. 2. - P.497-504]. Несмотря на существование более сильных антибиотиков, действующих при меньших концентрациях, антимикробные пептиды обладают рядом преимуществ. Способность быстро убивать клетки-мишени, широкий спектр действия, активность в отношении штаммов, резистентных к другим антибиотикам, а также относительная трудность в селекции устойчивых мутантов in vitro позволяют рассматривать эти вещества в качестве основы для создания эффективных лекарств, особенно на фоне снижения потенциала обычных антибиотиков [Hancock R.E.W., Lehrer R. Cationic peptides: a new source of antibiotics. // Trends Biotechnol. - 1998. - Vol. 16. - P.82-88].

Известно несколько сотен антимикробных пептидов [Brahmachary M. et al. ANTIMIC: a database of antimicrobial sequences. // Nucleic Acids Res. - 2004. - Vol. 32. - P.D586-D589]. Особое место занимают антимикробные пептиды, не содержащие в своем составе остатков цистеина, поскольку такая структурная особенность значительно облегчает их производство химическим или биотехнологическим путем и снижает себестоимость. Много внимания уделяется линейным пептидам, склонным к организации в амфипатическую α-спираль при контакте с мембранами, обсуждаются подходы к оптимизации их свойств с целью повышения терапевтического потенциала [Tossi A., Sandri L., Giangaspero A. Amphipathic, α-helical antimicrobial peptides. // Biopolymers. - 2000. - Vol. 55. - P.4-30].

В числе свойств, которые необходимо контролировать у потенциальных антибиотиков, - цитотоксическое действие на клетки макроорганизма, чаще оцениваемое в стандартных тестах на гемолитическую активность. Наличие подобной активности у целого ряда антимикробных пептидов широкого спектра действия является серьезным недостатком и ограничивает возможность их применения в качестве лекарственных средств. Таким образом, важной задачей является оптимизация свойств пептидов, а именно снижение их гемолитической активности, токсичности в отношении нормальных клеток человека.

Предыдущие попытки направленного изменения активности линейных антимикробных пептидов основывались на: (а) укорочении молекулы исходного пептида [Subbalakshmi С. et al. Biological activities of C-terminal 15-residue synthetic fragment of melittin: design of an analog with improved antibacterial activity. // FEBS Lett. - 1999. - Vol. 448. - P.62-66.], (б) изменении заряда молекулы [Dathe M. et al. Optimization of the antimicrobial activity of magainin peptides by modification of charge. // FEBS Lett. - 2001. - Vol. 501. - P.146-150.], (в) изменении гидрофобности пептида [Ohmori N. et al. Interaction of alpha-helical peptides with phospholipid membrane: effects of chain length and hydrophobicity of peptides. // J. Pept. Res. - 1998. - Vol. 51. - P.103-109.], (г) изменении характера распределения гидрофобных и гидрофильных остатков [Yan H. et al. Individual substitution analogs of Mel(12-26), melittin's C-terminal 15-residue peptide: their antimicrobial and hemolytic actions. // FEBS Lett. - 2003. - Vol. 554. - P.100-104.], (д) изменении жесткости вторичной структуры [Zelezetsky I. et al. Tuning the biological properties of amphipathic α-helical antimicrobial peptides: Rational use of minimal amino acid substitutions. // Peptides. - 2005. - Vol. 26. - P.2368-2376].

Все перечисленные способы сводились к изменению интегральных характеристик пептидов, таких как длина, заряд, спиральность, гидрофобность, гидрофобный момент [Dathe М., Wieprecht Т. Structural features of helical antimicrobial peptides: their potential to modulate activity on model membranes and biological cells. // Biochim. Biophys. Acta. - 1999. - Vol.1462. - P.71-87].

