Способ выделения и очистки макролидов

Изобретение относится к области органической химии, в частности к способу очистки макролидов. Описывается способ выделения макролида в очищенной форме, заключающийся в а) обработке неочищенного макролида или макролида-сырца не смешивающимся с водой растворителем, b) необязательном концентрировании смеси, с) обработке газообразным аммиаком для осаждения примесей, d) отделении примесей, е) необязательном концентрировании фазы, содержащей макролид, f) проведении хроматографии на силикагеле, необязательно обращенно-фазовой или с предварительной обработкой серебром, и элюирование макролида, g) получение макролида в существенной степени очищенной форме, h) необязательное повторение стадий f) и g) для получения макролида в существенной степени очищенной форме. Макролид предпочтительно представлен такролимусом, иммуномицином или сиролимусом. Предложенный способ позволяет по упрощенной технологии получить макролиды с высокой степенью чистоты. 7 з.п. ф-лы.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к области органической химии и фармакологии, конкретно к новому способу очистки макролидов.

Уровень техники

Соединение 15,19-эпокси-3Н-пиридо[2,1-с][1,4] оксаазациклотрикозин-1,7,20,21(4Н,23Н)-тетрон, 5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,25,26,26а-гексадекагидро-5,19, дигидрокси-3-[(1Е)-2-[(1R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксициклогексил]-1-метилэтенил]-14,16-диметокси-4,10,12,18-тетраметил-8(2-пропенил)-(3S,4R,5S,8R,9E,12S,14S,15R,16S,18R,19R,26aS), известное также как FK506, а также такролимус, описанный в патенте ЕР №184162 и патенте США №4894366, используют как иммунодепрессант.

Другое соединение, 15,19-эпокси-3Н-пиридо-[2,1-с][1,4] оксаазациклотрикозин-1,7,20,21(4Н,23Н)-тетрон,8-этил-5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,25,26,26а-гексадекагидро-5,19,дигидрокси-3-[(1E)-2-[(1R,3R,4R)-4-гидрокси-3-метоксициклогексил]-1-метилэтенил]-14,16-диметокси-4,10,12,18-тетраметил-(3S,4R,5S,8R,9E,12S,14S,15R,16S,18R,19R,26aS)-, известное также как иммуномицин, а кроме того, как FK520, раскрытое в Публикации ЕРО № 0184162, также используют как иммунодепрессант.

Многие другие производные данных соединений, а также структурные аналоги обладают свойствами иммунодепрессантов.

Патент США №5508398 раскрывает способ отделения нейтрального неполипептидного макролида от кислых, основных и неполярных нейтральных примесей, присутствующих в концентрате экстрактов ферментационных бульонов или маточных растворов, содержащих указанный нейтральный макролид, который включает в любом порядке стадию экстракции (а) и необязательно одну или обе стадии (b) и (с), причем (а) включает экстракцию водным основанием, (b) включает экстракцию водной кислотой и (с) включает обработку неароматическим углеводородным растворителем.

Патент США №5616595 раскрывает способ выделения нерастворимых в воде соединений (включая FK506, FK520 и рапамицин) из ферментационного бульона, включающий последовательные стадии концентрирования, солюбилизации и диафильтрации представляющего интерес соединения, все стадии осуществляют через одну замкнутую систему рециркуляции с целью выделения соединения для дальнейшей очистки далее по ходу процесса.

Способ отделения такролимуса от родственных примесей раскрывают в патенте США №6492513. Способ включает обработку ионообменной смолы, содержащей группу сульфоновой кислоты, ионами серебра. Такролимус, содержащий алкенильную боковую цепь, отделяют от его аналогов, содержащих алкильную боковую цепь.

Патент США №6576135 раскрывает способ аналогичного разделения. Такролимус вместе с другими примесями адсорбируют на неионной адсорбционной смоле с последующей элюцией водным растворителем, содержащим ионы серебра.

Ван-Фаном и др. представлен способ отделения такролимуса от иммуномицина с использованием центробежной противоточной хроматографии. (см. статью Wang-Fan W., Kusters E., Lohse О., Mak C., Wang Y., Journal of Chromatography A, 864, (1999), 69-76).

