Способ идентификации противоопухолевых целевых ферментов

Изобретение относится к биотехнологии. Идентифицируют фермент, используемый при получении препарата для доставки противораковых соединений, которые избирательно превращаются в активные вещества в опухолевой ткани или клетках. Для этого сравнивают уровни экспрессии генов в здоровой человеческой ткани или нормальных клетках с уровнями экспрессии генов в человеческой опухолевой ткани или клетках опухолевого происхождения. Затем выбирают фермент, имеющий в тканях или клетках опухолевого происхождения уровень экспрессии, более чем вдвое превышающий уровень экспрессии в нормальных клетках или в здоровой ткани. Изготавливают препарат для доставки противораковых соединений. Для этого культивируют клетки в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения, где в указанные клетки включена кДНК идентифицированного фермента. Далее определяют, представляет ли собой тестируемое соединение противораковое соединение, которое способно избирательно превращаться в активные вещества в опухолях. Применяют фермент для доставки противораковых соединений. Настоящее изобретение позволяет исключать побочные эффекты при лечении онкологических заболеваний. 3 н. и 11 з.п. ф-лы.

 

Настоящее изобретение относится к способу идентификации ферментов, которые преимущественно экспрессируются в некоторых опухолевых тканях по сравнению с быстро растущими нормальными клетками или тканями, применению указанных ферментов для разработки соединения, предназначенного для избирательного образования активного противоракового вещества в опухолевой ткани, соединениям, созданным на основе указанных ферментов, их фармацевтически приемлемым солям, а также фармацевтическим композициям на их основе.

Одной из наиболее серьезных и наиболее важных проблем в области лекарственной медицины являются побочные эффекты. Побочные эффекты лекарственных средств главным образом вызваны их неспецифическим действием; лекарства взаимодействуют и влияют не только на молекулы-мишени, но и на другие молекулы, играющие важную роль в поддерживании нормальных физиологических процессов. Другая важная причина побочных эффектов состоит в неспецифическом распределении лекарственных средств во многих тканях; лекарства внедряются не только в поврежденные ткани, но также и в другую ткань, которая не должна затрагиваться для сохранения нормальных физиологических функций. Молекулы-мишени большинства противораковых лекарственных средств повсеместно экспрессированы во многих тканях и не являются специфичными для определенной ткани. С другой стороны, заболевание обычно вызывается нарушением регуляции определенных молекул в определенных тканях. Таким образом, для исключения побочных эффектов необходимо установить способы, с помощью которых лекарства оказывают влияние на определенные молекулы только в конкретной ткани, ответственной за заболевание, и обеспечить лекарства, разработанные с помощью упомянутых способов.

Среди многих заболеваний при лечении онкологических больных побочные эффекты лекарственных средств имеют особенное значение. Цитотоксические лекарства широко используются для лечения рака, и их регулярное применение для химиотерапевтического лечения рака будет продолжаться, по меньшей мере, в течение следующего десятилетия. Однако применение цитотоксических лекарственных средств ограничивается их недостаточной эффективностью и тяжелыми побочными эффектами. В опухолевых тканях многие цитотоксические лекарства, например 5-FU, 2'-дезоксицитидины, метотрексат, камптотецины и таксаны, воздействуют на опухолевые клетки, находящиеся в S или М фазе клеточного цикла, т.е. во время синтеза ДНК или митоза. Однако растущие опухолевые клетки опухолевой ткани находятся в различных стадиях клеточного цикла, и лишь небольшая часть опухолевых клеток находится в S или М фазах. Поэтому время действия идеального лекарственного средства должно быть, по меньшей мере, большим, чем время, которое требуется для завершения одного клеточного цикла (длящегося 20-40 часов), а идеальным режимом дозирования цитотоксических лекарств является последовательное ежедневное или непрерывное лечение, направленное на воздействие на все раковые клетки, присутствие в опухолевой ткани. Однако лечение цитотоксическими лекарствами в таких режимах дозирования оказывает тяжелое токсическое действие на быстро растущие здоровые клетки, в особенности на кроветворные клетки-предшественницы и кишечные клетки крипта. Миелосупрессия, являющаяся следствием токсического воздействия на кроветворные клетки-предшественницы, является наиболее распространенным побочным эффектом действия цитотоксических лекарств и часто приводит к ухудшению иммунной реакции хозяина и эмбриональному инфицированию. При проявлении симптомов миелосупрессии обычно требуется 2-3 недели для восстановления после миелотоксичности, и этот факт служит основной причиной применения цитотоксических лекарств один раз каждые 3-4 недели. Однако такой режим прерывистой дозировки ответственен за недостаточную эффективность большинства существующих цитотоксических лекарств.

В настоящее время разрабатываются некоторые новые противоопухолевые агенты с новым типом действия. Однако им также присущи проблемы, связанные с безопасностью действия за счет недостаточной противоопухолевой селективности. По-видимому, основными факторами токсичности ингибиторов фарнезилтрансферазы и тирозинкиназных ингибиторов рецептора эпидермального фактора роста (EGF) являются миелотоксичность и кожные язвы соответственно. По-видимому, это связано с тем фактом, что целевой фермент или белок гиперэкспрессруются не только в опухолевой ткани, но также и в других здоровых тканях, например в костном мозге и коже.

С другой стороны, капецитабин (пероральный фторпиримидин) является цитотоксичным лекарством, которое последовательно превращается в активное лекарство 5-FU под действием ферментов, интенсивно экспрессирующихся в печени и опухолях, но не в растущих клетках костного мозга [Miva. M. et al. Design of oral fluoropyrimidine carbamate, capecitabine, which generates 5-furuoloyracil selectiviely in tumors by enzymes concentrated in human liver and cancer tissue. Eur. J. Cancer 34, 1274-1281 (1998)]. В результате рассматриваемый лекарственный препарат обеспечивает высокие концентрации 5-FU непосредственно в опухолевой ткани и демонстрирует улучшенные профили эффективности по сравнению с профилями 5-FU. Кроме этого, рассматриваемый препарат обладает низкой миелотоксичностью. Такие характеристики позволяют использовать такой препарат в ежедневном лечении с высокими дозировками даже в течение длительного времени. В настоящее время этот препарат назначают для лечения рака груди, колоректального рака и других видов онкологических заболеваний. Несмотря на это, все еще трудно идентифицировать противораковые лекарственные средства повышенной эффективности и пределами безопасного применения, подобные капецитабину, поскольку не разработан подход к точному определению ферментов и/или белков, среди тех, что экспрессируются в различных тканях.

Настоящее изобретение относится к способам обнаружения ферментов для конструирования соединений, способных избирательно превращаться в активные вещества в опухолях, но не в растущих здоровых клетках (далее в тексте противоопухолевые целевые цитотоксиканты, (ТТС)), в особенности гранулоцитных предшественников, которые преимущественно присутствуют в костном мозге. Противоопухолевые цитотоксиканты должны избирательно воздействовать на опухоль лишь с незначительной миелотоксичностью. Такие соединения должны без опасений назначаться в высоких дозах в течение длительного времени, обеспечивая более высокую безопасность и эффективность, чем существующие цитотоксиканты. Рассматриваемые соединения могут уменьшить госпитализацию, связанную с проявлением побочных эффектов, и могут безопасно назначаться амбулаторным больным. Другие преимущества противоопухолевых целевых цитотоксикантов состоят в том, что они позволяют проводить индивидуальные оздоровительные процедуры (адаптационная терапия) в результате измерения уровней экспрессии их активационных ферментов (ТТС-активационные ферменты). Индивидуальные опухоли, экспрессирующие высокие уровни ТТС-активационных ферментов, могут эффективно генерировать активные лекарства из противоопухолевых цитотоксикантов, и поэтому они могут обладать высокой чувствительностью к противоопухолевым цитотоксикантам.

Цель настоящего изобретения заключается в разработке способов обнаружения ферментов для получения противораковых соединений, способных избирательно превращаться в активные вещества в опухолях, причем такие способы предусматривают измерение уровней экспрессии генов и/или белков в человеческой ткани и/или клетках нормального или опухолевого происхождения, сравненение измеренных уровней экспрессии и выбор ферментов, в которых уровни содержания мРНК и/или белков в опухолевой ткани более чем в два раза выше, чем в нормальных растущих кроветворных предшественниках, кишечнике и/или коже.

Другая цель настоящего изобретения заключается в разработке способов идентификации противораковых соединений, способных избирательно превращаться в активные вещества в опухолях, включающих стадии генерации клеток, экспрессирующих фермент с более чем вдвое большим содержанием белка в опухолевой ткани, по сравнению со здоровыми клетками и тканями, и определения активностей факторов роста указанных противораковых соединений.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в разработке противораковых соединений формулы (I)

X-Y-Q (I),

в которой

Х представляет собой профрагмент, предназначенный для генерации активного противоракового вещества (Q-Y-H) непосредственно в опухолях под воздействием ферментов настоящего изобретения;

Q-Y- представляет собой радикал, производный активного противоракового вещества (Q-Y-H), в котором Y представляет собой

-О-, -S- или -N-,

и их фармацевтически применимых солей.

Другая цель настоящего изобретения заключается в разработке противораковых соединений, представленных формулой (II),

в которой

Q и Y имеют указанные выше значения,

R0 представляет собой боковую цепь природной или синтетической аминокислоты,

Z представляет собой (С1-С3)алкилен или группу -О-СН(R3)-, в которой R3 представляет собой водород или неразветвленный (С1-С4)алкил,

R1 представляет собой водород или метил, и

R2 представляет собой водород, разветвленный (С3-С10)алкил или (С3-С8)циклоалкил,

или их фармацевтически применимых солей.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в разработке противораковых соединений, представленных формулой (III),

в которой

R0 имеет указанные выше значения,

R4 представляет собой бензоил или трет-бутоксикарбонил,

R5 представляет собой водород или ацетил,

или их фармацевтически применимых солей.

Другая цель настоящего изобретения заключается в разработке противораковых соединений, представленных формулой (IV),

в которой

R0, R1, R2 и R3 имеют указанные выше значения,

R6 представляет собой водород, фтор, гидроксил или циано,

R7 представляет собой водород, фтор или гидрокси,

или R6 и R7 совместно образуют метилиден или фторметилиден,

R8 представляет собой водород или этинил,

R9 представляет собой водород, фтор, винил или этинил, и

R10 представляет собой водород или гидрокси

или их фармацевтически применимых солей.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении противораковых соединений, представленных формулой (V),

в которой m представляет собой цело число, равное 2 или 3,

R0, R2, R6, R7, R8, R9 и R10 имеют указанные выше значения,

и их фармацевтически применимых солей.

Другая цель настоящего изобретения предусматривает противораковые соединения, представленные формулой (VI),

в которой

m представляет собой целое число в интервале 1-3,

n представляет собой целое число, равное 0 или 1,

R0 имеет указанные выше значения,

R11 представляет собой водород или фтор,

R12 представляет собой водород, фтор, метил или гидрокси,

R13 представляет собой водород, амино, нитро или (диметиламино)метил,

R14 представляет собой водород, (С1-С4)алкил, 4-метилпиперазинилметил, трет-бутоксииминометил, или R13 и R14, либо R11 и R12, взятые вместе, могут образовывать пяти- или шестичленное кольцо, которое может содержать один или два гетероатома и может быть необязательно замещено (С1-С8)алкилом, амино, (С1-С8)алкиламино и ди-(С1-С4)алкиламино,

или их фармацевтически применимые соли.

Используемый в тексте настоящего описания термин «(С1-С3)алкилен» относится к бирадикальной разветвленной или неразветвленной углеводородной цепочке, содержащей 1-3 углеродных атома, например к метилену, этилену, пропилену и триметилену, наиболее предпочтительно к этилену.

В тексте настоящего изобретения термин "-О-СН(R3)-" относится к группам -О-СН2-, -О-СН(СН3)-, -О-СН(СН2СН3)-, -О-СН(СН2СН2СН3)-, -О-СН(СН2СН2СН2СН3)-; предпочтительно -О-СН2-, -О-СН(СН3)- и наиболее предпочтительно к -О-СН(СН3)-.

Термин «ацетил» относится к группе СН3СО-.

Термин «циклоалкил» обозначает насыщенную, циклическую углеводородную группу, содержащую 3-7 углеродных атомов, предпочтительно 4-7 углеродных атомов, более предпочтительно 4-6 углеродных атомов, например циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил и т.п.

Термин «гетероатом» относится к атомам кислорода, азота и серы.

Термин «моно- и диалкиламино» относится к указанным ниже аминогруппам, замещенным алкилом или диалкилом, например к алкил-NH- и диалкил-N-.

Термин «(С1-С8)алкиламино» относится к метиламино, этиламино, пропиламино, изопропиламино, бутиламино, третбутиламино, пентиламино, гексиламино, гептиламино и октиламино; предпочтительно к бутиламино и пентиламино группам.

Термин «ди-(С1-С4)алкиламино» относится к диметиламино, диэтиламино, дипропиламино, дибутиламино; предпочтительно к диметиламино и диэтиламино группам.

В определение R0 формулы (II) термин «боковая цепь природной аминокислоты» предпочтительно обозначает такую боковую цепь природных аминокислот, как метил, изопропил, 2-метилпропил, 1-метилпропил, бензил, индол-3-илметил, 2-(метилтио)этил и 4-аминобутил, 3-аминопропил; предпочтительно обозначает боковую цепь природной липофильной аминокислоты, например метил, 2-метилпропил, бензил и индол-3-метил.

Термин «боковая цепь синтетической аминокислоты» предпочтительно обозначает (С5-С12)алкил, циклоалкилметил, замещенный или незамещенный арилметил, (циклоалкилтио)метил, алкилтио-(СН2)r-, где r представляет собой целое число, равное 1 или 2, и т.д.

В приведенном выше тексте термин «(С5-С12)алкил» обозначает неразветвленную или разветвленную алкильную цепь, содержащую 5-12 углеродных атомов; более предпочтительно неразветвленную (С8-С12)алкильную цепь, например н-октил, нонил, децил, ундецил и додецил.

Термин "алкилтио-(СН2)r-" обозначает алкилтиометил или алкилтиоэтил, содержащий нормальную или разветвленную алкильную цепь, включающую 2-10 углеродных атомов, например этилтиометил, этилтиоэтил, н-пропилтиометил, н-бутилтиометил, н-пентилтиометил, н-октилтиометил, н-нонилтиометил, н-децилтиометил, третбутилтиометил и т.п.; более предпочтительно этилтиоэтил, н-пропилтиометил и н-бутилтиометил.

Термин «замещенный или незамещенный арилметил» предпочтительно обозначает 4-фенилбензил, нафт-2-илметил, [4-(4-гидроксифенокси)фенил]метил и (4-низший алкоксифенил)метил, причем в рассматриваемом термине сочетание «низшая алкокси» обозначает алкильную цепь нормального или изостроения, содержащую 1-6 углеродных атомов; предпочтительно метокси, этокси, пропокси, бутокси и изопропокси. Наиболее предпочтительными значениями термина «замещенный или незамещенный арилметил» является 4-фенилбензил, нафт-2-илметил, (4-метоксифенил)метил и [4-(4-гидроксифенокси)фенил]метил.

Используемый в определении R2 формулы (II) термин «разветвленный (С3-С10)алкил» обозначает разветвленную алкильную цепь, содержащую 3-6 углеродных атомов, предпочтительно изопроприл, 2-бутил, 3-пентил, неопентил и т.п.; более предпочтительно изопропил и 3-пентил. Термин «(С3-С8)циклоалкил» обозначает углеродное кольцо, состоящее из 3-8 углеродных атомов, например циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т.п.; более предпочтительно циклопентил и циклогексил.

В определении R3 формулы (II) термин «разветвленный (С1-С4)алкил» обозначает разветвленную алкильную группу, содержащую 1-4 углеродных атомов, предпочтительно метил, этил и н-пропил.

Термин «фармацевтичски применимая соль» относится к солям, сохраняющим биологическую эффективность и свойства свободных оснований и свободных кислот, которые приемлемы в биологическом или ином отношении. Рассматриваемые соли получают путем взаимодействия с такими неорганическими кислотами, как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, и т.п., и такими органическими кислотами, как уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота, N-ацетилцистеин и т.д. Кроме этого, рассматриваемые соли могут быть получены присоединением неорганического или органического основания к свободной кислоте. Соли, являющие производными неорганического основания, без конкретных ограничений, включают соли натрия, калия, лития, аммония, кальция, магния и т.д. Соли, являющие производными органического основания, без конкретных ограничений, включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, замещенных аминов, включая природные замещенные амины, циклические амины и основные ионообменные смолы, например изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин, этаноламин, лизин, аргинин, N-этилпиперидин, пиперидин, полииминовые смолы и т.п. Предпочтительные соли представляют собой гидрохлориды. Соединения, не содержащие солей, могут быть получены способами, известными в данной области техники.

В контексте настоящего изобретения фраза «про-фрагмент (Х)» обозначает уходящую группу, которая отщепляется в опухолях под действием упомянутого выше фермента после применения соединения формулы (I) или (II), например Х представляет собой группу формулы:

Используемый в тексте изобретения термин «таксаны» обозначает таксол [Front. Biotechnol. Pharm. (2000), 1, 336-348], таксорет [J.Med. Aromat. Sci. (2001), 22/4А-23/1А 4-5], IDN 5109 [Chirality, (2000), 12 (5/6), 431-441], BMS 188797 [Clinical Cancer Research. 5 (suppl.), 3859, Nov 1999], BMS184476 [L. Clinical Oncology 19: 2493-2503, 1 May 2001].

Термин «камптотецины» [(a) Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principle and Practice, 2nd Ed., Lippincott-Ravenmeans, page 463-484, (b) Biochim. Biophys. Acta (1998), 1400 (1-3), 107-119] обозначает любые соединения со структурой камптотецина, например камптотецин, топотекан, SN-38, 9-аминокамптотецин, 9-нитрокамптотецин, луртотекан [Br. J. Cancer (1998), 78 (10), 1329-1336], DX-8951f [Ann. N.Y. Acad. Sci. (2000), 922 (Camptotecins), 260-273], BN-80915 [Anti-cancer Drugs (2001), 12(1), 9-19] и т.д.

Термин «противораковые нуклеозиды» обозначает производное цитидина [Cancer Chemotherapy and Biotherapy: 2nd Ed., Lippincott-Ravenmeans, page 213-233], например, DFDC (гемцитабин), DMDC [Clin. Cancer Res. (2000), 6(6), 2288-2294], FMDC [Curr.Opin. Invest. Drugs (PharmaPress Ltd.) (2000), 1(1), 135-140], Ara-C, децитабин [IDrugs (2000), 3(12), 1525-1533] троксацитабин [Clin.Cancer Res. (2000), 6(4), 1574-1588], 2'-циано-2'-дезоксицитидин (CNDAC), 3'-этинилцитидин (TAS106) [Jpn.J. Cancer Res. (2001), 92 (3), 343-351], 5-фтор-5'-дезоксицитидин [Bioorg. Med. Che. Lett., (2000), 8, 1697-1706], 5-винил-5'-дезоксицитидин или производное аденозина [Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principle and Prectice, 2nd Ed., Lippincott-Ravenmeans, page 235-252], например флударабин, кладрибин и т.п.

Термин «доластатины» обозначает доластатин 10 [Curr. Pharm. Des. (1999), 5(3), 139-162], доластатин 14, TZT1027 [Drugs Future (1999), 24(4), 404-409], цемадотин и т.п.

Термин «антрациклины» [Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principle and Prectice, 2nd Ed., Lippincott-Ravenmeans, page 409-434] обозначает адриамицин, дауномицин, идарубицин и т.п.

Термин «ингибиторы фарнезилтрансферазы» обозначает R115777 [Cancer Res. (2001), 61(1), 131-137] и т.д.

Термин «тирозинкиназные ингибиторы рецептора EGF» обозначает ZD 1839 [Drugs (2000), 60 (Suppl.1), 33-40], CP 358774 (OSI-774) [J. Pharmacol. Exp. Thr. (1999), 291 (2), 739-748], PD 158780 [J. Mad, Chem. (2001), 44(3), 429-440], GW2016 и т.д.

Приведенные ниже символы и сокращения, используемые в тексте описания, относятся к следующим соединениям:

а) таксол означает

6,12b-бис(ацетилокси)-12-(бензоилокси)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-додекагидро-4,11-дигидрокси-4а,8,13,13-тетраметил-5-оксо-7,11-метано-1Н-циклодекса[3,4]бенз[1,2-b]оксет-9-иловый эфир [2aR-[2aα,4β,4αβ,6β,9α(αR*,βS*),11α,12α,12aα,12bα]-β-(бензоиламино)-α-гидроксибензолпропановой кислоты,

b) таксотер означает

12b-(ацетилокси)-12-(бензоилокси)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-додекагидро-4,6,11-тригидрокси-4а,8,13,13-тетраметил-5-оксо-7,11-метано-1Н-циклододека[3,4]бенз[1,2-b]оксет-9-иловый эфир [2aR-[2aα,4β,4aα,6β,9α(αR*,βS*,11α,12α,12aα,12bα)]-β-[[(1,1-диметилэтокси)карбонил]амино)-α-гидроксибензолпропановой кислоты,

с) IDN 5109 означает

(3aS,4R,7R,8aS,9S,10aR,12aS,12bR,13S,13aS)-7,12a-бис(ацетилокси)-13-бензилокси)-3а,4,7,8,8а,9,10,10а,12,12а,12b,13-додекагидро-9-гидрокси-5,8а,14,14-тетраметил-2,8-диоксо-6,13а-метано-13аН-оксето[2",3":5',6']бензо[1',2':4,5]циклодека[1,2-d]-1,3-диоксол-4-иловый эфир (2R,3S)-3-[[(1,1-диметилэтокси)карбонил]амино]-2-гидрокси-5-метил-4-гексеновой кислоты,

d) BMS 188797 означает

(2aR,4S,4aS,6R,9s,11S,12S,12aR,12bS)-6-(ацетилокси)-12-(бензоилокси)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-додекагидро-4,11-дигидрокси-12b-[(метоксикарбонил)окси]-4а,8,13,13-тетраметил-5-оксо-7,11-метано-1Н-циклодека[3,4]бенз[1,2-b]оксет-9-иловый эфир (2R,3S)-β-(бензоиламино)-α-гидроксибензолпропановой кислоты, и

е) BMS 184476

(2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-бис(ацетилокси)-12-(бензоилокси)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-додекагидро-11-гидрокси-4a,8,13,13-тетраметил-4-[(метилтио)метокси]-5-оксо-7,11-метано-1Н-циклодека[3,4]бенз[1,2-b]оксет-9-иловый эфир (2R,3S)-β-(бензоиламино)-α-гидроксибензолпропановой кислоты,

f) камптотецин означает

4(S)-этил-4-гидрокси-1Н-пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2b]хинолин-3,14(4Н,12Н)-дион,

g) топотекан означает

моногидрохлорид (4S)-10-[(диметиламино)метил]-4-этил-4,9-дигидрокси-1Н-пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-3,14(4Н,12Н)-диона,

h) DX-8951f означает

(1S,9S)-1-амино-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-10,13-дион,

i) BN-80915 означает

5(R)-этил-9,10-дифтор-1,4,5,13-тетрагидро-5-гидрокси-3Н,15Н-оксепино[3',4':6,7]индолизино [1,2-b]хинолин-3,15-дион,

j) 9-аминокамптотецин означает

(S)-10-амино-4-этил-4-гидрокси-1Н-пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-3,14(4Н,12Н)-дион,

к) 9-нитрокамптотецин означает

4(S)-этил-4-гидрокси-10-нитро-1Н-пирано[3',4':6,7]-индолизино[1,2-b]хинолин-3,14(4Н,12Н)-дион,

l) DFDC означает

2'-дезокси-2',2'-дифторцитидин,

m) DMDC означает

2'-дезокси-2'-метилиденцитидин,

n) FMDC означает

(Е)-2'-дезокси-2'-(фторметилен)цитидин,

о) Ara-C означает

1-(β-D-арабинофуранозил)цитозин,

p) децитабин означает

4-амино-1-(2-дезокси-β-D-эритропентофуранозил)-1,3,5-триазин-2(1Н)-он,

q) троксацитабин означает

4-амино-1-[(2S,4S)-2-(гидроксиметил)-1,3-диоксолан-4-ил]-2(1H)-пиримидинон,

r) флударабин означает

2-фтор-9-(5-О-фосфоно-β-D-арабинофуранозил)-9Н-пурин-6-амин,

s) кладрибин означает

2-хлор-2'-дезоксиаденозин,

t) доластатин 10 означает

N,N-диметил-L-валил-N-[(1S,2R)-2-метокси-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-[[(1S)-2-фенил-1-(2-тиазолил)этил]амино]пропил]-1-пирролидинил]-1-[(1S)-1-метилпропил]-4-оксобутил]-N-метил-L-валинамид,

u) доластатин 14 означает

цикло[N-метилаланил-(2Е,4Е,10Е)-15-гидрокси-7-метокси-2-метил-2,4,10-гексадекатриеноил-L-валил-N-метил-L-фенилаланил-N-метил-L-валил-N-метил-L-валил-L-пролил-N2-метиласпарагинил],

v) доластатин 15 означает

(1S)-1-[[(2S)-2,5-дигидро-3-метокси-5-оксо-2-(фенилметил)-1Н-пиррол-1-ил]карбонил]-2-метилпропиловый эфир N,N-диметил-L-валил-L-валил-N-метил-L-валил-L-пролил-L-пролина,

w) TZT 1027 означает

N,N-диметил-L-валил-N-[(1S,2R)-2-метокси-4-[(2S)-2-[1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-[(2-фенилэтил)амино]пропил]-1-пирролидинил]-1-[(1S)-1-метилпропил]-4-оксобутил]-N-метил-L-валинамид,

х) цемадотин означает

N,N-диметил-L-валил-L-валил-N-метил-L-валил-L-пролил-N-(фенилметил)-L-пролинамид,

y) адриамицин означает

гидрохлорид (8S,10S)-10-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-L-ликсогексопиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксиацетил)-1-метоксинафтацен-5,12-диона,

z) дауномицин означает

гидрохлорид 8-ацетил-10-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-L-ликсогексопиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксиацетил)-1-метоксинафтацен-5,12-диона,

аа) идарубицин означает

(7S,9S)-9-ацетил-7-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-L-ликсогексопиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,9,11-тригидроксинафтацен-5,12-дион

bb) ZD 1839 означает

N-(3-хлор-4-фторфенил)-7-метокси-6-[3-(4-морфолинил)пропокси]-4-хиназолинамин,

сс) CP 358774 означает

N-(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин,

dd) PD 158780 означает

N4-(3-бромфенил)-N6-метилпиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамин,

ее) GW 2016 означает

N-(3-хлор-4-((3-фторбензил)окси)фенил)-6-(5-(((2-метилсульфонил)этил)амино)метил)-2-фурил)-4-хиназолинамин,

ff) R 115777 означает

6-[1-амино-1-(4-хлорфенил)-1-(1-метилимидазол-5-ил)метил]-4-(3-хлорфенил)-1-метилхинолин-2(1H)-он.

Согласно настоящему изобретению ферменты, которые предпочтительно экспрессируются в опухолевой ткани, избирательно активируя соединения, идентифицируют путем анализа уровней мРНК и/или белков в человеческой ткани. Затем из известных и/или новых цитотоксических лекарств конструируют соединения путем добавления фрагментов, которые маскируют биологические активности цитотоксических лекарств, но распознаются и избирательно удаляются указанными ферментами в опухолевых тканях-мишенях.

Нормальные и опухолевые человеческие ткани, используемые для анализа, включают ткань мозга, пищевода, сердца, легких, молочной железы, желудка, печени, поджелудочной железы, желчного пузыря, кишечника, толстой кишки, прямой кишки, почек, яичника, матки, яичка, предстательной железы, кожи, кости, костного мозга и крови. Предпочтительно предшественники гранулоцитов в качестве нормальных клеток используют для сравнения уровней экспрессии генов и/или белков в опухолевой и нормальной ткани, выбора генов и/или белков, которые предпочтительно экспрессируются в опухолевой ткани. После резекции человеческой ткани в ходе хирургической операции ее немедленно замораживают в жидком азоте или ацетоне, содержащим сухой лед, с добавлением или без добавления соединения О.С.Т. (Sakura-Seiki, Tokyo, Japan, Catalog № 4583) и хранят при температуре ниже -70°С или -80°С до последующего использования.

Если опухолевая ткань содержит значительное количество нормальных клеток, опухолевые клетки выделяют из ткани, залитой в ОСТ пролекарство, с помощью возбуждаемой лазером микродессекции (Ohyama H. et al. Laser capture microdessection - generated target sample for high-density oligonucleotide array hybridization. Biotechniques 29, 530-536 (2000), Leethanakul C. et al., Gene expression profiles in squamous cell carcinomas of the oral cavity: use of laser capture microdissection for the construction and analysis of stage-specific cDNA libraries. Oral Oncol 36, 474-83 (2000)). Для проведения микродессекции замороженные срезы толщиной 6 и 10 микрометров фиксируют 70% раствором этанола, окрашенного гематоксилином Майера, и заем дегидратируют в присутствии градиента этанола и ксилола. Микродессекцию опухолевых клеток проводят с помощью устройства для микродессекции с лазерным захватом (Olympus, Tokyo, Japan, Model LM200) и РНК в опухолевых клетках экстрагируют с использованием выпускаемого промышленностью набора (Micro RNA Isolation Kit, Stratagene, La Jolla, CA, USA).

Предшественников человеческих гранулоцитов, которые обладают наибольшей восприимчивостью к цитотоксическим лекарствам, готовили размножением CD34-положительных моноядерных клеток на мышиных стромальных клетках в присутствии некоторых цитокинов, включающих Flt3-лиганд, фактор стволовых клеток (SCF) и тромбопоэтин (TPO). CD34-положительные моноядерные клетки в крови человеческой пуповины или в костном мозге инкубировали и связывали с анти-CD34 антителом, коньюгированным с магнитными шариками, и подвергали очистке путем классификации клеток в магнитном поле (MACS) (Miltanyi, et al. In: Hematopoietic stem cells: The mulhouse manual, 201-213, AlphaMed press, Dayton (1994)). Очищенные CD34-моноядерные клетки, сохраняющие способность к дифференцировке в различные типы кроветворных клеток, размножали на чашах для культивирования и процентное количество предшественников гранулоцитов в культуре подтверждали изучением экспрессии CD34 после окрашивания клеток флуоресцентно-конъюгированным антителом против CD34. Обычно более 90% клеток в культуре становились предшественниками CD34-положительных гранулоцитов после размножения. Способность таких предшественников гранулоцитов к дифференцировке в миелобласты и затем в миелоциты и гранулоциты тестировали путем их обработки фактором стимуляции гранулоцитных колоний (G-CSF) или интерлейкином 3 (IL3) в комбинации с фактором стимуляции гранулоцит-макрофаговой колонии (GM-CSF) и G-CSF. Линию и стадии дифференцировки клеток изучали мониторингом таких антигенов поверхности клеток, как CD11, CD13 и CD15, методом флуоресцентной классификации клеток (FACS) с помощью FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA) и/или методом микроскопии после окрашивания клеток красителем по Гимза (Diff-Quick) (Midori-Juji, Co. Osaka, Japan, Catalog № 16920) или красителем Leishman (Merck, Darmstadt, Germany, Catalog № 105387 0500). Данные FACS анализировали с помощью программного обеспечения FACSCalibur CELLQuest, в соответствии с руководством FACSCalibur, FACSStation ver.1.1. (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA).

