Липотейхоевая кислота из молочно-кислых бактерий и ее применение для модуляции иммунных реакций, опосредованных грамотрицательными бактериями, потенциальными патогенными грамположительными бактериями

Изобретение относится к композиции для уменьшения или предупреждения воспалительных процессов, связанных с бактериально опосредованным заболеванием или LTA/LPS-опосредованными нарушениями в желудочно-кишечном тракте у человека или животных, включающей в качестве активного ингредиента липотейхоевую кислоту из молочно-кислых бактерий, принадлежащих к роду Lactobacillus, причем липотейхоевая кислота из молочно-кислых бактерий была отобрана по ее способности связываться с CD 14 и по ее неспособности индуцировать высвобождение противовоспалительных цитокинов, таких как IL-8 или TNF-α, из кишечных эпителиальных клеток. Применение по меньшей мере одной липотейхоевой кислоты из молочно-кислой бактерии, принадлежащей к роду Lactobacillus и/или продуцирующей ее молочно-кислой бактерии и/или супернатанта ее культуры для приготовления композиции, предназначенной для уменьшения или предупреждения воспалительных процессов, связанных с бактериально опосредованным заболеванием или LTA/LPS-опосредованными нарушениями в желудочно-кишечном тракте, костях, коже, глазах, ушах, легких и полости рта человека или животных. Изобретение обеспечивает поддержание иммунного гомеостаза, предотвращение или уменьшение воспалительных процессов. 2 н. и 6 з. п. ф-лы, 8 ил.

 

Область техники, к которой относится данное изобретение

Данное изобретение относится к медицине, в частности к композиции, содержащей липотейхоевую кислоту из молочно-кислых бактерий, для модуляции иммунных реакций, индуцируемых грамотрицательными бактериями, потенциальными патогенными грамположительными бактериями и/или их производными. Оно относится также к применению липотейхоевой кислоты из молочно-кислых бактерий в качестве активного ингредиента в приготовлении лекарственного средства, продукта для перорального или местного применения для косметических, дерматологических или офтальмологических применений, пищевой композиции или композиции для корма комнатных животных для модуляции бактериальной колонизации, иммунных реакций и уменьшения воспалительных процессов, связанных с опосредуемыми бактериями заболеванием и инфекцией, в желудочно-кишечном тракте, костях, коже, глазах, ушах, легких и полости рта. Данное изобретение относится также к липотейхоевой кислоте, отобранной для этого.

Уровень техники

При родах происходит колонизация ранее стерильного фетального кишечника многообразным микробным инокулумом. Установление кишечной микрофлоры является очень динамичным процессом во время первых дней жизни, прежде чем установятся стабильные популяции в определенных районах желудочно-кишечного тракта. Происходит последовательная колонизация сначала Е. coli и видами стрептококков (Mata, L.J. and J.J. Urrutia. 1971. Ann N Y Acad Sci 176:93-108) и затем бифидогенной микрофлорой, которая является высокодоминирующей во вскармливаемых грудью детях и предоставляет некоторую защиту против потенциальных патогенов (Gibson G.R. and X. Wang. 1994. J Appi Bacteriol. 77:412-420).

Молочно-кислые бактерии (LAB), такие как лактобациллы и бифидобактерии, являются нормальными обитателями желудочно-кишечного тракта взрослого человека. Отобранные штаммы из этих родов, называемые пробиотиками, являются ценными для здоровья при пероральном введении их хозяину (Brassart, D. and E.J. Schiffrin. 1997. Trends Food Sci Technol 9:321-326). Подобно сосуществующим молочно-кислым бактериям (LAB) пробиотики действуют антагонистически на патогенные организмы и стимулируют механизмы иммунной защиты. Хотя мало известно о точных механизмах, лежащих в основе этих биологических действий, широко признается, что штаммами, которые с наибольшей вероятностью проявляют пользу для здоровья, являются те штаммы, которые могут временно прикрепляться к эпителию кишечника, возможно, через липотейхоевую кислоту (LTA) в их клеточных стенках.

LTA является комплексным глицерофосфатным полимером, связанным с гидрофобной липидной частью молекулы (Fischer, W. 1990. Bacterial Phosphoglycolipids and lipoteichoic acids. In Glycolipids, phosphoglycolipids and sulfoglycolipids, M. Kates, editor. Hanahan, D.J., New York and London. 123-234). Она является компонентом клеточной стенки большинства грамположительных бактерий, и, хотя существует большое разнообразие в LTA из различных бактерий, она имеет структурные сходства с липополисахаридом (LPS), обнаруженным в клеточной стенке грамотрицательных организмов. Тем не менее, представляется, что только LTA из специфических видов бактерий опосредует подобные эффекты (Suda, Y., et al., FEMS Immunol Med Microbiol 12:97-112; Arakaki, R., et al., 1998, FEMS Immunol Med Microbiol 22:283-291).

