Способ оценки гормонозависимости низкодифференцированного рака эндометрия и его чувствительности к ингибиторам ароматазы

Изобретение относится к медицине, а именно к онкоэндокринологии и онкогинекологии. Для выявления гормонозависимости низкодифференцированного рака эндометрия определяют активность ароматазы и содержание рецепторов прогестерона (ПР) в опухолевой ткани. При содержании ПР более 10 фМ/мг белка/час и активности ароматазы более 20 фМ/мг белка новообразования относят к гормоночувствительным, способным реагировать на гормонотерапию ингибиторами ароматазы. Использование способа позволяет повысить точность выявления гормонозависимости рака тела матки с низкой степенью дифференцировки. 2 табл.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкоэндокринологии и онкогинекологии.

Хотя по данным, характеризующим заболеваемость раком эндометрия в странах Северной Америки, в последние годы не отмечается прироста в частоте его выявления по сравнению с предыдущими десятилетиями (SEER, 2002), в структуре онкологической заболеваемости женских половых органов в Российской Федерации рак тела матки (РТМ) в 2001 году вышел на первое место и составил 39,8%, а в Санкт-Петербурге более 40%. Существенно, что, если во второй половине 20 века рост заболеваемости РТМ связывался преимущественно с сопутствующей эндокринной патологией типа ожирения или сахарного диабета 2 типа (Бохман Я.В., 1972, 1989), в последнее время все большее значение приобретают и другие факторы, в том числе внешней среды, под влиянием которых меняется не только частота заболеваемости, но и фенотип больных и биологические свойства возникающих новообразований. В итоге соотношение раков эндометрия т.н. I и II типов может в конкретной стране или популяции с годами постепенно меняться в пользу вторых. Поскольку РТМ II типа, как правило, проявляется более низкой степенью дифференцировки опухоли и худшим прогнозом quo ad vitam, это может явиться одним из факторов, препятствующих улучшению итоговых результатов лечения. Между тем, существует мнение, что отказ от гормональной терапии при низкодифференцированном раке эндометрия не является в полной мере целесообразным, поскольку применение адъювантной терапии прогестинами или прогестинами в сочетании с предварительным курсом тамоксифена при опухолях с дифференцировкой G3 увеличивало 5-летнюю выживаемость больных с 58.1% до 76.6% (Микая Н.А., Максимов С.Я., 1999). Соответственно, представляется оправданным поиск дополнительных подходов к оценке гормонозависимости подобных новообразований, что может быть, среди прочего, основано на современных представлениях о гормональном канцерогенезе.

Действительно, в настоящее время становится все более общепринятой та точка зрения, что, как это видно на примере эстрогенов, гормональный канцерогенез может реализоваться благодаря двум основным механизмам - промоторному, связанному с преимущественно митогенным эффектом гормона-стимулятора, и генотоксическому, являющемуся следствием ДНК-повреждающего эффекта, индуцированного свободно-радикальными продуктами - дериватами метаболитов классических эстрогенных гормонов (Liehr J., 1997; Cavalieri E. et al., 2003; Берштейн Л.М., 1995, 2000). Применительно к проблеме РТМ это позволяет считать I тип данного заболевания клиническим эквивалентом промоторного, а II тип (значительная часть наблюдений, при котором представлена низкодифференцированными новообразованиями) - следствием генотоксического варианта гормонального канцерогенеза (Берштейн Л.М. и др., 2003-2005). Во втором случае большое значение приобретает возможность локальной продукции эстрогенов в ткани-мишени (эндометрии), оценка чего представляется важной не только с точки зрения понимания механизмов возникновения опухоли, но и в целях определения гормонозависимости последней и ее потенциальной чувствительности к гормонотерапии (Bulum S. et al., 2004; Emons G. et al., 2004; Берштейн Л.М., 2004).