Раскрытие изобретения

Данное изобретение относится к новому способу очистки макролидных соединений, включающему:

a) обработку неочищенного макролида или макролида-сырца не смешивающимся с водой растворителем,

b) концентрирование смеси,

c) обработку газообразным аммиаком для осаждения примесей,

d) отделение примесей,

e) концентрирование фазы, содержащей макролид,

f) проведение хроматографии на силикагеле, необязательно обращенно-фазовой или с предварительной обработкой серебром, и элюирование макролида,

g) получение макролида в существенной степени очищенной форме,

h) необязательное повторение стадий f и g для получения макролида в существенной степени очищенной форме.

Полученный таким образом продукт имеет фармацевтически приемлемое качество.

Осуществление изобретения

Как отмечено ранее, данное изобретение относится к новому способу очистки макролидных соединений.

Новый способ, соответствующий данному изобретению, включает:

a) обработку неочищенного макролида или макролида-сырца не смешивающимся с водой растворителем,

b) концентрирование смеси,

c) обработку газообразным аммиаком для осаждения примесей,

d) отделение примесей,

e) концентрированно фазы, содержащей макролид,

f) проведение хроматографии на силикагеле, необязательно обращенно-фазовой или с предварительной обработкой серебром, и элюирование макролида,

g) получение макролида в существенной степени очищенной форме,

h) необязательное повторение стадий f и g для получения макролида в существенной степени очищенной форме.

Макролид, соответствующий настоящему изобретению, получен посредством ферментации.

Бульон, полученный при ферментации, или водную фазу, содержащую макролид, можно непосредственно экстрагировать не смешивающимся с водой растворителем.

Любой материал сырца в твердой, полутвердой или жидкой форме, полученный из бульона может быть обработан не смешивающимся с водой растворителем для осуществления солюбилизации макролида в не смешивающимся с водой растворителе. Не смешивающийся с водой растворитель, содержащий макролид, можно частично концентрировать. Концентрирование можно осуществить известными способами, например выпариванием растворителя. Выпаривание растворителя может быть проведено нагреванием без или с пониженным давлением. Полученную таким образом смесь можно обработать газообразным аммиаком. Примеси можно отделить известными в основном способами, например фильтрацией, центрифугированием или любым подходящим способом разделения твердого вещества и жидкости. Фаза, содержащая макролид, может быть подвергнута очистке с использованием активированного угля. Фаза, содержащая макролид, может быть сконцентрирована способом, обсуждавшимся ранее. Фаза, содержащая макролид, может быть подвергнута хроматографии на силикагеле. Хроматография на силикагеле может быть обращенно-фазовой. Силикагель можно предварительно обработать серебром. Элюат, полученный при хроматографировании, можно смешать с не смешивающимся с водой растворителем. Не смешивающийся с водой растворитель может быть выбран из группы, включающей углеводороды, гетероциклические соединения, простые или сложные эфиры. Предпочтительно, когда растворитель выбран из углеводородов или простых эфиров. Макролид может быть получен путем кристаллизации или осаждения. Макролид может быть получен из одного или смеси растворителей, выбранных из этилацетата, диэтилацетата, ацетонитрила и гексана.

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, причем следует иметь в виду, что не предусматривается ограничивать изобретение деталями, описанными в данном контексте.

Примеры

Пример 1

Ферментационный бульон (11 кг), содержащий 1,2 г такролимуса, экстрагируют 11 л этилацетата. Этилацетатный экстракт частично концентрируют до 1,2 л. Концентрат охлаждают до 4°С и через концентрат пропускают аммиак в течение 30 минут. Раствор фильтруют с использованием целита в качестве фильтра с целью отделения осажденных примесей. Фильтрат концентрируют для получения 28 г маслянистого остатка. Остаток наносят на колонку с силикагелем. Колонку промывают тройным объемом колонки 25% этилацетата в гексане и тройным объемом колонки 50% этилацетата в гексане. Продукт элюируют 75% этилацетатом в гексане. Фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют для получения 2,8 г маслянистого остатка. Остаток растворяют в 100 мл этилацетата. К нему добавляют 3 г активированного угля. Смесь перемешивают в течение 20 минут, а затем фильтруют. Фильтрат концентрируют, получая 2,7 г маслянистого остатка. К остатку добавляют 2,5 мл этилацетата. Неочищенный продукт кристаллизуют при 4°С путем медленного добавления гексана. Неочищенный продукт фильтруют и сушат.