Наиболее близким к заявляемому является способ получения антимикробных пептидов с пониженной гемолитической активностью, включающий замену гидрофобных аминокислотных остатков, локализованных в кластерах гидрофобности [Chen Y. et al. Rational design of α-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index. // J. Biol. Chem. - 2005. - Vol.280. - P.12316-12329]. При этом каждому аминокислотному остатку приписывают определенное значение гидрофобности в соответствии с выбранной шкалой. Наибольшее распространение получила шкала Эйзенберга [Eisenberg D. Three-dimensional structure of membrane and surface proteins. // Ann. Rev. Biochem. - 1984. - Vol.53. - P.595-623]. Положение остатков на поверхности пептида определяют геометрическими характеристиками идеальной α-спирали. При таком способе детализации гидрофобных свойств пептида теряется информация о пространственном распределении гидрофобности в аминокислотных остатках, что приводит к невозможности корректной оценки вклада различных остатков пептида в формирование поверхностных гидрофобных паттернов.

Изобретение решает задачу получения антимикробных пептидов с пониженной гемолитической активностью.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения антимикробных пептидов с пониженной гемолитической активностью химическим или биотехнологическим синтезом, включающем моделирование пространственной структуры исходного пептида с высокой гемолитической активностью в α-спиральной конформации и замену гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные в процессе синтеза, после моделирования пространственной структуры исходного пептида в α-спиральной конформации дополнительно проводят расчет гидрофобных свойств пептида с учетом молекулярного гидрофобного потенциала в каждой точке поверхности пептида, выявление гидрофобных кластеров и аминокислотных остатков, локализованных в них, с последующим определением наиболее эффективных гидрофильных аминокислотных остатков для использования в процессе синтеза.

Способ осуществляют следующим образом:

1. моделируют пространственную структуру исходного пептида с высокой гемолитической активностью в α-спиральной конформации,

2. рассчитывают молекулярный гидрофобный потенциал (МГП) для каждой точки поверхности пептида,

3. проецируют полученные значения МГП на поверхность цилиндра, аппроксимирующего α-спираль, и картируют эти значения на плоскости (α; Z), где α - угол поворота, Z - смещение вдоль оси α-спирали,

4. выявляют гидрофобные паттерны (кластеры) на полученной плоскости и аминокислотные остатки, локализованные в них,

5. определяют наиболее эффективные гидрофильные аминокислотные остатки для замены идентифицированных гидрофобных аминокислотных остатков с целью сокращения гидрофобных кластеров,

6. проводят химический или биотехнологический синтез пептида с введением в его аминокислотную последовательность эффективных гидрофильных остатков.

В предлагаемом способе анализ пространственной организации гидрофобных свойств АМП основан на расчете МГП для каждой точки поверхности пептида в конформации идеальной α-спирали. МГП-подход учитывает гетерогенную природу боковых цепей аминокислотных остатков пептидов, их конформацию и микроокружение в трехмерной структуре и, таким образом, дает возможность детально оценить гидрофобные свойства различных частей молекулы. Это позволяет сохранить детализацию гидрофобных свойств на атомном уровне и избежать недостатков предыдущих упрощенных способов. МГП-подход успешно использовался ранее для анализа гидрофобных свойств белков и пептидов [Efremov R.G., Vergoten G. Hydrophobia organization of alpha-helix membrane bundle in bacteriorhodopsin. // J. Protein Chem. - 1995. - Vol.15. - P.63-76. Volynsky P.E. et al. Effect of lipid composition on the "membrane response" induced by a fusion peptide. // Biochemistry. - 2005. - Vol.44. - P.14626-14637].

Применение заявляемого способа позволяет значительно снизить гемолитическую активность пептидов (в десятки раз увеличить необходимую для лизиса эритроцитов концентрацию), а также цитотоксичность в отношении других клеток человека при сохранении высокой антимикробной активности.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Расчет карты гидрофобной поверхности линейного антимикробного пептида.