В настоящее время все более широкое распространение на полном основании получило определение стероидных рецепторов в ткани РТМ. Положительный уровень этих рецепторов, прежде всего, рецепторов прогестерона (ПР), является основным критерием установления гормонозависимости новообразований эндометрия. Содержание ПР в опухоли положительно коррелирует с клинико-морфологическим вариантом заболевания и степенью морфологической дифференцировки рака эндометрия, а также со способностью опухоли к секреторным процессам (Gurpide E., 1981; Kauppila A., 1989; Цырлина Е.В. и др., 1989). При этом существенно подчеркнуть, что в то время как в высокодифференцированных карциномах эндометрия ПР (при том или ином рецепторном фенотипе) обнаруживаются в 81.7% случаев, в низкодифференцированных опухолях они выявляются в среднем, как минимум, в два раза реже (Цырлина Е.В. и др., 1989; Хаджимба А.С., 2003).

Однако даже у тех больных, в новообразованиях у которых определяются рецепторы стероидов, клинический эффект от гормонотерапии удается получить только в 70-90% случаев и наоборот, у пациенток с отрицательными как прогестероновыми, так и эстрогенными рецепторами в 10-15% случаев удается получить хороший лечебный эффект (Bonte J. et al., 1977; Kauppila A., Vihko R., 1987; Вишневский А.С. и др., 1993). Поэтому сохраняется необходимость в комплексной оценке факторов, помогающих предсказать эффект гормонотерапии. Одним из важных дополнительных показателей, позволяющих оценить гормоночувствительность или гормонокомпетентность ткани РТМ, как представляется, является ароматаза (эстрогенсинтетаза) и ее реакция на ингибиторы этого фермента.

Существуют расхождения точек зрения на то, способна ли к самостоятельному синтезу эстрогенов ткань нормального эндометрия (Bulun S. et al., 1994; Tarkowski et al., 2000). Напротив, присутствие ароматазы (цитохрома Р450, класс XIX, или CYP19) и экспрессии ее гена в ткани РТМ доказано, но существенно, что хотя эстрогенозависимость рака эндометрия в целом не уступает таковой при раке молочной железы, до последнего времени частота определения и тем более практического использования результатов тестирования данного фермента при РТМ была крайне невелика. Между тем, активность ароматазы, как мы предположили ранее (Берштейн Л.М. и др., 2003), в ткани малигнизированного эндометрия может представлять несомненную важность как показатель, ассоциированный с клиническим течением заболевания. Такое предположение основывалось, в частности, на закономерностях, установленных при оценке связи между внутриопухолевым содержанием эстрогенов и клинико-морфологическими особенностями РТМ. Направленность этой связи отличается - что весьма важно с прикладной точки зрения - от заключений, которые были сделаны на основании определения эстрогенов в крови больных. В частности, в то время как повышение эстрадиола в крови сочетается, как правило, с более благоприятным течением рака эндометрия или никак не связано с ним (Бохман Я.В., 1989), содержание эстрогенов в опухоли ассоциировано с более агрессивным течением процесса и, в частности, с более низкой степенью дифференцировки (Чернобровкина А.Е., 1999). Соответственно, заслуживало внимания оценить, каким образом с тем же параметром, т.е. с дифференцировкой ткани РТМ, связана активность ключевого фермента биосинтеза эстрогенов - ароматазы - и можно ли, следовательно, использовать этот показатель, наряду с традиционным измерением содержания рецепторов прогестерона (ПР), как способ для оценки гормоночувствительности опухолевой ткани и назначения гормонотерапии в случаях низкодифференцированного рака эндометрия, традиционно считающихся малозависящими от гормональных влияний. Хотя наиболее распространенным методом гормональной терапии РТМ является применение прогестинов, в последнее время ведется активный поиск других вариантов лекарственного антигормонального воздействия при этом заболевании, в том числе с учетом накапливающихся сведений о способности опухолей эндометрия к самостоятельной продукции эстрогенов (Берштейн Л.М., 2001-2005, Коломиец Л.А. и др., 2004; Emons G. et al., 2004).

Техническим результатом заявляемого изобретения является установление условий, при которых в случае рака тела матки с низкой степенью дифференцировки может оказаться успешной гормонотерапия ингибиторами ароматазы - к этим условиям относится повышение в опухоли активности ароматазы, в особенности в сочетании с повышенным содержанием ПР.