Хотя LTA из грамположительных бактерий обнаруживает значительное разнообразие от штамма к штамму, имеется некоторое структурное сходство с LPS, присутствующим в клеточной стенке грамотрицательных организмов. Рецепторы узнавания пространственного распределения типов и активностей клеток (PRR) узнают консервативные районы бактериальных структур и передают сигнал хозяину о присутствии бактериального инокулума. Одним из таких рецепторов является CD 14, заякоренный гликозилфосфатидилинозитом (ОРГ) гликопротеин, присутствующий на миелоидных клетках. В настоящее время известно, что он может связывать как LTA, так и LPS. В самом деле, сепсис, вызываемый грамотрицательными организмами, происходит через связывание LPS в CD 14 на мембране моноцитов-макрофагов. Существует все увеличивающееся доказательство того, что растворимая форма CDH-рецептора опосредует связывание LPS с CDH-негативными клетками. Однако эта молекула узнает также другие бактериальные компоненты, такие как пептидогликан, липоарабиноманнан и полимеры мануроновой кислоты (Dziarski, R., et al., 2000. Chem Immunol. 74:83-107). Авторы данного изобретения сообщали, что растворимая форма CD 14 (sCD14), присутствующая в грудном молоке человека, стимулирует кишечные эпителиальные клетки человека (IEC) к высвобождению цитокинов после воздействия непатогенной Е. coli или ее LPS (Labeta, М.О., et al., 2000. J Ехр Med 191:1807-1812), но не после воздействия живыми грамположительными бактериями или компонентами их клеточных стенок.

Данное изобретение нацелено на обеспечение композиции, способной модулировать иммунные реакции, имеющие место во время бактериальной колонизации или инфекции, и предотвращать или уменьшать любую воспалительную реакцию, индуцируемую ими, в желудочно-кишечном тракте, костях, коже, глазах, легких, ушах и полости рта у человека или животных.

Раскрытие изобретения

Таким образом, в первом аспекте данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую липотейхоевую кислоту из молочно-кислых бактерий в качестве активного ингредиента, для модуляции иммунных реакций, индуцируемых грамотрицательными бактериями, потенциальными патогенными грамположительными бактериями и/или их производными.

Эта композиция, содержащая липотейхоевую кислоту из молочно-кислых бактерий, может поддерживать иммунный гомеостаз, предотвращать или уменьшать воспалительные процессы, индуцируемые грамотрицательными бактериями, и/или применяться для LPS-опосредованных нарушений. Она может также использоваться против патогенных или потенциальных патогенных грамположительных бактерий и/или LTA-опосредованных нарушений.

Фактически было обнаружено, что имеется антагонистическое действие LTA из штаммов молочно-кислых бактерий, таких как штамм Lactobacillus johnsonii Lal и штамм Lactobacillus acidophilus La 10, например, на отвечаемость IEC (кишечных эпителиальных клеток), провоцированных LPS, очищенным из Е. coli и Salmonella enteridis, или цельными бактериями Е. coli. При предоставлении LTA из любого из этих штаммов Lactobacillus одновременно с LPS в присутствии молока человека опосредованное LPS-sCD14 продуцирование IL-8 ингибировалось.

Указанная композиция может быть лекарственным средством, косметическим, дерматологическим или офтальмологическим продуктом для перорального или локального применения, пищевой композицией или композицией для корма комнатных животных. Она действует на воспалительный процесс, связанный с бактериально опосредованным заболеванием или LPS-опосредованными нарушениями, в желудочно-кишечном тракте, костях, коже, глазах, легких, ушах и полости рта и может быть использована для модуляции бактериальной колонизации в вышеуказанных тканях и иммунных реакций.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает липотейхоевую кислоту из молочно-кислых бактерий, которая была отобрана на ее способность связываться с CD 14 и на ее неспособность индуцировать высвобождение провоспалительных цитокинов, таких как IL-8 или TNF-α, из IEC.

При пероральном введении липотейхоевая кислота в соответствии с данным изобретением может быть использована для поддержания иммунного гомеостаза, модуляции бактериальной колонизации или для борьбы с бактериально опосредованными заболеванием и инфекцией или LTA/LPS-опосредованным заболеванием не только в желудочно-кишечном тракте, но и в костях, коже, глазах, ушах, легких и полости рта.

Таким образом, в следующем аспекте данное изобретение обеспечивает применение по меньшей мере одной липотейхоевой кислоты из молочно-кислых бактерий для приготовления композиции, предназначенной для модуляции иммунных реакций, индуцируемых грамотрицательными бактериями и/или их производными. Липотейхоевая кислота может быть использована в приготовлении лекарственного средства, продукта для локального нанесения, такого как крем или лосьон, пищевой композиции или кормовой композиции для комнатных животных для уменьшения воспалительного процесса, связанного с бактериально опосредованньм заболеванием или LTA/LPS-опосредованными нарушениями у человека или животных.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способ модуляции вышеуказанных реакций у человека или животных, предусматривающий введение эффективного количества липотейхоевой кислоты из молочно-кислых бактерий или содержащей ее композиции.