Неочищенный продукт наносят на колонку с силикагелем. Силикагель (230-400 меш) сначала обрабатывают нитратом серебра. Колонку элюируют 75% этилацетатом и 25% гексаном. Фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют. Продукт кристаллизуют, как указано выше, из этилацетата и гексана. Кристаллы фильтруют и сушат. Хроматографическая чистота превышает 99%.

Пример 2

Ферментационный бульон (29 кг), содержащий 3,1 г такролимуса, экстрагируют 29 л этилацетата. Этилацетатный экстракт частично концентрируют до 2 л. Концентрат охлаждают до 4°С и через концентрат пропускают аммиак в течение 20 минут. Раствор фильтруют с использованием целита в качестве фильтра с целью отделения осажденных примесей. Фильтрат концентрируют для получения 51 г маслянистого остатка. Остаток наносят на колонку с силикагелем. Колонку промывают тройным объемом колонки 25% этилацетата в гексане и тройным объемом колонки 50% этилацетата в гексане. Продукт элюируют 75% этилацетатом в гексане. Фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют, получая 6 г маслянистого остатка. Остаток растворяют в 200 мл этилацетата. К нему добавляют 6 г активированного угля. Смесь перемешивают в течение 20 минут, а затем фильтруют. Фильтрат концентрируют, получая 5 г маслянистого остатка. К остатку добавляют 5 мл этилацетата. Неочищенный продукт кристаллизуют при 4°С путем медленного добавления гексана. Неочищенный продукт фильтруют и сушат.

3 г неочищенного продукта наносят на колонку для ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) с обращенной фазой (гелевая колонка размером d (диаметр) ˜50 мм х Н (высота) - 200 мм). Продукт элюируют системой н-бутанол: ацетонитрил: буфер в соотношении 9,75:12,5:77,75. Буфер содержит 1,36 г/л дигидрофосфата калия, 1 мл/л триэтиламина и 1 мл/л фосфорной кислоты. Фракции, содержащие продукт, объединяют и экстрагируют равным объемом этилацетата. Слой этилацетата сушат безводным сульфатом натрия и концентрируют. Продукт кристаллизуют, как указано выше, из этилацетата и гексана. Кристаллы (1,6 г) отфильтровывают и сушат. Хроматографическая чистота превышает 99%.

Новый способ имеет ряд преимуществ, таких как:

1. Возможность промышленного масштабирования.

2. Получение продукта высокой чистоты.

3. Простота процесса.

4. Уменьшение числа стадий.

5. Экономичность.

1. Способ выделения и очистки макролида, характеризующийся тем, что неочищенный макролид или макролид-сырец, полученный ферментацией, обрабатывают не смешивающимся с водой растворителем, осуществляют концентрирование полученной смеси, которую обрабатывают газообразным аммиаком для осаждения примесей, отделяют примеси от фазы, содержащей макролид, концентрируют эту фазу, проводят ее хроматографирование на силикагеле, необязательно обращенно-фазовое или с предварительной обработкой силикагеля серебром, элюируют макролид с силикагеля и выделяют существенно очищенный макролид, при необходимости повторяют стадии хроматографирования, элюирования и выделения макролида с существенной степенью очистки.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что макролид выбран из такролимуса, иммуномицина или сиролимуса.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что не смешивающийся с водой растворитель выбран из группы, включающей углеводороды, гетероциклические соединения, простые или сложные эфиры.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что не смешивающийся с водой растворитель выбран из группы, включающей бензол, толуол, гексан, этилацетат, изобутилацетат или бутилацетат.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что очищенный макролид выделяют кристаллизацией или осаждением.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что кристаллизацию осуществляют с использованием растворителей, выбранных из этилацетата, диэтилацетата, ацетонитрила и гексана.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что после первого хроматографирования макролида из содержащей его фазы и элюции с силикагеля проводят концентрирование элюата, смешивание его с не смешивающимся с водой растворителем, выделение макролида в более чистой форме, после чего осуществляют его повторное хроматографирование на силикагеле, предварительно обработанном серебром, и элюирование с последующим выделением целевого продукта с существенной степенью очистки.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что после первого хроматографирования макролида из содержащей его фазы и элюции с силикагеля проводят концентрирование элюата, смешивание его с не смешивающимся с водой растворителем, выделение макролида в более чистой форме, после чего осуществляют его повторное хроматографирование на силикагеле с обращенной фазой и элюирование с последующим выделением целевого продукта с существенной степенью очистки.