Ферменты и белки, экспрессирующиеся в некоторых опухолевых тканях, определяли измерением содержания их мРНК и/или белков в тканях и клетках человека. Уровни экспрессии мРНК определяли такими известными способами, как анализ ДНК на микроматрицах (Schena, M. Et al. Quantitative minitoring of gene expression patterns with complementary DNA microarray, Science 270, 467-470 (1995), and Lipshutz, R.J. et al. High density synthetic oligonucleotide arrays. Nature Genetics 21, 20-24 (1999)), полимеразная реакция с обратной транскрипцией (далее RT-PCR) (Weis, J.H. et al. Detection of rare mRNAs via quantitative RT-PCR, Trend Genetics 8, 263-264 (1992), Bustin, S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain traction assays, J. Mol. Endocrinol. 25, 169-193 (2000)), нозерн-блоттинг и гибридизация in situ (Parker, R.M., Barnes N.M. mRNA: detection in situ and northern hybridization, Methods Mol. Biol. 106, 247-283 (1999), анализ на защиту РНК (Hod, Y.A. Samplified ribonuclease protection assay, Biotechniques 13, 8520854 (1992), Saccomanno, C.F. et al. A faster ribonuclease protection assay, Biotechniques 13, 846-850 (1992)), вестерн-блоттинг (Towbin, H. et al. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets, Proc. Natl. Acad. Sci. US A 764350-4354 (1979), Burnette, W,N, Western blotting: Electrophoretic transfer of proteins form sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radioiodinated protein A, Anal. Biochem. 112, 195-2-3 (1981)), анализ ELISA (Engvall E, Perlman, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay of immunoglobulin G, Immunochemistry 8: 871-879 (1971) и анализ белков на матрицах (Merchant, M, Weinberger, S.R. Review: Recent advancements in surface-enhanced laser desorption|ionization-time of light-mass spectrometry, Electrophoresis 21, 1164-1177 (2000), Paweletz, C.P. et al. Rapid protein display profiling of cancer progression directly from human tissue using a protein biochip, Drug Development Research 49, 34-42 (2000)). Для высокопроизводительного и количественного анализа экспрессии мРНК предпочтительно использовать такие методы, как анализ ДНК на микроматрицах и RT-PCR соответственно.

Для анализа ДНК на микроматрицах РНК вырезают из мелких кусков ткани и/или клеток, которые были заморожены в жидком азоте или системе ацетон-сухой лед, и хранились при температуре -70 или -80°С. Ткани или клетки гомогенизируют и РНК в ткани и клеточные гомогенаты экстрагируют хлороформом и осаждают изопропиловым спиртом. Препарат РНК, загрязненный ДНК, переваривают с DNase I и РНК дополнительно очищают гель-фильтрационной колонной хроматографией. Вывод о качестве РНК делают из соотношения между 28S и 18S рибосомальной РНК после электрофореза на агарозном геле и окрашивания РНК бромистым этидием.

Используя в качестве шаблона полную РНК, проводят синтез кДНК в присутствии олиго-dT праймера (Sawady Technology, Tokyo, Japan), который содержит последовательности Т7 промотора и обратной транскриптазы. Полученную кДНК экстрагируют смесью фенола и хлорформа и отделяют от коротких олигонулкеотидов методом гель-фильтрационной колонной хроматографии.

Используя в качестве матрицы кДНК, кРНК синтезируют с использованием Т7 полимеразы, аденозин трифосфата (АТР), трифосфата гуанозина (GTP), трифосфата цитидина (СТР), трифосфата уридина (UTP), Bio-11CTP и Bio-16 UTP (ENZO Diagnostics, Farmingdale, USA, Catalog № 42818 and 42814 соответственно) при 37°С в течение 6 часов. Полученную в результате кРНК отделяют от нуклеотидов методом гель-фильтрационной колонной хроматографии. Вывод о качестве кРНК делают из длины кРНК после электрофореза на агарозном геле и окрашивания кРНК бромистым этидием.

Анализ ДНК на микроматрицах проводят в присутствии олигонуклеотидных чипов высокой плотности (матрица HuGeneFL, Affymetrix, Santa Clara, USA, Catalog № 510137) (Lipshutz, R.L. et al. Nature Genet. 21, 20-24 (1999)) в соответствии с инструкциями производителя. Фрагментацию кРНК при 95°С, гибридизацию и промывку осуществляют в соответствии с инструкциями производителя. Каждый пиксель регистрируют с помощью лазерного сканера (Affymetrix, Santa Clara, USA) и уровни экспрессии каждой кДНК и достоверность определения (запрос на присутствие/отсутствие) рассчитывают с помощью программного обеспечения Affymetrix GeneChip ver.3. и Affymetrix Microarray Suite ver. 4.0.

Помимо анализа ДНК на микроматрицах, другие методы, включающие RT-PCR (Weis,J.H. et al. Detection of rare mRNAs via quantitative RT-PCR, Trend Genetics 8, 263-264 (1992), and Bustin, S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain traction assays, J. Mol. Endocrinol. 25, 169-193 (2000)), нозерн-блоттинг и гибридизацию in situ (Parker, R.M., Barnes N.M. mRNA: detection in situ and northern hybridization, Methods Mol. Biol. 106, 247-283 (1999)), дифференциальное отображение (Zhu, W, and Liang, P. Detection and isolation of differentially expressed genes by differential display, Methods Mol. Biol. 68, 211-20 (1997), Liang, P., Pardee A.D. Differential display of euceriotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 257, 967-971 (1992)), анализ с защитой РНК (Hod, Y.A. Samplified ribonuclease protection assay, Biotechniques 13, 8520854 (1992), Saccomanno, C.F. et al. A faster ribonuclease protection assay, Biotechniques 13, 846-850 (1992)), анализ белков на матрице ((Merchant, M, Weinberger, S.R. Review: Recent advancements in surface-enhanced laser desorption/ionization-time of light-mass spectrometry, Electrophoresis 21, 1164-1177 (2000), Paweletz, C.P. et al. Rapid protein display profiling of cancer progression directly from human tissue using a protein biochip, Drug Development Research 49, 34-42 (2000)), вестерн-блоттинг (Towbin, H. et al. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets, Proc. Natl. Acad. Sci. US A 764350-4354 (1979), Burnette, W,N, Western blotting: Electrophoretic transfer of proteins form sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radioiodinated protein A, Anal. Biochem. 112, 195-2-3 (1981)), двухмерный гель-электрофорез (O'farrell, P.H. High-resolution two-dimensional electrophoresis of protein. L. Biol. Chem. 250: 4007-4021 (1975)), анализ ELISA (Engwall, E., Perlman, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 8: 871-879 (1971)), также могут использоваться для определения уровней содержания мРНК и/или белков.

Ферменты и/или белки, которые преимущественно экспрессируются в некоторых опухолях, но не в предшественниках гранулоцитов и других нормальных тканях, идентфицируют путем сравнения уровней содержания мРНК и белков в опухолевой ткани с соответствующими значениями в нормальной ткани. Гены и/или белки, уровни экспрессии которых в некоторых опухолях и предшественниках гранулоцитов отличаются более чем вдвое, выбирают в качестве генов-кандидатов для ферментов и/или белков, подходящих для активации ТТС. Более предпочтительны те гены и/или белки, которые демонстрируют наибольшие различия в уровнях экспрессии между экспрессией в некоторых опухолях и предшественниках гранулоцитов. После этого уровни мРНК, продемонстрировавшие высокую экспрессию в некоторых опухолевых тканях, но не в предшественниках гранулоцитов, сравнивают с соответствующими значениями в других нормальных тканях, в особенности с нормальной печенью, поскольку печень является главным органом, ответственным за метаболизм большинства лекарственных средств. Выбирают те мРНК, уровни которых в некоторых опухолевых тканях выше соответствующих значений в предшественниках гранулоцитов и других нормальных тканях, особенно в печени.

Дополнительную селекцию проводят среди ферментов и/или белков, выбранных в соответствии с различием в уровнях экспрессии между некоторыми опухолевыми тканями и предшественниками гранулоцитов и другими нормальными тканями, например печенью, обладающих относительно широким спектром специфичности в отношении субстрата и механизмом ферментной реакции, подходящим для конструирования соединения.

Такие ферменты включают фосфолипазу С, микросомальную дипептидазу, арилсульфатазу А, DT-диафоразу, пирролин 5'-карбоксиредуктазу, дегидродиолдегидрогеназу, карбонилредуктазу, лизилгидроксилазу, пролидазу, дигидропиримидиназу, глутамин:фруктоза-6-фосфат амидотрансферазу, UDP-галактозакерамидгалактозилтрансферазу, лизилоксидазу, энолазу, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу, стеароил-кофермент А десатуразу, эпоксидгидролазу и альдолазу С.

Более предпочтительные ферменты для конструирования ТТС представляют собой микросомальные дипептидазы, фосфолипазу С, DT-диафоразу, дигидродиолдегидрогеназу, пирролин 5'-карбоксиредуктазу, карбонилредуктазу, лизилгидролазу или матричные металлопротеиназы.

Рассматриваемые ферменты могут использоваться для создания противораковых соединений формулы (I)

X-Y-Q (I),

в которой

Х представляет собой про-фрагмент, предназначенный для избирательной генерации активного противоракового вещества (Q-Y-H) в опухолях с помощью ферментов, обнаруженных способом настоящего изобретения; (Q-Y-) представляет собой радикал, происходящий из активного противоракового вещества (Q-Y-H), в котором Y представляет собой -О-, -S- или -N-.

Ниже соединения формулы (I) описываются более подробно. Активное противораковое вещество (Q-Y-H) может представлять собой любой противораковый агент. Это вещество может быть соединено с про-фрагментом Х через группу -Y-H-, такую как амино, гидрокси или сульфгидрильная группа в структуре (Q-Y-H), таким образом, что может происходить спонтанное выделение активного противоракового вещества под воздействием фермента, обнаруженного с помощью способов настоящего изобретения. Более конкретно, (Q-Y-H) представляет собой такой цитотоксический агент, как таксан, камптотецин, противораковый нуклеозид, доластатин, а также антрациклин и ингибитор фарнезилтрансферазы, тирозинкиназный ингибитор рецептора EGF и т.п.

Предпочтительными веществами являются соединения, в которых активное противораковое вещество (Q-Y-H) представляет собой таксан, выбранный из группы, состоящей из

а) таксола

6,12b-бис(ацетилокси)-12-(бензоилокси)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-додекагидро-4,11-дигидрокси-4а,8,13,13-тетраметил-5-оксо-7,11-метано-1Н-циклодека[3,4]бенз[1,2-b]оксет-9-иловый эфир [2aR-[2aα,4α,4αβ,6β,9α(αR*,βS*),11α,12α,12aα,12bα]-β-(бензоиламино)-α-гидроксибензолпропановой кислоты,

b) таксотера

12b-(ацетилокси)-12-(бензоилокси)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-додекагидро-4,6,11-тригидрокси-4а,8,13,13-тетраметил-5-оксо-7,11-метано-1Н-циклододека[3,4]бенз[1,2-b]оксет-9-иловый эфир [2aR-[2aα,4β,4aα,6β,9α(αR*,βS*,11α,12α,12aα,12bα)]-β-[[(1,1-диметилэтокси)карбонил]амино)-α-гидроксибензолпропановой кислоты,

с) IDN 5109

(3aS,4R,7R,8aS,9S,10aR,12aS,12bR,13S,13aS)-7,12a-бис(ацетилокси)-13-бензилокси)-3а,4,7,8,8а,9,10,10а,12,12а,12b,13-додекагидро-9-гидрокси-5,8а,14,14-тетраметил-2,8-диоксо-6,13а-метано-13аН-оксето[2",3":5',6']бензо[1',2':4,5]циклодека[1,2-d]-1,3-диоксол-4-иловый эфир (2R,3S)-3-[[(1,1-диметилэтокси)карбонил]амино]-2-гидрокси-5-метил-4-гексеновой кислоты,

d) BMS 188797

(2aR,4S,4aS,6R,9s,11S,12S,12aR,12bS)-6-(ацетилокси)-12-(бензоилокси)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-додекагидро-4,11-дигидрокси-12b-[(метоксикарбонил)окси]-4а,8,13,13-тетраметил-5-оксо-7,11-метано-1Н-циклодека[3,4]бенз[1,2-b]оксет-9-иловый эфир (2R,3S)-β-(бензоиламино)-α-гидроксибензолпропановой кислоты,

е) BMS 184476

(2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-бис(ацетилокси)-12-(бензоилокси)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-додекагидро-11-гидрокси-4a,8,13,13-тетраметил-4-[(метилтио)метокси]-5-оксо-7,11-метано-1Н-циклодека[3,4]бенз[1,2-b]оксет-9-иловый эфир (2R,3S)-β-(бензоиламино)-α-гидроксибензолпропановой кислоты.

К предпочтительным соединениям, в которых активное противораковое вещество (Q-Y-H) представляет собой камптотецин, выбранный из группы, состоящей из:

а) камптотецина

4(S)-этил-4-гидрокси-1Н-пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2b]хинолин-3,14(4Н,12Н)-дион,

b) топотекана

моногидрохлорид (4S)-10-[(диметиламино)метил]-4-этил-4,9-дигидрокси-1Н-пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-3,14(4Н,12Н)-диона,

с) DX-8951f

(1S,9S)-1-амино-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино [1,2-b]хинолин-10,13-дион,

d) BN-80915

5(R)-этил-9,10-дифтор-1,4,5,13-тетрагидро-5-гидрокси-3Н,15Н-оксепино[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-3,15-дион,

e) 9-аминокамптотецина

(S)-10-амино-4-этил-4-гидрокси-1Н-пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-3,14(4Н,12Н)-дион,

f) 9-нитрокампотецина

4(S)-этил-4-гидрокси-10-нитро-1Н-пирано[3',4':6,7]-индолизино[1,2-b]хинолин-3,14 (4Н,12Н)-дион,

g) (9S)-9-этил-9-гидрокси-1-пентил-1Н,12Нпирано [3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

h) (9S)-9-этил-9-гидрокси-2-метил-1-пентил-1Н,12Нпирано [3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

i) (9S)-9-этил-9-гидрокси-2-гидроксиметил-1-пентил-1Н,12Нпирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона.

Предпочтительными являются также те соединения, в которых активное противораковое вещество (Q-Y-H) представляет собой противораковый нуклеозид, выбранный из группы, состоящей из

а) DFDC

2'-дезокси-2',2'-дифторцитидин,

b) DMDC

2'-дезокси-2'-метилиденцитидин,

c) FMDC

(Е)-2'-дезокси-2'-(фторметилен)цитидин,

d) Ara-C

1-(β-D-арабинофуранозил)цитозин,

e) децитабина

4-амино-1-(2-дезокси-β-D-эритропентофуранозил)-1,3,5-триазин-2(1Н)-он,

f) троксацитабина

4-амино-1-[(2S,4S)-2-(гидроксиметил)-1,3-диоксолан-4-ил]-2(1H)-пиримидинон,

g) флударабина

2-фтор-9-(5-О-фосфоно-β-D-арабинофуранозил)-9Н-пурин-6-амин,

h) кладрибина

2-хлор-2'-дезоксиаденозин.

Предпочтительными соединениями являются те, в которых активное противораковое вещество Q-Y-H представляет собой доластатин, выбранный из группы, состоящей из

а) доластатина 10

N,N-диметил-L-валил-N-[(1S,2R)-2-метокси-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-[[(1S)-2-фенил-1-(2-тиазолил)этил]амино]пропил]-1-пирролидинил]-1-[(1S)-1-метилпропил]-4-оксобутил]-N-метил-L-валинамид,

b) доластатина 14

цикло[N-метилаланил-(2Е,4Е,10Е)-15-гидрокси-7-метокси-2-метил-2,4,10-гексадекатриеноил-L-валил-N-метил-L-фенилаланил-N-метил-L-валил-N-метил-L-валил-L-пролил-N2-метиласпарагинил],

с) доластатина 15

(1S)-1-[[(2S)-2,5-дигидро-3-метокси-5-оксо-2-(фенилметил)-1Н-пиррол-1-ил]карбонил]-2-метилпропиловый эфир N,N-диметил-L-валил-L-валил-N-метил-L-валил-L-пролил-L-пролина,

d) TZT 1027

N,N-диметил-L-валил-N-[(1S,2R)-2-метокси-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-[(2-фенилэтил)амино]пропил]-1-пирролидинил]-1-[(1S)-1-метилпропил]-4-оксобутил]-N-метил-L-валинамид,

e) цемадотина

N,N-диметил-L-валил-L-валил-N-метил-L-валил-L-пролил-N-(фенилметил)-L-пролинамид.

Предпочтительное соединение, в котором активное противораковое вещество (Q-Y-H) представляет собой антрациклин, выбирают из группы, состоящей из

а) адриамицина

гидрохлорид (8S,10S)-10-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-L-ликсогексопиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксиацетил)-1-метоксинафтацен-5,12-диона,

b) дауномицина

гидрохлорид 8-ацетил-10-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-L-ликсогексопиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксиацетил)-1-метоксинафтацен-5,12-диона,

с) идарубицина

(7S,9S)-9-ацетил-7-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-L-ликсогексопиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,9,11-тригидроксинафтацен-5,12-дион.

Также предпочтительным является соединение, в котором активное противораковое вещество (Q-Y-H) представляет собой тирозинкиназный ингибитор рецептора EGF или ингибитор фарнезилтранферазы.

Предпочтительным является соединение, в котором активное противораковое вещество (Q-Y-H) представляет собой тирозинкиназный ингибитор рецептора EGF, выбранный из группы, состоящей из

а) ZD 1839

N-(3-хлор-4-фторфенил)-7-метокси-6-[3-(4-морфолинил)пропокси]-4-хиназолинамин,

b) CP 358774

N-(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин,

с) PD 158780

N4-(3-бромфенил)-N6-метилпиридо[3,4-d]пиримидин-4,6-диамин,

d) GW 2016

N-(3-хлор-4-((3-фторбензил)окси)фенил)-6-(5-(((2-метилсульфонил)этил)амино)метил)-2-фурил)-4-хиназолинамин.

Также предпочтительным является соединение, в котором активное противораковое вещество (Q-Y-H) представляет собой ингибитор фарнезилтрансферазы R 115777, отвечающий формуле 6-[1-амино-1-(4-хлорфенил)-1-(1-метилимидазол-5-ил)метил]-4-(3-хлорфенил)-1-метилхинолин-2(1Н)-он.

Противоопухолевые соединения формулы (II) настоящего изобретения

в которой Q и Y имеют указанные выше значения; R0 представляет собой боковую цепь природной или синтетической аминокислоты; Z представляет собой (С1-С3)алкилен или группу -О-СН(R3)-, в которой R3 представляет собой водород или неразветвленный (С3-С10)алкил или (С3-С8)циклоалкил, избирательно генерирующие активные противораковые вещества в опухоли под действием микросомальной дипептидазы, проиллюстрированы ниже примером конструирования соединения с использованием фермента, обнаруженного описанными выше способами. Однако настоящее изобретение не ограничивается представленным примером. Соединения формулы (II) также включают их фармацевтически приемлемые соли.

Первый пример настоящего изобретения относится к противоопухолевым соединениям, разработанным с использованием таксанов в качестве активных противораковых лекарственных средств и микросомальной дипептидазы в качестве активирующего фермента, представленным общей формулой (III):

в которой R0 имеет указанные выше значения, R4 представляет собой бензоил или трет-бутоксикарбонил, а R5 представляет собой водород или ацетил, а также к их фармацевтически приемлемым солям.

Предпочтительными значениями R0 в формуле (III) являются метил, изопропил, 2-метилпропил, 1-метилпропил, бензил, индол-3-илметил, и 2-(метилтио)этил; более предпочтительно метил, бензил и 2-метилпропил.

Согласно настоящему изобретению предпочтительными соединениями формулы (III) являются следующие вещества:

а) 13-((2R,3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-амино-4-метил-пентаноиламино)-5-гидроксикарбонил]пентаноилокси}-3-бензоиламино-3-фенилпропионилокси)-2α-бенилокси-4α,10β-диацетокси-1β,7β-дигидрокси-5β,20-эпокси-такс-11-ен-9-он,

b) 13α-((2R,3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-амино-пропиониламидо)-5-гидроксикарбонил]пентаноилокси}-3-бензоиламино-3-фенилпропионилокси)-2α-бензилокси-4α,10β-диацетокси-1β,7β-дигидрокси-5β,20-эпокси-такс-11-ен-9-он,

с) 13-((2R,3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-амино-3-фенил-пропиониламидо)-5-гидроксикарбонил]пентаноилокси}-3-бензоиламино-3-фенилпропионилокси)-2α-бензилокси-4α,10β-диацетокси-1β,7β-дигидрокси-5β,20-эпокси-такс-11-ен-9-он

и их фармацевтически приемлемые соли.

Фигура 1 иллюстрирует опухоль-селективную активацию соединений формулы (III) микросомальной дипептидазой.

Схема 1

Второй пример противоопухолевых соединений, разработанных с использованием производного нуклеозида в качестве активного противоракового лекарственного средства и микросомальной дипептидазы в качестве активирующего фермента, представлен формулой (IV):

в которой R0, R1, R2 и R3 имеют значения указанные выше для формулы (II), R6 представляет собой водород, фтор, гидроксил или циано, R7 представляет собой водород, фтор или гидрокси, или R6 и R7 совместно образуют метилиден или фторметилиден, R8 представляет собой водород или этинил, R9 представляет собой водород, фтор, винил или этинил, а R10 представляет собой водород или гидрокси, причем формула охватывает фармацевтически приемлемые соли таких соединений.

Предпочтительное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям приведенной выше формулы (IV), в которой R6 представляет собой водород, фтор, гидроксил, R7 представляет собой фтор или гидрокси либо R6 и R7 совместно образуют метилиден или фторметилиденовую группу. В соответствии с другим предпочтительным воплощением настоящее изобретение относится к представленным выше соединениям формулы (IV), в которой R0 представляет собой 2-метилпропил, циклогексилметил, 2-нафтилметил, 4-фенилбензил, (4-циклогексилциклогексил)метил, алкилтиометил, циклогексилтиометил, или 4-алкоксибензил, а R3 представляет собой водород или метил.

Предпочтительные активные нуклеозиды, содержащиеся в соединениях формулы (IV), представляют собой DFDC, DMDC, FMDC, Ara-C, децитабин, троксацитабин, 2'-циано-2'-дезоксицитидин, 3'-этинилцитидин, 5-фтор-5'-дезоксицитидин, 5-винил-5'-дезоксицитидин и т.п.; более предпочтительно DFDC, DMDC и FMDC.

Предпочтительным значением R0 в формуле (IV) является остаток липофильной природной аминокислоты, (С8-С12)алкил, (С3-С8)циклоалкилметил, замещенный или незамещенный бензил или нафтилметил, (С8-С12)алкилтиометил, (С3-С8)циклоалкилтиометил, более предпочтительно 2-метилпропил, циклогексилметил, бензил, нафт-2-илметил, 4-фенилбензил, метилтиоэтил, циклогексилтиометил и т.п.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные соединения формулы (IV) могут быть выбраны из группы, состоящей из:

(a) (2R)-((2S)-амино-3-циклогексил-пропиониламино)-(3S)-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидро-фуран-(2R)-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоилокси)-масляной кислоты,

(b) (2R)-((2S)-амино-4-метил-пентаноиламино)-(3S)-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидро-фуран-(2R)-ил)-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси)-масляной кислоты,

(с) (2R)-((2S)-амино-3-бифенил-4-ил-пропиониламино)-(3S)-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидро-фуран-(2R)-ил)-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси)-масляной кислоты,

(d) (2R)-((2S)-амино-3-бифенил-4-ил-пропиониламино)-3-{1[4(S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидро-фуран-(2R)-ил]-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоилокси)-пропионовой кислоты,

(е) (2R)-((2S)-амино-3-нафталин-2-ил-пропиониламино)-(3S)-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидро-фуран-(2R)-ил)-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси)-масляной кислоты,

(f) (2R)-{(2S)-амино-3-[4-(4-гидрокси-фенокси)-фенил]пропиониламино}-3-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидро-фуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси)-масляной кислоты,

(g) (2R)-[((2S)-амино-3-(4-метокси-фенил)-пропиониламино)-(3S)-[1-[(4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидро-фуран-2-ил]-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси)-масляной кислоты,

(h) (2R)-[(2S)-амино-4-этилсульфанилбутириламино]-(3S)-[1-[(4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидро-фуран-(2R)-ил]-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси)-масляной кислоты,

(i) (2R)-((2S)-амино-3-циклогексил-пропиониламино)-(3S)-[1-(3,3-дифтор-(4R)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-тетрагидро-фуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси)-масляной кислоты,

(j) 2(S)-[2(S)-амино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-[1-(3,3-дифтор-4(R)-гидрокси-5(R)-гидроксиметил-тетрагидро-фуран-2(R)-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоилокси)-2(S)-метилпропионовой кислоты,

(k) 2(R)-[2(S)-амино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-{1-(3,3-дифтор-4(R)-гидрокси-5(R)-гидроксиметил-тетрагидро-фуран-2(R)-ил]-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси)-2(R)-метилпропионовой кислоты,

(l) (2S,3S)-2-(2-амино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-[1-{(4R,5R)-3,3-дифтор-4-гидрокси-5-гидроксиметил-тетрагидро-фуран-2-ил}-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-4-илкарбамоилокси]-2-метилмасляной кислоты,

(m) (2R,3R)-2-(2-амино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-[1-{(4R,5R)-3,3-дифтор-4-гидрокси-5-гидроксиметил-тетрагидро-фуран-2-ил}-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-4-илкарбамоилокси]-2-метилмасляной кислоты, и

(n) изопропилового эфира (2R)-[(2S)-амино-3-циклогексил-пропиониламино]-(3S)-[1-[(4S)-гидрокси-(5R)-гидроксимиетил-3-метилен-тетрагидро-фуран-(2R)-ил]-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси]-масляной кислоты,

и их фармацевтически приемлемых солей.

Третий пример противоопухолевых соединений, полученных с использованием нуклеозидов в качестве активных противораковых лекарств и микросомальной дипептидазы в качестве активирующего фермента, представлен формулой (V):

в которой m представляет собой целое число, равное 2 или 3, а R0, R2, R6, R7, R8, R9 и R10 имеют указанные выше значения.

Предпочтительными примерами активных цитидиновых аналогов, содержащихся в формуле (V), являются DFDC, DMDC, FMDC, Ara-C, децитабин, троксацитабин, 2'-циано-2'-дезоксицитидин, 3'-этинилцитидин, 5-фтор-5'-дезоксицитидин, 5-винил-5'-дезоксицитидин и т.п.; более предпочтительно DFDC, DMDC и FMDC.

Предпочтительными значениями R0 в формуле (V) являются циклогексилметил, нафт-2-илметил, 4-фенилбензил, бензил, индол-3-илметил или 4-алкоксибензил, например, такой (4-низший алкоксифенил)метил, как 4-метоксибензил, 4-этоксибензил и т.п.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными соединениями формулы (V) являются следующие вещества:

а) (2R)-[(2S)-амино-3-(1Н-индол-3-ил)пропиониламино]-4-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилентетрагидрофуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоил]-масляная кислота,

b) (2R)-((2S)-амино-3-циклогексилпропиониламино)-4-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилентетрагидрофуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоил]-масляная кислота,

с) (2R)-((2S)-амино-3-бифенил-4-илпропиониламино)-4-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилентетрагидрофуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоил]-масляная кислота, и

d) (2R)-((2S)-амино-3-нафталин-4-илпропиониламино)-4-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилентетрагидрофуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоил]-масляная кислота

а также их фармацевтически приемлемые соли.

Четвертый пример противоопухолевых соединений, сконструированных с использованием камптотецинов в качестве активных противораковых лекарств и микросомальной дипептидазы в качестве активирующего фермента, представлен формулой (VI):

в которой m представляет собой целое число от 1 до 3, n представляет собой целое число от 0 до 1, R0 имеет те же значения, что указаны для формулы (II), R11 представляет собой водород или фтор, R12 представляет собой водород, фтор, метил или гидрокси, R13 представляет собой водород, амино, нитро, или (ди-метиламино)метил, R14 представляет собой водород, (С1-С4)алкил, (4-метилпиперазинил)метил, (трет-бутоксиимино)метил или R13 и R14, или R11и R12, совместно друг с другом, образуют 5- или 6-членное кольцо, которое необязательно содержит 1-2 гетероатома и может быть необязательно замещено 1-3 заместителями, выбранными из группы, состоящей из (С1-С8)алкила, амино, (С1-С8)алкиламино и/или ди-(С1-С4)алкиламино и их фармацевтически приемлемых солей. Более предпочтительно, соединения формулы (VI) характеризуются тем, что R11 представляет собой водород, R12 представляет собой водород или гидрокси, R13 представляет собой водород или (диметиламино)метил, а R14 представляет собой водород или этил. Предпочтительным значением R0 в формуле (VI) является 2-метилпропил, циклогексилметил, бензил, индол-3-илметил, 4-аминобутил, 4-аминопропил; более предпочтительно 2-метилпропил, циклогексилметил, бензил и индол-3-илметил.

Предпочтительными примерами активного камптотецинового аналога, охватываемого формулой (VI), являются кампотецин, топотекан, SN-38, луртотекан, 9-аминокамптотецин, 9-нитрокамптотецин, DX-8951f, BN-80915, (9S)-9-этил-9-гидрокси-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-дион, (9S)-9-этил-9-гидрокси-2-метил-1-пентил-1Н,12Нпирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-дион, и (9S)-9-этил-9-гидрокси-2-гидроксиметил-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-дион и т.п.