В следующем аспекте данное изобретение обеспечивает способ модуляции иммунной реакции, индуцируемой в комнатном животном грамотрицательными бактериями, потенциальными грамположительными бактериями и/или их производными, причем этот способ предусматривает введение комнатному животному композиции, содержащей компонент пробиотического бактериального штамма, способный модулировать такую реакцию.

Этот способ может предусматривать введение комнатному животному композиции, содержащей пробиотический микроорганизм, его культуральный супернатант или его метаболит, причем указанный пробиотик способен по меньшей мере временно прикрепляться к эпителию кишечника этого комнатного животного.

В одном варианте этот способ предусматривает введение этой композиции в виде компонента сбалансированной в питательном отношении еды. В предпочтительном варианте этот компонент включен в состав увлажненного или сухого корма для комнатных животных.

В последнем аспекте данное изобретение относится к кормовой композиции для комнатных животных, содержащей сбалансированную в питательном отношении еду и активный ингредиент, отобранный на его способность модулировать иммунную реакцию, индуцируемую в комнатном животном грамотрицательным бактериальным штаммом, потенциальным грамположительным бактериальным штаммом и/или их производным.

В одном варианте этот активный ингредиент содержит микроорганизм, имеющий LTA. Предпочтительно LTA присутствует в клеточной стенке указанного микроорганизма.

Предпочтительно, этот микроорганизм является пробиотиком, способным временно прикрепляться к эпителию кишечника комнатного животного, принимающего его внутрь. В предпочтительном варианте этим микроорганизмом является молочнокислая бактерия.

Преимущество данного изобретения заключается в том, что оно обеспечивает средство регуляции иммунных реакций на грамотрицательные организмы, патогенные или потенциально патогенные грамположительные организмы или их производные LPS или LTA, в частности, средство уменьшения воспалительных процессов, таких как продуцирование провоспалительных цитокинов, таких как IL-8, TNF-α и происходящий из эпителиальных клеток активирующий нейтрофилы белок (ENA)-78, кишечными эпителиальными клетками (IEC).

Другое преимущество данного изобретения заключается в том, что оно обеспечивает средство понижающей регуляции воспалительной реакции макрофагов, например, уменьшением высвобождения провоспалительных цитокинов, таких как IL-8 и TNF-α.

Еще одно преимущество данного изобретения заключается в том, что простым потреблением пищевой композиции данного изобретения может быть улучшен защитный иммунный процесс в млекопитающем и уменьшен риск вредного воспаления и инфекции. Должно быть понятно, что внутривенное или подкожное введение лекарственного средства требует опыта и в сравнении с пероральным введением не является безопасным, удобным или приемлемым для пациента. В свете этих проблем данное изобретение обеспечивает явное преимущество пищевого и/или терапевтического продукта, который может вводиться перорально.

Кроме того, данное изобретение использует LTA из бактериальных видов пищевой категории и, следовательно, имеет статус GRAS (статус продукта, обычно рассматриваемого как безопасный продукт), и дает некоторые выгоды, связанные с пробиотическими организмами. В качестве такового, данное изобретение может быть использовано в стерильных лекарственных средствах, энтеральных или топических композициях для клинических нарушений и инфекций, в которых невозможно применение живых пробиотических организмов.

Осуществление изобретения

В следующем описании использованы следующие аббревиатуры: ENA-78, происходящий из эпителиальных клеток активирующий нейтрофилы белок-78; НМ, молоко человека; IEC, кишечные эпителиальные клетки; IL, интерлейкин; LPS, липополисахарид; LTA, липотейхоевая кислота; mAb, моноклональное антитело; РВМС, мононуклеарные клетки периферической крови; PRR, рецепторы узнавания распределения (типов и активностей клеток); TNF, фактор некроза опухоли.

Наконец, "NCC" означает Коллекция культур Нестле (Nestle Research Centre, Verschez-les-Blanc, Lausanne, Switzerland).

Согласно первому аспекту данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую липотейхоевую кислоту из молочно-кислых бактерий, для модуляции иммунных реакций, в частности, воспалительных процессов, индуцируемых грамотрицательными бактериями, потенциальными патогенными грамположительными бактериями и/или их производными.

Такие воспалительные процессы могут быть индуцированы грамотрицательными бактериями и/или LPS грамотрицательных бактерий, таких как, например, Escherichia ssp., Helicobacter spp.. Salmonella spp.; они могут быть также индуцированы патогенными или потенциально патогенными грамположительными бактериями, т.е. бактериями, которые могут становиться патогенными в определенных условиях.

Предпочтительно, липотейхоевая кислота из молочно-кислых бактерий может быть отобрана на ее способность связываться с CD 14 и на ее неспособность индуцировать высвобождение провоспалительных цитокинов, таких как IL-8 или TNF-α, из IEC. Липотейхоевая кислота должна содержать ее липидную часть молекулы.