Для исходного гемолитически активного пептида (LtAMP-2a) проводят моделирование пространственной структуры в α-спиральной конформации (с помощью молекулярного редактора MOLMOL, см. фиг. 1А) на основании аминокислотной последовательности пептида (см. табл. 1) и данных о ротамерных состояниях аминокислотных остатков. Полученную структуру используют для расчета карт гидрофобной поверхности. Для расчета молекулярного гидрофобного потенциала (МГП) в каждой точке поверхности пептида используют набор физико-химических параметров, вычисленных из данных по коэффициентам распределения (log P) большого набора химических соединений в системе октанол-вода [Furet P. et al. 3D molecular lipophilicity potential profiles: a new tool in molecular modeling. // J. Mol. Graphics. - 1988. - Vol.6. - P.182-200]. МГП, создаваемый атомами остатка i в точке пространства j, рассчитывают по формуле [Fauchäre J.L. et at. Estimating and representing hydrophobicity potential. // J. Mol. Graphics. - 1988. - Vol. 6. - P.203-206]:

Здесь f_k - атомная константа гидрофобности атома k, принадлежащего остатку i, R_jk - расстояние между атомом k и точкой j (в Å), N_i - число атомов в остатке i, с=1 Å^-1. Значения атомных констант гидрофобности (f_k) взяты из работы [Viswanadhan V.N. et al. Atomic physicochemical parameters for three-dimensional structure directed quantitative structure-activity relationships. 4. Additional parameters for hydrophobic and dispersive interactions and their application for an automated superposition of certain naturally occurring nucleoside antibiotics. // J. Chem. Inf. Comput. Sci. - 1989. - Vol.29. - P.163-172]. МГП выражают в относительных условных единицах. Координаты точек поверхности пептидов, доступной растворителю, вычисляют с помощью программ CONNOLLY [Connolly M.L. Solvent-accessible surfaces of proteins and nucleic acids. // Science. - 1983. - Vol.221. - P.709-713]. Двумерные МГП-карты получают с помощью программы SURFER [Golden Software, Inc. SURFER User Manual, version 4.0.-1986]. МГП на цилиндрической поверхности (α, Z) (α - угол вращения относительно оси спирали, Z - смещение вдоль оси спирали) представляют с помощью контурных линий, соединяющих точки с одинаковым потенциалом. Для этого предварительно выполняют сплайн-интерполяцию данных (α_i, Z_i) для получения набора значений (α'_i,Z'_i), равномерно распределенных на поверхности. Все виды расчетов МГП осуществляют с помощью программы HIPPO [Efremov R.G. et al. Application of 3D molecular hydrophobicity potential to the analysis of spatial organization of membrane domains in proteins. I. Hydrophobic properties of transmembrane segments of Na, K-ATPase. // J. Prot. Chem. - 1992. - Vol. 11. - P.665-675]. Полученная карта представлена на фиг.1Б.

Пример 2.

Выбор аминокислотных замен для получения аналогов антимикробного пептида со сниженной гемолитической активностью.

На построенной двумерной карте гидрофобности (см. пример 1, фиг.1Б) исходного гемолитически активного пептида (LtAMP-2а) находят протяженные паттерны гидрофобности. Определяют ключевые остатки пептида, формирующие обширные гидрофобные области - Ile⁷, Phe¹⁰ (см. фиг.2). Предлагают замены соответствующих остатков на полярные или заряженные остатки, сходные по размеру и склонности к формированию α-спирали: Ile->Gln, Phe->Lys. Аминокислотные последовательности полученных аналогов (LtAMP-2a_I7Q, LtAMP-2a_F10K) приведены в таблице 1.

Для пептидов LtAMP-2a_I7Q и LtAMP-2a_F10K проводят расчет двумерных карт гидрофобности согласно схеме, описанной в примере 1. Полученные карты используют для оценки влияния предложенных мутаций на структуру гидрофобных паттернов на поверхности пептидов. Из фиг.2 видно, что предложенная замена в случае пептида LtAMP-2a_I7Q приводит к уменьшению размера гидрофобной области, соответствующей остатку Gln⁷ по сравнению с исходным пептидом LtAMP-2а. Замена Phe->Lys приводит к разрыву исходного гидрофобного паттерна в области остатка Lys¹⁰.

Таблица 1 Аминокислотные последовательности исходного гемолитически активного пептида LtAMP-2a и предложенных аналогов.
Пептид	Аминокислотная последовательность
LtAMP-2a (исходный)	1GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKH26
LtAMP-2a_F10K	1GLFGKLIKKKGRKAISYAVKKARGKH26
LtAMP-2a_I7Q	1GLFGKLQKKFGRKAISYAVKKARGKH26

Пример 3.