Материал для исследования (опухолевую ткань) брали сразу после операции и его аликвоты хранили в жидком азоте. Активность ароматазы оценивалась по образованию тяжелой воды из меченного тритием в 1β-положении андростендиона в описанной ранее модификации (Ларионов А.А. и др., 1998). В кратком виде метод сводится к гомогенизации замороженной в жидком азоте опухолевой ткани в калий-фосфатном буфере, центрифугировании и инкубации надосадочной жидкости с меченым андрогенным предшественником в присутствии НАДФ, глюкозо-6-фосфата и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы. Реакцию останавливают добавлением холодного хлороформа. После экстракции и центрифугирования к водной фазе добавляют 5% суспензию активированного угля, энергично встряхивают в течение 30 с, вновь центрифугируют и производят подсчет радиоактивности в надосадочной жидкости. Результаты (данные об активности ароматазы) выражают в фМ/мг белка/час. Рецепторы прогестерона (в фМ/мг белка) определялись по S.Saez et al., 1978 с использованием меченой по тритию метки (1,2,6,7-³H-Progesterone) фирмы «Amersham», Великобритания. К рецепторпозитивным новообразованиям относили опухоли, в которых содержание ПР превышало 10 фМ/ мг белка, а к «обогащенным» ПР случаям - опухоли с содержанием ПР свыше 20 фМ/мг белка.

Всего активность ароматазы была определена в 80 образцах рака тела матки, преимущественно от больных, находящихся в менопаузе длительностью не менее 1-2 лет. В 76 случаях проведенное морфологическое исследование позволило оценить степень дифференцировки опухоли: в 58 наблюдениях были обнаружены высоко- и умереннодифференцированные новообразования (G1 и G2), а в остальных 18 наблюдениях рак эндометрия был низкодифференцированным (G3).

В табл.1 представлены сведения о внутриопухолевой активности ароматазы в 76 случаях рака эндометрия с известной степенью дифференцировки новообразования. Как видно, в случаях с более низкой дифференцировкой (G3) отмечается достоверное повышение активности ароматазы в опухолевой ткани, что позволяет рассматривать этот параметр как самостоятельный и важный критерий, поддающийся иным регуляторным закономерностям, чем уровень эстрогенов в крови. Сходная зависимость между утратой (низкой степенью) дифференцировки РТМ и повышением внутриопухолевой активности ароматазы была установлена по предварительным и значительно меньшего объема данным, Watanabe К. et al., 1995 и Jongen V.H. et al., 2005, чьи работы можно расценивать как прототип заявляемого изобретения.

Таблица 1 Активность ароматазы в ткани рака тела матки: роль дифференцировки опухоли.
Степень дифференцировки	Число наблюдений	Активность ароматазы, фМ/мг белка/час М±m	Р
Высокая и умеренная (G1+G2)	58	7.33±0.82	0.03
Низкая (G3)	18	11.01±1.46

На следующем этапе работы 23 больных раком эндометрия (5 из них - с низкой степенью дифференцировки опухоли) подвергали 2-недельной неоадъювантной (дооперационной) терапии инигибиторами ароматазы. 10 больных получали с этой целью летрозол (фемара) по 2.5 мг/день и 13 пациенток - экземестан (аромазин) по 25 мг/день. У всех больных до начала терапии в образцах опухолевой ткани, полученных во время диагностического выскабливания и сохранявшихся до момента анализа в жидком азоте, определяли активность ароматазы и содержание рецепторов прогестерона методами, описанными выше. Помимо этого, до начала лечения и после завершения курса гормонотерапии осуществляли УЗИ малого таза с оценкой толщины эндометрия (М-эхо), брали вагинальные мазки для определения степени эстрогенной насыщенности и определяли содержание эстрадиола (Е2) и фолликулостимулирующего гормона в крови.

Прежде всего, в этой части работы подтвердилось, что до начала лечения активность ароматазы при G3-дифференцировке опухоли (10.6±3.3 фМ/мг белка, 5 случаев) значительно более высока, чем при дифференцировке G1 и G2, т.е. при высоко- и умереннодифференцированных новообразованиях (5.4±0.9 фМ/мг белка, 18 наблюдений). Далее выяснилось, что при сравнении коэффициентов корреляции между активностью ароматазы и содержанием ПР в опухоли эта взаимосвязь значительно более прочна именно в низкодифференцированных опухолях (табл.2).