Предпочтительно, липотейхоевую кислоту выделяют из бактерий, принадлежащих к роду Lactobacillus, Bifidobacterium или Streptococcus, таких как, например, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium animalis. Streptococcus thermophilus; и наиболее предпочтительно штамм Lactobacillus johnsonii Lal (NCC 533), штамм Lactobacillus acidophilus LalO (NCC 90) и Lactobacillus gasseri (NCC/2 493).

Например, штаммы Lactobacillus johnsonii NCC 533, Lactobacillus acidophilus NCC 90 были депонированы в Институте Пастера, Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, F-75024 Paris cedex 15, FRANCE 30.06.92 и 12.10.99 соответственно, под депозитными номерами CNCM 1-1225 и CNCM 1-2332 соответственно.

В наиболее предпочтительном варианте LTA из молочно-кислых бактерий может быть использована с такими молекулами, как sCD14.

Липотейхоевая кислота и/или продуцирующие ее молочно-кислые бактерии и/или супернатант их культуры могут быть включены в сухие или жидкие пищевые композиции или в энтеральные питательные смеси для кормления младенцев, кормления комнатных животных и корма для животных, для клинического питания или для фармацевтических применений.

LTA может быть также использована для косметических или дерматологических применений в форме препаратов для локального применения (кремов и мазей) или пероральных препаратов, для глазных применений (промывных растворов для глаз) или для применений в полости рта (жидкостей для полоскания рта, зубных паст). LTA могла бы также использоваться для предупреждения ушных инфекций. Кроме того, LTA в продуктах может быть также использована для предупреждения LPS-опосредуемых костных нарушений.

Таким образом, указанная композиция может быть лекарственньм средством, косметическим, дерматологическим или офтальмологическим препаратом для перорального или локального применения, пищевой композицией или кормовой композицией для комнатных животных.

Используемое количество липотейхоевой кислоты может варьироваться, но должно соответствовать уровням бактерий в пищевой композиции, которые могут варьироваться от 10⁵ КОЕ/г до приблизительно 10¹¹ КОЕ/г, наиболее предпочтительно от приблизительно 10⁷ КОЕ/г до 10⁹ КОЕ/г. В случае фармацевтического препарата количество LTA может варьироваться и соответствует количеству бактерий, которое варьируется от 10⁵ КОЕ/г до 10¹⁶ КОЕ/г, предпочтительно от приблизительно 10⁷ КОЕ/г до 10¹⁰ КОЕ/г.

LTA действует на воспалительный процесс, связанный с бактериально опосредованным заболеванием или LTA/LPS-опосредованными нарушениями, в желудочно-кишечном тракте, костях, коже, глазах, ушах, легких и в полости рта.

Более конкретно эти продукты могут модифицировать бактериальную колонизацию и инфекцию во время неонатального периода, и посредством этого иммунологическую компетентность новорожденного, и в клиническом питании могут быть использованы для лечения сепсиса, бактериальной транслокации, воспаления, инфекции и заболевания и чрезмерного бактериального роста.

В предпочтительном варианте эта композиция может быть полным и сбалансированным в питательном отношении питанием или кормом для комнатных животных. Она может быть также, например, пищевой добавкой.

Если готовят пищевую композицию для потребления человеком она может быть полной в питательном отношении смесью, молочным продуктом, охлажденным или стабильным при хранении напитком, супом, питательной добавкой, пищевым заменителем, пищевым брикетом (плиткой) или кондитерским изделием.

Кроме липотейхоевой кислоты и/или продуцирующих ее молочно-кислых бактерий и/или супернатанта их культуры, согласно данному изобретению питательная смесь может содержать источник белка. Диетические белки могут быть любым подходящим диетическим белком, например: животными белками (такими как белки молока, белки мяса и белки яиц); растительными белками (такими как соевый белок, пшеничный белок, рисовый белок и гороховый белок); смесями свободных аминокислот или их комбинациями. Особенно предпочтительными являются молочные белки, такие как казеин, белки молочной сыворотки, и соевые белки. Эти композиции могут также содержать источник углеводов и источник жира.

Если питательная смесь включает в себя источник жира, этот источник жира предпочтительно обеспечивает приблизительно 5% - приблизительно 55% энергии питательной смеси; например, приблизительно 20% - приблизительно 50% энергии. Липиды, составляющие этот источник жира, могут быть любым подходящим жиром или смесями жиров. Особенно предпочтительными являются растительные жиры, например: соевое масло, пальмовое масло, кокосовое масло, сафлоровое масло, кукурузное масло, масло канолы (рапса), лецитины и т.п. Если это желательно, добавляют также животные жиры, такие как жиры молока.

К этим питательным смесям может быть добавлен источник углеводов. Предпочтительно он обеспечивает приблизительно 40% - приблизительно 80% энергии питательной композиции. Могут быть использованы любые подходящие углеводы, например: сахароза, лактоза, глюкоза, фруктоза, твердые вещества кукурузного сиропа и мальтодекстрины и их смеси. Если желательно, может быть также добавлена диетическая клетчатка. В случае ее применения она предпочтительно составляет до приблизительно 5% энергии питательной смеси. Диетическая клетчатка может быть любого подходящего происхождения, в том числе, например, она может происходить из сои, гороха, овса, пектина, гуаровой камеди, аравийской камеди и фруктоолигосахаридов.