Предпочтительные значения R0 в формуле (VI) представляют собой 2-метилпропил, циклогексилметил, бензил, индол-3-илметил, 4-аминобутил, 4-аминопропил; более предпочтительно 2-метилпропил, циклогексилметил, бензил и индол-3-илметил.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные соединения формулы (VI) представляют собой следующие вещества:

а) 20-О-[(S)-триптофил-γ-(S)-глутамил]-20-(S)-камптотецин,

b) 20-О-[(S)-валил-γ-(S)-глутамил]-20-(S)-камптотецин,

с) 20-О-[(S)-фенилаланил-γ-(S)-глутамил]-20-(S)-камптотецин,

d) 20-О-[(S)-лейцил-γ-(S)-глутамил]-20-(S)-камптотецин,

e) 20-О-[(R)-лейцил-γ-(S)-глутамил]-20-(S)-камптотецин,

f) 20-О-[(R)-фенилаланил-γ-(S)-глутамил]-20-(S)-камптотецин,

g) 20-О-[(S)-триптофил-γ-(R)-глутамил]-20-(S)-камптотецин,

h) 20-О-[(R)-триптофил-γ-(R)-глутамил]-20-(S)-камптотецин,

i) 20-О-[(S)-фенилаланил-γ-(R)-глутамил]-20-(S)-камптотецин,

j) 20-О-[(S)-лейцил-γ-(R)-глутамил]-20-(S)-камптотецин,

k) 20-О-[(R)-лейцил-γ-(S)-глутамил]-20-(S)-камптотецин,

l) 20-О-[(R)-фенилаланил-γ-(R)-глутамил]-20-(S)-камптотецин,

m) 20-О-[(R)-лейцил-γ-(R)-глутамил]-20-(S)-камптотецин,

n) 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(R)-триптофил-(R)-гомоглутамил]-20(S)-камптотецин,

о) 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(R)-триптофил-γ-(R)-глутамил]-20(S)-камптотецин,

p) 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(S)-фенилаланил-γ-(R)-глутамил]-20(S)-камптотецин,

q) 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(S)-фенилаланил-γ-(S)-аспартил]-20(S)-камптотецин,

r) 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(S)-лейцил-γ-(S)-аспартил]-20(S)-камптотецин,

s) 20-О-[(S)-триптофил-β-(R)-аспартил]-20(S)-камптотецин,

t) 20-О-[(S)-фенилаланил-β-(R)-аспартил]-20(S)-камптотецин,

u) 20-О-[(R)-фенилаланил-β-(R)-аспартил]-20(S)-камптотецин,

v) 20-О-[(S)-фенилаланил-β-(S)-аспартил]-20(S)-камптотецин,

w) 20-О-[(S)-лейцил-β-(R)-аспартил]-20(S)-камптотецин,

x) 20-О-[(S)-валил-β-(R)-аспартил]-20(S)-камптотецин,

y) 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(S)-циклогексилаланил-(R)-глутамил]-20(S)-камптотецин,

z) 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(S)-циклогексилаланил-(S)-глутамил]-20(S)-камптотецин,

аа) 20-О-[(S)-лизил-γ-(S)-глутамил]-20(S)-камптотецин,

bb) 20-О-[(S)-оринитил-γ-(S)-глутамил]-20(S)-камптотецин,

сс) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-триптофил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

dd) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-циклогексилаланил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

ее) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-фенилаланил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

ff) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

gg) дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лизил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

hh) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-валил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

ii) дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-оринитил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

jj) соль метансульфоновой кислоты (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

kk) дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(D)-лизил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

ll) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-фенилаланил-(L)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

mm) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-циклогексилаланил-(D)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

nn) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-циклогексилаланил-(L)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

oo) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-триптофил-(L)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

pp) дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-орнитил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

qq) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(D)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

rr) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-валил-(D)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

ss) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(L)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

tt) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-циклогексилглицил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

uu) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(D)-циклогексилаланил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

vv) дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лизил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

ww) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-триптофил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

xx) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

yy) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[глицил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

zz) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-аланил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

aaa) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-фенилаланил-(D)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

соединения не в форме солей и другие фармацевтически применимые соли перечисленных соединений.

Более предпочтительными примерами соединений формулы (VI) являются следующие вещества:

а) 20-О-[(S)-триптофил-γ-(S)-глутамил]-20(S)-камптотецин,

b) 20-О-[(S)-лейцил-γ-(S)-глутамил]-20(S)-камптотецин,

с) 20-О-[(S)-триптофил-γ-(R)-глутамил]-20(S)-камптотецин,

d) 20-О-[(S)-лейцил-γ-(R)-глутамил]-20(S)-камптотецин,

e) 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(S)-фенилаланил-β-(R)-глутамил]-20(S)-камптотецин,

f) 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(S)-фенилаланил-β-(S)-аспартил]-20(S)-камптотецин,

g) 20-О-[(S)-фенилаланил-β-(S)-аспартил]-20(S)-камптотецин,

h) 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(S)-циклогексилаланил-(R)-глутамил]-20(S)-камптотецин,

i) 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(S)-циклогексилаланил-(S)-глутамил]-20(S)-камптотецин,

j) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-триптофил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

k) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-циклогексил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

l) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-фенилаланил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

m) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

n) дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лизил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

o) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-валил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

p) дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-оринитил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

q) соль метансульфоновой кислоты (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

r) дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(D)-лизил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

s) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-фенилаланил-(L)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

t) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-циклогексилаланил-(D)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

u) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-циклогексилаланил-(L)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

v) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-триптофил-(L)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

w) дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-орнитил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

x) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(D)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

y) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-валил-(D)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

z) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(L)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

аа) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-циклогексилглицил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

bb) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(D)-циклогексилаланил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

сс) дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лизил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

dd) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-триптофил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

ее) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

ff) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[глицил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

gg) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-аланил-(D)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

hh) гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-фенилаланил-(D)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона,

соединения не в форме солей и другие фармацевтически приемлемые соли перечисленных соединений.

Наиболее предпочтительными примером соединений формулы (VI) является дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лизил-(L)-γ-глутамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона, соединение не в форме соли и его другие фармацевтически приемлемые соли.

Соединение формулы (I) может быть получено по реакции конденсации соединения Q-Y-H с реакционноспособным производным Х. Такие реакции известны в данной области: так, например, соединение формул (II), (III), (V) и (VI) может быть получено по реакции конденсации соединения формулы (VII), а соединение формулы (IV) может быть получено по реакции конденсации соединения формулы (VIII), как описано выше.

Соединение формулы (II), (III), (V) и (VI) может быть получено по реакции конденсации соединения формулы (VII):

в которой Р1 и Р2 представляют собой амино- и карбоксизащитные группы соответственно; R0 и m имеют указанные выше значения, и соответствующим образом защищенного противоракового соединения, например паклитаксела, производных цитидина или камптотецинов, с таким конденсирующим агентом, как дициклогексилкарбодиимид, BOP, HBTU, TNTU, PyBroPTM, TBTU, TSTU, HOBt [коммерчески доступные сшивающие агенты: The Combinatirial Chemistry Catalog, Feb., 1997; Novabiochem.] и т.п., с последующим удалением защитных групп.

Указанные выше амино- и карбоксизащитные группы P1 и P2, а также реакция конденсации известны специалисту в данной области [The Practice of Peptide Synthesis, M. Bodansky and A. Bodansky. 2nd ed., 1994 (Springer-Verlag)].

Соединения формулы (IV) могут быть получены по реакции конденсации соединения формулы (VIII):

в которой Р1, Р2, R0, R1 и R3 имеют указанные выше значения, и соответствующим образом защищенного производного цитидина с таким агентом конденсации, как 4-нитрофенил хлорформиат и трифосген, с последующим удалением защитных групп.

Реакцию можно проводить в среде такого растворителя, как хлористый метилен, пиридин, N,N-диметилформамид, N-метилпирролидон, ацетонитрил, и т.п., в присутствии или в отсутствие такого основания, как триэтиламин, диизопропилэтиламин, пиридин, N,N-диметиламинопиридин и т.п., при температуре в интервале от -20°С до +50°С, предпочтительно при 0-25°С.

Удаление аминозащитной группы, при использовании для реакции конденсации амино- и/или карбоксизащищенного дипептида, может осуществляться известными способами, например, путем обработки трифторуксусной кислотой в случае Вос группы, пиперидином в случае Fmoc группы, или тетрабутиламмоний фторидом в случае 2-(триметилсили)этоксикарбонильной (Teoc), триметилсилилэтильной и трет-бутилдиметилсилильной группы, а также путем каталитического гидрогенолиза в случае Cbz группы.

Аминокислотные производные, используемые для получения дипептидных производных в формуле (VII) и (VIII), представляют собой коммерчески доступные соединения или могут быть получены известными методами, описанными в литературе (например, J. Am. Chem. Soc. 20000, 122, 762-766; J. Org. Chem. 1998 5240; Tetrahedron Asymmetry 1995, 1741; Tetrahedron Asymmetry 1998, 4249). Производные S-алкил-цистеина получают S-алкилированием амино/карбоксизащищенных производных цистеина в присутствии алкилирующего агента, или замещением гидроксигруппы амино/карбоксизащищенных производных серина на атом брома с последующей реакцией замещения с использованием производного тиола. Производные О-алкил-тирозина получают О-алкилированием амино/карбоксизащищенных производных тирозина с помощью алкилирующего агента.

Дипептидные производные могут быть получены традиционными методами пептидной химии, известными специалисту в данной области [The Practice of Peptide Synthesis, M. Bodansky and A. Bodansky. 2nd ed., 1994 (Springer-Verlag)].

Затем ТТС тестируют на их селективную активацию определенным ферментом с использованием рекомбинантных ферментов и/или клеточных экстрактов, которые экспресссируют или не экспрессируют значительные количества ТТС-активирующих ферментов. Предшественники человеческих кроветворных клеток также используют в качестве клеток, которые не экспрессируют ТТС-активирующие ферменты или экспрессируют их лишь в незначительных количествах. Рекомбинантные белки для ТТС-активирующих ферментов могут производиться экспрессией кДНК для ферментов в бактериях или других клетках, включающих клетки насекомых или клетки млекопитающих. Клеточные линии, которые конститутивно экспрессируют высокие уровни ТТС-активирующих ферментов, также вырабатываются трансфекцией плазмиды, в которой кДНК ТТС-активирующего фермента клонируют за сильным конститутивным промотором, включающего цитамегаловирусный (CMV) промотор (Foecking, M.K. and Hofstetter, H. Powerful and versatile enhancer-promotor unit for mammalian expression vectors. Gene. 45, 101-105 (1986)). Таким образом, транскрипция ТТС-активирующих ферментов в трансфектантах находится под контролем сильного конститутивного промотора. Активацию ТТС изучают путем инкубации ТТС в присутствии рекомбинантных ТТС-активирующих ферментов и/или клеточных экстрактов, способных экспрессировать или не экспрессировать ТТС-активирующие ферменты, и измерением количества ТТС и активных лекарств методами HPLC и/или LCMS.

Помимо клеток, переносящих дополнительные копии кДНК для ТТС-активирующих ферментов, экстракты различных тканей человека и животных также могут использоваться для подтверждения опухоль-специфичной активации ТТС. Опухоли и нормальные ткани, используемые для анализа, включают ткани мозга, сердца, легких, желудка, кишечника, толстой кишки, печени, почек, крови и костного мозга мышей, крыс, обезьян и людей.

Селективное действие ТТС дополнительно подтверждают сравнением ингибирования клеточного роста под воздействием ТТС, используя для этого клетки, экспрессирующие высокие уровни ТТС-активирующих ферментов, и клетки, экспрессирующие очень низкие уровни ТТС-активирующих ферментов. Ингибирование клеточного роста определяют количественным измерением живых клеток после их культивации в присутствии или в отсутствие ТТС.

Вывод о том, что активация соединения опосредована микросомальной дипептидазой, делают на основании ингибиторной активности соединений в отношении роста клеток, экспрессирующих низкий уровень микросомальной дипептидазы, клеток, экспрессирующих высокие уровни микросомальной дипептидазы и предшественников гранулоцитов, которые размножаются ex vivo. Клеточная линия рака толстой кишки человека, НСТ116 (American Type Culture Collection № CCL-247), и предшественники гранулоцитов используются в качестве клеток, экспрессирующих лишь низкий уровень микросомальной дипептидазы. Стабильный трансфектант, НСТ116/S5, в который трансфицирована человеческая микросомальная дипептидаза кДНК (далее MDP), соединенная с CMV промотором, используется в качестве клеток, экспрессирующих высокий уровень микросомальной дипептидазы. Дипептидазная кДНК (Saton et al. Biotechnol. Prog. 10 (2), 134-140 (1994) и другие ссылки) и упомянутые методы клонирования являются известными в данной области техники. HCT116, HCT116\S5 и предшественники гранулоцитов культурируют в отсутствие или присутствии лекарственных средств и значения IC50, представляющие собой концентрации лекарств, необходимые для 50% ингибирования по сравнению с клетками, культивированными в отсутствие лекарства, определяют и сравнивают в системах, содержащих HCT116, HCT116\S5 и предшественники гранулоцитов. Хотя длительность воздействия лекарств на клетки может меняться в зависимости от типа клеток и лекарственных средств, обычно она составляет 24, 96 или 168 часов. В том случае, когда клетки культивируют в присутствии лекарственных средств в течение 24 часов, лекарства удаляют из культуральной среды путем ее замены и клетки дополнительно инкубируют в течение 72 часов перед измерением значений IC50 лекарственного средства.

Биологические данные о соединениях, используемых в каждом из примеров 4, 16, 17, 31, 39, 49-1, 49-2, 49-3, 49-4 и 49-11.

Цитоксичность (IC50 в нМ)

[длительность воздействия лекарства: 24 часа]

СоединениеHCT116HCT116/S5CFU-GM
Пактитаксель2,52,416
Пример 4515,154
Камптотецин195,66,1
Пример 31 30018170
SN383,72,21,8
Пример 39232,820
Пример 49-1333,361
Пример 49-2182,631
Пример 49-4152,154
Пример 49-3>502,9250
Пример 49-11>5013120

Цитотоксичность (IC50 в нМ)

[длительность воздействия лекарства: 96 часов]

[длительность воздействия лекарства: 168 часов]

СоединениеHCT116HCT116/S5CFU-GM
DMDC0,20,30,07
Пример 161,70,232,8
Пример 170,990,0981,1

HCT116: клеточная линия рака толстой кишки человека; HCT116/S5: HCT116 трансфицированная кДНК человеческой микросомальной дипептидазы; CFU-GM: предшественники человеческих кроветворных клеток.

Таким образом, можно ожидать, что в клинических условиях могут быть достигнуты значительно улучшенные характеристики эффективности и безопасности действия ТТС, особенно в том, что относится к миелотоксичности, по сравнению с характеристиками известных цитотоксикантов.

Другое воплощение настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим описанное выше соединение. Такие композиции особенно подходят для перорального и парентерального применения.

Как отмечалось выше, лекарственные средства, содержащие соединение формулы I, также являются целью настоящего изобретения, как и способ их получения, причем такой способ заключается в переводе одного или более соединений формулы I и, если желательно, одного или более других терапевтически ценных веществ в галеновую форму.

Фармацевтические композиции могут применяться перорально, например, в виде таблеток, таблеток с покрытием, драже, твердых и мягких желатиновых капсул, растворов, эмульсий и суспензий. Такие рецептуры также могут применяться ректально, например, в виде свечей; локально или чрескожно, например, в виде мазей, кремов, гелей или растворов; или парентерально, например, с использованием растворов для инъекций.

Для получения фармацевтических препаратов (таблеток, таблеток с покрытием, драже или твердых желатиновых капсул) могут составляться рецептуры из рассматриваемых соединений и терапевтически инертных, неорганических или органических носителей. В качестве носителей для таблеток, таблеток с покрытием, драже и твердых желатиновых капсул могут применяться лактоза, маисовый крахмал или его производные, тальк, стеариновая кислота или ее соли. Подходящими носителями для мягких желатиновых капсул могут служить растительные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиолы. В зависимости от природы активного вещества, в случае мягких желатиновых капсул, применение носителей обычно не требуется. Подходящими носителями для производства растворов и сиропов являются вода, полиолы, сахароза, инвертный сахар и глюкоза. Подходящими носителями для инъекционных растворов могут служить вода, спирты, полиолы, глицерин и растительные масла. Подходящие носители для свеч представляют собой природные или застывшие масла, воски, жиры и полужидкие полиолы.

Рассматриваемые фармацевтические препараты также могут содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, подслащивающие агенты, окрашивающие агенты, отдушки, соли для изменения осмотического давления, буферы, покрывающие агенты или антиоксиданты. Они также могут содержать другие терапевтически ценные вещества.

Дозировка может изменяться в широких пределах, и предполагается, что она должна удовлетворять индивидуальным требованиям в каждом конкретном случае. Как правило, при пероральном или парентеральном применении на взрослых людях подходящая дневная дозировка составляет 5-500 мг/м2. Если целесообразно, то верхний указанный предел может быть превышен.

Дневная дозировка может применяться в виде одной дозы или раздельными дозами, а в случае перорального или парентерального применения может использоваться непрерывная инфузия.

Другое воплощение настоящего изобретения относится к применению описанных выше противораковых веществ для приготовления медикаментов, предпочтительно предназначенных для лечения нарушения клеточной пролиферации, например лечения рака, например колоректального рака, рака легких, рака молочной железы, рака желудка, цервикального рака и рака мочевого пузыря.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения нарушения пролиферации клеток, например рака, например солидной опухоли, колоректального рака, рака легких, рака молочной железы, рака желудка, цервикального рака, и рака мочевого пузыря, включающему введение пациенту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества противоракового соединения, описанного выше.

Настоящее изобретение также относится к описанным выше соединениям, предназначенным для использования в терапевтических целях.

Следующие ниже примеры приведены исключительно в целях иллюстрации предпочтительных способов идентификации ферментов и/или белков, подходящих для активации соединений указанными ферментами и для получения соединений настоящего изобретения, причем область изобретения не ограничивается представленными примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1:

Измерение различных уровней содержания мРНК в опухолях человека и нормальной ткани с использованием микронабора олигонуклеотидов и RT-PCR

1-1. Экстракция РНК из ткани

Небольшие кусочки образцов, состоящие из 41 человеческой колоректальной опухоли, 30 желудочных опухолей, 41 немелкоклекточной карциномы легких, 24 опухолей молочной железы, 15 опухолей яичника, 53 гепатоцеллюлярных карцином и 15 не-опухолевых печеночных тканей (в каждом случае около 125 мм3) и 107 предшественников гранулоцитов, размноженных ex vivo, быстро замораживали в жидком азоте. Для экстракции РНК ткани и клетки суспендировали в TRIZOL (Life Technologies, Gaithersburg, USA, Catalog № 15596-018) или Sepasol-RNAI (Nacalai tesque, Kyoto, Japan, Catalog № 306-55) и дважды гомогенизировали в Polytron (Kinematica, Littau, Switherland) (5 секунд при максимальной скорости). После добавления хлороформа гомогенизат ткани центрифугировали при 15000 × g в течение 10 минут и собирали водные фазы, содержащие РНК. Общую клеточную РНК осаждали изопропиловым спиртом, промывали 70% этанолом и суспендировали в DEPC-обработанной воде (Life Technologies, Gaithersburg, USA, Catalog № 10813-012). После обработки РНК 1,5 единицами ДНК-азы I (Life Technologies, Gaithersburg, USA, Catalog # 18068-015) РНК повторно экстрагировали системой TRIZOL/хлороформ, осаждали этанолом и растворяли в DEPC-обработанной воде. После этого нуклеотиды низкой молекулярной массы удаляли с использованием набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany, Catalog № 74104), пользуясь инструкциями изготовителей. При электрофорезе РНК на агарозном геле и окрашивании бромистым этидием обнаруживали 28S и 18S рибосомальную РНК, причем флуоресценция бромистого этидия, связанного с 28S РНК, оказалась выше, чем у 18S РНК. Очищенную целую РНК хранили при -80°С в 70% растворе этанола до использования в синтезе кДНК.

1-2. Синтез кДНК и меченых сРНК-зондов

кДНК синтезировали с использованием обратной SuperScript Choise System (Life Technologies, Gaithersburg, USA, Catalog № 18090-019) в соответствии с инструкциями производителя. Пять микрограмм очищенной общей РНК подвергали гибридизации с олиго-dTпраймером (Sawady Technology, Tokyo, Japan), содержащим последовательности Т7 промотора и 200 единиц обратной транскриптазы SuperScriptII, и полученную систему инкубировали при 42°С в течение 1 часа. Полученную в результате кДНК экстрагировали смесью фенол/хлороформ и очищали с помощью Phase Lock GelTM Light (Eppendorf, Hamburg, Germany, Catalog № 0032 005.101).

кРНК также синтезировали с использованием набора MEGAscript T7 kit (Ambion, Austin, USA, Catalog № 1334) и сДНК в качестве матрицы в соответствии с инструкциями производителя. Примерно 5мкг кДНК инкубировали в присутствии 2 мкл ферментной смеси, содержащей Т7 полимеразу, по 7,5М трифосфата аденозина (АТР) и трифосфата гуанозина (GTP), по 5,625 мМ трифосфата цитидина (СТР) и трифосфата уридина (UTP), по 1,875 мМ Bio-11-CTP и Bio-16-UTP (ENZO Diagnostics, Farmingdale, USA, Catalog № 42818 и 42814 соответственно) при 37°С в течение 6 часов. Мононуклеотиды и короткие нуклеотиды удаляли методом колоночной хроматографии на CHRPMA SPIN+STE-100 колонке (CLONTECH, Palo Alto, USA, Catalog № К1302-2) и кРНК в элюатах осаждали добавлением этанола. После выделения 0,1 микрограмм кРНК методом электрофореза на агарозном геле и окрашивания бромистым этидием кРНК имела длину в интервале от 300 оснований до 3 тысяч оснований. Очищенную кРНК хранили при температуре ниже -80°С в 70% растворе этанола до последующего применения.

1-3. Анализ опухоли и нормальной ткани на экспрессию гена

Образцы генной экспрессии первичных опухолей человека, взятые у пациентов с раком печени, исследовали олигонуклеотидной микроматрицей высокой плотности (HuGeneFL array, Affymetrix, Santa Clara, USA, Catalog № 510137)(Lipshutz, R.L. et al. Nature Genet. 21, 20-24 (1999)). С целью гибридизации олигонуклеотидами на чипах кРНК фрагментировали при 95°С в течение 35 минут в буфере, содержащим 40 мМ системы Tris (Sigma, St. Louis, USA, Catalog № Т1503)-уксусная кислота (Wako, Osaka, Japan, Catalog № 017-00256) (рН 8,1), 100 мМ ацетата калия (Wako, Osaka, Japan, Catalog № 160-03175), и 30 мМ ацетата магния (Wako, Osaka, Japan, Catalog № 130-00095). Гибридизацию проводили в 200 мкл буфера, содержащего 0,1М 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) (Sigma, St. Louis, USA, Catalog № М-3885), (рН 6,7), 1М NaCl (Nacalai tesque, Tokyo, Japan, Catalog № 313-20), 0,01% полиоксиэтилен(10)октилфенилового эфира (Wako, Osaka, Japan, Catalog № 168-11805), 20 мкг ДНК спермы селедки (Promega, Madison, USA, Catalog № В181B), 100 мкг ацетилированного альбумина бычьей сыворотки (Sigma, St. Louis, USA, Catalog № B-8894), 10 мкг фрагментированной кРНК и биотинилированные контрольные олигонуклеотиды, биотин-5'-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3' (Sawady technology, Tokyo, Japan) при 45°С в течение 12 часов. После промывки чипов буфером, содержащим 0,01М MES (pH 6,7), 0,1M NaCl, 0,001% полиоксилен(10)октилфениловым буфером, чипы инкубировали с биотинилированным анти-стрептавидиновым антителом (Funakoshi, Tokyo, Catalog № ВА0500) и окрашивали стрептавидин R-фикоэритрином (Molecular Probes, Eugene, USA, Catalog №S-866) c целью усиления сигналов гибридизации, в соответствии с инструкциями производителей (Affymetrix, Santa Clara, USA), после чего уровни экспрессии каждой кДНК и надежность эксперимента (присутствие/отсутствие) рассчитывали с использованием программного обеспечения Affymetrix GeneChip ver.3. и Affymetrix Microarray Suite ver.4.0. В результате проведения экспериментов определяли экспрессию примерно 6000 генов в массиве из 41 человеческой колоректальной опухоли, 30 желудочных опухолей, 41 мелкоклеточных легочных карцином, 24 опухолей молочной железы, 15 опухолей яичников, 53 гепатитоцеллюлярных карцином, и 15 не-опухолевых печеночных тканей и 10 партий независимо культурированных предшественников гранулоцитов (107 клеток в каждой партии).

Пример 2:

Селекция ферментов, экспрессия которых осуществляется предпочтительно в опухолях, но не в предшественниках гранулоцитов и в печени

2-1. Размножение предшественников гранулоцитов ex vivo

CD-34-моноядерные клетки, полученные из крови человеческой пуповины и костного мозга, приобретали у Veritas (Veritas Co., Tokyo, Japan, Catalog № СB009F, ABM019F) и культивировали на конфлюентном монослое MS5 (Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hematopoietic supportive stromal cells from murine bone marrow. Exp. Hematol. 17, 145-153 (1989)) стромальных клеточных линий в альфа МЕМ среде (Life Technologies, Gaithersburg, USA, Catalog № 12571-0063), дополненной 10% (об/об) лошадиной сыворотки (HS) (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada, Catalog № 06750), 10% (об/об) фетальной телячьей сыворотки (FBS) (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada, Catalog № 06450), 50 нг/мл Flt3 лигандом (Pepro Tec EC., London, UK., Catalog 3 300-19), 100 нг/мл SCF (Pepro Tec EC., London, UK., Catalog № 300-07) и 50 нг/мл ТРО (Pepro Tec EC., London, UK., Catalog № 300-18) при 37°С в атмосфере влажного воздуха, содержащего 5% СО2. Всплывшие кроветворные клетки собирали и окрашивали моноклональными телами против PerCP-анти-CD34 (BD pharMingen, SanDiego, USA, Catalog № 340430), PE-anti-CD13 (BD pharMingen, SanDiego, USA, Catalog № 30525Х) и FITC-анти-15 (BD pharMingen, SanDiego, USA, Catalog № PM30525). По пять микролитров каждого антитела добавляли в 50 мкл клеточной суспензии и смесь инкубировали в течение 25 минут при 4°С. После промывания PBS, содержащим 10% (об/об) FCS, экспрессию CD-антигенов обнаруживали с использованием FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA) согласно руководству FACSCalibur Traing manual (FACStation ver1.1. Becton Dickinsojn, Franklin Lakes, New Jersey, USA). В соответствии с FACS-анализом было установлено, что более 90% моноядерных клеток экспрессировали маркер предшественника CD34 после их размножения в указанных выше условиях. После того как рассматриваемые CD-34-положительные клетки обрабатывали 50 нг/мл G-CSF (Souza, L.M., et al. Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells. Science 232, 61-65 (1986). Pepro Tech EC, London, UK. Catalog № 300-23), за 7 дней более 80% клеток дифференцировали в CD-34-отрицательные, CD13- и CD15-положительные миелобласты и миелоциты и через 14 дней в нейтроофилы после добавления G-CSF.

2-2. кДНК, предпочтительно экспрессирующие в опухолях, но не в предшественниках гранулоцитов и других неопухолевых тканях

В результате экспериментов с чипом ДНК было получено несколько сотен кДНК, в которых отсутствовала мРНК (в соответствии с запросом на отсутствие), или ее экспрессия протекала с очень низкими уровнями (о чем судили по среднему значению разности ниже 50) в предшественниках гранулоцитов и печени, в то время как наблюдалась экспрессия (в соответствии с запросом на присутствие) с заметными уровнями (о чем судили по значению средней разности выше 200) в опухолях молочной железы, печени, желудка, колоректальной области, поджелудочной железы, или яичников у более чем 50% общего числа пациентов. Из таких кДНК отбирали более 150 кДНК, кодирующих белки с известной каталитической активностью. Такие ферменты включают фосфолипазу С, микросомальную дипептидазу, арилсульфатазу А, DT-диафоразу, пирролин 5'-карбоксиредуктазу, дегидродиолдегидрогеназу, карбонилредуктазу, лизилгидроксилазу, пролидазу, дигидропиримидиназу, гамма-глютимилтранспептидазу, глутамин:фруктоза-6-фосфатамидотрансферазу, UDP-галактозакерамидгалактозилтрансферазу, лизилоксидазу, енолазу, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу, уридинфосфорилазу, стеароил-кофермент десатуразу, эпоксидгидролазу, альдолазу С.

2-3. Кинетический RT-PCR анализ

Уровни содержания мРНК в кДНК ТТС-активирующего фермента также проверяли исследованием кинетики RT-PCR. Кинетику RT-PCR изучали по флуоресценции в реальном времени в PCR системе. Амплификацию PCR с использованием LightCycler system (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Catalog № 2011468) проводили в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из исходной смеси, содержащей Taq ДНК полимеразу, реакционный буфер, dNTP смесь и краситель SYBR Green I dye (LightCycler - DNA Master SYBR Green I, Roche Diagnistics, Mannheim, Germany, Catalog # 2158817), 4 мМ хлористого магния (Nacalai rescque, Tokyo, Japan, Catalog № 7791-18-6), 10 пикомолей PCR праймеров (Sawady Technology, Tokyo, Japan) и 2 мкл матричной кДНК в LightCycler капилляре (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Catalig № 1909339). Праймеры, амплифицирующие кДНК человеческой микросомальной дипептидазы, имели последовательность ATCGACTTGGCTCACGTGTCTGTGG и TGTGATCCAGATGGTCGGCCACTTG. Амплификацию проводили в LightCycler, осуществляя 40 инкубационных циклов при 95°С в течение времени от 0 секунд до денатурации, при 57-60°С в течение 3-10 секунд с целью отжига и при 72°С в течение 10 секунд с целью наращивания, при градиенте температуры 20°С/сек. Мониторинг PCR в системе реального времени обеспечивался измерением сигналов флуоресценции к концу фазы денатурации в каждом цикле амплификации. кДНК нормальных легких, сердца, печени, почек, кишечника, толстой кишки, кожи и мозга синтезировали с использованием РНК, поставляемой Srtategene (Srtategene, La Jolla, USA, Catalog № В6030-01 для мозга, D6050-01 для толстой кишки, D6064-01 для сердца, D6065-01 для тонкого кишечника, D6070-01 для почек, D6080-01 для печени, D6115-01 для кожи).