Таблица 2 Величина коэффициентов линейной и ранговой (по Спирмену) корреляции между активностью ароматазы и содержанием рецепторов прогестерона в опухолевой ткани.
Группа	Коэффициенты корреляции
Линейной (r)	ранговой (R)
Все случаи	+0.08 (р=0.74)	+0.16 (р=0.51)
Только низкодифференцированные опухоли (G3)	+0.77 (р=0.12)	+0.87 (р=0.053)

Наконец, когда новообразования были подразделены по исходной (до начала гормонотерапии ингибиторами ароматазы) активности ароматазы на две группы - с величиной этого показателя менее и более 5 фМ/мг белка/час, то оказалось, что, несмотря на отсутствие различий в динамике в ходе терапии величины М-эхо сигнала, больные во второй группе (к которой принадлежала и большая часть случаев с низкой степенью дифференцировки) отвечали на лечение более частым (78% vs 50%) снижением уровня ПР в опухоли и концентрации эстрадиола в крови (54.5% vs 33.3%), что можно рассматривать и как отражение большей эффективности проводившейся краткосрочной гормонотерапии.

Следовательно, в ситуации, когда низкодифференцированная карцинома эндометрия характеризуется повышенной, более 10 фМ/мг белка/час, активностью ароматазы (в особенности, когда это сочетается с содержанием рецепторов прогестерона, превышающим 20 фМ/мг белка), такие случаи заболевания можно рассматривать, как потенциально чувствительные к терапии ингибиторами ароматазы за счет биосинтеза эстрогенов в самой опухолевой ткани и сохранения (возможно, благодаря последнему обстоятельству) эстрогенозависимости рецепторов прогестерона.

Пример 1: больная З-ва, 73 лет, степень дифференцировки опухоли G₃ (низкодифференцированная). Активность ароматазы в опухоли 16,2 фМ/мг белка/час, содержание рецепторов прогестерона 40 фМ/мг белка. Реакция на 2-недельную терапию экземестаном (аромазином): уменьшение величины М-эхо сигнала на 20%, содержания ПР - на 90%, эстрогенной насыщенности вагинальных мазков - на 1 балл.

Пример 2: больная Е-ва, 55 лет, степень дифференцировки опухоли G₁ (высокодифференцированная). Активность ароматазы в опухоли 6,6 фМ/мг белка/час, содержание рецепторов прогестерона 22 фМ/мг белка. Реакция на 2-недельную терапию летрозолом (фемарой): уменьшение величины М-эхо сигнала - нет, содержания ПР - нет, концентрации эстрадиола в крови - на 22,9%.

Таким образом, у пациентки Е-вой, несмотря на наличие высокодифференцированного рака эндометрия, благоприятная реакция на неоадъювантную терапию ингибитором ароматазы была выражена в меньшей степени, чем у б-ой З-вой, низкодифференцированной опухоли которой было присуще не только достаточно высокое содержание ПР (как и у больной Е-вой), но и повышенная активность ароматазы. Следовательно, комбинация повышенной внутриопухолевой способности к биосинтезу эстрогенов с присутствием в новообразовании рецепторов прогестерона могут быть критериями, оправдывающими проведение в группе повышенного риска - у больных с низкодифференцированной карциномой эндометрия неоадъювантной и, вероятно, адъювантной гормонотерапии ингибиторами ароматазы. При использовании предлагаемого способа выявления гормонозависимости рака тела матки с дифференцировкой G3 создаются условия для оценки применительно к каждому отдельному больному вероятности позитивного ответа на гормонотерапию, несмотря на наличие морфологических критериев, говорящих не в пользу такой возможности.

Способ выявления гормонозависимости низкодифференцированного рака эндометрия, отличающийся тем, что в опухоли изучают активность ароматазы (эстрогенсинтетазы) и содержание рецепторов прогестерона и в случае величины этих показателей, превышающей, соответственно, 10 фМ/мг белка/ч и 20 фМ/мг белка, относят такие новообразования к гормоночувствительным, способным реагировать на гормонотерапию ингибиторами ароматазы.