В питательную смесь могут быть включены подходящие витамины и минеральные вещества в количестве, соответствующем общепринятым указаниям.

Если желательно, в питательную смесь могут быть включены один или несколько эмульгаторов пищевой категории, например: эфиры диацетилвинной кислоты моно- и диглицеридов, лецитин и моно- и диглицериды. Могут быть также включены подходящие соли и стабилизаторы.

Питательная смесь предпочтительно является вводимой энтерально, например, в форме порошка, таблетки, капсулы, жидкого концентрата, твердого продукта или готового к употреблению напитка. Если желательным является получение порошкообразной питательной смеси, гомогенизированную смесь переносят в подходящий сушильный аппарат, такой как распылительная сушилка или сублимационная сушилка, и превращают в порошок.

В другом варианте обычный пищевой продукт может быть обогащен по меньшей мере одной липотейхоевой кислотой из молочно-кислых бактерий данного изобретения, например ферментированное молоко (кисло-молочный продукт), йогурт, свежий сыр, обработанное сычужным ферментом молоко, кондитерское изделие, например сладкий или подслащенный напиток, кондитерская плитка, зерновые хлопья или брикетированные зерновые концентраты для завтрака, напитки, молочные продукты, продукты на основе сои, немолочные ферментированные продукты или питательные добавки для клинического питания.

В другом варианте может быть приготовлен полный в питательном отношении корм для комнатных животных. Полный в питательном отношении корм для комнатных животных может быть в любой подходящей форме, например в высушенной форме, полувлажной форме или в увлажненной форме; он может быть охлажденным или стабильным при хранении кормовым продуктом для комнатных животных. Эти корма для комнатных животных могут быть приготовлены общепринятым способом. Кроме липотейхоевой кислоты данного изобретения, эти корма для комнатных животных включают в себя любые, один или несколько, источники углеводов, источник белка и источник липидов.

Может быть использован любой источник углеводов. Предпочтительно источник углеводов обеспечивают в форме зерен, муки разного типа и крахмалов. Например, источником углеводов может быть мука из риса, ячменя, сорго, проса, овса, кукурузы или пшеницы. Могут также использоваться простые сахара, такие как сахароза, глюкоза, и кукурузные сиропы. Количество углевода, обеспечиваемое этим источником углеводов, может быть выбрано по желанию. Например, корм для комнатных животных может содержать до приблизительно 60% по весу углеводов.

Подходящие источники белка могут быть выбраны из любого подходящего источника животного или растительного белка, например: мышечного или скелетного мяса, костной или мясной кормовой муки, кормовой муки из домашней птицы, рыбной муки, белков молока, клейковины кукурузы, клейковины пшеницы, соевой муки, концентратов соевого белка, изолятов соевого белка (деривата, содержащего до 97% соевого белка), яичных белков, молочной сыворотки, казеина, клейковины и т.п. Количество белка, обеспечиваемого источником белка, может быть выбрано по желанию. Например, корм для комнатных животных может содержать приблизительно 12% - приблизительно 70% по весу белка в расчете на сухой вес.

Корм для комнатных животных может содержать источник жира. Может быть использован любой подходящий источник жира как из животных, так и из растительных жиров. Предпочтительно, источником жира является источник животного жира, такой как твердый животный жир. Могут быть также использованы растительные масла, такие как кукурузное масло, подсолнечное масло, сафлоровое масло, рапсовое масло, соевое масло, оливковое масло и другие масла, богатые мононенасыщенными и полиненасыщенными жирными кислотами. Кроме незаменимых жирных кислот (линолевой и альфа-линолевой кислоты), источник жира может включать в себя жирные кислоты с длинной цепью. Количество жира, обеспечиваемого источником жира, может быть выбрано по желанию. Например, корм для комнатных животных может содержать приблизительно 5% - приблизительно 40% по весу жира в расчете на сухой вес. Предпочтительно, корм для комнатных животных имеет относительно уменьшенное количество жира.

Корм для комнатных животных может содержать другие активные агенты, такие как жирные кислоты в длинной цепью. Подходящие жирные кислоты с длинной цепью включают в себя альфа-линолевую кислоту, гамма-линолевую кислоту, линолевую кислоту, эйкозапентановую кислоту и докозагексановую кислоту. Жиры рыбы являются подходящим источником эйкозапентановой кислоты и докозапентановой кислоты. Масло бурачника, масло семян черной смородины, масло энотеры являются подходящими источниками гамма-линолевой кислоты. Сафлоровые масла, подсолнечные масла, кукурузные масла и соевые масла являются подходящими источниками линолевой кислоты.

Выбор источников углеводов, белка и липидов не является критическим и будет определяться на основе питательных потребностей животного, вкусовых свойств и типа получаемого продукта. Кроме того, в корм для комнатных животных могут быть включены различные другие ингредиенты, например, сахар, соль, специи, пряности, витамины, минеральные вещества, ароматизаторы, камеди, пребиотики и пробиотические микроорганизмы, если это желательно.