Для качественной оценки целостности выделенной РНК и нормализации числа копий целевых последовательностей также проводили кинетический RT-PCR анализ на глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH) с использованием зондов для гибридизации. Внешние стандарты для целевой мРНК и мРНК для GAPDH готовили 10-кратными серийными разведениями (от 103 до 108) плазмидной ДНК. Количественное определение мРНК в каждом образце проводили автоматически, обращаясь к стандартной кривой, построенной в каждый момент времени с помощью программного обеспечения LightCycler (LightCycler software version 3, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Праймеры для амплификации кДНК GAPDH имели следующие последовательности:

TCTCCAGAACATCATCCCTGCCTCTAC и

TGCTGTAGCCCAAATTCGTTGTCATACC.

Хотя микросомальную дипептидазную мРНК обнаруживали в почках и тонких кишках, она отсутствовала в легких, сердце, желудке, толстой кишке и печени. Однако уровни содержания микросомальной дипептидазной мРНК, обнаруженные в 12 колоректальных опухолях, были значительно выше, чем в почках и мелких кишках.

Уровни микросомальной дипептидазной мРНК в человеческих тканях.

ТканиУровень мРНК (относительно мРНКGAPDH)

Микросомальная дипептидазная мРНК/мРНК GAPDH
Колоректальные опухоли2,6
Предшественники гранулоцитов0,02
Толстая кишка0,06
Кожа<0,01
Мозг<0,01
Сердце<0,01
Печень0,03
Почки0,58
Тонкий кишечник0,37

Пример 3:

Формиат 13α-((2R,3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-амино-4-метилпентаноиламино)-5-гидроксикарбонил]пентаноилокси}-3-бензоиламино-3-фенилпропионилокси-2α-бензилокси-4α,10β-диацетокси-1β,7β-дигидрокси-5β,20-эпокси-такс-11-ен-9-она

а) Смесь 2α-бензилокси-13α-((2R,3S)-3-бензоиламино-2-гидрокси-3-фенилпропионилокси)-4α,10β-диацетокси-1β,7β-дигидрокси-5β,20-эпокси-такс-11-ен-9-она (таксол) (50,6 мг), гидрохлорида 1-[3-(диметиламино)пропил]-этилкарбодиимида (13,9 мг), диметиламинопиридина (1,0 мг) и 1-бензилового эфира (2S)-2-((2S)-2-бензилоксикарбониламино-4-метил-пентаноиламино)гексановой дикислоты (31,9 мг) в дихлорметане (2,0 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 22 часов. Реакционную смесь охлаждали водой (3 мл) и органический слой отделяли. Водный слой дважды экстрагировали дихлорметаном. Объединенный органический слой промывали рассолом и сушили над безводным сульфатом натрия, после чего концентрировали в вакууме. Полученную смесь очищали хроматографией на колонке с силикагелем, проводя элюирование смесью дихлорметан-этилацетат (2:1) с получением 13α-((2R,3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-бензилоксикарбониламино-4-метилпентаноиламино)-5-гидроксикарбонил]пентаноилокси}-3-бензоиламино-3-фенилпропионилокси-2α-бензилокси-4α,10β-диацетокси-1β,7β-дигидрокси-5β,20-эпокси-такс-11-ен-9-она в виде бледно-желтого твердого материала (74,8 мг, 97,6%).

b) Смесь, состоящую из полученного выше 13α-((2R,3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-бензилоксикарбониламино-4-метилпентаноиламино)-5-гидроксикарбонил]пентаноилокси}-3-бензоиламино-3-фенилпропионилокси-2α-бензилокси-4α,10β-диацетокси-1β,7β-дигидрокси-5β,20-эпокси-такс-11-ен-9-она (31,3 мг), 10% Pd/C (7,1 мг) и муравьиной кислоты (0,42 мл) в метаноле (6,0 мл), перемешивали в присутствии Н2 при комнатной температуре в течение 6,5 часов. Образовавшуюся смесь фильтровали и фильтрат концентрировали в вакууме с получением формиата 13α-((2R,3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-амино-4-метилпентаноиламино)-5-гидроксикарбонил]пентаноилокси}-3-бензоиламино-3-фенилпропионилокси-2α-бензилокси-4α,10β-диацетокси-1β,7β-дигидрокси-5β,20-эпокси-такс-11-ен-9-она в виде бледно-желтого твердого материала 23,6 мг, 91%).

1Н-ЯМР (CDCl3):δ 0,8˜0,9 (6Н, м), 0,98 (3Н, с), 1,20 (3Н, с), 1,48 (3Н, с), 1,2˜1,6 (2Н, м), 1,55˜1,8 (7Н, м), 1,75 (3Н, с), 2,16 (3Н, с), 2,3˜2,5 (6Н, м), 2,25 (3Н, с), 3,50 (1Н, шир), 3,80 (1Н, м), 3,95 (2Н, м), 4,08 (1Н, м), 4,7˜4,9 (3Н, м), 5,32 (1Н, д, J=11 Гц), 5,39 (1Н, д, J=8 Гц), 5,50 (1Н, т, J=9 Гц), 5,78 (1Н, дrт, J=8,8 Гц), 6,29 (1Н, с), 7,17 (1Н, м), 7,4˜7,8 (11Н, м), 7,87 (2Н, м), 7,98 (2Н, м), 9,28 (1Н, д, J=11 Гц); ESI-MS: m/z 1110 (М+-НСО2Н).

Соединения примеров 4 и 5 получали по методике Примера 3 из 1-бензилового эфира (2S)-2-((2S)-2-бензилоксикарбониламино-3-фенилпропиониламино)гександиовой кислоты или 1-бензилового эфира (2S)-2-((2S)-2-бензилоксикарбониламино-пропиониламино) гександиовой кислоты.

Пример 4:

Формиат 13α-((2R,3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-амино-пропиониламино)-5-гидроксикарбонил]пентаноилокси}-3-бензоиламино-3-фенилпропионилокси-2α-бензилокси-4α,10β-диацетокси-1β,7β-дигидрокси-5β,20-эпокси-такс-11-ен-9-она

1Н-ЯМР (CDCl3):δ 1,04 (3Н, с), 1,10 (3Н, с), 1,20 (3Н, д, J=11 Гц), 1,49 (3Н, с), 1,5˜1,8 (6Н, м), 1,75 (3Н, с), 2,14 (3Н, с), 2,3˜2,5 (6Н, м), 2,25 (3Н, с), 3,50 (1Н, шир), 3,80 (1Н, м), 3,98 (2Н, м), 4,12 (1Н, м), 4,7˜4,9 (3Н, м), 5,32 (1Н, д, J=11 Гц), 5,42 (1Н, д, J=8 Гц), 5,52 (1Н, т, J=9 Гц), 5,80 (1Н, дrт, J=8,8 Гц), 6,39 (1Н, с), 7,18 (1Н, м), 7,4˜7,8 (11Н, м), 7,87 (2Н, м), 7,98 (2Н, м), 9,31 (1Н, д, J=11 Гц); ESI-MS: m/z 1068 (М+-НСО2Н).

Пример 5:

Формиат 13α-((2R,3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-амино-3-йенил-пропиониламино)-5-гидроксикарбонил]пентаноилокси}-3-бензоиламино-3-фенилпропионилокси-2α-бензилокси-4α,10β-диацетокси-1β,7β-дигидрокси-5β,20-эпокси-такс-11-ен-9-она

1Н-ЯМР (CDCl3):δ 0,98 (3Н, с), 1,00 (3Н, с), 1,47 (3Н, с), 1,4˜1,8 (6Н, м), 1,75 (3Н, с), 2,08 (3Н, с), 2,3˜2,5 (8Н, м), 2,20 (3Н, с), 3,60 (1Н, шир), 3,80 (1Н, м), 3,98 (2Н, м), 4,10 (1Н, м), 4,70 (1Н, шир.), 4,9 (2Н, шир), 5,31 (1Н, д, J=11 Гц), 5,40 (1Н, д, J=8 Гц), 5,53 (1Н, т, J=9 Гц), 5,79 (1Н, дrт, J=8,8 Гц), 6,29 (1Н, с), 7,15˜7,30 (6Н, м), 7,4˜7,8 (11Н, м), 7,87 (2Н, м), 7,98 (2Н, м), 9,31 (1Н, д, J=11 Гц); ESI-MS: m/z 1144 (М+-НСО2Н).

Пример 6:

(2R)-((2S)-амино-3-циклогексил-пропиониламино)-(3S)-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидрофуран-(2R)-ил)-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси]-масляная кислота.

а) К перемешиваемому раствору 2,5 г (8,09 ммоля) BOC-D-Thr(Bzl)-OH в 200 мл CH2CCl2 (обезвоженный) добавляли 1,3 мл (8,9 ммоля) 2-(триметилсилил)этанола, 0,5 г (4,04 ммоля) DMAP и 2,3 г (12,13 ммоля) WSC HCl. Полученную смесь перемешивали в течение 5 часов в атмосфере Ar при комнатной температуре. Реакционную смесь охлаждали добавлением воды и органический слой отделяли. Водный слой экстрагировали EtOAc. Объединенный органический слой промывали водой и рассолом. Экстракт сушили над безводным Na2SO4 и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Сырой продукт очищали флеш-хроматографией на SiO2 (элюент: 20% EtOAc/гексан) с получением 2-триметилсиланилэтилового эфира (3S)-бензилокси-(2R)-трет-бутоксикарбониламино-масляной кислоты в виде бесцветного вязкого масла (2,66 г, 79%).

1Н-ЯМР (270 МГц, CDCl3) δ 0,02 (9Н, с), 0,90 (2Н, д.д.д, J=6,6, 3,3, 2,6 Гц), 1,23 (3Н, д, J=6,3 Гц), 1,43 (9Н, с), 4,03-4,26 (4Н, м), 4,34 (1Н, д, J=12,0 Гц, АВ), 4,54 (1Н, д, J=12,0 Гц, АВ), 5,26 (1Н, д, J=9,6 Гц), 7,18-7,33 (5Н, м); MS: (LCMS) m/z 410 [М+H]+, 432 [M+Na].

b) К перемешиваемому раствору 2,68 г (6,55 ммоля) 2-триметилсиланилэтилового эфира (3S)-бензилокси-(2R)-трет-бутоксикарбониламино-масляной кислоты в 50 мл CH2Cl2 (обезвоженный) добавляли 4,5 мл TFA при комнатной температуре. Полученную смесь перемешивали в течение 7 часов и концентрировали при пониженном давлении с получением трифторацетата 2-триметилсиланилэтилового эфира (2R)-амино-(3S)-бензилокси масляной кислоты в виде вязкого бледно-желтого масла (в количестве 3,555 г). Полученный продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

1Н-ЯМР (270 МГц, CDCl3) δ 0,03 (9Н, с), 0,88 (2Н, д.д.д, J=11,9, 5,9, 5,3 Гц), 1,36 (3Н, д, J=6,3 Гц), 3,94 (1Н, д, J=3,3 Гц), 4,11 (2Н, м), 4,23 (1Н, д.д, J=10,2, 6,9 Гц), 4,37 (1Н, д, J=11,9 Гц, АВ), 4,61 (1Н, д, J=11,9 Гц, АВ), 5,26 (1Н, д, J=9,6 Гц), 7,18-7,34 (5Н, м); MS: (LCMS) m/z 310 [М+H]+.

с) К перемешиваемому раствору 181,6 г (0,439 ммоля) трифторацетата 2-триметилсиланилэтилового эфира (2R)-амино-(3S)-бензилокси масляной кислоты в 5 мл CH2Cl2 (безводный препарат) добавляли 131 мг (0,484 ммоля) N-BOC-(L)- циклогексилаланина и 170 мг (0,878 ммоля) WSC + HCl при комнатной температуре.

Полученную смесь перемешивали в течение 18 часов в атмосфере Ar при комнатной температуре. Реакционную смесь охлаждали добавлением воды и органический слой отделяли. Водный слой экстрагировали EtOAc. Объединенный органический слой промывали водой и рассолом. Экстракт сушили над безводным Na2SO4 и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Сырой продукт очищали флеш-хроматографией на SiO2 (элюент: 10% EtOAc/гексан) с получением 2-триметилсиланилэтилового эфира (3S)-бензилокси-(2R)-((2S)-третбутоксикарбониламино-3-циклогексил-пропиониламино)масляной кислоты в виде бесцветного вязкого масла (63,1 мг, 26%).

1Н-ЯМР (270 МГц, CDCl3) δ 0,02 (9Н, с), 0,91 (2Н, д.д.д, J=10,2, 7,5, 6,9 Гц), 0,24-1,82 (13Н, м), 1,21 (3Н, д, J=6,3 Гц), 1,43 (9Н, с), 4,03-4,26 (3Н, м), 4,37 (1Н, д, J=11,9 Гц, АВ), 4,57 (1Н, д, J=11,9 Гц, АВ), 4,59 (1Н, д.д, J=9,6, 2,3 Гц), 4,83 (1Н, м), 6,77 (1Н, д, J=8,9 Гц), 7,21-7,64 (5Н, м); MS: (LCMS) m/z 563 [М+H]+.

d) К перемешиваемому раствору 61,3 мг (0,109 ммоля) 2-триметилсиланилэтилового эфира (3S)-бензилокси-(2R)-((2S)-третбутоксикарбонил-амино-3-циклогексилпропиониламино)масляной кислоты в 10 мл CH2Cl2 (обезвоженный) добавляли 1,0 мл TFA при комнатной температуре. Полученную смесь перемешивали в течение 1 часа и затем концентрировали при пониженном давлении с получением трифторацетата 2-триметилсиланилэтилового эфира (2R)-((2S)-амино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-бензилокси-масляной кислоты в виде бесцветного вязкого масла (в количестве 77,9 мг). Полученный продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

1Н-ЯМР (270 МГц, CDCl3): δ 0,02 (9Н, с), 0,88 (2Н, м), 0,8-1,74 (13Н, м), 1,19 (3Н, д, J=6,3 Гц), 4,00-4,21 (3Н, м), 4,11 (2Н, м), 4,35 (1Н, д, J=11,9 Гц, АВ), 4,54 (1Н, д.д, J=8,2, 2,3 Гц), 4,57 (1Н, д, J=11,9 Гц, АВ), 7,20-7,35 (5Н, м); MS: (LCMS) m/z 463 [М+H]+.

е) К перемешиваемому раствору трифторацетата 2-триметилсиланилэтилового эфира (2R)-((2S)-амино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-бензилокси-масляной кислоты в 5,0 мл ТГФ при комнатной температуре прикапывали 130 мл 1 моль/л NaOH. рН реакционной смеси устанавливали на значении 7. После этого в реакционную смесь добавляли 74 мг (0,262 ммоля) 2-(триметилсилил)этил п-нитрофенилкарбоната и полученную смесь нагревали до 60°С на масляной бане. После перемешивания в течение 1 дня при 60°С смесь охлаждали до комнатной температуры и разбавляли EtOAc (20 мл) и водой (20 мл) и органический слой отделяли. Водный слой экстрагировали EtOAc. Объединенный органический слой промывали водой и рассолом. Экстракт сушили над безводным Na2SO4 и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Сырой продукт очищали методом флеш-хроматографии на SiO2 (элюент: 10%-15% EtOAc/гексан) с получением 2-триметисиланилового эфира (3S)-бензилокси-(2R)-[3-циклогексил-(2S)-(2-триметилсиланил-этоксикарбониламино)-пропиониламино]-масляной кислоты в виде бесцветного вязкого масла (49,6 мг, 62%).

1Н-ЯМР (270 МГц, CDCl3) δ 0,02 (18Н, с), 0,87-1,04 (6Н, м), 1,10-1,28 (2Н, м), 1,21 (3Н, д, J=6,3 Гц), 1,37-1,57 (3Н, м), 1,67-1,83 (6Н, м), 4,03-4,23 (4Н, м), 4,36 (1Н, м), 4,38 (1Н, д, J=11,9 Гц, АВ), 4,58 (1Н, д, J=11,9 Гц, АВ), 4,59 (1Н, д.д, J=9,2, 2,3 Гц), 4,97 (1Н, м), 6,68 (1Н, д, J=9,2 Гц), 7,23-7,36 (5Н, м); MS: (LCMS) m/z 607 [М+H]+, 629 [M+Na]+.

f) К раствору 2-триметисиланилового эфира (3S)-бензилокси-(2R)-[3-циклогексил-(2S)-(2-триметилсиланил-этоксикарбониламино)-пропиониламино]-масляной кислоты в 10 мл EtOAc добавляли 10% Pd/C. Реакционную смесь тщательно перемешивали в атмосфере Н2. После перемешивания в течение 2 часов смесь фильтровали пропусканием через колонку с тонким слоем Celite. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением 2-триметисиланилового эфира (2R)-[3-циклогексил-(2S)-(2-триметилсиланил-этоксикарбониламино)-пропиониламино]-(3S) гидрокси-масляной кислоты в виде бесцветного вязкого масла. Полученный продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

1Н-ЯМР (270 МГц, CDCl3): δ 0,04 (9Н, с), 0,05 (9Н, с), 0,09-1,07 (6Н, м), 1,11-1,30 (2Н, м), 1,22 (3Н, д, J=6,3 Гц), 1,37-1,56 (3Н, м), 1,67-1,82 (6Н, м), 2,09 (1Н, д, J=5,3 Гц), 4,15-4,36 (7Н, м), 4,54(1Н, д.д, J=8,9, 2,6 Гц), 4,95 (1Н, д, J=7,6 Гц), 6,76 (1Н, д, J=8,6 Гц); MS: (LCMS) m/z 517 [М+H]+, 539 [M+Na]+.

g) К перемешанному раствору 39,1 мг (0,075 ммоля) 2-триметисиланилового эфира (2R)-[3-циклогексил-(2S)-(2-триметилсиланил-этоксикарбониламино)-пропиониламино]-(3S) гидроксимасляной кислоты в 5,0 мл CH2Cl2 (обезвоженная) при комнатной температуре добавляли 30 мг (0,151 ммоля) хлорформиата 4-нитрофенила и 1,0 мл пиридина.

После перемешивания в течение 3 часов реакционную смесь охлаждали водой и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали EtOAc. Объединенный органический слой промывали водой и рассолом. Экстракт сушили над безводным Na2SO4 и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Сырой продукт очищали методом флеш-хроматографии на SiO2 (элюент: 20% EtOAc/гексан) с получением 2-триметилсиланилэтилового эфира (2R)-[3-циклогексил-(2S)-(2-триметилсиланил-этоксикарбониламино)-пропиониламино]-(3S)-(4-нитрофеноксикарбонилокси)-масляной кислоты в виде бесцветного твердого материала (64,7 мг).

1Н-ЯМР (270 МГц, CDCl3): δ 0,02 (9Н, с), 0,04 (9Н, с), 0,97-1,04 (6Н, м), 1,17-1,38 (3Н, м), 1,41 (3Н, д, J=6,3 Гц), 1,47-1,83 (8Н, м), 4,16-4,33 (5Н, м), 4,84 (1Н, д.д, J=9,2, 2,6 Гц), 4,90 (1Н, м), 7,38 (2Н, д, J=9,2 Гц), 8,2 (2Н, д, J=9,2 Гц); MS: (LCMS) m/z 681 [М+H]+.

h) К перемешанному раствору 62,2 мг (0,09 ммоля) 2-триметилсиланилэтилового эфира (2R)-[3-циклогексил-(2S)-(2-триметилсиланил-этоксикарбониламино)-пропиониламино]-(3S)-(4-нитрофеноксикарбонилокси)-масляной кислоты в 5 мл ТГФ (обезвоженный) добавляли 85 мг (0,182 ммоля) 3',5'-ди-третбутилдиметисилил-DMDC при комнатной температуре. Реакционную смесь нагревали до 60°С на масляной бане. После перемешивания в течение 4 дней смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали при пониженном давлении. Маслянистый остаток растворяли в EtOAc и промывали насыщенным NaHCO3, водой и рассолом. Органический слой сушили над безводным Na2SO4 и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Сырой продукт очищали методом флеш-хроматографии на SiO2 (элюент: 20-30% EtOAc/гексан) с получением 2-триметилсиланилэтилового эфира (2R)[3-циклогексил-(2S)-(2-триметилсиланил-этоксикарбониламино)-пропиониламино]-(3S)-{1-[(4S)-(третбутилдиметилсиланилокси)-(5R)-(третбутилдиметилсиланилоксиметил)-3-метилен-тетрагидрофуран-(2R)-ил]-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси}-масляной кислоты в виде бесцветного твердого материала (38,8 мг, 50%, 2 стадии).

1Н-ЯМР (270 МГц, CDCl3) δ 0,00 (12Н, с), 0,01 (9Н, с), 0,02 (9Н, с), 0,92 (9Н, с), 0,95 (9Н, с), 0,86-1,81 (13Н, м), 1,33 (3Н, д, J=6,3 Гц), 3,82 (2Н, м), 4,17 (4Н, м), 4,40 (1Н, шир.с), 4,78 (2Н, м), 5,32 (3Н, м), 5,66 (1Н, шир.с), 6,79 (1Н, шир.с), 7,1 (1Н, шир.д, J=6,9 Гц), 7,65 (1Н, шир.с), 8,16 (1Н, шир.д, J=6,9 Гц), 9,80 (1Н, шир.с); MS: (LCMS) m/z 1010 [М+H]+.

i) К перемешанному раствору 37,3 мг (0,037 ммоля) 2-триметилсиланилэтилового эфира (2R)[3-циклогексил-(2S)-(2-триметилсиланил-этоксикарбониламино)-пропиониламино]-(3S)-{1-[(4S)-(третбутилдиметилсиланилокси)-(5R)-(третбутилдиметилсиланилоксиметил)-3-метилен-тетрагидрофуран-(2R)-ил]-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси}-масляной кислоты в 5,0 мл ТГФ (обезвоженный) добавляли 220 мл фтористого н-тетрабутиламмония (1 моль/л в ТГФ) при комнатной температуре.

После перемешивания в течение 1 часа растворитель удаляли при пониженном давлении, маслянистый желтоватый остаток очищали методом препаративной ЖХВР (С18)* с получением (2R)-((2S)-амино-3-циклогексилпропиониламино)-(3S)-{1-((4S)-гидрокси-пиримидин-4-илкарбамоил]-масляной кислоты в виде бесцветного твердого вещества (12,1 мг, 61%).

*Условия проведения анализа методом ЖХВР: колонка, 2×25см (TSK-гель 80-TS ODS), элюент; 5% MeCN/H2O до 100% MeCN (30 минут, линейный градиент), расход газа 9 мл/мин, детекция: фотодиодная матрица.

1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD): δ 0,95-1,82 (13Н, м), 2,65 (3Н, д, J=6,6 Гц), 3,79 (2Н, м), 3,95 (2Н, м), 4,46 (1Н, д, J=4,3 Гц), 4,68 (1Н, м), 5,42 (1Н, д.д, J=6,6, 4,3 Гц), 5,47 (2Н, т, J=2,0 Гц), 6,67 (1Н, д, J=1,3 Гц), 7,26 (1Н, д, J=7,6 Гц), 8,20 (1Н, д, J=7,6 Гц); MS: (FABMS) m/z 538 [М+H]+.

Следующие соединения примеров 7-13 получали из DMDC с использованием дипептидных (треонин) производных формулы (VIII), следуя методике, аналогичной методике Примера 6.

Пример 7:

(2R)-((2S)-Амино-4-метил-пентаноиламино)-(3S)-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидрофуран-(2R)-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоилокси]-масляную кислоту получали из 2-триметилсиланилэтилового эфира (3S)-гидрокси-(2R)-[4-метил-(2S)-(2-триметилсиланил-этоксикарбониламино)-пентаноиламино]-масляной кислоты.

1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,98 (6Н, д, J=4,9 Гц), 1,31 (3Н, д, J=6,3 Гц), 1,63-1,76 (3Н, м), 3,77-3,99 (4Н, м), 4,46 (1Н, д, J=4,0 Гц), 4,73 (1Н, м), 5,41 (1Н, м), 5,46 (2Н, с), 6,66 (1Н, с), 7,26 (1Н, д, J=7,3 Гц), 8,19 (1Н, д, J=7,3 Гц); MS: (FABMS) m/z 498 [М+H]+.

Пример 8:

(2S)-((2S)-Амино-3-бифенил-4-ил-пропиониламино)-(3S)-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидрофуран-(2R)-ил)-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси]-масляную кислоту получали из триметилсиланилэтилового эфира (2R)-[3-бифенил-4-ил-(2S)-(2-триметилсиланил-этоксикарбониламино)-пропиониламино]-(3S)-гидроксимасляной кислоты.

1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,92 (3Н, д, J=6,6 Гц), 3,20 (2Н, м), 3,76 (2Н, м), 3,84 (1Н, м), 4,26 (1Н, т, J=7,56 Гц), 4,35 (1Н, д, J=3,3 Гц), 4,68 (1Н, м), 5,28 (1Н, д.д, J=6,3, 3,0 Гц), 5,47 (2Н, м), 6,54 (1Н, д, J=1,6 Гц), 7,11 (1Н, д, J=7,6 Гц), 7,23-7,60 (9Н, м), 8,13 (1Н, д, J=7, 6 Гц); MS: (FABMS) m/z 608 [М+H]+.

Пример 9:

(2S)-((2S)-Амино-3-бифенил-4-ил-пропиониламино)-3-{1-[4(S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидрофуран-(2R)-ил)-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси]-пропионовую кислоту получали из триметилсиланилэтилового эфира (2R)-[3-бифенил-4-ил-(2S)-(9Н-флуорен-9-илметоксикарбониламино)-пропиониламино]-3-гидроксипропионовой кислоты.

1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 3,13 (2Н, ддд, J=13,2, 8,9, 8,2 Гц), 3,76 (1Н, м), 3,87 (2Н, м), 4,13 (1Н, дд, J=8,2, 6,9 Гц), 4,21 (1Н, дд, J=10,9, 3,3 Гц), 4,35 (1Н, дд, J=10,9, 5,3 Гц), 4,59 (1Н, дд, J=5,2, 3,0 Гц), 4,70 (1Н, м), 5,48 (2Н, д, J=2,3 Гц), 6,62 (1Н, д, J=1,3 Гц), 6,98 (1Н, д, J=7,6 Гц), 7,20-7,57 (9Н, м), 8,04 (1Н, д, J=7,6 Гц); MS: (FABMS) m/z 594 [М+H]+.

Пример 10

2-триметилсиланилэтиловый эфир (2R)-((2S)-Амино-3-нафталин-2-ил-пропиониламино)-(3S)-[1-(4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидро-фуран-(2R)-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоилокси]-масляной кислоты получали из 2-триметилсиланилэтилового эфира (3S)-гидрокси-(2R)-[3-нафтален-2-ил-(2S)-(2-триметилсиланил-этоксикарбониламино)-пропиониламино]масляной кислоты.

1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,69 (3Н, д, J=6,6 Гц), 3,20 (2Н, м), 3,80 (1Н, м), 3,90 (2Н, м), 4,29-4,35 (2Н, м), 4,67 (1Н, м), 5,24 (1Н, д.д, J=6,6, 3,0 Гц), 5,46 (2Н, с), 6,65 (1Н, д, J=1,7 Гц), 7,12 (1Н, д, J=7,5 Гц), 7,38-7,47 (3Н, м), 7,81-7,87 (4Н, м), 8,13 (1Н, д, J=7,5 Гц); MS: (FABMS) m/z 582 [М+H]+.

Пример 11:

(2R)-{(2S)-Амино-3-[4-(4-гидроксифенокси)-фенил]-пропиониламино}-3-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидрофуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоилокси]-масляную кислоту получали из 2-триметилсиланилэтилового эфира (3S)-гидрокси-(2R)-[3-{4-[4-(третбутил-диметил-силаноилокси)-фенокси]-фенил}-(2S)-(2-триметилсилагил-этокси-карбониламино)-пропиониламино]масляной кислоты.

1Н-ЯМР (CD3OD): δ 0,95 (3Н, д, J=6,2 Гц), 2,89-3,08 (2Н, м), 3,74-3,98 (3Н, м), 4,34 (1Н, д, J=2,9 Гц), 4,66 (1Н, м), 5,30 (1Н, м), 5,44 (2Н, с), 6,65 (1Н, с), 6,72 (2Н, д, J=7,1 Гц), 6,80 (2Н, д, J=7,0 Гц), 6,82 (2Н, д, J=8,5 Гц), 7,18 (2Н, д, J=8,6 Гц), 7,22 (1Н, д, J=7,6 Гц), 8,13 (1Н, д, J=7,6 Гц); MS: LC-MS m/z 640,0 [М+H]+.

Пример 12:

(2R)-{(2S)-Амино-3-[4метоксифенил]-пропиониламино}-(3S)-[1-[(4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидрофуран-2-ил]-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоилокси]-масляную кислоту получали из 2-триметилсиланил-этилового эфира (3S)-гидрокси-(2R)-[3-(4-метоксифенил)-(2S)-(2-триметилсиланил-этокси-карбониламино)-пропиониламино]масляной кислоты.

1Н-ЯМР (CD3OD) δ 0,93 (3Н, д, J=6,6 Гц), 2,91-3,14 (2Н, м), 3,72 (с, 3Н), 3,73-3,95 (3Н, м), 4,11 (1Н, т, J=6,7 Гц), 4,34 (1Н, шир), 4,65 (1Н, м), 5,31 (1Н, м), 5,45 (2Н, с), 6,65 (1Н, с), 6,86 (2Н, д, J=6,9 Гц), 7,17 (2Н, д, J=7,0 Гц), 7,21 (1Н, д, J=8,6 Гц), 8,15 (1Н, д, J=6,9 Гц); ESI-MS m/z 561,9 [М+H]+, 434, 297, 150.

Пример 13:

Триметилсиланилэтиловый эфир (2R)-[(2S)-Амино-4-этилсульфанил-бутириламино]-(3S)-[1-[(4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидро-фуран-(2R)-ил]-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоил]-масляную кислоту получали из триметилсиланилэтилового эфира (2R)-[4-этинилсульфанил-(2S)-(3-триметилсиланил-пропиониламино)-бутиламино]-(3S)-гидроксимасляной кислоты.

Н-ЯМР (400 МГц, CD3OD) δ 1,22 (3Н, т, J=7,6 Гц), 1,34 (3Н, д, J=6,4 Гц), 2,05 (1Н, м), 2,14 (1Н, м), 2,52-2,62 (4Н, м), 3,80 (2Н, м), 3,93 (1Н, м), 4,08 (1Н, т, J=6,6 Гц), 4,49 (1Н, д, J=4,0 Гц), 4,68 (1Н, м), 5,42 (1Н, дд, J=6,4, 4,0 Гц), 5,47 (2Н, шир), 6,67 (1Н, с), 7,25 (1Н, д, J=7,2 Гц), 8,20 (1Н, д, J=7,6 Гц); MS: (FAB-MS) m/z 530 [М+H]+.