Химический синтез пептидов.

Пептид LtAMP-2a синтезируют твердофазным методом путем наращивания цепи с С-концевого остатка на 2-хлор-тритил-хлоридной (с нагрузкой 0,8-1,44 ммоль/г) смоле (PepChem, Германия) для временной защиты α-NH₂-групп используют флуоренилметоксикарбонильную группу (Fmoc) [Chan W.C., White P.D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. - 2000. - University Press, Oxford]. Защиту боковых групп аминокислотных остатков выбирают с расчетом на конечное деблокирование трифторуксусной кислотой: для защиты боковых групп остатков Ser и Tyr используют третбутильную группу, для Lys - третбутилоксикарбонильную группу, для His - тритильную группу, для Arg - 2,2,4,6,7-пентаметилдегидробензофуран-5-сульфонильную группу.

Для присоединения первой (С-концевой) аминокислоты к смоле 1,5 экв (по отношению к количеству активных групп на смоле) Fmoc-защищенной аминокислоты растворяют в дихлорметане (из расчета 10 мл дихлорметана на 1 г смолы) с 1,5 экв диизопропилэтиламина.

К полученному раствору добавляют еще 1,5 экв диизопропилэтиламина и приливают к сухой смоле, мягко перемешивают в течение 45 мин. Непрореагировавшие активные группы на смоле блокируют метанолом (из расчета 1 мл метанола на 1 г смолы) в течение 20 мин, после чего смолу промывают тремя объемами дихлорметана, тремя объемами N,N-диметилформамида и тремя объемами этанола, высушивают под вакуумом. Аминокислотные остатки присоединяют к пептидил-полимеру с образованием гидроксибензотриазолового эфира в присутствии 1,3-диизопропилкарбодиимида, для активации 1 экв аминокислоты используют 1,2 экв N-гидроксибензотриазола и 1 экв 1,3-диизопропилкарбодиимида. Для наращивания полипептидной цепи в ходе каждого синтетического цикла проводят конденсацию пептидил-полимера с 5 экв активированной Fmoc-аминокислоты (1-12 часов при 37°С), содержание непрореагировавших аминогрупп контролируют визуально по окрашиванию рН-зависимого индикатора бромфенолового синего.

Отщепление продукта от 2-хлор-тритил-хлоридного полимера с одновременным деблокированием боковых групп проводят смесью трифторуксусной кислоты, воды и этандитиола (95:2,5:2,5, v/v/v) из расчета 1 мл смеси на 50 мг смолы. Суспензию перемешивают в течение 2 часов, затем раствор пептида в трифторуксусной кислоте отфильтровывают от полимера. Продукт высаживают 10-кратным избытком (по объему) охлажденного диэтилового эфира, отфильтровывают, дважды промывают эфиром, после чего высушивают лиофильно.

Синтезированный пептид подвергают очистке по методу ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой Luna C₁₈ (10×250 мм, размер пор 100 Å, диаметр частиц 10 мкм, Phenomenex, США). Фракционирование проводят в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 0 до 50% (v/v) в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте в течение 60 минут со скоростью элюции 2 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм.

Содержание примесей в синтетическом препарате LtAMP-2a составляет 1%, что подтверждается разделением по методу ВЭЖХ на аналитической колонке Luna C₁₈ (1×150 мм, размер пор 100 Å, диаметр частиц 3 мкм, Phenomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 20 до 50% (v/v) в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте в течение 40 минут со скоростью элюции 50 мкл/мин, детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм.

Идентичность синтезированного LtAMP-2a природному доказывают при помощи масс-спектрометрического анализа, сравнением хроматографических подвижностей при разделении на аналитической колонке Luna C₁₈ (1×150 мм, Phenomenex, США), а также сравнением биологических свойств.

Пептиды LtAMP-2a_F10K и LtAMP-2a_I7Q синтезируют аналогичным способом, внося необходимые аминокислоты. Для защиты боковой цепи Gln используют тритильную группу.