Таким образом, пробиотический микроорганизм может быть выбран из одного или нескольких микроорганизмов, пригодных для потребления животными и способных улучшать микробный баланс в кишечнике. Пробиотические микроорганизмы могут быть в порошкообразной, высушенной форме, в частности, в форме спор в случае микроорганизмов, образующих споры. Кроме того, если желательно, пробиотический микроорганизм может быть инкапсулирован для дополнительного увеличения возможности выживания, например, в сахарном матриксе, жировом матриксе или полисахаридном матриксе.

Для высушенных кормов для комнатных животных подходящим процессом является экструзионное пропаривание, хотя могут быть использованы выпечка и другие подходящие процессы. При экструзионном пропаривании высушенный корм для комнатных животных получают обычно в форме муки грубого помола. При применении пребиотика этот пребиотик может быть смешан с другими ингредиентами высушенного корма для домашних животных перед обработкой. Подходящий способ описан в Европейской заявке на патент с номером 0850569. При использовании пробиотического микроорганизма, этот микроорганизм предпочтительно наносят на высушенный корм или вносят в виде наполнителя в высушенный корм для комнатных животных. Подходящий способ описан в Европейской заявке на патент с номером 0862863.

Для увлажненных кормов для комнатных животных могут быть использованы процессы, описанные в патентах США 4781939 и 5132137 для получения имитированных мясных продуктов. Могут быть также использованы другие процедуры для получения продуктов в виде больших кусков, например пропаривание в паровой печи. Альтернативно продукты в виде мясного хлеба могут быть получены эмульгированием подходящего мясного материала для получения мясной эмульсии, добавлением подходящего гельобразующего (желирующего) агента и нагреванием мясной эмульсии перед помещением в консервные банки или другие контейнеры.

Следующие примеры приведены только в качестве иллюстрации и никоим образом не должны рассматриваться в качестве ограничения объема притязаний данной заявки. Проценты и части являются массовыми процентами и массовыми частями (т.е. процентами и частями по весу), если нет иных указаний.

Краткое описание чертежей.

Фигура 1. Действие LTA из штамма L. johnsonii Lal и штамма L. acidophilus La10 на высвобождение IL-8 клетками НТ29, стимулированными LPS из Е. coli.

Продуцирование IL-8 измеряли при помощи ELISA в супернатантах клеток НТ29 в течение 24 часов в среде, дополненной 2% молоком человека (НМ), в присутствии LPS Е. coli при 10 нг/мл (•) или 100 нг/мл (□) и варьирующихся количеств LTA из La1 (А) или La10(B). Активация клеток НТ29 только смесью LPS-HM изображена в виде пунктирных линий. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение (SD). Результаты представляют три независимых эксперимента.

Фигура 2. Действие LTA из лактобацилл La1 на высвобождение IL-8 клетками НТ29, стимулированными либо LPS из Sal. enteridis, либо цельными бактериями Е. coli. Продуцирование IL-8 измеряли при помощи ELISA в супернатантах клеток НТ29 в течение 24 часов в среде, дополненной 2% молоком человека (НМ) и либо LPS Salmonella enteridis (А) при 10 нг/мл (•) или 100 нг/мл (□), либо 2,5×10⁵ на мл цельных бактерий Е. coli (В), в присутствии варьирующихся количеств LTA из La1. Активация клеток НТ29 в отсутствие LTA изображена в виде пунктирных линий. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение (SD).

Фигура 3. Действие LTA из лактобацилл Lal и La 10 на высвобождение TNF-α клетками НТ29, стимулированными LPS Е. coli. Продуцирование TNF-α измеряли при помощи ELISA в супернатантах клеток НТ29 в течение 24 часов в среде, дополненной 2% молоком человека (НМ), в присутствии LPS Е. coli при 100 нг/мл и варьирующихся количеств LTA из La1 (□) или La10 (•). Активация клеток НТ29 в отсутствие LTA изображена в виде пунктирной линии. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение (SD).

Фигура 4. Действие LTA из лактобациллы La1 на индукцию LPS экспрессии мРНК ENA-78 в клетках НТ29. Экспрессию ENA-78 оценивали при помощи ОТ-ПЦР на тотальной РНК клеток НТ29, стимулированных 100 нг/мл LPS Е. coli, в отсутствие (дорожка 1) или в присутствии 2% молока человека (дорожки 2-6) и при добавлении mAb анти-CDH MY4 (дорожка 3); контрольного антитела того же изотипа (дорожка 4); или LTA из La1 при 1 мкг/мл (дорожка 5) или 50 мкг/мл (дорожка 6). Ожидаемый размер ПЦР-продукта для транскриптов ENA-78 был 220 п.н. Для внутреннего стандарта использовали амплифицированные полосы для β-актина (460 п.н.) в качестве гена "домашнего хозяйства". SM, маркер размера.