Пример 14:

(2R)-{(2S)-Амино-3-(1Н-индол-3-ил)пропиониламино]-4-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилентетрагидрофуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоил]масляная кислота.

(а) Смесь Teoc-L-Trp-OH (25 г), гидрохлорида 5-бензилового эфира-1-(2-триметилсиланилэтилового эфира (2R)-аминопентандиовой кислоты (23 г), полученного по описанной в литературе методике (Pacofsky, Gregory J; J. Med. Chem., 41, 11, 1998, 1894-1908), WSCI (14 г), и диизопропилэтиламина (25 мл) в дихлорметане (250 мл) перемешивали при комнатной температуре в атмосфере Ar в течение 22 часов. Реакционную смесь охлаждали водой и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали дихлорметаном. Объединенный органический слой промывали рассолом и сушили над безводным сульфатом натрия, после чего концентрировали в вакууме.

Сырой остаток очищали методом хроматографии на колонке с силикагелем, проводя элюирование смесью н-гексан-этилацетат (2:1) с получением 5-бензилового эфира 1-(2-триметилсиланилэтилового) эфира (2R)-[3-(1H-индол-3-ил)-2S-(2-триметилсиланилэтоксикарбониламино)пропиониламино]пентандиовой кислоты в виде бесцветного масла (39 г, 93,2%).

1Н-ЯМР [270 МГц: CDCl3]: δ 0,023-0,005 (18Н, м), 0,88-0,98 (4Н, м), 0,6-2,0 (4Н, м), 3,07-3,15 (1Н, м), 3,25-3,30 (1Н, м), 4,06-4,17 (4Н, м), 4,4-4,6 (2Н, м), 5,08 (2Н, с), 5,2-5,3 (1Н, шир.с), 6,18 (1Н, д, J=7,6 Гц), 6,96 (1Н, с), 7,0-7,25 (3Н, м), 7,3-7,4 (5Н, м), 7,66 (1Н, д, J=7,3 Гц), 7,81 (1Н, шир.с); FAB-MS: m/z 668 [М+H]+.

(b) Смесь 5-бензилового эфира 1-(2-триметилсиланилэтилового) эфира (2R)-[3-(1H-индол-3-ил)-2S-(2-триметилсиланилэтокси карбониламино)пропиониламино]пентандиовой кислоты (36 г) и 10% Pd-C (3,6 г) в этилацетате (350 мл) перемешивали в присутствии газообразного Н2 при комнатной температуре в течение 22 часов.

Реакционную смесь фильтровали и фильтрат выпаривали в вакууме с образованием 1-(2-триметилсиланилэтилового)эфира (2R)-[3-(1H-индол-3-ил)-2S-(2-триметилсиланилэтокси карбониламино)пропиониламино]пентандиовой кислоты в виде бесцветного масла (32 г).

1Н-ЯМР: [270 МГц: CDCl3]: δ 0,018-0,01 (18Н, м), 0,85-1,0 (4Н, м), 0,6-2,1 (4Н, м), 3,1-3,4 (2Н, м), 4,0-4,2 (4Н, м), 4,4-4,6 (2Н, м), 5,3-5,4 (1Н, шир.с), 6,5-6,6 (1Н, шир.с), 7,0-7,2 (3Н, м), 7,33 (1Н, д, J=7,6 Гц), 7,61 (1Н, д, J=8,2 Гц), 8,33 (1Н, шир.с) LS-MS: m/z 578 [М+H]+.

(с) Смесь 1-(2-триметилсиланилэтилового)эфира (2R)-[3-(1H-индол-3-ил)-2S-(2-триметилсиланилэтокси карбониламино)пропиониламино]пентандиовой кислоты (29 г), 3',5'-бис-О-(трет-бутилдиметилсилил)-2'-дезокси-2'-метилиденцитидина (24 г), BOP реагента (27 г) и диизопропилэтиламина (12 мл) в дихлорметане (500 мл) перемешивали при комнатной температуре в атмосфере Ar в течение 19 часов. Реакционную смесь охлаждали водой и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали дихлорметаном. Объединенный органический слой промывали рассолом и сушили над безводным сульфатом натрия, после чего концентрировали в вакууме.

Сырой остаток очищали методом хроматографии на колонке с силикагелем, проводя элюирование смесью н-гексан/ацетон (3:1) с получением 1-(2-триметилсиланилэтилового)эфира 4-[1-(4S-третбутилдиметилсиланилокси-5R-третбутилдиметилсиланилоксиметил-3-метилентетрагидрофуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоил]-2R-[3-(1H-индол-3-ил)-2S-(2-триметилсиланилэтоксикарбониламино)пропиониламино]масляной кислоты в виде бесцветного аморфного твердого вещества (45 г, 86,4%).

1Н-ЯМР: [270 МГц: CDCl3]: δ 0,01-0,13 (30Н, м), 0,8-1,0 (22Н, м), 1,6-2,1 (4Н, м), 3,1-3,3 (2Н, м), 3,78-3,85 (2Н, м), 4,0-4,2 (5Н, м), 4,35-4,45 (1Н, м), 4,45-4,65 (1Н, м), 4,77-4,79 (1Н, м), 5,33-5,34 (1Н, м), 5,44 (1Н, д, J=7,6 Гц), 5,6-5,7 (1Н, м), 6,51 (1Н, д, J=7,9 Гц), 6,78 (1Н, д, J=1,3 Гц), 7,07-7,23 (4Н, м), 7,35-7,38 (1Н, м), 7,64 (1Н, д, J=7,3 Гц), 8,17 (1Н, д, J=7,6 Гц), 8,63 (1Н, шир.с), 8,86 (1Н, шир.с); FAB-MS: m/z 1027 [М+H]+.

d) Смесь 1-(2-триметилсиланилэтилового)эфира 4-[1-((4S-третбутилдиметилсиланилокси-(5R)-третбутилдиметилсиланилоксиметил-3-метилентетрагидрофуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоил]-(2R)-[3-(1H-индол-3-ил)-(2S)-(2-триметилсиланилэтоксикарбониламино)пропиониламино]масляной кислоты (2 г) и TBAF [1 моль/л в ТГФ] (39 мл) в тетрагидрофуране (20 мл) перемешивали при комнатной температуре в атмосфере Ar в течение 23 часов. Реакционную смесь выпаривали в вакууме. Сырой остаток очищали методом ионно-обменной хроматографии [Amberlite®CG-50], проводя элюирование метанолом, и затем методом препаративной обратно-фазовой ЖХВР, проводя элюирование смесью Н2О-ацетонитрил (85:15), с получением (2R)-[(2S)-амино-3-(1Н-индол-3-ил)пропиониламино]-4-[1β-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилентетрагидрофуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоил]масляной кислоты в виде белого твердого материала (449 мг, 41,6%).

1Н-ЯМР: [270 МГц: CD3OD]: δ 1,6-2,0 (4Н, м), 3,17 (1Н, дд, J=7,3, 14,2 Гц), 3,2-3,4 (1Н, м), 3,76-3,83 (2Н, м), 3,93 (1Н, дд, J=3,3, 13,2 Гц), 4,06-4,17 (2Н, м), 4,66-4,69 (1Н, м), 5,44-5,47 (2Н, м), 6,67 (1Н, д, J=1,7 Гц), 6,98-7,08 (2Н, м), 7,17 (1Н, с), 7,29-7,32 (2Н, м), 7,58-7,61 (1Н, м), 8,16 (1Н, д, J=7,6 Гц); FAB-MS: m/z 555 [М+H]+.

Следующие вещества в примерах 15-18 получали из DNDC с использованием различных дипептидных (глютаминовая кислота) производных формулы (VII) с помощью способов, аналогичных способу Примера 14.

Пример 15:

(2R)-((2S)-Амино-3-циклогексилпропиониламино)-4-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилентетрагидрофуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоил]масляную кислоту получали из 1-(2-триметилсиланилэтилового)эфира (2R)-[3-циклогексил-(2S)-(2-триметилсиланилэтоксикарбониламино)пропиониламино]пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: [270 МГц: DMSO-d6]: δ 0,7-1,0 (2Н, м), 1,0-1,8 (11Н, м), 1,8-2,0 (2Н, м), 2,3-2,5 (2Н, м), 3,5-3,8 (4Н, м), 4,0 (1Н, м), 4,51-4,53 (1Н, м), 5,31 (1Н, с), 5,34 (1Н, с), 6,55 (1Н, с), 7,20 (1Н, д, J=7,6 Гц), 8,10 (1Н, д, J=7,3 Гц); FAB-MS: m/z 522 [М+H]+.

Пример 16:

(2R)-((2S)-Амино-3-бифенил-4-илпропиониламино)-4-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилентетрагидрофуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоил]масляную кислоту получали из 1-(2-триметилсиланилэтилового)эфира (2R)-[3-бифенил-4-ил-(2S)-(2-триметилсиланилэтоксикарбониламино)пропиониламино]пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: [270 МГц: DMSO-d6]: δ 1,7-1,8 (1Н, м), 1,9-2,0 (1Н, м), 2,2-2,4 (2Н, м), 2,76-2,80 (1Н, м), 3,0-3,04 (1Н, м), 3,5-4,0 (4Н, м), 4,08 (1Н, м), 4,52-4,54 (1Н, м), 5,12 (1Н, шир.с), 5,32 (1Н, с), 5,35 (1Н, с), 5,74 (1Н, шир.с), 6,55 (1Н, с), 7,17 (1Н, д, J=8,0 Гц), 7,28-7,40 (5Н, м), 7,55-7,60 (4Н, м), 8,09 (1Н, д, J=7,5 Гц), 8,11 (1Н, шир.с), 11,0 (1Н, шир.с); FAB-MS: m/z 592 [М+H]+.

Пример 17:

(2R)-((2S)-Амино-3-нафталин-2-илпропиониламино)-4-[1-((4S)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-3-метилентетрагидрофуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоил]масляную кислоту получали из 1-(2-триметилсиланилэтилового)эфира (2R)-[3-нфталин-2-ил-(2S)-(2-триметилсиланилэтоксикарбониламино)пропиониламино]пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: [270 МГц: DMSO-d6]: δ 1,7-2,0 (2Н, м), 2,3-2,35 (2Н, м), 2,89 (1Н, дд, J=8,6, 13,5 Гц), 3,19 (1Н, дд, J=5,3, 13,5 Гц), 3,5-4,0 (4Н, м), 4,0-4,1 (1Н, м), 4,51-4,54 (1Н, м), 5,31 (1Н, с), 5,34 (1Н, с), 6,55 (1Н, с), 7,19 (1Н, д, J=7,6 Гц), 7,39-7,47 (3Н, м), 7,73 (1Н, с), 7,80-7,84 (3Н, м), 8,11 (1Н, д, J=7,6 Гц), 8,20 (1Н, шир.с); FAB-MS: m/z 566 [М+H]+.

Пример 18:

(2R)-((2S)-Амино-3-циклогексил-пропиониламино)-(3S)-[1-(3,3-дифтор-(4R)-гидрокси-(5R)-гидроксиметил-тетрагидро-фуран-2-ил)-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоил]масляную кислоту получали из DFDC и 2-триметилсиланилэтилового эфира (2R)-[3-циклогексил-(2S)-(2-триметилсиланил-этоксикарбониламино)-пропиониламино]-(3S)-гидроксимасляной кислоты, следуя методике примера 6.

1Н-ЯМР: (270 МГц: CD3OD): δ 0,89-1,05 (2Н, м), 1,16-1,25 (2Н, м), 1,40-1,82 (9Н, м), 1,32 (3Н, д, J=6,3 Гц), 3,80 (1Н, дд, J=2,9, 12,5 Гц), 3,93-4,05 (3Н, м), 4,30 (1Н, дкв, J=4,3, 8,3 Гц), 4,44 (1Н, д, J=3,9 Гц), 5,42 (1Н, дт, J=2,0, 4,3 Гц), 6,24 (1Н, т, J=6,5 Гц), 7,31 (1Н, д, J=7,6 Гц), 8,33 (1Н, д, J=7,6 Гц); LC-MS: m/z 561,9 [М+H]+.

Пример 19:

(S)-[2(S)-Амино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-[1-(3,3-дифтор-4(R)-гидрокси-5(R)-гидроксиметил-тетрагидро-фуран-2-(R)-ил)-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси]-2-(S)-метилпропионовая кислота.

а) К перемешиваемому раствору 255,1 мг (0,514 ммоля) бензилового эфира 2(S)-[2(S)-бензилоксикарбониламино-3-циклогексил-пропиониламино]-3-гидрокси-2(S)-метилпропионовой кислоты в 10,0 мл CH2Cl2 (обезвоженный) добавляли 207 мг (1,028 ммоля) 4-нитрофенилхлорформиата и 83 мкл пиридина при комнатной температуре.

После перемешивания в течение 1,5 часа реакционную смесь охлаждали добавлением воды и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали EtOAc. Объединенный органический слой промывали водой и рассолом. Экстракт сушили над безводным Na2SO4 и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении.

Сырой продукт очищали методом флеш-хроматографии на SiO2 (элюент:20% EtOAc/гексан) с образованием бензилового эфира 2(S)-[2)S)-бензилоксикарбониламино-3-циклогексил-пропиониламино]-2(S)-метил-3-(4-нитро-феноксикарбонилокси)пропионовой кислоты в виде желтого твердого вещества (342,2 мг, количественный выход; включая небольшое количестве п-нитрофенола).

1Н-ЯМР: (270 МГц, CDCl3) δ 0,97 (2Н, м), 1,13-1,50 (5Н, м), 1,61 (3Н, с), 1,62-1,77 (6Н, м), 4,20 (1Н, м), 4,66 (1Н, д, J=10,9 Гц, АВ), 4,92 (1Н, д, J=10,9 Гц, АВ), 4,98 (1Н, шир.д), 5,08 (2Н, м), 5,22 (2Н, м), 6,92 (1Н, шир.с), 7,30 (2Н, д, J=9,6 Гц), 7,34 (10Н, с), 8,22 (2Н, д, J=9,6 Гц); MS: (LCMS) m/z 662 [М+H]+.

b) К перемешиваемому раствору 337 мг (0,509 ммоля) бензилового эфира 2(S)-[2)S)-бензилоксикарбониламино-3-циклогексил-пропиониламино]-2(S)-метил-3-(4-нитро-феноксикарбонилокси) пропионовой кислоты в 5 мл ТГФ (обезвоженный препарат) добавляли 310 мг (0,611 ммоля) 3',5'-ди-О-третбутилдиметилсилил-DFDC при комнатной температуре.

Реакционную смесь нагревали до 60°С на масляной бане. После перемешивания в течение 18 часов смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали при пониженном давлении. Маслянистый остаток растворяли в EtOAc и промывали насыщенным раствором NaHCO3, водой и рассолом. Органический слой сушили над безводным Na2SO4 и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Сырой продукт очищали методом флеш-хроматографии на SiO2 (элюент: 20-40% EtOAC/гексан) с получением продукта сшивания в виде бесцветного твердого материала (437,7 мг, 85%). Полученный продукт (106 мг; 0,105 ммоля) растворяли в 10 мл ТГФ (обезвоженный препарат) и затем добавляли в 200 мл фтористого н-тетрабутиламмония (1 моль/л в ТГФ) при комнатной температуре.

Поле перемешивания в течение 2 часов растворитель удаляли при пониженном давлении, маслянистый желтоватый остаток очищали методом флеш-хроматографии на SiO2 (элюент: 70% EtOAc - 100% EtOAc) c получением бензилового эфира 2(S)-[2(S)-бензилоксикарбониламино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-[1-(3,3-дифтор-4(R)-гидрокси-5(R)-гидроксиметил-тетрагидрофуран-2(R)-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиримидин-4-илкарбамоилокси]-2(S)-метилпропионовой кислоты в виде бесцветного твердого вещества (67,9 мг, 82%).

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,75 (2Н, м), 1,03-1,37 (4Н, м), 1,43 (3Н, с), 1,52-1,62 (7Н, м), 3,79 (2Н, м), 3,85 (1Н, м), 4,13 (1Н, м), 4,19 (2Н, м), 4,80 (1Н, шир.с), 4,90 (1Н, д, J=12,5 Гц, АВ), 4,99 (1Н, д, J=12,5 Гц, АВ), 5,02 (2Н, с), 6,16 (1Н, дд, J=7,9 6,9 Гц), 7,19 (1Н, д, J=7,6 Гц), 7,20 (5Н, с), 7,21 (5Н, с), 8,21 (1Н, д, J=7,6 Гц); MS: (LCMS) m/z 786 [М+H]+.

с) К раствору 62,1 мг (0,079 ммоля) бензилового эфира 2(S)-[2(S)-бензилоксикарбониламино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-[1-(3,3-дифтор-4(R)-гидрокси-5(R)-гидроксиметил-тетрагидро-фуран-2(R)-ил)-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси]-2(S)-метилпропионовой кислоты в 5 мл MeOH добавляли 10% Pd/C.

Реакционную смесь тщательно перемешивали в атмосфере водорода. После перемешивания в течение 15 минут смесь фильтровали через колонку с коротким слоем из Celite. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и сырой продукт очищали методом препаративной ЖХВР (ODS) с получением 2(S)-[2(S)-амино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-[1-(3,3-дифтор-4(R)-гидрокси-5(R)-гидроксиметил-тетрагидрофуран-2(R)-ил)-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси]-2(S)-метилпропионовой кислоты в виде бесцветного твердого материала (35,8 мг, 81%).

Условия ЖХВР анализа: колонка 5×30 см (TSK-гель 80-TS ODS), элюент; 5% MeCN/H2O - 100% MeCN (40 минут, линейный градиент), скорость потока 50 мл/мин, детектор: фотодиодная матрица.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,90 (2Н, м), 1,01-1,34 (4Н, м), 1,50 (3Н, с), 1,54-1,75 (7Н, м), 3,76 (2Н, м), 3,95 (2Н, м), 4,27 (1Н, дд, J=12,2, 8,2 Гц), 4,48 (1Н, д, J=10,9 Гц, АВ), 4,92 (1Н, д, J=10,9 Гц, АВ), 6,25 (1Н, дд, J=7,6, 6,9 Гц), 7,28 (1Н, д, J=7,6 Гц), 8,30 (1Н, д, J=7,6 Гц); MS: (LCMS) m/z 562 [М+H]+.

Следующие соединения Примеров 20-22 получали из ВАВС с использованием различных дипептидных производных формулы (VIII), следуя методике Примера 19.

Пример 20:

2(R)-[2(S)-Амино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-{1-[3,3-дифтор-4(R)-гидрокси-5(R)-гидроксиметил-тетрагидро-фуран-2(R)-ил]-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси}-2(R)-метилпропионовую кислоту получали из DFDC и бензилового эфира 2(R)-[2(S)-бензилоксикарбониламино-3-циклогексил-пропиониламино]-3-гидрокси-2(R)-метилпропионовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,90 (2Н, м), 1,02-1,45 (4Н, м), 1,55 (3Н, с), 1,62-1,75 (7Н, м), 3,80 (1Н, м), 3,93 (3Н, м), 4,21 (1Н, м), 4,27 (1Н, д, J=10,5 Гц, АВ), 5,00 (1Н, д, J=10,5 Гц, АВ), 6,24 (1Н, дд, J=7,6, 7,3 Гц), 7,27 (1Н, д, J=7,6 Гц), 8,28 (1Н, д, J=7,6 Гц); MS: (LCMS) m/z 562 [М+H]+.

Пример 21:

(2S,3S)-2-(2-Амино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-[1-{[4R,5R)-3,3-дифтор-4-гидрокси-5-гидроксиметил-тетрагидро-фуран-2-ил}-2-оксо-1,2-дигидропиридин-4-илкарбамоилокси]-2-метилмасляную кислоту получали из DFDC и бензилового эфира (2S,3S)-2-(2-бензилоксикарбониламино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-гидрокси-2-метилмасляной кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,91-1,70 (13Н, м), 1,34 (3Н, д, J=6,3 Гц), 1,56 (3Н, с), 3,73-3,94 (4Н, м), 4,25 (1Н, тд, J=12,2, 8,6 Гц), 5,50 (1Н, кв, J=6,6 Гц), 6,20 (1Н, т, J=7,3 Гц), 7,19 (1Н, д, J=7,6 Гц), 8,25 (1Н, д, J=7,6 Гц); MS: (LC-MS) m/z 576 [М+H]+.

Пример 22:

(2R,3R)-2-(2-Амино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-[1-{[4R,5R)-3,3-дифтор-4-гидрокси-5-гидроксиметил-тетрагидро-фуран-2-ил}-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-4-илкарбамоилокси]-2-метилмасляную кислоту получали из DFDC и бензилового эфира (2R,3R)-2-(2-бензилоксикарбониламино-3-циклогексил-пропиониламино)-3-гидрокси-2-метилмасляной кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,77-1,75 (13Н, м), 1,42 (3Н, д, J=6,6 Гц), 1,63 (3Н, с), 3,77-3,99 (4Н, м), 4,27 (1Н, тд, J=12,2, 8,3 Гц), 5,54 (1Н, кв, J=6,6 Гц), 6,26 (1Н, дд, J=7,6, 7,3 Гц), 7,31 (1Н, д, J=7,6 Гц), 8,29 (1Н, д, J=7,6 Гц); MS: (LC-MS) m/z 576 [М+H]+.

Пример 23:

Изопропиловый эфир 2R-(2S-амино-3-циклогексил-пропиониламино)-3S-[1-(4S-гидрокси-5R-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидро-фуран-2R-ил)-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилоси]-масляной кислоты.

а) К перемешиваемому раствору, состоящему из 5,5 г (17,8 ммоля) BOC-D-Thr(Bzl)-OH, 280 мг (2,3 ммоля) DMAP и 2,7 мл (35,6 ммоля) 2-пропанола в 50 мл дихлорметана (обезвоженный), добавляли 4,41 г (23,1 ммоля) WSC HCl при 0°С. Полученную смесь перемешивали в течение 5 часов в атмосфере Ar при температуре окружающего воздуха. Реакционную смесь охлаждали 300 мл воды и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали EtOAc (300 мл × 2). Объединенный органический слой промывали водой (300 мл) и рассолом (300 мл), сушили над безводным Na2SO4 и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Сырой продукт очищали на колонке с силикагелем (100 г, элюент: 20% EtOAc/гексан) с образованием изопропилового эфира 3S-бензилокси-2R-третбутоксикарбониламиномасляной кислоты в виде бесцветного сиропа (6,372 г, количественный выход).

1Н-ЯМР: (270 МГц, CDCl3) δ 1,10-1,30 (9Н, м), 1,43 (9Н, с), 4,03-4,26 (2Н, м), 4,34 (1Н, д, J=11,6 Гц), 4,51 (1Н, д, J=11,6 Гц), 4,99 (1Н, гептет, J=6,6 Гц), 5,24 (1Н, шир.д, J=8,9 Гц), 7,11-7,35 (5Н, м); MS: (LCMS) m/z 373,9 (М+Na).

b) В растворе, содержащем 6,372 г (18,1 ммоля) изопропилового эфира 3S-бензилокси-2R-третбутоксикарбониламиномасляной кислоты в 200 мл EtOAc, суспендировали 10% Pd/C и полученную систему интенсивно перемешивали в течение 3 часов в атмосфере Н2. Катализатор отфильтровывали и тщательно промывали EtOAc. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением изопропилового эфира 2R-трет-бутоксикарбониламино-3S-гидроксимасляной кислоты в виде бесцветного сиропа (4,74 г, количественный выход). Полученный продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CDCl3) δ 1,16 (6Н, д, J=6,3 Гц), 1,23 (3Н, д, J=6,3 Гц), 1,43 (9Н, с), 2,05(1Н, шир.с), 4,14-4,25 (2Н, м), 5,06 (1Н, гептет, J=6,3 Гц), 5,27 (1Н, д, J=4,3 Гц); MS: (LCMS) m/z 262,1 [М+H]+.

с) К раствору 4,74 г (18,1 ммоля) изопропилового эфира 2R-трет-бутоксикарбониламино-3S-гидроксимасляной кислоты в 50 мл EtOAc добавляли 18 мл 4 н. HCl в EtOAC при комнатной температуре. Полученную смесь перемешивали в течение 14 часов и концентрировали при пониженном давлении с получением гидрохлорида изопропилового эфира 2R-амино-3S-гидроксимасляной кислоты в виде бесцветного сиропа (3,60 г, количественный выход). Полученный продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

1Н-ЯМР: (270 МГц, DMSO-d6) δ 1,21 (6Н, д, J=6,6 Гц), 1,25 (3Н, д, J=6,3 Гц), 3,83 (1Н, д, J=4,0 Гц), 4,05-4,15 (1Н, м), 5,00 (1Н, гептет, J=6,3 Гц), 5,65 (1Н, д, J=5,3 Гц), 8,40 (3Н, шир.с); MS: (LCMS) m/z 162,0 [М+H]+.

d) Раствор, состоящий из 3,7 г (17,8 ммоля) гидрохлорида 3-циклогексил-2S-амино-пропионовой кислоты, 6,3 г (18,7 ммоля) FmocOSu и 2,47 мл (21,5 ммоля) триэтиламина в 30 мл диоксана и 15 мл воды, перемешивали в течение 18 часов при окружающей температуре. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток распределяли между EtOAc (200 мл) и 0,1 н. водным цитратом. Водный слой экстрагировали EtOAc (200 мл). Объединенный органический слой промывали водой (100 мл), сушили над безводным Na2SO4 и фильтровали через стеклянный фильтр. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и оставшийся твердый материал обрабатывали 20% EtOAc/н-гексан (100 мл) с получением 3-циклогексил-2S-(9H-флуорен-9-илметоксикарбониламино)-пропионовой кислоты в виде бесцветных кристаллов (6,8 г, 97%).

1Н-ЯМР: (270 МГц, DMSO-d6) δ 0,76-0,96 (2Н, м), 1,10-1,20 (4Н, м), 1,25-1,35 (1Н, м), 1,50-1,70 (6Н, м), 4,00 (1Н, дд, J=8,9, 5,6 Гц), 4,21-4,30 (2Н, м), 7,32 (2Н, т, J=7,6 Гц), 7,41 (2Н, т, J=7,6 Гц), 7,64 (1Н, д, J=8,3 Гц), 7,90 (2Н, д, J=7,3 Гц), 12,5 (1Н, с); MS: (LCMS) m/z 393,9 [М+H]+.

е) К перемешиваемой суспкензии из 6,8 г (17,3 ммоля) 3-циклогексил-2S-(9H-флуорен-9-илметоксикарбониламино)-пропионовой кислоты и 2,0 г (17,3 ммоля) N-гидроксисукцинимида в 60 мл системы 50% диоксана-EtOAc, добавляли одной порцией 3,92 г дициклогексилкарбодиимида при 0°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 6 часов при комнатной температуре. Полученный осадок фильтровапли через стеклянный фильтр и тщательно промывали EtOAc. Фильтрат концентировали при пониженном давлении с получением сырого N-сукцинимидного эфира. Остаток растворяли в 100 мл дихлорметана и в систему добавляли 3,52 г (17,8 ммоля) гидрохлорида изопропилового эфира 2R-амино-3S-гидроксимасляной кислоты и 5,18 мл (37,4 ммоля) и полученную смесь перемешивали в течение 9 часов при окружающей температуре. Реакционную смесь охлаждали 0,1 н. водным цитратом (100 мл) и органический слой отделяли. Водный слой экстрагировали EtOAc (200 мл × 2) и объединенный органический слой промывали рассолом (100 мл), сушили над безводным Na2SO4 и концентрировали при пониженном давлении. Оставшийся материал перекристаллизовывали из смеси 20% EtOAc/н-гексан с образованием изопропилового эфира 2R-[3-циклогексил-2S-(9H-флуорен-9-илметоксикарбониламино)-пропиониламино]-3S-гидроксималяной кислоты в виде бесцветных кристаллов (8,432 г, 91%).

1Н-ЯМР: (270 МГц, DMSO-d6) δ 0,86-0,96 (2Н, м), 1,03 (3Н, д, J=6,3 Гц), 1,00-1,40 (11Н, м), 1,50-1,75 (6Н, м), 4,08-4,30 (5Н, м), 4,90 (1Н, гептет, J=5,6 Гц), 4,97 (1Н, д, J=5,6 Гц), 7,28-7,53 (4Н, м), 7,60-7,78 (3Н, м), 7,90 (2Н, д, J=7,3 Гц); MS: (LCMS) m/z 537,0 [М+H]+.

f) К перемешиваемому раствору 8,40 г (15,7 ммоля) изопропилового эфира 2R-[3-циклогексил-2S-(9H-флуорен-9-илметоксикарбониламино)-пропиониламино]-3S-гидроксималяной кислоты в 200 мл дихлорметана (обезвоженный) при комнатной температуре добавляли 8,2 г (4,1 ммоля) 4-нитрофенилхлорформиата и 3,29 мл пиридина.

После перемешивания в течение 2 часов реакционную смесь охлаждали добавлением воды и органический слой отделяли. Водный слой экстрагировали EtOAc (200 мл), сушили над безводным Na2SO4 и концентрировали при пониженном давлении. Сырой продукт перекристаллизовывали из EtOAc и н-гексана с получением изопропилового эфира 2R-[3-циклогексил-2S-(9H-флуорен-9-илметоксикарбониламино)-пропиониламино]-3S-(4-нитро-феноксикарбонилоксимасляной кислоты в виде бесцветных кристаллов (10,6 г, 96%).