Пример 4.

Тестирование пептидов на антимикробную активность.

Для определения антимикробной активности пептидов используют следующие штаммы микроорганизмов: Bacillus subtilis BKM B-501, Escherichia coli C600. Антимикробная активность оценивается по методу ингибирования роста культуры в жидкой среде. Определение минимальных концентраций пептидов, необходимых для полного ингибирования роста микроорганизмов (минимальных ингибирующих концентраций), проводят методом серийных разведений, используют модифицированную методику [Amsterdam D. Susceptibility testing of antimicrobials in liquid media. // Loman V., ed. Antibiotics in laboratory medicine, 4^th ed. - Williams and Wilkins, Baltimore. - 1996. - P.52-111].

Бактерии культивируют в жидкой низкосолевой среде LB (1% бакто-триптон, 0,5% бакто-дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, pH 7) при 37°С и перемешивании со скоростью 220 об/мин в течение 18 ч. Полученные культуры разбавляют в 200 раз, используя среду LB, и выращивают в тех же условиях в течение 3-5 ч до достижения экспоненциальной фазы роста (оптическая плотность культуры при 620 нм OD₆₂₀˜0,3-0,5), после чего снова разбавляют до концентрации клеток 10⁵ колоний образующих единиц в 1 мл. Культуры помещают в стерильные 96-луночные планшеты, по 90 мкл в лунку, куда затем добавляют по 10 мкл растворов тестируемых веществ различных концентраций, получаемых серийными разведениями. Отрицательным контролем служит культура клеток с добавлением 10 мкл чистой воды, положительным - чистая среда для культивирования. Планшеты инкубируют в условиях, описанных выше, в течение 24 ч, после чего измеряют OD₆₂₀, минимальные ингибирующие концентрации определяют как наименьшие концентрации веществ, полностью подавляющие рост микроорганизмов. Опыт проводят в трех независимых повторах.

Результаты определения минимальных ингибирующих концентраций для пептидов LtAMP-2a, LtAMP-2a_F10K, LtAMP-2a_I7Q представлены в таблице 2. Пептиды LtAMP-2a_F10K и LtAMP-2a_I7Q сохраняют высокую антимикробную активность.

Таблица 2 Антимикробные свойства исходного пептида LtAMP-2a и его аналогов
пептид	минимальная ингибирующая концентрация, мкМ
Escherichia coli С600	Bacillus subtilis ВКМ В-501
LtAMP-2a (исходный)	3,0	0,7
LtAMP-2a_F10K	5,5	0,7
LtAMP-2a_I7Q	5,0	1,3

Пример 5.

Тестирование пептидов на гемолитическую активность.

Гемолитическую активность пептидов определяют с использованием крови здорового донора (группа В, Rh+). К 100 мкл свежей крови добавляют 900 мкл среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамин, 8% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС) и гепарин (10 ед/мл). Определяют плотность клеток, после чего суспензию разводят средой RPMI-1640 до плотности 10⁷ клеток/мл. К полученной суспензии добавляют тестируемый пептид нужной концентрации, в качестве отрицательного контроля используют клетки без добавления пептида. Инкубируют при 37°С и перемешивании со скоростью 120 об/мин в течение 3 ч, после чего клетки осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 4000 g, 100 мкл супернатанта отбирают в стерильные 96-луночные планшеты, выход гемоглобина из эритроцитов оценивают по оптической плотности при 414 нм. Гемолитическая активность пептидов (см. табл. 3) выражается в % от максимально возможного гемолиза, максимально возможный лизис эритроцитов (положительный контроль) получают за счет ресуспендирования осажденных клеток в чистой воде до плотности 10⁷ клеток/мл.

В результате получают, что предложенные аналоги LtAMP-2a_F10K и LtAMP-2a_I7Q для исходного гемолитически активного пептида подобной активности не проявляют (0% гемолиз) в концентрациях до 45 мкМ.

Пример 6.

Тестирование пептидов на цитотоксичность по отношению к лейкоцитам и клеткам эритролейкемии человека.