Фигура 5. Действие LTA из лактобацилл La1 и La10 на высвобождение IL-8 дифференцированными клетками НТ29, стимулированными LPS Е. coli. Продуцирование IL-8 измеряли при помощи ELISA в супернатантах дифференцированных клеток НТ29 в течение 24 часов в среде, дополненной 2% молоком человека (НМ), в присутствии LPS Е. coli при 100 нг/мл и указанных количеств LTA из Lactobacillus Lal (□) или La10 (•).

Активация дифференцированных клеток НТ29 в отсутствие добавленной LTA изображена в виде пунктирной линии.

Фигура 6. Действие LTA из Lactobacillus La1 на активацию РВМС человека. (А) Свежевыделенные РВМС человека (2×10⁵ клеток на лунку) инкубировали в среде RPMI, дополненной 1% сывороткой человека, в присутствии варьирующихся количеств либо LPS Е. coli (Δ), либо LTA из La1 (•). РВМС (В) и (С) инкубировали в течение 30 минут при 37°С в отсутствие (пунктирные линии) или в присутствии (сплошные линии) варьирующихся количеств LTA из La1 перед добавлением LPS Е. coli (1 нг/мл). После 24 часов инкубации культуральтные супернатанты собирали и анализировали на присутствие IL-8 (А) и (В) или TNF-α (С) при помощи специфического способа ELISA. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение (SD).

Фигура 7. Действие деацилирования LTA на их антагонистическую активность. Клетки НТ29 стимулировали LPS Е. coli (100 нг/мл) в среде, дополненной 2% молоком человека (НМ), в отсутствие (пунктирные линии) или в присутствии (сплошные линии) варьирующихся количеств нативных LTA (□) или деацилированных LTA (•), очищенных либо из La1 (А), либо из La10 (В). Спустя 24 часа измеряли высвобождение IL-8 в культуральных супернатантах при помощи ELISA.

Фигура 8. Действие прединкубации клеток либо с LTA и sCD14, либо с LTA и LPS на антагонизм. (А) Клетки НТ29 прединкубировали в течение 4 часов с LTA La1 (50 и 100 мкг/мл) в присутствии 2% молока человека (НМ), промывали дважды бессывороточной средой и затем стимулировали в течение 20 часов LPS Е. coli (100 нг/мл) в отсутствие или в присутствии НМ. (В) Клетки НТ29 инкубировали с LTA La1 (1, 10 и 50 мкг/мл) в присутствии молока человека (НМ) в течение 4 часов перед добавлением LPS Е. coli (100 нг/мл). (С) Клетки НТ29 инкубировали с LTA La1 (1, 10 и 50 мкг/мл) в присутствии LPS Е. coli (100 нг/мл) в течение 4 часов перед добавлением 2% молока человека (НМ). (D) Клетки НТ29 стимулировали LPS Е. coli (100 нг/мл) в присутствии 2% молока человека (НМ) в течение 4 часов перед добавлением LTA La1 (1, 10 и 50 мкг/мл). Высвобождение IL-8 в супернатантах после 24 часов культивирования в целом измеряли при помощи ELISA. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение (SD).

Пример 1. Липотейхоевая кислота из штамма Lactobacillus johnsonii NCC 533 и штамма Lactobacillus acidophilus NCC 90 действует антагонистически на отвечаемость эпителиальных клеток кишечника человека на LPS или грамотрицательные бактерии

Материалы и способы

Клетки, среды и реагенты

Линию клеток аденокарциномы ободочной кишки человека НТ29 получали из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС, Manassas, VA. АТСС: НТВ-38). Недифференцированные клетки поддерживали в содержащей глюкозу DMEM, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (PCS; Amimed BioConcept, Allschwill, Switzerland), при 37°С в 5% СО₂/воздух-термостате, тогда как дифференцированные клетки выращивали в не содержащей глюкозу среде. Культуральную среду заменяли каждые 2 дня, пока монослои клеток не достигали 90% конфлюэнтности. Мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) выделяли из гепаринизированной крови здоровых взрослых доноров центрифугированием в градиенте плотности Ficoll-Isopaque (Phannacia). Выделенные РВМС промывали три раза и ресуспендировали в среде RPMI 1640 (Life Technologies, адрес), дополненной 1% ФТС. LPS из штаммов Е. coli и Salmonella enteritidis покупали у Sigma Chemicals Co. (St Louis, МО). Мышиное анти-CDH моноклональное антитело MY4 (IgG2b) покупали у Coulter (Instrumentation Laboratory AG, Switzerland). Контрольным mAb того же самого изотипа было мышиное mAb IgG2b (каппа), полученное от МОРС 141 (Sigma). Грудное человеческое молоко получали от здоровых матерей. Пробы получали до 70 дней после родов откачиванием при помощи насоса из груди в стерильные центрифужные пробирки и обрабатывали в пределах 2 часов после сбора. После центрифугирования при 200×g в течение 30 минут бесклеточную не содержащую липидов фракцию замораживали и хранили при -80°С до использования.