1Н-ЯМР: (270 МГц, DMSO-d6) δ 0,86-0,96 (2Н, м), 1,29 (3Н, д, J=6,3 Гц), 1,00-1,40 (11Н, м), 1,50-1,75 (6Н, м), 4,21-4,35 (5Н, м), 4,68 (1Н, дд, J=4,3, 8,6 Гц), 4,93 (1Н, гептет, J=6,3 Гц), 5,26 (1Н, м), 7,29-7,55 (6Н, м), 7,60-7,78 (2Н, м), 7,90 (2Н, д, J=7,3 Гц), 8,31 (2Н, дд, J=2,3, 6,9 Гц), 8,54 (1Н, д, J=8,6 Гц); MS: (LCMS) m/z 702,1 [М+H]+.

g) Раствор, состоящий из 5,0 г (7,0 ммоля) изопропилового эфира 2R-[3-циклогексил-2S-(9H-флуорен-9-илметоксикарбониламино)-пропиониламино]-3S-(4-нитро-феноксикарбонилокси-масляной кислоты и 3,8 г (8,12 ммоля) 3',5'-ди-трет-бутилдиметилсилил-DMDC в 40 мл ТГФ (безводный), перемешивали в течение 2 дней при 70°С. Полученную смесь концентрировали при пониженном давлении. Маслянистый остаток распределяли между EtOAc (150 мл × 2) и насыщенным раствором NaHCO3. Объединный органический слой промывали водой (100 мл) и рассолом (100 мл × 2), сушили над безводным Na2SO4 и концентрировали при пониженном давлении. Сырой продукт очищали на колокне с силикагелем (элюент: 25% EtOAc/гексан) с образованием изопропилового эфира 2R-[3-циклогексил-2S-)9Н-флуорен-9-илметоксикарбониламино)-пропиониламино]-3S-{1-[4S-(трет-бутилдиметилсиланилокси)-5R-(трет-бутилдиметилсиланилоксиметил)-3-метилен-тетрагидро-фуран-2R-ил]-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси}масляной кислоты в виде бесцветного аморфного материала (6,6 г, 90%).

1Н-ЯМР: (270 МГц, DMSO-d6) δ 0,06 (3Н, с), 0,06 (3Н, с), 0,07 (6Н, с), 0,83 (9Н, с), 0,88 (9Н, с), 0,83-1,81 (22Н, м), 3,70-3,80 (2Н, м), 3,82 (1Н, д, J=6,8 Гц), 4,15-4,25 (4Н, м), 4,54 (1Н, дд, J=4,3, 8,6 Гц), 4,74 (1Н, д, J=5,3 Гц), 4,86 (1Н, гептет, J=6,3 Гц), 5,23 (1Н, м), 5,29 (1Н, с), 5,37 (1Н, с), 6,57 (1Н, с), 6,94 (1Н, д, J=5,0 Гц), 7,29 (2Н, т, J=7,3 Гц), 7,39 (2Н, т, J=7,3), 7,61 (1Н, д, J=8,3 Гц), 7,73 (2Н, дд, J=3,3, 7,6 Гц), 7,87 (2Н, д, J=7,3), 7,98 (2Н, м); MS: (LCMS) m/z 1030,3 [М+H]+.

h) В раствор, состоящий из 200 мг (0,194 ммоля) изопропилового эфира 2R-[3-циклогексил-2S-(9Н-флуорен-9-илметоксикарбониламино)-пропиониламино]-3S-{1-[4S-(трет-бутилдиметилсиланилокси)-5R-(трет-бутилдиметилсиланилоксиметил)-3-метилен-тетрагидрофуран-2R-ил]-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси} масляной кислоты в 3 мл ТГФ (безводный), при комнатной температуре добавляли 323 мл (1,941 ммоля) HF триэтиламина (98%). После перемешивания в течение 14 часов реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали на колонке с силикагелем (элюент: 6,25% метанол/дихлорметан) с получением изопропилового эфира 2R-[3-циклогексил-2S-(9Н-флуорен-9-илметоксикарбониламино)-пропиониламино]-3S-[1-[4S-гидрокси-5R-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидрофуран-2R-ил]-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси} масляной кислоты в виде бесцветного аморфного материала (145,7 мг, 94%).

1Н-ЯМР: (270 МГц, DMSO-d6) δ 0,80-0,99 (2Н, м), 1,10-1,81 (20Н, м), 3,55-3,80 (3Н, м), 4,15-4,30 (4Н, м), 4,50 (1Н, м), 4,58 (1Н, дд, J=3,3, 8,9 Гц), 4,86 (1Н, гептет, J=6,3 Гц), 5,01 (1Н, м), 5,20 (1Н, м), 5,30 (1Н, с), 5,34 (1Н, с), 5,66 (1Н, шир.д), 6,53 (1Н, с), 6,90 (1Н, д, J=7,6 Гц), 7,30 (2Н, т, J=7,3), 7,39 (2Н, т, J=7,2 Гц), 7,65 (1Н, д, J=8,2 Гц), 7,72 (2Н, дд, J=3,3, 7,6 Гц), 7,88 (2Н, д, J=7,3 Гц), 7,94 (1Н, д, J=8,2 Гц), 8,10 (1Н, д, J=7,6 Гц); MS: (LCMS) m/z 802,0 [М+H]+.

i) К раствору 136 мг (0,17 ммоля) изопропилового эфира 2R-[3-циклогексил-2S-(9Н-флуорен-9-илметоксикарбониламино)-пропиониламино]-3S-[1-[4S-гидрокси-5R-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидрофуран-2R-ил]-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси} масляной кислоты в 1 мл ДМФ (безводный) при комнатной температуре добавляли 100 мл пиперидина.

После перемешивания в течение 3 часов растворитель удаляли при пониженном давлении. Желтоватый остаток очищали на колонке с силикагелем (элюент: 10% метанол/дихлорметан) с образованием изопропилового эфира 2R-(2S-амино-3-циклогексил-пропиониламино]-3S-[1-[4S-гидрокси-5R-гидроксиметил-3-метилен-тетрагидрофуран-2R-ил]-2-оксо-1,2-дигидро-пиримидин-4-илкарбамоилокси} масляной кислоты в виде бесцветного твердого материала (28,6 мг, 29 %).

1Н-ЯМР: (270 МГц, DMSO-d6) δ 0,75-0,95 (2Н, м), 1,12-1,80 (20Н, м), 3,55-3,80 (3Н, м), 4,50 (1Н, м), 4,60 (1Н, м), 4,88 (1Н, гептет, J=6,3 Гц), 5,03 (1Н, м), 5,30-5,35 (4Н, м), 5,70 (1Н, шир.д), 6,53 (1Н, с), 6,93 (1Н, д, J=7,6 Гц), 8,06 (1Н, шир.с), 8,10 (1Н, д, J=7,6 Гц); MS: (LCMS) m/z 579,9 [М+H]+.

Справочный пример 2.1:

Получение (20S)-9-нитрокампотецин-N-оксида 20-ацетата

К раствору 9-нитрокамптотецина 20-ацетата (8,62 г, 19,8 ммоля) в трифторуксусной кислоте (65 мл) при комнатной температуре добавляли комплекс мочевины с пероксидом водорода (3,11 г, 33,1 ммоля). Псле перемешивания в течение 4 часов при комнатной температуре полученную смесь концентрировали при пониженном давлении до половинного объема и переливали в смесь воды со льдом. Образовавшийся остаток собирали фильтрацией, промывали дистиллированной водой и сушили в вакууме с получением указанного в названии соединения (8,35 г, выход 93%).

1Н-ЯМР: (270 МГц) δ (CDCl3) 0,98 (т, J=7,6 Гц, 3Н), 2,08-2,33 (м, 2Н), 2,23 (с, 3Н), 5,38 (с, 2Н), 5,40 (д, J=17,7 Гц, 1Н), 5,67 (д, J=17,7 Гц, 1Н), 7,96 (с, 1Н), 7,96 (дд, J=7,6 и 7,8 Гц, 1Н), 8,67 (с, 1Н), 9,16 (д, J=7,6 Гц, 1Н); MS m/z (ES) 452 (М++1).

Справочный пример 3.1:

Получение (20S)-7-хлор-9-нитрокамптотецина 20-ацетата

К раствору (20S)-9-нитрокампотецин-N-оксида 20-ацетата (10,88 г, 24,1 ммоля) из Справочного примера 2.1 в N,N-диметилформамиде (196 мл) при 0°С добавляли хлористый оксалил (4,2 мл, 48,2 ммоля) и полученную смесь перемешивали в течение 3 часов при 15°С. Смесь переливали в воду со льдом (500 мл) и экстрагировали этилацетатом (500 мл×1, 250 мл×2). Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали методом хроматографии на колокне с силикагелем (этилацетат/гексан=1/1) с получением указанного в названии соединения (5,54 г, 49%) в виде желтого твердого вещества.

1Н-ЯМР: (270 МГц) δ (CDCl3) 0,99 (т, J=7,6 Гц, 3Н), 2,07-2,33 (м, 2Н), 2,23 (с, 3Н), 5,33 (с, 2Н), 5,41 (д, J=17,8 Гц, 1Н), 5,69 (д, J=17,8 Гц, 1Н), 7,20 (с, 1Н), 7,87-7,95 (м, 2Н), 8,44 (дд, J=2,3 и 7,6 Гц, 1Н); MS m/z (ES) 470 (М++1).

Справочный пример 4.1:

Получение (20S)-9-нитро-7-(пентиламино)камптотецина 20-ацетата

К суспензии (20S)-7-хлор-9-нитрокамптотецина 20-ацетата (2,58 г, 5,49 ммоля) из Справочного примера 3.1 в 1,4-диоксане (29 мл) добавляли н-амиламин (25 мл, 21,96 ммоля) и полученную смесь перемешивали в течение 2 часов при 80°С с последующим концентрированием при пониженном давлении. Полученный в результате остаток очищали методом хроматографии на колокне с силикагелем (дихлорметан/ацетон = 30/1-20/1) с получением указанного в названии соединения (1,80 г, 63%) в виде коричневого масла.

1Н-ЯМР: (270 МГц) δ (CDCl3) 0,86-1,01 (м, 6Н), 1,22-1,59 (м, 4Н), 1,60-1,78 (м, 3Н), 2,03-2,37 (м, 5Н), 3,57-3,68 (м, 2Н), 5,02 (шир, 1Н), 5,40 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,47 (с, 2Н), 5,67 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,13 (с, 1Н), 7,66 (дд, J=2,0, 7,9 Гц, 1Н), 7,71 (т, J=7,9 Гц, 1Н), 8,23 (дд, J=2,0, 7,9 Гц, 1Н); MS (ES) m/z 521 (М++1).

Справочный пример 4.15:

Получение (20S)-7-бутиламино-9-нитрокамптотецина 20-ацетата

Указанное в заглавии соединение получали из (20S)-7-хлор-9-нитро-камптотецина 20-ацетата Справочного примера 3.1 и бутиламина в соответствии со способом, аналогичным тому, что описан в Справочном примере 4.1.

1Н-ЯМР: (270 МГц) δ (CDCl3) 0,97 (т, J=7,6 Гц, 3Н), 1,00 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,43-1,52 (м, 2Н), 1,63-1,71 (м, 2Н), 2,13-2,32 (м, 2Н), 2,22 (с, 3Н), 3,62-3,69 (м, 2Н), 5,02 (шир.т, 1Н), 5,40 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,47 (с, 2Н), 5,66 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,14 (с, 1Н), 7,65-7,74 (м, 2Н), 8,23 (дд, J=1,6 и 7,9 Гц, 1Н); MS m/z (ES) 507 (М++1).

Справочный пример 5.1:

Получение (20S)-9-амино-7-(бутиламино)камптотецина 20-ацетата

(20S)-7-бутиламино-9-нитрокамптотецин 20-ацетат (156 мг, 0,31 ммоля) из Справочного примера 4.15 растворяли в МеОН (10 мл) и 1 н. водном растворе HCl (2 мл). Добавляли 5% Pd-C (15 мг) и гидрогенизировали в атмосфере Н2 из баллона при комнатной температуре в течение 1 часа. После удаления Pd-С фильтрацией фильтрат концентрировали под пониженным давлением с получением продукта (137 мг, выход 87%).

1Н-ЯМР: (270 МГц) δ (CDCl3) 0,95 (т, J=7,6 Гц, 3Н), 1,01 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,48-1,60 (м, 2Н), 1,68-1,78 (м, 2Н), 2,10-2,31 (м, 2Н), 2,20 (с, 3Н), 3,60-3,67 (м, 2Н), 3,90 (шир.с, 2Н), 5,39 (д, J=17,0 Гц, 1Н), 5,41 (с, 2Н), 5,66 (д, J=17,0 Гц, 1Н), 6,85 (д, J=7,3 Гц, 1Н), 7,11 (с, 1Н), 7,45 (дд, J=7,3 и 8,3 Гц, 1Н), 7,64 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 8,77 (шир.с, 1Н); MS (ES) m/z 477 (М++1).

Справочный пример 5.14:

Получение (20S)-9-амино-7-(пентиламино)камптотецина 20-ацетата

Указанное соединение получали из (20S)-9-нитро-7-(пентиламино)камптотецина 20-ацетата из Справочного примера 4.1, используя методику, аналогичную методике Справочного примера 5.1.

MS (ES) m/z 491 (M++1).

Пример 1.1

Получение (9S)-1-бутил-9-этил-9-гидрокси-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-2,10,13(3Н,9Н,15Н)-триона.

Способ получения включает две следующих стадии, в которых используется соединение (а).

(а) (9S)-9-ацетокси-1-бутил-9-этил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-2,10,13(3Н,9Н,15Н)-трион

Гидрохлорид (20S)-9-амино-7-(бутиламино)-9-нитрокамптотецина 20-ацетата (123 мг, 0,24 ммоля) из Справочного примера 5.1 растворяли в сухом СН2Cl2 (5 мл) и охлаждали на бане со льдом. Последовательно добавляли DIEA (390 мкл, 2,3 ммоля) и трифосген (67 мг, 0,23 ммоля) и полученную смесь перемешивали в течение 1 часа на бане со льдом. Реакционную смесь охлаждали 1 н. водным раствором HCl до 0°С и экстрагировали СН2Cl2 (20 мл). СН2Cl2 слой промывали рассолом, сушили над MgSO4 и выпаривали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали методом колоночной хроматографии (дихлорметан/ацетон = 15/1-7/1) с получением чистого продукта (70 мг, 56%).

1Н-ЯМР: (270 МГц) δ (CDCl3) 0,98 (т, J=7,7 Гц, 3Н), 1,00 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,43-1,59 (м, 2Н), 1,66-1,77 (м, 2Н), 2,07-2,35 (м, 2Н), 2,23 (с, 3Н), 4,12-4,18 (м, 2Н), 5,36 (с, 2Н), 5,40 (д, J=17,4 Гц, 1Н), 5,68 (д, J=17,4 Гц, 1Н), 6,76 (дд, J=1,5 и 6,7 Гц, 1Н), 7,16 (с, 1Н), 7,56-7,67 (м. 2Н), 9,24 (с, 1Н); MS (ES) m/z 503 (М++1).

(b) (9S)-1-бутил-9-этил-9-гидрокси-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-2,10,13(3Н,9Н,15Н)-трион

К раствору (9S)-9-ацетокси-1-бутил-9-этил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-2,10,13(3Н,9Н,15Н)-триона (11,5 мг, 0,023 ммоля) в МеОН (3 мл), охлажденному на бане со льдом, добавляли безводный гидразин (100 мкл). Полученную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Для подкисления реакционной смеси прикапывали 1 н. водный раствор HCl и полученную смесь перемешивали в комнатной температуре в течение 1 часа. После концентрации при пониженном давлении полученный остаток экстрагировали СН2Cl2 (20 мл × 3). Объединенный CH2Cl2 раствор промывали рассолом, сушили над MgSO4 и выпаривали. Остаток очищади методом колонной хроматографии (дихлорметан/метанол = 30/1) с получением чистого продукта (6,1 мг, 58%).

1Н-ЯМР (400 МГц) δ (DMSO) 0,87 (т, J=7,2 Гц, 3Н), 0,96 (т, J=7,6 Гц, 3Н), 1,39-1,47 (м, 2Н), 1,64-1,70 (м, 2Н), 1,81-1,91 (м, 2Н), 4,03-4,07 (м, 2Н), 5,42 (с, 2Н), 5,43 (с, 2Н), 6,51 (с, 1Н), 6,77 (д, J=7,2 Гц, 1Н), 7,24 (с, 1Н), 7,41 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 7,61 (дд, J=7,2 и 7,6 Гц, 1Н), 11,15 (шир.с, 1Н); MS (ES) m/z 461 (М++1).

Пример 1.14:

Получение (9S)-9-этил-9-гидрокси-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-2,10,13(3Н,9Н,15Н)-триона

Названное соединение получали из (20S)-9-амино-7-(пентиламино)камптотецина 20-ацетата из Справочного примера 5.14 в соответствии с методикой, аналогичной той, что описана в Примере 1,1, применяя двухстадийный процесс с использованием соединения (а).

(а) (9S)-9-ацетокси-9-этил-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-2,10,13(3Н,9Н,15Н)-трион

1Н-ЯМР: (270 МГц) δ (CDCl3) 0,92 (т, J=6,9 Гц, 3Н), 0,98 (т, J=7,6 Гц, 3Н), 1,29-1,53 (м, 4Н), 1,65-1,76 (м, 2Н), 2,12-2,30 (м, 5Н), 3,75-4,17 (м, 2Н), 5,36 (с, 2Н), 5,40 (д, J=17,5 Гц, 1Н), 5,68 (д, J=17,5 Гц, 1Н), 6,75 (дд, J=1,7, 6,9 Гц, 1Н), 7,15 (с, 1Н), 7,58 (дд, J=1,7, 6,9 Гц, 1Н), 7,64 (дд, J=6,9, 8,6 Гц, 1Н), 8,88 (шир, 1Н); MS (ES) m/z 517 (М++1).

(b) (9S)-9-этил-9-гидрокси-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-2,10,13(3Н,9Н,15Н)-трион

1Н-ЯМР: (270 МГц) δ (DMSO-d6) 0,85-0,93 (м, 6Н), 1,36-1,38 (м, 4Н), 1,69-1,88 (м, 4Н), 4,05 (м, 2Н), 5,43 (с, 4Н), 6,49 (с, 1Н), 6,78 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,25 (с, 1Н), 7,42 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,61 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 11,13 (шир, 1Н); MS (ES) m/z 475 (М++1).

Пример 2.1:

Получение (9S)-1-бутил-9-этил-9-гидрокси-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

Способ получения включает две следующие стадии с использованием соединения (а).

(а) (9S)-9-ацетокси-1-бутил-9-этил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-дион

К раствору гидрохлорида (20S)-9-амино-7-(бутиламино)камптотецина 20-ацетата (14,9 мг, 0,029 ммоля) из Справочного примера 5.1 в сухом CH2Cl2 (5 мл) добавляли триметил хлорформиат (100 мкл) и моногидрат п-толуолсульфоксилоты (5 мг). Полученную смесь последовательно промывали 1% воднам раствором NaHCO3 и рассолом, сушили над MgSO4 и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали методом колоночной хроматографии (элюент: дихлорметан/метанол = 20/1) с получением чистого продукта (12,6 мг, 89%).

1Н-ЯМР (400 МГц) δ (CDCl3) 0,96 (т, J=7,6 Гц, 3Н), 1,01 (т, J=7,4 Гц, 3Н), 1,49-1,58 (м, 2Н), 1,74-1,82 (м, 2Н), 2,09-2,17 (м, 2Н), 2,21 (с, 3Н), 2,24-2,31 (м, 1Н), 3,84 (т, J=7,4 Гц, 2Н), 5,22 (д, J=17,8 Гц, 1Н), 5,25 (д, J=17,8 Гц, 1Н), 5,39 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,65 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,10 (с, 1Н), 7,16 (д, J=7,2 Гц, 1Н), 7,40 (с, 1Н), 7,62 (д, J=8,4 Гц, 1Н), 7,68 (дд, J=7,2 и 8,4 Гц, 1Н); MS (ES) m/z 487 (М++1).

(b) (9S)-1-бутил-9-этил-9-гидрокси-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)дион

К раствору (9S)-9-ацетокси-1-бутил-9-этил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)диона (6,1 мг, 0,013 ммоля) в МеОН (2 мл), охлажденному на бане со льдом, добавляли безводный гидразин (100 мкл) и полученную смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Для подкисления реакционной смеси прикапывали 1 н. водный раствор HCl и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. После концентрации при пониженном давлении полученный остаток экстрагировали СН2Cl2 (30 мл) и CH2Cl2 раствор промывали рассолом, сушили над MgSO4 и выпаривали. Остаток очищали методом колоночной хроматографии (дихлорметан/метанол = 20/1) с получением чистого продукта (3,9 мг, 70%).

1Н-ЯМР (400 МГц) δ (DMDO-d6) 1,02 (т, J=7,2 Гц, 6Н), 1,50-1,59 (м, 2Н), 1,76-1,93 (м, 4Н), 3,82 (т, J=7,2 Гц, 2Н), 3,88 (шир.с, 1Н), 5,21 (с, 2Н), 5,27 (д, J=16,2 Гц, 1Н), 5,70 (д, J=16,2 Гц, 1Н), 7,11 (дд, J=1,6 и 7,4 Гц, 1Н), 7,37 (с, 1Н), 7,51 (с, 1Н), 7,59-7,67 (м, 2Н); MS (ES) m/z 445 (М++1).

Пример 2.15:

Получение (9S)-9-этил-9-гидрокси-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)диона

Названное соединение получали из (20S)-9-амино-7-(пентиламино)камптотецина 20-ацетата Справочного примера 5.14 по методике, аналогичной той, что применяли в Примере 2.1, используя двухстадийный процесс с использованием соединения (а).

(а) (9S)-9-ацетокси-9-этил-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)дион

1Н-ЯМР (270 МГц) δ (CDCl3) 0,91-0,99 (м, 6Н), 1,26-1,58 (м, 4Н), 1,74-1,82 (м, 2Н), 2,09-2,31 (м, 5Н), 3,83 (т, J=7,3 Гц, 2Н), 5,23 (с, 2Н), 5,39 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,65 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,09 (с, 1Н), 7,17 (дд, J=1,5, 6,9 Гц, 1Н), 7,40 (с, 1Н), 7,62 (дд, J=1,5, 8,6 Гц, 1Н), 7,68 (дд, J=6,9, 8,6 Гц, 1Н);

(b) (9S)-9-этил-9-гидрокси-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)дион

1Н-ЯМР (270 МГц) δ (DMSO-d6) 0,85-0,92 (м, 6Н), 1,35-1,38 (м, 4Н), 1,75-1,93 (м, 4Н), 3,89-3,94 (м, 2Н), 5,29 (с, 2Н), 5,40 (с, 2Н), 6,46 (с, 1Н), 6,99 (дд, J=1,0, 7,4 Гц, 1Н), 7,18 (с, 1Н), 7,47 (дд, J=1,0, 8,6 Гц, 1Н), 7,62 (дд, J=7,4, 8,6 Гц, 1Н), 7,86 (с, 1Н); MS (ES) m/z 459 (М++1).

Пример 2.28:

Получение (9S)-9-этил-9-гидрокси-2-метил-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)диона

Названное соединение получали из (20S)-9-амино-7-(пентиламино)камптотецина 20-ацетата справочного примера 5.14 и триметилортоацетата в соответствии со способом, аналогичным тому, что использовали в примере 2.1, применяя двухстадийный процесс с использованием соединения (а).

(а) (9S)-9-ацетокси-2-метил-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)дион

1Н-ЯМР (270 МГц) δ (CDCl3) 0,94 (т, J=6,9 Гц, 3Н), 0,97 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,30-1,56 (м, 4Н), 1,65-1,89 (м, 2Н), 2,05-2,35 (м, 2Н), 2,21 (с, 3Н), 2,49 (с, 3Н), 3,79-4,01 (м, 2Н), 5,24 (шир.с, 2Н), 5,39 и 5,66 (кв, J=17,2 Гц, 1Н × 2), 7,04-7,12 (м, 1Н), 7,08 (с, 1Н), 7,52-7,71 (м, 2Н); MS (ES) m/z 515 (М++1).

(b) (9S)-9-этил-9-гидрокси-2-метил-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)дион

1Н-ЯМР (270 МГц) δ (DMSO-d6) 0,87 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 0,91 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,30-1,60 (м, 4Н), 1,66-1,94 (м, 4Н), 2,45 (д, J=2,6 Гц, 3Н), 3,93 (шир, 2Н), 5,23-5,44 (м, 2Н), 5,41 (шир.с, 2Н), 6,50 (шир.с, 1Н), 6,89-7,00 (м, 1Н), 7,19 (д, J=2,3 Гц, 1Н), 7,38-7,49 (м, 1Н), 7,62 (дт, J=3,6 и 7,9 Гц, 1Н); MS (FAB) m/z 473 (М++1).

Пример 3.1:

Получение (9S)-9-этил-9-гидрокси-2-гидроксиметил-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)диона.

Способ получения включает две следующие стадии с использованием соединения (а).

(а) (9S)-9-ацетокси-2-ацетоксиметил-9-этил-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)дион

К раствору гидрохлорида (20S)-9-амино-7-(пентиламино)камптотецина 20-ацетата (1,61 г, 3,07 ммоля) из Справочного примера 5.14 в сухом дихлорметане (120 мл), охлажденному на бане со льдом, последовательно добавляли хлористый ацетоксиацетил (4,3 мл) и диизопропилэтиламин (1,07 мл). После завершения добавления полученную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Добавляли воду (50 мл) и смесь экстрагировали дихлорметаном (100 мл). Дихлорметановый слой промывали рассолом, сушили над MgSO4 и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали методом колонной хроматографии (элюент: этилацетат/гексан = 8/1) с получением чистого продукта (1,72 г, 98%).

1Н-ЯМР (400 МГц) δ (CDCl3) 0,91 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 0,97 (т, J=7,5 Гц, 3Н), 1,31-1,48 (м, 4Н), 1,70-1,82 (м, 2Н), 2,08-2,30 (м, 2Н), 2,22 (с, 3Н), 2,25 (с, 3Н), 3,86 (т, J=7,9 Гц, 2Н), 5,04 (с, 2Н), 5,26 (с, 2Н), 5,39 (д, J=17,1 Гц, 1Н), 5,66 (д, J=17,1 Гц, 1Н), 7,13 (с, 1Н), 7,19 (дд, J=2,0 и 6,6 Гц, 1Н), 7,63-7,73 (м, 2Н); MS (ES) m/z 573 (М++1).

(b) (9S)-9-этил-9-гидрокси-2-гидроксиметил-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)дион

К раствору (9S)-9-ацетокси-2-ацетоксиметил-9-этил-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)диона (34 мг, 0,059 ммоля) в метаноле (3 мл), охлажденному на бане со льдом, добавляли безводный гидразин (100 мкл) и полученную смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. Для подкисления реакционной смеси прикапывали 1 н. раствор HCl (5 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь экстрагировали дихлорметаном (50 мл) и дихлорметановый слой промывали рассолом, сушили над MgSO4 и выпаривали. Остаток очищали методом колонной хроматографии (дихлорметан/метанол = 25/1) с получением чистого продукта (19 мг, 65%).

1Н-ЯМР (400 МГц) δ (DMSO-d6) 0,87 (т, J=7,6 Гц, 3Н), 0,90 (т, J=6,9 Гц, 3Н), 1,32-1,45 (м, 4Н), 1,74-1,90 (м, 4Н), 4,04 (м, 2Н), 4,43 (д, J=5,6 Гц, 2Н), 5,36 (с, 2Н), 5,41 (с, 2Н), 5,79 (т, J=5,6 Гц, 1Н), 6,50 (с, 1Н), 7,03 (дд, J=1,0 и 7,3 Гц, 1Н), 7,20 (с, 1Н), 7,50 (дд, J=1,0 и 8,6 Гц, 1Н), 7,66 (дд, J=7,3 и 8,6 Гц, 1Н); MS (ES) m/z 489 (М++1).

Пример 24:

Получение гидрохлорида 20-О-[(S)-триптофил-γ-(S)-глютамил]-20-(S)-камптотецина

а) К перемешиваемому раствору 2,5 г (7,58 ммоля) гидрохлорида α-трет-бутил-γ-бензилового диэфира L-глютаминовой кислоты в 75 мл дихлорметана добавляли 3,65 г (9,10 ммоля) N-α-Boc-L-триптофан гидрокси сукцинимида в 1,59 мл (9,10 ммоля) N,N-диизопропилэтиламина. Полученную смесь перемешивали в течение ночи в атмосфере азота при комнатной температуре. Реакционную смесь охлаждали добавлением насыщенного раствора хлористого аммония и органический слой отделяли. Водный слой экстрагировали дихлорметаном. Объединенный органический слой промывали водой и рассолом. Экстракт сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Сырой продукт очищали методом жидкостной хроматографии среднего давления с Lobar LiChroprep Si-60 Grobe C (элюент: этилацетат/дихлорметан = 1/1) с получением 1-трет-бутилового эфира 5-бензилового эфира 2(S)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-(1Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пентандиовой кислоты в виде белого аморфного вещества (4,38 г, количественный выход).

1Н-ЯМР: (270 МГц, CDCl3) δ 1,30-1,49 (15Н, м), 1,62 (3Н, с), 1,73-1,95 (1Н, м), 2,02-2,25 (3Н, м), 3,13 (1Н, дд, J=14,5, 6,3 Гц), 3,27-3,43 (1Н, м), 4,33-4,56 (2Н, м), 4,90-5,15 (3Н, м), 5,08 (2Н, с), 6,52 (1Н, д, J=7,3 Гц), 7,00 (1Н, д, J=2,3 Гц), 7,03-7,28 (3Н, м), 7,30-7,47 (5Н, м), 7,59 (1Н, дд, J=5,6, 1,7 Гц), 7,90 (1Н, шир.с); MS (LCMS) m/z 580 [М+H]+.

b) К перемешиваемому раствору 4,33 г (7,47 ммоля) 1 трет-бутилового эфира 2(S)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-(1Н-индол-3-ил)-пропиламино]-пентандиовой кислоты 5-бензилового эфира в 80 мл этилацетата добавляли каталитическое количество палладия на углероде. Смесь перемешивали в течение ночи в атмосфере водорода при комнатной температуре. Смесь отфильтровывали для удаления катализатора и растворитель удаляли при пониженном давлении с получением 1-трет-бутилового эфира 2(S)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-(1Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пентадиовой кислоты в виде белого аморфного вещества (3,70 г, количественный выход). Этот продукт использовался в последующих реакциях без дополнительной очистки. MS: (LCMS) m/z 490 [М+Н]+.