Оценку цитотоксических свойств латарцинов для лейкоцитов человека проводят на фракции крови здорового донора (группа В, Rh+), обогащенной лейкоцитами, которую получают отстаиванием гепаринизированной (10 ед/мл) крови в течение 2 ч при 15°С в темноте. Отбирают фракцию выше эритроцитарного столба, соотношение лейкоцитов и эритроцитов в которой 1:10, добавляют 1,5 объема среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамин и 8% ЭБС. Клетки осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 200 g, супернатант удаляют, клетки ресуспендируют в равном объеме среды RPMI-1640. Операцию повторяют дважды, после чего клетки рассаживают в 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты (10⁶ клеток/мл, 150 мкл среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-GIn и 8% ЭБС, на лунку).

Клетки эритролейкемии человека К562 культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 8% ЭБС при 37°С, в атмосфере 100%-ной влажности с 5%-ным содержанием СО₂. За день до эксперимента клетки рассаживают в 96-луночные планшеты (10⁶ клеток/мл).

В лунки вносят исследуемые пептиды в нужной концентрации, в качестве отрицательного контроля в лунки добавляют чистую воду. Клетки (К562 и лейкоциты) инкубируют с различными концентрациями пептидов в течение 3 ч при 37°С, затем в лунки вносят флуоресцентные красители Hoechst33342 (20 мкМ, окрашивает ядра всех клеток) и пропидиум иодид (20 мкМ, окрашивает ядра мертвых клеток) и через 15 мин регистрируют флуоресцентные изображения клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200M (Zeiss, Германия) с цифровой камерой AxioCam MRc (Zeiss, Германия) в области флуоресценции Hoechst33342 (фильтры на возбуждение - ВР 365/12, на эмиссию - LP 397) и в области флуоресценции пропидиум иодида (фильтры на возбуждение - ВР 510-560, на эмиссию - LP 590). По этим изображениям для каждой концентрации пептида подсчитывают общее число клеток (1000 клеток на одно измерение) и число мертвых клеток среди них, а затем рассчитывают концентрацию пептида, вызывающую гибель 50% клеток, ИК₅₀. Результаты (см. табл. 3) усредняют по трем независимым экспериментам.

В итоге получают, что предложенные аналоги LtAMP-2a_F10K и LtAMP-2a_I7Q для исходного цитотоксичного в отношении нормальных лейкоцитов пептида подобной активности не проявляют (0% лизис) в концентрациях до 45 мкМ. Однако пептиды сохраняют достаточно высокую цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток.

Таблица 3 Цитотоксические свойства исходного пептида LtAMP-2a и его аналогов
пептид	эритроциты человека	нормальные лейкоциты человека	клетки эритролейкемии человека К562
ЭК50 *, мкМ	ИК50 *, мкМ	ИК50 *, мкМ
LtAMP-2a (исходный)	9,2	17,9	3,3
LtAMP-2a_F10K	-**	-**	18,6
LtAMP-2a_I7Q	-**	-**	24,7
* - эффективная концентрация, вызывающая 50%-ный лизис ** - активность отсутствует (0% лизис) при концентрациях до 45 мкМ

Способ получения антимикробных пептидов с пониженной гемолитической активностью, включающий моделирование пространственной структуры исходного пептида с высокой гемолитической активностью в α-спиральной конформации и химический синтез с заменой гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные в процессе синтеза, отличающийся тем, что после моделирования пространственной структуры исходного пептида в α-спиральной конформации дополнительно проводят расчет гидрофобных свойств пептида с учетом молекулярного гидрофобного потенциала в каждой точке поверхности пептида, выявление гидрофобных кластеров и аминокислотных остатков, локализованных в них, с последующим определением наиболее эффективных гидрофильных аминокислотных остатков, являющихся полярными или заряженными, сходными по размеру и склонности к формированию α-спирали, для использования в процессе синтеза, в ходе которого происходит замена гидрофобных аминокислот Ile⁷ и Phe¹⁰ на гидрофильные Gln⁷ и Lys¹⁰.