с) К перемешиваемому раствору 3,70 г (7,56 ммоля) 1-третбутилового эфира 2(S)-[2(S)-третбутоксикарбониламино-3-(1Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пентандиовой кислоты в 200 мл дихлорметана добавляли 1,83 г (14,9 ммоля) 4-(диметиламино)пиридина, 5,73 г (29,9 ммоля) гидрохлорида 1-[3-(диметиламино)пропил]-3-этилкарбодиимида и 1,73 г (4,98 ммоля) камптотецина. Полученную смесь перемешивали в течение 2 часов в атмосфере азота при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением воды и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали дихлорметаном. Объединенный органический слой промывали 0,5 н. раствором хлористоводородной кислоты, насыщенным раствором бикарбоната натрия, водой и рассолом. Экстракт сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Сырой продукт очищали жидкостной хроматографией среднего давления с Lobar LiChroprep Si-60 Grobe C (элюент: этилацетат/дихлорметан = 20/1) с образованием 1-третбутилового эфира 5-(4(S)-этил-3,13-диоксо-3,4,12,13-тетрагидро-1Н-2-окса-6,12а-диазадибензо[b,h]флуорен-4-илового эфира 2(S)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-(1Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пентандиовой кислоты в виде желтоватого аморфного материала (3,95 г, 97%). MS: (LCMS) m/z 820 [M+H+].

d) К перемешиваемому раствору 3,95 г (4,82 ммоля) 1-третбутилового эфира α5-(4(S)-этил-3,13-диоксо-3,4,12,13-тетрагидро-1Н-2-окса-6,12а-диазадибензо[b,h]флуорен-4-илового эфира 2(S)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-(1Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пентандиовой кислоты в 20 мл этилацетата добавляли 40 мл 1 н. хлористоводородной кислоты и 20 мл трифторуксусной кислоты. Полученную смесь перемешивали в течение ночи в атмосфере азота при комнатной температуре. Реакционную смесь добавляли в 800 мл этилацетата и образвавшийся осадок отфильтровывали с образованием гидрохлорида 20-О-[(S)-триптофил-γ-(S)-глютамил]-20(S)-камптотецина в виде красноватого твердого вещества (3,2 г, 95%).

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 1,03 (3Н, т, J=7,5 Гц), 2,02-2,39 (4Н, м), 2,68-2,83 (2Н, м), 3,06-3,23 (2Н, м), 3,27-3,35 (м), 3,38-3,50 (2Н, м), 4,17-4,33 (1Н, м), 4,42-4,57 (1Н, м), 4,79-4,97 (м), 5,20-5,38 (2Н, м), 5,55 (2Н, дд, J=38,6, 16,8 Гц), 6,97 (1Н, т, J=7,6 Гц), 7,11 (1Н, т, J=7,9 Гц), 7,19 (1Н, с), 7,36 (2Н, д, J=8,3 Гц), 7,58 (1Н, с), 7,56 (1Н, д, J=7,9 Гц), 7,76 (1Н, т, J=6,9 Гц), 7,83-7,93 (1Н, м), 8,11 (1Н, д, J=8,6 Гц), 8,25 (1Н, д, J=8,3 Гц), 8,77 (1Н, с); MS (LCMS) m/z 664 [М+H]+.

Следующие соединения в примерах 25-49 получали из камптотецина или SN38 с использованием различных дипептидных производных формулы (VII), следуя методике, аналогичной той, что использовали в Примере 24.

Пример 25:

Гидрохлорид 20-О-[(S)-валил-γ-(S)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(S)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-метил-бутириламино]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,97-1,14 (9Н, м), 1,93-2,38 (6Н, м), 2,63-2,92 (2Н, м), 3,27-3,34 (м), 3,81 (1Н, д, J=5,3 Гц), 4,48-4,59 (1Н, м), 4,80-4,97 (м), 5,38 (2Н, шир.с), 5,55 (2Н, дд, J=35,6, 17,2 Гц), 7,69 (1Н, с), 7,80 (1Н, т, J=8,3 Гц), 8,00 (1Н, тд, J=8,6, 1,3 Гц), 8,18 (1Н, д, J=8,3 Гц), 8,33 (1Н, д, J=8,6 Гц), 8,88 (1Н, с); MS (LCMS) m/z 577 [М+H]+.

Пример 26:

Гидрохлорид 20-О-[(S)-фенилаланил-γ-(S)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(S)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-фенил-пропиониламино]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,99-1,10 (3Н, м), 1,33-1,42 (1Н, м), 1,97-2,42 (4Н, м), 2,73 (1Н, т, J=9,6 Гц), 2,93-3,12 (1Н, м), 3,19-3,40 (м), 3,52-3,82 (2Н, м), 4,02-4,26 (1Н, м), 4,40-4,60 (1Н, м), 4,71-4,91 (м), 5,28-5,39 (2Н, м), 5,56 (2Н, дд, J=38,3, 17,2 Гц), 7,14-7,23 (1Н, м), 7,25-7,43 (6Н, м), 7,73 (1Н, т, J=6,9 Гц), 7,88 (1Н, т,J=8,6 Гц), 8,09 (1Н, д, J=8,3 Гц), 8,13-8,22 (1Н, м), 8,64 (1Н, д, J=8,3 Гц); MS: (LCMS) m/z 625 [М+H]+.

Пример 27:

Гидрохлорид 20-О-[(S)-лейцил-γ-(S)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(S)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-4-метил-пентаноиламино]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,89-1,12 (11Н, м), 1,58-2,41 (8Н, м), 2,60-2,99 (2Н, м), 3,23-3,36 (м), 3,51-3,79 (7Н, м), 3,87 (1Н, шир.с), 4,00-4,11 (1Н, м), 4,47-4,63 (1Н, м), 4,74-5,00 (м), 5,39 (2Н, шир.с), 5,54 (2Н, дд, J=36,0, 17,5 Гц), 7,78-7,94 (2Н, м), 7,98-8,11 (1Н, м), 8,24 (1Н, д, J=8,3 Гц), 8,42 (1Н, д, J=8,6 Гц), 8,99 (1Н, с); MS: (LCMS) m/z 591 [М+H]+.

Пример 28:

Гидрохлорид 20-О-[(R)-лейцил-γ-(S)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(S)-[2(R)-трет-бутоксикарбониламино-4-метил-пентаноиламино]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,83-1,12 (10Н, м), 1,60-1,82 (3Н, м), 1,90-2,40 (3Н, м), 2,54-2,80 (2Н, м), 3,17-3,40 (м), 3,51-3,80 (3Н, м), 3,81-3,97 (1Н, м), 4,43-4,60 (1Н, м), 4,62-5,00 (м), 5,32 (2Н, шир.с), 5,54 (2Н, дд, J=37,3, 17,0 Гц), 7,38 (1Н, с), 7,71 (1Н, т, J=7,3 Гц), 7,87 (1Н, т, J=7,8 Гц), 8,06 (1Н, д, J=7,6 Гц), 8,16 (1Н, д, J=8,4 Гц), 8,63 (1Н, с); MS (LCMS) m/z 591 [М+H]+.

Пример 29:

Трифторацетат 20-О-[(R)-фенилаланин-γ-(S)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(S)-[2(R)-трет-бутоксикарбониламино-3-фенил-пропиониламино]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 1,05 (3Н, т, J=7,6 Гц), 1,70-1,99 (1Н, м), 2,02-2,47 (5Н, м), 2,95-3,22 (2Н, м), 3,23-3,41 (м), 4,09 (1Н, т, J=7,9 Гц), 4,43 (1Н, дд, J=9,2, 4,6 Гц), 4,70-4,90 (м), 5,29 (2Н, д, J=3,3 Гц), 5,54 (2Н, дд, J=38,3, 17,2 Гц), 7,19-7,49 (6Н, м), 7,72 (1Н, тд, J=6,9, 1,3 Гц), 7,88 (1Н, тд, J=6,9, 1,3 Гц), 8,08 (1Н, д, J=7,3 Гц), 8,17 (1Н, д, J=8,6 Гц), 8,62 (1Н, с); MS (LCMS) m/z 625 [М+H]+.

Пример 30:

Гидрохлорид 20-О-[(S)-триптофил-γ-(R)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-(1H-индол-3-ил)-пропиониламино]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 1,03 (3Н, т, J=7,6 Гц), 1,69-1,98 (1Н, м), 2,05-2,36 (5Н, м), 3,14 (2Н, д, J=36,6 Гц), 3,22-3,39 (м), 4,09 (1Н, т, J=6,9 Гц), 4,33-4,46 (1Н, м), 4,72-5,02 (м), 5,03 (2Н, дд, J=42,2, 18,8 Гц), 5,53 (2Н, дд, J=45,5, 16,8 Гц), 6,80-6,98 (2Н, м), 7,10 (1Н, т, J=7,3 Гц), 7,29 (1Н, д, J=7,9 Гц), 7,32-7,41 (2Н, м), 7,69 (1Н, тд, J=13,9, 6,9 Гц), 7,78-7,89 (1Н, м), 8,00 (1Н, д, J=7,9 Гц), 8,10 (1Н, д, J=8,6 Гц), 8,44 (1Н, с); MS: (LCMS) m/z 664 [М+H]+.

Пример 31:

Гидрохлорид 20-О-[(R)-триптофил-γ-(R)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(R)-трет-бутоксикарбониламино-3-(1H-индол-3-ил)-пропиониламино]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 1,03 (3Н, т, J=7,3 Гц), 1,94-2,40 (6Н, м), 2,73 (2Н, т, J=7,3 Гц), 3,00-3,17 (1Н, м), 3,19-3,48 (м), 3,53-4,78 (2Н, м), 4,08-4,23 (1Н, м), 4,45-4,58 (1Н, м), 4,72-5,00 (м), 5,21 (2Н, дд, J=40,9, 19,8 Гц), 5,52 (2Н, дд, J=40,9, 16,8 Гц), 6,94-7,19 (3Н, м), 7,32-7,40 (2Н, м), 7,60 (1Н, т, J=7,9 Гц), 7,70 (1Н, тд, J=8,3, 1,3 Гц), 7,87 (1Н, тд, J=8,6, 1,3 Гц), 8,08 (1Н, д, J=7,3 Гц), 8,17 (1Н, д, J=8,6 Гц), 8,59 (1Н, с); MS: (LCMS) m/z 664 [М+H]+.

Пример 32:

Гидрохлорид 20-О-[(S)-фенилаланил-γ-(R)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-фенил-пропиониламино]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,97 (3Н, т, J=7,3 Гц), 1,60-2,38 (7Н, м), 2,98 (2Н, д, J=7,9 Гц), 3,14-3,29 (м), 4,00 (1Н, т, J=7,3 Гц), 4,28-4,39 (1Н, м), 4,70-4,89 (м), 5,29 (2Н, д, J=4,6 Гц), 5,54 (2Н, дд, J=40,3, 16,8 Гц), 7,02-7,32 (7Н, м), 7,62 (1Н, тд, J=7,3, 1,0 Гц), 7,77 (1Н, тд, J=8,6, 1,7 Гц), 7,99 (1Н, д, J=8,2 Гц), 8,05 (1Н, д, J=8,6 Гц), 8,52 (1Н, с); MS: (LCMS) m/z 625 [М+H]+.

Пример 33:

Гидрохлорид 20-О-[(S)-лейцил-γ-(R)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-4-метил-пентаноил]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,91-1,09 (10Н, м), 1,60-1,81 (2Н, м), 1,94-2,41 (3Н, м), 2,70 (2Н, д, J=8,6 Гц), 3,23-3,38 (м), 3,82-3,98 (1Н, м), 4,43-4,54 (1Н, м), 4,79-4,97 (м), 5,32 (2Н, шир.с), 5,54 (2Н, дд, J=38,9, 16,8 Гц), 7,40 (1Н, с), 7,71 (1Н, тд, J=7,3, 1,3 Гц), 7,82-7,93 (1Н, м), 8,08 (1Н, д, J=7,3 Гц), 8,18 (1Н, д, J=8,6 Гц), 8,64 (1Н, с); MS: (LCMS) m/z 591 [М+H]+.

Пример 34:

Гидрохлорид 20-О-[(R)-триптофил-γ-(R)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(S)-[2(R)-трет-бутоксикарбониламино-3-(1Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,97-1,10 (3Н, м), 1,68-2,48 (9Н, м), 2,62-2,78 (1Н, м), 2,94-3,47 (м), 3,93-4,36 (3Н, м), 4,46-4,58 (1Н, м), 4,80-4,98 (м), 5,02-5,29 (2Н, м), 5,52 (2Н, дд, J=40,3, 17,2 Гц), 6,85 (1Н, с), 6,96-7,24 (5Н, м), 7,34 (2Н, с), 7,39 (1Н, с), 7,44 (2Н, т, J=7,6 Гц), 7,62 (1Н, д, J=7,9 Гц), 7,71 (2Н, т, J=6,9 Гц), 7,78-7,90 (2Н, м), 8,00-8,18 (4Н, м), 8,49 (1Н, с), 8,58 (1Н, с); MS: (LCMS) m/z 664 [М+H]+.

Пример 35:

Гидрохлорид 20-О-[(R)-фенилаланил-γ-(R)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(R)-трет-бутоксикарбониламино-3-фенил-пропиониламино]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 1,03 (3Н, т, J=7,6 Гц), 1,90-2,38 (4Н, м), 2,65-2,78 (2Н, м), 2,94-3,08 (1Н, м), 3,22-3,34 (м), 4,10-4,22 (1Н, м), 4,48-4,57 (1Н, м), 4,73-4,98 (м), 5,30 (2Н, шир.с), 5,54 (2Н, дд, J=40,3, 16,8 Гц), 7,21-7,43 (6Н, м), 7,70 (1Н, т, J=7,9 Гц), 7,81-7,92 (1Н, м), 8,08 (1Н, д, J=8,2 Гц), 8,17 (1Н, д, J=8,6 Гц), 8,62 (1Н, с); MS: (LCMS) m/z 625 [М+H]+.

Пример 36:

Гидрохлорид 20-О-[(R)-лейцил-γ-(R)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(R)-трет-бутоксикарбониламино-4-метил-пентаноиламино]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,91-1,09 (9Н, м), 1,58-2,39 (8Н, м), 2,68-2,80 (2Н, м), 3,25-3,34 (м), 3,86-3,98 (1Н, м), 4,49-4,60 (1Н, м), 4,79-4,97 (м), 5,31 (2Н, шир.с), 5,54 (2Н, дд, J=38,9, 16,8 Гц), 7,40 (1Н, с), 7,68-7,75 (1Н, м), 7,83-7,93 (1Н, м), 8,08 (1Н, д, J=8,2 Гц), 8,18 (1Н, д, J=8,3 Гц), 8,64 (1Н, с); MS: (LCMS) m/z 591 [М+H]+.

Пример 37:

Гидрохлорид 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(R)-триптофил-γ-(R)-гомоглютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(R)-трет-бутоксикарбониламино-3-(1Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 1,04 (3Н, т, J=7,6 Гц), 1,39 (3Н, т, J=7,6 Гц), 1,60-2,34 (6Н, м), 2,53-2,70 (2Н, м), 3,02-3,49 (м), 4,09-4,19 (1Н, м), 4,38-4,52 (1Н, м), 5,16-5,33 (2Н, м), 5,52 (2Н, дд, J=41,2, 17,3 Гц), 6,92-7,48 (8Н, м), 7,65 (1Н, д, J=8,1 Гц), 7,98-8,08 (1Н, м); MS: (LCMS) m/z [М+H]+.

Пример 38:

Гидрохлорид 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(R)-триптофил-γ-(R)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(R)-трет-бутоксикарбониламино-3-(1Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 1,03 (3Н, т, J=7,3 Гц), 1,36 (3Н, т, J=7,6 Гц), 2,01-2,36 (4Н, м), 2,73 (2Н, т, J=7,3 Гц), 3,02-3,18 (3Н, м), 3,26-3,44 (м), 4,15 (1Н, дд, J=8,9, 5,4 Гц), 4,52 (1Н, дд, J=9,2, 4,6 Гц), 4,82-4,98 (м), 5,09 (2Н, дд, J=44,6, 18,6 Гц), 5,52 (2Н, дд, J=44,0, 16,7 Гц), 6,99-7,15 (4Н, м), 7,29 (1Н, с), 7,34-7,43 (3Н, м), 7,60 (1Н, д, J=8,1 Гц), 8,00 (1Н, д, J=9,7 Гц); MS: (LCMS) m/z 708 [М+H]+.

Пример 39:

Гидрохлорид 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(S)-фенилаланил-γ-(R)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-фенил-пропиониламино]-пентандиовой кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 1,05 (3Н, т, J=7,4 Гц), 1,38 (3Н, т, J=7,6 Гц), 1,86 (1Н, м), 2,05-2,40 (5Н, м), 3,04 (2Н, шир.д), 3,14 (2Н, шир.кв), 4,08 (1Н, т, J=7,4 Гц), 4,42 (1Н, м), 5,16 (1Н, д, J=18,8 Гц), 5,26 (1Н, д, J=18,8 Гц), 5,46 (1Н, д, J=16,8 Гц), 5,62 (1Н, д, J=16,8 Гц), 7,13 (2Н, м), 7,28 (4Н, м), 7,42 (2Н, м), 8,00 (1Н, д, J=7,3 Гц); MS: (FABMS) m/z 669 [М+H]+.

Пример 40:

Гидрохлорид 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(S)-фенилаланил-β-(S)-аспартил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(S)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-фенил-пропиониламино]-янтарной кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 1,04 (3Н, т, J=7,4 Гц), 1,43 (3Н, т, J=7,6 Гц), 2,22 (2Н, м), 2,97-3,35 (6Н, м), 4,15 (1Н, м), 4,83 (1Н, м), 5,38 (2Н, с), 5,50 (1Н, д, J=17,2, Гц), 5,63 (1Н, д, J=17,2 Гц), 7,30 (5Н, м), 7,57-7,68 (3Н, м), 8,23 (1Н, м); MS: (FABMS) m/z 655 [М+H]+.

Пример 41:

Гидрохлорид 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(S)-лейцил-β-(S)-аспартил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(S)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-4-метил-пентаноиламино]-янтарной кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,94-1,08 (9Н, м), 1,42 (3Н, т, J=7,6 Гц), 1,61-1,83 (3Н, м), 2,12-2,31 (2Н, м), 3,18-3,35 (4Н, м), 3,88 (1Н, м), 4,85 (1Н, м), 5,38 (2Н, с), 5,50 (1Н, д, J=17,2 Гц), 5,63 (1Н, д, J=17,2 Гц), 7,50-7,61 (3Н, м), 8,16 (1Н, д, J=9,2 Гц); MS: (FABMS) m/z 621 [М+H]+.

Пример 42:

Гидрохлорид 20-О-[(S)-триптофил-β-(S)-аспартил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-(1Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-янтарной кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, DMSO-d6) δ 0,87 (3Н, т, J=7,6 Гц), 2,18 (2Н, м), 2,70-3,03 (4Н, м), 3,84 (1Н, м), 4,34 (1Н, д, J=19,2 Гц), 4,70 (1Н, м), 4,98 (1Н, д, J=19,2 Гц), 5,49 (2Н, с), 6,56 (1Н, т, J=7,5 Гц), 6,77 (1Н, с), 6,93 (1Н, т, J=7,2 Гц), 7,07 (1Н, д, J=7,9 Гц), 7,14 (1Н, с), 7,25 (1Н, д, J=7,9 Гц), 7,70 (1Н, т, J=7,0 Гц), 7,84 (4Н, м), 8,01 (1Н, д, J=7,6 Гц), 8,11 (1Н, д, J=8,6 Гц), 8,25 (1Н, с), 9,05 (1Н, д, J+8,6 Гц), 10,8 (1Н, с); MS: (FABMS) m/z 650 [М+H]+.

Пример 43:

Гидрохлорид 20-О-[(S)-фенилаланил-β-(R)-аспартил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-фенил-пропиониламино)-янтарной кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, DMSDO-d6) δ 0,90 (3Н, т, J=7,3 Гц), 2,18 (2Н, м), 2,55-3,05 (4Н, м), 3,95 (1Н, м), 4,68 (1Н, м), 4,74 (1Н, д, J=19,3 Гц), 5,13 (1Н, д, J=19,3 Гц), 5,50 (2Н, с), 6,76 (2Н, д, J=7,3 Гц), 6,99 (2Н, т, J=7,5 Гц), 7,13 (1Н, т, J=7,6 Гц), 7,14 (1Н, с), 7,73 (1Н, т, J=7,6 Гц), 7,88 (1Н, т, J=7,3 Гц), 7,94 (3Н, м), 8,14 (2Н, шир.т), 8,53 (1Н, с), 9,03 (1Н, д, J=8,6 Гц; MS: (FABMS) m/z 611 [М+H]+.

Пример 44:

Гидрохлорид 20-О-[(R)-фенилаланил-β-(R)-аспартил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(R)-трет-бутоксикарбониламино-3-фенил-пропиониламино)-янтарной кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, DMSO-d6) δ 0,91 (3Н, т, J=7,5 Гц), 2,18 (2Н, м), 2,87-3,09 (4Н, м), 3,99 (1Н, м), 4,67 (1Н, м), 5,26 (2Н, шир.с), 5,50 (2Н, шир.с), 7,16-7,27 (6Н, м), 7,74 (1Н, шир.т), 7,88 (1Н, шир.т), 8,03 (3Н, м), 8,16 (2Н, шир.т), 8,69 (1Н, с), 9,12 (1Н, д, J=7,9 Гц); MS: (FABMS) m/z 611 [М+H]+.

Пример 45:

Гидрохлорид 20-О-[(S)-фенилаланил-β-(S)-аспартил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(S)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-фенил-пропиониламино)-янтарной кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 1,04 (3Н, т, J=7,4 Гц), 2,13-2,32 (2Н, м), 2,96-3,37 (4Н, м), 4,13 (1Н, м), 4,85 (1Н, м), 5,36 (2Н, с), 5,49 (1Н, д, J=17,2 Гц), 5,62 (1Н, д, J=17,2 Гц), 7,30 (5Н, шир.с), 7,50 (1Н, с), 7,76 (1Н, шир.т), 7,93 (1Н, шир.т), 8,14 (1Н, д, J=7,6 Гц), 8,22 (1Н, д, J=8,6 Гц), 8,76 (1Н, с); MS: (FABMS) m/z 611 [М+H]+.

Пример 46:

Гидрохлорид 20-О-[(S)-лейцил-β-(R)-аспартил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-4-метил-пропиониламино)-янтарной кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, DMSO-d6) δ 0,67 (3Н, д, J=7,4 Гц), 0,68 (3Н, д, J=7,4 Гц), 0,89 (3Н, т, J=7,6 Гц), 1,43-1,62 (3Н, м), 2,15 (2Н, м), 3,03 (2Н, м), 3,78 (1Н, м), 4,64 (1Н, м), 5,32 (2Н, шир.с), 5,48 (2Н, шир.с), 7,17 (1Н, с), 7,74 (1Н, шир.т), 7,89 (1Н, шир.т), 8,16 (5Н, м), 8,72 (1Н, с), 8,95 (1Н, д, J=7,3 Гц); MS: (FABMS) m/z 577 [М+H]+.

Пример 47:

Гидрохлорид 20-О-[(S)-валил-β-(R)-аспартил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-метил-бутириламино)-янтарной кислоты.

1Н-ЯМР: (270 МГц, CD3OD) δ 0,66 (3Н, д, J=6,9 Гц), 0,70 (3Н, д, J=6,9 Гц), 1,03 (3Н, т, J=7,5 Гц), 1,98 (1Н, м), 2,22 (2Н, м), 3,22 (2Н, м), 3,64 (1Н, д, J=5,3 Гц), 4,85 (1Н, м), 5,38 (2Н, шир.с), 5,48 (1Н, д, J=16,8 Гц), 5,61 (1Н, д, J=16,8 Гц), 7,47 (1Н, с), 7,77 (1Н, шир.т), 7,94 (1Н, шир.т), 8,13 (1Н, шир.д), 8,22 (1Н, шир.д), 8,75 (1Н, с); MS: (FABMS) m/z 563 [М+H]+.

Пример 48:

Гидрохлорид 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(S)-циклогексилаланил-γ-(R)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(R)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-циклогексил-пропиониламино]-пентандиовой кислоты

1Н-ЯМР: (270 МГц, DMSO-d6) δ 0,81-2,66 (22Н, м), 0,92 (3Н, т, J=7,3 Гц), 1,29 (3Н, т, J=7,6 Гц), 3,02-3,17 (2Н, м), 3,76-3,88 (1Н, м), 4,27-4,39 (1Н, м), 5,30 (1Н, с), 5,49 (1Н, с), 7,00 (1Н, д, J=8,2 Гц), 7,43-7,47 (2Н, м), 8,03 (1Н, д, J=3,0, 8,2 Гц), 8,22 (2Н, шир.с), 8,94 (1Н, д, J=4,9 Гц); MS: (FABMS) m/z 675 [М+H]+.

Пример 49:

Гидрохлорид 7-этил-10-гидрокси-20-О-[(S)-циклогексилаланил-γ-(S)-глютамил]-20(S)-камптотецина получали из 1-трет-бутилового эфира 2(S)-[2(S)-трет-бутоксикарбониламино-3-циклогексил-пропиониламино]-пентандиовой кислоты

1Н-ЯМР: (270 МГц, DMSO-d6) δ 0,77-2,85 (22Н, м), 0,92 (3Н, т, J=7,3 Гц), 1,29 (3Н, т, J=7,6 Гц), 3,01-3,17 (2Н, м), 3,76-3,90 (1Н, м), 4,30-4,45 (1Н, м), 5,31 (1Н, с), 5,50 (1Н, с), 7,02 (1Н, д, J=4,6 Гц), 7,40-7,50 (2Н, м), 8,04 (1Н, д, J=9,6 Гц), 8,22 (2Н, шир.с), 8,78 (1Н, д, J=7,6 Гц); MS: (FABMS) m/z 675 [М+H]+.

Соединения, перечисленные в Примерах 49-1 - 49-25, получали из (9S)-9-этил-9-гидрокси-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)диона, используя различные пептидные производные формулы (VII), в соответствии с методикой, аналогичной той, что описана в Примере 24. Дипептиды перечислены в следующей ниже таблице:

ПримерДипептидный фрагмент
49-1HCl.(L)Trp-(L)-γ-Glu
49-2HCl.(L)Циклогексилаланил-(D)-γ-Glu-
49-3HCl.(L)Phe-(D)-γ-Glu-
49-4HCl.(L)Leu-(D)-γ-Glu-
49-52HCl.(L)Lys-(L)-γ-Glu-
49-6HCl.(L)Val-(D)-γ-Glu-
49-72HCl.(L)Orn-(L)-γ-Glu-
49-8MsOH.(L)Leu-(D)-γ-Glu-
49-92HCl.(D)Lys-(L)-γ-Glu-
49-10HCl.(L)Phe-(L)-β-Asp-
49-11HCl.(L)Циклогексилаланил-(D)-β-Asp-
49-12HCl.(L)Циклогексилаланил-(L)-β-Asp-
49-13HCl.(L)Trp-(L)-β-Asp-
49-142HCl.(L)Orn-(D)-γ-Glu-
49-15HCl.(L)Leu-(D)-β-Asp-
49-16HCl.(L)Val-(D)-β-Asp-
49-17HCl.(L)Leu-(L)-β-Asp-
49-18HCl.(L)Циклогексилглицил-(L)-γ-Glu-
49-19HCl.(D)Циклогексилаланил-(L)-γ-Glu-
49-202HCl.(L)Lys-(D)-γ-Glu-
49-21HCl..(L)Trp-(D)-γ-Glu-
49-22HCl.(L)Leu-(L)-γ-Glu-
49-23HCl.Gly-(D)-γ-Glu-
49-24HCl.(L)Ala-(D)-γ-Glu-
49-25HCl.(L)Phe-(D)-γ-Glu-

Пример 49-1

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-триптофил-(L)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

MS (FAB) m/z 774 (MH+); 1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,98 (т, J=7,0 Гц, 3Н), 1,03 (т, J=7,6 Гц, 3Н), 1,39-2,32 (м, 10Н), 2,71-3,47 (м, 4Н), 4,10-4,23 (м, 2Н), 4,35 (м, 2Н), 5,28 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,38 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,48 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,63 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 6,83 (т, J=7,3 Гц, 1Н), 7,05 (шир.т, 1Н), 7,11 (с, 1Н), 7,34 (д, J=7,9 Гц, 1Н), 7,48 (д, J=7,3 Гц, 1Н), 7,62 (д, J=7,9 Гц, 1Н), 7,92 (т, J=7,6 Гц, 1Н), 7,97 (шир.д, 1Н), 8,00 (с, 1Н), 8,27 (с, 1Н).

Пример 49-2

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-циклогексилаланил-(D)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

MS (FAB) m/z 741 (MH+); 1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,99 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,04 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,00-2,36 (м, 23Н), 2,70-2,85 (м, 2Н), 2,95 (шир.т, J=7,8 Гц, 2Н), 4,01 (м, 1Н), 4,24 (шир.т, 2Н), 4,42 (м, 1Н), 5,48 (д, J=17,5 Гц, 1Н), 5,51 (с, 2Н), 5,63 (д, J=17,5 Гц, 1Н), 7,54 (д, J=7,9 Гц, 1Н), 7,83 (с, 1Н), 7,95 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 8,06 (шир.т, 1Н), 8,36 (с, 1Н).

Пример 49-3

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-фенилаланил-(D)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

MS (FAB) m/z 735 (MH+); 1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,99 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,06 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,39-1,60 (м, 4Н), 1,86-2,31 (м, 6Н), 2,34-2,74 (м, 2Н), 3,05-3,25 (м, 2Н), 4,15-4,25 (м, 3Н), 4,42 (м, 1Н), 5,46 (с, 2Н), 5,48 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,62 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,20-7,31 (м, 5Н), 7,50 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 7,82 (с, 1Н), 7,90 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 8,00 (шир.т, 1Н), 8,32 (с, 1Н).

Пример 49-4

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(D)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

MS (FAB) m/z 701 (MH+); 1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,94-1,08 (м, 12Н), 1,39-2,35 (м, 13Н), 2,65-2,85 (м, 2Н), 3,98 (м, 1Н), 4,23 (шир.т, 2Н), 4,42 (м, 1Н), 5,49 (д, J=17,5 Гц, 1Н), 5,50 (с, 2Н), 5,63 (д, J=17,5 Гц, 1Н), 7,53 (д, J=7,9 Гц, 1Н), 7,79 (с, 1Н), 7,92 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 8,06 (шир.т, 1Н), 8,35 (с, 1Н).

Пример 49-5

Дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лизил-(L)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

MS (FAB) m/z 716 (MH+); 1Н-ЯМР (400 МГц, CD3OD) δ 0,99 (т, J=7,2 Гц, 3Н), 1,04 (т, J=7,2 Гц, 3Н), 1,46-2,30 (м, 16Н), 2,76-2,90 (м, 2Н), 2,95 (шир.т, J=7,8 Гц, 2Н), 4,07 (т, J=6,6 Гц, 1Н), 4,22 (шир.т, 2Н), 4,55 (дд, J=10,0, 4,4 Гц, 1Н), 5,49 (д, J=16,8 Гц, 1Н), 5,50 (с, 2Н), 5,63 (д, J=16,8 Гц, 1Н), 7,51 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,81 (с, 1Н), 7,93 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 8,06 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 8,30 (с, 1Н).

Пример 49-6

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-валил-(D)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

MS (FAB) m/z 687 (MH+); 1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,97-1,11 (м, 12Н), 1,40-1,59 (м, 4Н), 1,88-2,33 (м, 7Н), 2,66-2,89 (м, 2Н), 3,80 (д, J=5,6 Гц, 1Н), 4,23 (шир.т, 2Н), 4,43 (дд, J=9,2, 4,6 Гц, 1Н), 5,49 (д, J=17,5 Гц, 1Н), 5,51 (с, 2Н), 5,63 (д, J=17,5 Гц, 1Н), 7,54 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 7,80 (с, 1Н), 7,93 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 8,08 (шир.т, 1Н), 8,35 (с, 1Н).

Пример 49-7

Дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-орнитил-(L)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

MS (FAB) m/z 702 (MH+); 1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,99 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,04 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,40-2,38 (м, 14Н), 2,68-3,00 (м, 2Н), 3,01 (шир.т, 2Н), 4,11 (м, 1Н), 4,24 (шир.т, 2Н), 4,57 (м, 1Н), 5,48 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,51 (с, 2Н), 5,64 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,57 (д, J=7,3 Гц, 1Н), 7,93 (с, 1Н), 8,01 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 8,11 (шир.т, 1Н), 8,33 (с, 1Н).

Пример 49-8

Метансульфонат (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(D)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

MS (FAB) m/z 701 (MH+); 1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,95-1,08 (м, 12Н), 1,39-2,35 (м, 13Н), 2,66-2,75 (м, 2Н), 2,72 (с, 9Н), 3,96 (м, 1Н), 4,25 (шир.т, 2Н), 4,45 (м, 1Н), 5,49 (д, J=17,5 Гц, 1Н), 5,51 (с, 2Н), 5,63 (д, J=17,5 Гц, 1Н), 7,52 (с, 1Н), 7,54 (д, J=7,9 Гц, 1Н), 7,88 (д, J=8,6 Гц, 1Н), 8,09 (шир.т, 1Н), 8,38 (с, 1Н).

Пример 49-9

Дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(D)-лизил-(L)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

MS (FAB) m/z 716 (MH+); 1Н-ЯМР (400 МГц, CD3OD) δ 0,95-1,07 (м, 6Н), 1,42-2,30 (м, 16Н), 2,64-2,95 (м, 2Н), 2,99 (шир.т, 2Н), 4,02 (шир.т, 1Н), 4,26 (м, 2Н), 4,39 (м, 1Н), 5,51 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,52 (с, 2Н), 5,63 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,55 (д, J=7,2 Гц, 1Н), 7,96 (с, 1Н), 7,99 (шир.д, 1Н), 8,09 (шир.т, 1Н), 8,33 (с, 1Н).

Пример 49-10

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-фенилаланил-(L)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

MS (FAB) m/z 721 (MH+); 1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,99 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,04 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,42-2,30 (м, 8Н), 2,98-3,37 (м, 4Н), 4,17 (м, 1Н), 4,24 (шир.т, 2Н), 4,82 (м, 1Н), 5,50 (с, 2Н), 5,51 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,62 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,31 (шир.с, 5Н), 7,53 (д, J=7,3 Гц, 1Н), 7,68 (с, 1Н), 7,83 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 8,08 (шир.т, 1Н), 8,36 (с, 1Н).

Пример 49-11

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-циклогексилаланил-(D)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

MS (FAB) m/z 727 (MH+); 1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,98 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,04 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 0,80-2,27 (м, 21Н), 3,23 (шир.д, J=6,0 Гц, 2Н), 3,98 (м, 1Н), 4,24 (шир.т, 2Н), 4,85 (м, 1Н), 5,50 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,52 (с, 2Н), 5,63 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,54 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 7,72 (с, 1Н), 7,87 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 8,09 (т, J=7,6 Гц, 1Н), 8,36 (с, 1Н).

Пример 49-12

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-циклогексилаланил-(L)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

MS (FAB) m/z 727 (MH+); 1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,98 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,04 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 0,90-2,30 (м, 21Н), 3,12-3,34 (м, 2Н), 3,93 (м, 1Н), 4,22 (шир.т, 2Н), 4,83 (м, 1Н), 5,50 (с, 2Н), 5,51 (д, J=17,5 Гц, 1Н), 5,63 (д, J=17,5 Гц, 1Н), 7,47 (шир.д, 1Н), 7,65 (шир.с, 1Н), 7,82 (шир.д, 1Н), 8,03 (шир.т, 1Н), 8,30 (с, 1Н).

Пример 49-13

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-триптофил-(L)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

MS (FAB) m/z 760 (MH+); 1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,98 (т, J=6,9 Гц, 3Н), 1,00 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,39-1,60 (м, 4Н), 1,83-1,97 (м, 2Н), 2,13-2,30 (м, 2Н), 3,05-3,40 (м, 4Н), 4,12 (м, 2Н), 4,29 (м, 1Н), 4,79 (м, 1Н), 5,27 (д, J=17,8 Гц, 1Н), 5,36 (д, J=17,8 Гц, 1Н), 5,51 (д, J=17,5 Гц, 1Н), 5,63 (д, J=17,5 Гц, 1Н), 8,68 (шир.т, 1Н), 7,06 (шир.т, 1Н), 7,10 (с, 1Н), 7,29 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 7,43 (д, J=7,9 Гц, 1Н), 7,53 (д, J=7,3 Гц, 1Н), 7,84 (с, 1Н), 7,85 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 8,06 (шир.т, 1Н), 8,30 (с, 1Н).

Пример 49-14

Дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-орнитил-(D)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

MS (LCMS) m/z 702 (MH+); 1Н-ЯМР (400 МГц, CD3OD) δ 0,98 (т, J=7,0 Гц, 3Н), 1,04 (т, J=7,4 Гц, 3Н), 1,46-2,21 (м, 14Н), 2,77-2,81 (м, 2Н), 3,01 (шир.т, J=7,4 Гц, 2Н), 4,03 (т, J=6,6 Гц, 1Н), 4,24 (м, 2Н), 4,44 (м, 1Н), 5,50 (д, J=16,8 Гц, 1Н), 5,51 (с, 2Н), 5,63 (д, J=16,8 Гц, 1Н), 7,54 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,91 (с, 1Н), 7,95 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 8,09 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 8,34 (с, 1Н).

Пример 49-15

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(D)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

1Н-ЯМР (270 МГц) δ (CD3OD) 0,80-0,91 (м, 6Н), 0,91-1,06 (м, 6Н), 1,37-1,80 (м, 7Н), 2,83-2,01 (м, 2Н), 2,07-2,30 (м, 2Н), 3,15-3,40 (м, 2Н), 3,88-4,00 (м, 1Н), 4,25 (шир.т, 2Н), 4,74-4,93 (м, 1Н), 5,50 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,52 (с, 2Н), 5,62 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,55 (д, J=7,9 Гц, 1Н), 7,75 (с, 1Н), 7,88 (д, J=8,6 Гц, 1Н), 8,10 (шир.т, 1Н), 8,37 (с, 1Н); MS (FAB) m/z 687 (МН+).

Пример 49-16

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-валил-(D)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

1Н-ЯМР (270 МГц) δ (CD3OD) 0,86 (д, J=6,9 Гц, 3Н), 0,88 (д, J=6,9 Гц, 3Н), 0,94-1,08 (м, 6Н), 1,40-1,61 (м, 4Н), 1,89-2,05 (м, 2Н), 2,05-2,28 (м, 3Н), 3,13-3,38 (м, 2Н), 3,77 (д, J=5,3 Гц, 1Н), 4,25 (шир.т, 2Н), 4,77-4,91 (м, 1Н), 5,49 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,53 (с, 2Н), 5,62 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,55 (д, J=7,3 Гц, 1Н), 7,79 (с, 1Н), 7,91 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 8,10 (шир.т, 1Н), 8,37 (с, 1Н); MS (FAB) m/z 673 (МН+).

Пример 49-17

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(L)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

1Н-ЯМР (270 МГц) δ (CD3OD) 0,79-1,00 (м, 12Н), 1,30-1,51 (м, 4Н), 1,30-1,75 (м, 3Н), 1,75-1,92 (м, 2Н), 2,00-2,21 (м, 2Н), 3,00-3,30 (м, 2Н), 3,76-3,85 (м, 1Н), 4,09-4,20 (м, 2Н), 4,68-4,85 (м, 1Н), 5,41 (д, J=17,3 Гц, 1Н), 5,43 (с, 2Н), 5,57 (д, J=17,3 Гц, 1Н), 7,43 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 7,65 (с, 1Н), 7,76 (д, J=8,2 Гц, 1Н), 7,99 (шир.т, 1Н), 8,27 (с, 1Н); MS (FAB) m/z 687 (МН+).

Пример 49-18

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-циклогексилглицил-(L)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

1Н-ЯМР (270 МГц) δ (CD3OD) 0,92-1,07 (м, 6Н), 1,7-2,30 (м, 21Н), 2,62-3,09 (м, 2Н), 3,87 (д, J=5,6 Гц, 1Н), 4,24 (шир.т, 2Н), 4,40-4,51 (м, 1Н), 5,48 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,51 (с, 2Н), 5,63 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,53 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 7,88 (с, 1Н), 7,97 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 8,06 (шир.т, 1Н), 8,32 (с, 1Н); MS (FAB) m/z 727 (МН+).

Пример 49-19

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(D)-циклогексилаланил-(L)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

1Н-ЯМР (270 МГц) δ (CD3OD) 0,93-1,08 (м, 6Н), 1,15-2,36 (м, 23Н), 2,60-2,94 (м, 2Н), 3,99 (шир.т, 1Н), 4,22 (шир.т, 2Н), 4,37-4,45 (м, 1Н), 5,49 (д, J=17,3 Гц, 1Н), 5,50 (с, 2Н), 5,62 (д, J=17,3 Гц, 1Н), 7,51 (д, J=7,9 Гц, 1Н), 7,80 (с, 1Н), 7,91 (д, J=8,2 Гц, 1Н), 8,05 (шир.т, 1Н), 8,32 (с, 1Н); MS (FAB) m/z 741 (МН+).

Пример 49-20

Дигидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лизил-(D)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

1Н-ЯМР (270 МГц) δ (CD3OD) 0,92-1,10 (м, 6Н), 1,40-1,62 (м, 6Н), 1,62-1,80 (м, 7Н), 1,83-2,41 (м, 8Н), 2,70-2,82 (м, 2Н), 2,89-3,00 (м, 2Н), 3,93-4,03 (м, 1Н), 4,16-4,31 (м, 2Н), 4,40-4,50 (м, 1Н), 5,30 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,53 (с, 2Н), 5,63 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,54 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 7,87 (с, 1Н), 7,94 (д, J=8,2 Гц, 1Н), 8,10 (шир.т, 1Н), 8,35 (с, 1Н); MS (FAB) m/z 716 (МН+).

Пример 49-21

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-тртиптофил-(D)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

1Н-ЯМР (270 МГц, CD3OD) δ 0,99 (т, J-7,3 Гц, 3Н), 1,04 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,40-2,39 (м, 9Н), 2,19 (т, J=7,3 Гц, 1Н), 2,58-2,74 (м, 1Н), 2,91-3,05 (м, 1Н), 3,10 (дд, J=15,2, 5,6 Гц, 1Н), 3,40 (дд, J=15,2, 5,6 Гц, 1Н), 3,95-4,15 (м, 2Н), 4,21 (шир.т, J=5,6 Гц, 1Н), 4,58-4,69 (м, 1Н), 5,00 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 5,20 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 5,48 (д, J=7,3 Гц, 1Н), 5,67 (д, J=7,3 Гц, 1Н), 6,59 (т, J=7,3 Гц, 1Н), 6,66 (с, 1Н), 6,94-7,03 (м, 2Н), 7,25 (д, J=7,9 Гц, 1Н), 7,45 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 7,87 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 7,92 (с, 1Н), 7,97 (т, J=7,6 Гц, 1Н), 8,18 (с, 1Н); MS (FAB) m/z 774 (МН+).

Пример 49-22

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-лейцил-(L)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

1Н-ЯМР (270 МГц) δ (CD3OD) 1,01-1,06 (м, 12Н), 1,39-2,32 (м, 13Н), 2,67-2,79 (м, 1Н), 2,89-2,98 (м, 1Н), 4,08 (шир.т, J=5,6 Гц, 1Н), 4,23 (шир.т, 2Н), 4,50 (дд, J=9,6, 4,6 Гц, 1Н), 5,49 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,51 (с, 2Н), 5,63 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,52 (дд, J=7,6, 1,0 Гц, 1Н), 7,88 (с, 1Н), 7,96 (дд, J=8,2, 1,0 Гц, 1Н), 8,05 (шир.т, 1Н), 8,30 (с, 1Н); MS (ES) m/z 701 (МН+).

Пример 49-23

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[глицил-(D)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

1Н-ЯМР (270 МГц) δ (CD3OD) 0,95-1,05 (м, 6Н), 1,39-2,30 (м, 10Н), 2,62-2,89 (м, 2Н), 3,48 (д, J=16,0 Гц, 1Н), 3,86 (д, J=16,0 Гц, 1Н), 4,23 (шир.т, J=7,7 Гц, 2Н), 4,51 (дд, J=9,4, 4,5 Гц, 1Н), 5,48 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,50 (с, 2Н), 5,62 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,51 (д, J=7,9 Гц, 1Н), 7,77 (с, 1Н), 7,91 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 8,06 (шир.т, 1Н), 8,31 (с, 1Н); MS (ES) m/z 645 (МН+).

Пример 49-24

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-аланил-(D)-γ-глютамилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

1Н-ЯМР (270 МГц) δ (CD3OD) 0,98 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,03 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,56 (д, J=6,9 Гц, 3Н), 1,39-2,34 (м, 10Н), 2,64-2,85 (м, 2Н), 4,03 (кв, J=6,9 Гц, 1Н), 4,23 (шир.т, J=7,6 Гц, 2Н), 4,44 (дд, J=9,4, 4,8 Гц, 1Н), 5,48 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,50 (с, 2Н), 5,62 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 7,51 (д, J=7,9 Гц, 1Н), 7,76 (с, 1Н), 7,89 (д, J=8,2 Гц, 1Н), 8,06 (шир.т, 1Н), 8,32 (с, 1Н); MS (ES) m/z 659 (МН+).

Пример 49-25

Гидрохлорид (9S)-9-этил-9-[(L)-фенилаланил-(D)-β-аспартилокси]-1-пентил-1Н,12Н-пирано[3",4":6',7']индолизино[1',2':6,5]пиридо[4,3,2-de]хиназолин-10,13(9Н,15Н)-диона

1Н-ЯМР (270 МГц) δ (CD3OD) 1,01 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,04 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,40-2,25 (м, 7Н), 2,62 (дд, J=14,5, 9,9 Гц, 1Н), 3,02 (дд, J=14,5, 4,3 Гц, 1Н), 3,33-3,47 (м, 2Н), 4,10-4,20 (м, 3Н), 4,93-5,01 (м, 2Н), 5,12 (д, J=18,5 Гц, 1Н), 5,32 (д, J=18,5 Гц, 1Н), 5,48 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 5,64 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 6,81-6,88 (м, 4Н), 7,01 (м, 1Н), 7,53 (д, J=7,6 Гц, 1Н), 7,91 (с, 1Н), 7,93 (шир.д, 1Н), 8,09 (шир.т, 1Н), 8,24 (с, 1Н); MS (FAB) m/z 721 (МН+).

Пример 50: Опухоль-специфическая активация и противоопухолевая активность TTC

50-1. Генерирование клеток, способных конститутивно экспрессировать высокий уровень содержания микросомальной дипептидазы

Среди ферментов, подвергнутых селекции в соответствии с результатами ранжировки олигонуклеотидов, кДНК полной длины микросомальной дипептидазы (MDP) (GenBank Accesion № J05257. Adachi, H., et.al. Primary atructure of human microsomal dipeptidase dedused from molecular cloning. J. Biol. Chem, 265, 3992-3995 (1990)) клонировали по Hind III сайту вектора pRC/CMV (Invitriogen, San Diego, USA, Catalog № V750-20) и трансфицировали в клеточную линию человеческой опухоли HCT116 (ATCC Number, CCL-247), которая экспрессирует лишь незначительный уровень микросомальной дипептидазной мРНК. Вектор pRC/CMV, не содержащий какой-либо кДНК, также трансфицировали в такую же клеточную линию с целью генерации контрольной линии клеток. Трансфекцию кДНК проводили с использованием TransIT-LT2 (Pan Vera, Madison, USA, Catalog № MIR2320) в соответствии с инструкциями изготовителей. Полученные в результате трансфектанты культивировали в среде MaCoy5A (Sigma, St Louis, USA, Catalog № M8403), дополненной 10% (об/об) фетальной телячей сыворотки и 1 мг/мл дисульфата генетицина (Waco, Osaka, Japan, Catalog № 535-24624). Клетки, растущие в присутствии 1 мг/мл G418, собирали и культивировали в среде MaCoy5A.

Для определения микросомальных дипептидазных активностей в клетках субконфлюентные монослойные культуры НСТ116, обработанные pRC/CMV, НСТ116, несущие pRC/CMV-MDP (далее в тексте НСТS5), промывали фосфатным забуференным солевым раствором (PBS), клетки собирали лезвием, суспендировали в PBS и клетки собирали низкоскоростным центрифугированием при 1000 × g в течение 5 минут. Клеточный дебрис суспендировали в PBS и подверали лизису в результате ультразвуковой обработки с использованием Polytron (5 секеунд при максимальной скорости). Используя аналогичный способ, клеточные экстракты предшественников гранулоцитов также готовили из CD-34-положительных моноядерных клеток крови человеческой пуповины. Всплывшие предшественники гранулоцитов, культивированные в течение 5 дней на слитом монослое MS5 в присутствии 50 нг/мл Flt3 лиганда, 100 нг/мл SCF и 50 нг/мл TPO, собирали, промывали с PBS, суспендировали в PBS и подвергали лизису путем гомогенизации с помощью Polytron. После удаления клеточного дебриса центрифугированием при 15000 × g в течение 15 минут супернатанты использовали в проследующих экспериментах.

После определения концетраций белков в клеточных экстрактах с помощью набора для DC анализа белков (Bio-Rad, Hercules, USA, Catalog № 500-0116) в соответствии с инструкциями производителей также определяли микросомальные дипептидазные активности в соответствии со способом Watanabe et al. (Watanabe, T. et al., Biochim. Biophys. Acta. 1298, 109-118 ((1996). Клеточные экстракты инкубировали в течение 30 минут при 37°С в 100 мкл реакционной смеси, содержащей 25 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 10 мкм ZnCl2, 10 мМ глицин-(D)-аланин, 20 мкМ FAD, 3,75 Ед/мл оксидазы D-аминокислоты (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Catalog № 102 784). Затем реакцию прекращали путем добавления 40 мкл 25% (масс./об.) трифторуксусной кислоты. После центрифугирования при 10000 × g в течение 5 минут 100 мкл супернатанта смешивали с 20 мкл 0,1% (мас./об.) 2,4-динитрофенилгидразина, растворенного в 2М HCl, и проводили инкубацию в течение 15 минут при 37°С. После этого раствор смешивали с 3,75М NaOH и дополнительно инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Количество (D)-аланина, продуцированного из глицин-(D)-аланина клеточными экстрактами, рассчитывали из спектрального поглощения при длине волны 445 нм, а также в сравнении со стандартным (D)-аланином.

Ферментные активности одного из клонов НСТS5, которые переносят pRC/CMV-MDP, обеспечивают более высокий уровень активностей микросомальных дипептидаз (430 нмоль (D)-аланина, продуцированного в минуту в расчете на мг белка), в сравнении со значением вектор-трасфекцированной НСТ116 (менее 1 нмоля (D)-аланина, продуцированного в минутуна мг белка) и предшествнников гранулоцитов (менее 1 нмоля (D)-аланина, подуцированного в минуту на мг белка).

50-2. Рост ингибирующие активности ТТС, зависящие от микрсомальной дипептидазы.

С использованием 96-луночных мультипланшетов, примерно 2×103 клеток на лунку НСТ116, несущих pRC/CMV, и НСТ116S5, несущих pRC/CMV-MDP, культивировали в 200 мкл среды McCoy5A, дополненной 10% FBS, в присутствии или в отсутствие указанных концентраций лекарств при 37°С в атмосфере влажного воздуха, содержащего 5% СО2. На клетки воздействовали лекарственными средствами в течение 24 часов (таксол, камптотецины и их пролекарственные формы) или 96 часов (DMDC и его производные). При времени лекарственного воздействия на клетки, составляющем 24 часа, культуральную среду, содержащую лекарства, удаляли и клетки промывали и суспендировали в свежей среде, не содержащей лекарств, и дополнительно культивировали при 37°С в атмосфере влажного воздуха, содержащего 5% СО2, в течение определенного числа дней. Затем в культуральные среды добавляли 10 мкл WST-8 (Cell Counting Kit-8, Wako, Osaka, Japan, Catalog № 343-07623) и клетки дополнительно инкубировали в течение 1-2 часов при 37°С. Ингибирование клеточного роста рассчитывали в виде значений IC50 в соответствии с оптическими плотностями при 450 нм и 655 нм. Для изучения влияния лекарств на предшественники гранулоцитов гранулоцитные предшественники, которые размножали на монослое MS-5 в течение 7 дней, собирали и промывали средой RPMI1640.

Примерно 5000 клеток суспендировали в 200 мкл среды RPMI, дополненной 10% FBS и 50 нг/мл G-CSF, в присутствии или в отсутствие лекарств и культивировали в присутствии лекарств в течение 24 часов (таксол, камптотецины и их пролекарственные формы) или 7 дней (DMDC и его производные) при 37°С в атмосфере влажного воздуха, содержащего 5% СО2. В том случае, когда время воздействия лекарств на клетки составляло 24 часа, лекарства удаляли через 24 часа после их добавления путем промывки клеток указанной выше средой, и клетки дополнительно культивировали в течение 6 дней в той же среде, не содержащей лекарственных средств. Затем в культуральные среды добавляли 20 мкл WST-1 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Catalog № 1644807) и клетки дополнительно инкубировали в течение 6 часов при 37°С. Ингибирование клеточного роста рассчитывали в виде значений IC50 в соответствии с оптическими плотностями при 450 нм и 655 нм. Ингибирование роста под воздействием паклитаксела, камптотецина и DMDC существенно не отличалось в случае HCT116, HCT116/S5 и предшественников гранулоцитов. Однако их производные проявляют более сильную анти-пролиферативную активность в отношении НСТ116/S5, которые экспрессируют более высокие микросомальные дипептидазные активности, чем НСТ116 и предшественники гранулоцитов, обладающие очень незначительной микросомальной дипептидазной активностью (см. биологические активности в примерах).

ПРИМЕР А

Таблетки, содержащие указанные ингредиенты, могут быть получены традиционным способом:

ИнгредиентыВ расчете на таблетку
Соединение примера 410,0-300,0 мг
Лактоза125,0мг
Маисовый крахмал75,0мг
Тальк4,0 мг
Стеарат магния1,0 мг

ПРИМЕР В

Таблетки, содержащие указанные ингредиенты, могут быть получены традиционным способом:

ИнгредиентыВ расчете на капсулу
Соединение примера 4100,0 мг
Лактоза150,0 мг
Маисовый крахмал20,0 мг
Тальк5,0 мг

ПРИМЕР С

Растворы для инъекций могут иметь следующий состав:

Соединение примера 410,0 мг
Хлористый натрийq.s. мг
Вода для инъекцийдо 2,0 мл

1. Способ идентификации фермента, используемого при получении препарата для доставки противораковых соединений, которые избирательно превращаются в активные вещества в опухолевой ткани или клетках, где указанный способ включает стадии сравнения уровней экспрессии генов в здоровой человеческой ткани или нормальных клетках с уровнями экспрессии генов в человеческой опухолевой ткани или клетках опухолевого происхождения, и выбора фермента, имеющего в тканях или клетках опухолевого происхождения уровень экспрессии более чем вдвое выше по сравнению с нормальными клетками или здоровой тканью.

2. Способ по п.1, в котором фермент идентифицируют с помощью анализов, включающих анализ ДНК на микроматрицах, полимеразную цепную реакцию, нозерн-блоттинг, гибридизацию in situ, дифференциальные замены, анализ на защиту РНК, анализ белков на матрицах, вестерн-блоттинг, двухмерный гель-электрофорез, твердофазный иммуноферментный анализ.

3. Способ по п.2, в котором фермент идентифицируют путем анализа ДНК на микроматрицах или полимерзаной цепной реакции.

4. Способ по п.1, в котором нормальные клетки или здоровая ткань происходят от здоровых растущих клеток.

5. Способ по п.1, в котором источник опухолевой ткани или клеток опухолевого происхождения выбирают из группы, состоящей из опухоли мозга, легких, пищевода, молочной железы, желудка, поджелудочной железы, печени, толстой кишки, прямой кишки, почек, яичников, матки, мочевого пузыря, предстательной железы, кожи и крови.

6. Способ по п.1, в котором нормальные клетки происходят от кроветворных клеток-предшественников, клеток кишечника или кожи.

7. Способ по п.1, в котором здоровая ткань происходит из кишечника или кожи.

8. Способ по п.6, в котором кроветворные клетки-предшественники происходят от костного мозга или пуповинной крови.

9. Способ по п.4, где уровень экспрессии фермента в тканях или клетках опухолевого происхождения более чем вдвое превышает уровень экспрессии в нормальных клетках или здоровой ткани, выбранных из кроветворных клеток-предшественников, а также нормальных клеток или здоровой ткани печени.

10. Способ изготовления препарата для доставки противораковых соединений, которые способны превращаться в активные вещества избирательно в опухолях, включающий стадии

(a) культивирования клеток в присутствии или в отсутствии тестируемого соединения, где в указанные клетки включена кДНК фермента, идентифицированного способом по любому из пп.1-9; и

(b) определения, что тестируемые соединения представляют собой противораковые соединения, которые способны избирательно превращаться в активные вещества в опухолях, если ингибирование роста клеток выявляется количественно и может сравниваться относительно живых клеток, в присутствии и в отсутствии тестируемых соединений.

11. Способ по п. 10, в котором указанные ферменты представляют собой микросомальную дипептидазу, арилсульфатазу А, пирролин 5'-карбоксиредуктазу, дегидродиолдегидрогеназу, карбонилредуктазу, лизилгидроксилазу, пролидазу, дигидропиримидиназу, глутамин:фруктоза-6-фосфат амидотрансферазу, UDP-галактозакерамидгалактозил трансферазу, лизилоксидазу, енолазу, глюкоза-6-фосфат дегидрогеназу, стеароил-кофермент А десатуразу, эпоксид гидролазу или альдолазу С.

12. Способ по п.10, в котором указанные ферменты представляют собой микросомальную дипептидазу, дегидродиолдегидрогеназу, пирролин 5'-карбоксиредуктазу, карбонилредуктазу или лизилгидроксилазу, или предпочтительно микросомальную дипептидазу.

13. Способ по п.10, в котором указанный фермент представляет собой микросомальную дипептидазу.

14. Применение фермента, идентифицированного способом по любому из пп.1-9, для доставки противораковых соединений, которые способны превращаться в активные вещества избирательно в опухолях, где получение противораковых соединений осуществляется способом по п.10 или 11.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, фармакологии, онкологии, и касается способов и лекарственных форм для противоопухолевого лечения и повышения пероральной биологической доступности таксанов.

Изобретение относится к медицине и лекарственным средствам, а именно к композиции для солюбилизации паклитаксела, при этом композиция включает в себя 40-89,99 мас.% (или 40-64,7 мас.% - варианты) моноолеина, 10-59,99 мас.% (или 25-49,7 мас.% - варианты) масла и 0,01-10 мас.% (или 0,3-4 мас.% - варианты) паклитаксела, а также к способу получения такой композиции.

Изобретение относится к новым С-21-метилированным производным паклитаксела формулы (I), в которых: где R представляет трифторметил, фенил, 2-фурил, 2-тиенил;R1 представляет трет-бутоксикарбонил или бензоил; R2 представляет гидрокси; R3 является водородом или вместе с R2 образует остаток циклического карбоната формулы при условии, что, когда R3 является водородом, R не является фенилом, а также фармацевтической композиции на их основе и применению для получения лекарственных средств с противоопухолевой активностью.
Изобретение относится к фармацевтике и касается фармацевтической композиции, терапевтическому комбинированному продукту и набору. .

Изобретение относится к новой кристаллической форме (1S,2S,3R,4S,5R,8R,9S,10R,13S)-4-ацетокси-2-бензоилокси-9,10-[(1S)-2-(диметиламино)этилидендиокси]-5,20-эпокси-1 -гидрокситакс-11 -ен-13-ил(2R,3S)-3-(трет-бутоксикарбониламино)-3-(3-фтор-2-пиридил)-2-гидроксипропионата, которая демонстрирует картину дифракции рентгеновских лучей в порошке с характеристическими пиками при углах дифракции (2 ), равных 6,2°, 10,3°, 10,7°, 11,4° и 12,0°, и способу ее получения, который включает этап проведения кристаллизации с использованием органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из растворителя типа кетона, растворителя типа нитрила и их смеси или смеси указанного органического растворителя и воды.

Изобретение относится к лекарственным средствам и касается применения доцетаксела в качестве лекарственного препарата вспомогательной терапии для лечения метастатического рака молочной железы в комбинации с доксорубицином и циклофосфамидом, которое обеспечивает повышенный коэффициент выживаемости, у больных со сверхэкспрессироваными железами ER, PR и/или HER2

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения паклитаксела, который содержит: (а) ацетилирование 10-деацетил-баккатина III в позиции С-10 в присутствии третичного аминооснования для выделения баккатина III; (b) защиту баккатина III в позиции С-7 путем реагирования баккатина III с защитной группой, такой как 2,2,2-трихлорэтилхлорформиат в присутствии в качестве катализатора третичного амина; (с) преобразование продукта, полученного на этапе (b), в паклитаксел
Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и касается способов комбинированного лечения немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) III стадии

Изобретение относится к новым токоферол-модифицированным терапевтическим лекарственным соединениям формулы 1 T-L-D, в которой Т представляет собой токоферол, L представляет собой сукцинат, и D представляет собой камптотецин или его производное, где все три фрагмента ковалентно соединены

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения больных с локализованным мелкоклеточным раком легкого (МРЛ) Т3N 0-3М0

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения негематологических злокачественных опухолей, экспрессирующих инсулиноподобный фактор роста IGF-1R
Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении немелкоклеточного рака легкого III стадии
Наверх