Выделение и очистка LTA

LTA Lactobacillus johnsonii Lal NCC 533 и Lactobacillus acidophilus LalO NCC 90 выделяли согласно способу Fischer et al., (Fischer, W., et al., 1983. Eur. J Biochem 133:523-530). Вкратце, бактерии культивировали в течение ночи в MRS-бульоне, собирали и ресуспендировали в 0,1 М ацетате натрия рН 4,5 при 800 мг сырого веса на мл буфера. Затем их обезжиривали смешиванием с двумя объемами метанола и одним объемом хлороформа в течение ночи при комнатной температуре. Обезжиренные бактерии извлекали фильтрованием, промывали двумя объемами метанола и ресуспендировали в 0,1 М ацетате натрия рН 4,7 при концентрации 500 мг бактерий на мл буфера. Эту суспензию смешивали с равным объемом горячего 80% (масса/объем) водного фенола и перемешивали непрерывно в течение 45 минут в водяной бане при 65°С. После охлаждения эмульсию, которая образовывалась, центрифугировали при 5000×g при 4°С в течение 30 минут. Затем верхний водный слой интенсивно диализовали против 0,1 М ацетата натрия рН 5 (предел 6-8 кДа). Нуклеиновые кислоты расщепляли 30 Е/мл ДНКазы I (Sigma), 9 Е/мл рибонуклеазы A (Sigma) в 5 мМ MgSO₄, 40 мМ динатрий-ЭДТА и 0,2 мМ NaN₃ (24 часа при комнатной температуре) с 1 мл толуола, добавляемым для предупреждения микробного загрязнения. Продукт расщепления диализовали еще один раз против 0,1 М ацетата натрия рН 4,7 и доводили до 15% 1-пропанолом. Полученный продукт наносили на октил-сефарозную колонку, уравновешенную 0,1 М ацетатом натрия с 15% 1-пропанолом, при скорости тока 0,1 мл/мин. Собирали фракции по 5 мл. Элюцию LTA выполняли градиентом 15-80% 1-пропанола в том же самом буфере при скорости тока 0,5 мл/мин. Собирали фракции по 3 мл. Мониторинг концентрации пропанола выполняли измерением показателя преломления. Каждую фракцию анализировали на ее содержание общих нейтральных сахаров (Dubois, M.A., et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem 28:350-356), фосфора (Chen, P.S., et al., 1956. Microdetermination of phosphorus. Anal Chem 28:1756-1758), нуклеиновых кислот и показатель преломления. Пики концентрировали при помощи роторного испарителя для удаления пропанола, затем интенсивно диализовали против воды. После концентрирования добавляли 0,1 М ацетат натрия рН 4,7,1 мМ CaCl₂ и MgCl₂ и аликвоты замораживали при -20°С. Антигенную активность LTA La1 подтверждали при помощи ELISA, как описано недавно (Granato, D., et al., 1999. Appi Environ Microbiol 65:1071-1077). Деацилирование выполняли, как описано Teti et al., (Teti, G., et al., 1987. Infect Immun 55:3057-3064).

Анализ лизата амебоцитов Limulus

Все реагенты, с которыми экспонировали клетки, анализировали на загрязнение эндотоксином при помощи турбидиметрического кинетического анализа свертывания амебоцитов Limulus (Е-Тоха1е®-анализ). Этот тест имел чувствительность 0,05-0,1 эндотоксиновых единиц (LPS Е. coli 0,55:B5) на мл. Было обнаружено, что различные среды, используемые в этом исследовании, являются неактивными или содержат <50 пг/мл эндотоксина.

Обработка клеток

Клетки НТ29 высевали при плотности 10⁴ клеток на лунку в 96-луночных плоскодонных планшетах. После инкубирования в течение 5 дней клетки НТ29 промывали дважды бессывороточной средой перед добавлением молока человека, LPS и/или LTA в 200 мкл DMEM. В некоторые лунки добавляли также моноклональные антитела анти-CDH в конечной концентрации 20 мкг/мл. В других экспериментах РВМС суспендировали в среде RPMI 1640 с 1% ФТС и затем высевали при концентрации 2×10⁵ клеток на лунку в 96-луночные плоскодонные планшеты. Затем эти клетки инкубировали с LTA в течение 30 минут при 37°С и после этого обрабатывали LPS. После 24 часов инкубации при 37°С супернатант собирали и хранили при -20°С для последующего измерения содержания цитокинов. Жизнеспособность клеток испытывали с использованием набора для детектирования цитотоксичности (Roche Diagnostics), который позволял измерить лактатдегидрогеназную (LDH) активность, высвобождаемую из цитозоля поврежденных клеток в супернатант.

Концентрации IL-8 и TNF-α в культуральных супернатантах

Количества IL-8 и TNF-α, генерируемые в супернатантах клеточных культур, измеряли при помощи ELISA. Моноклональные антитела против IL-8 (2 мкг/мл, ImmunoKontakt, Bioggio, Switzerland) наносили в виде покрытия на 96-луночные планшеты (Nunc) инкубированием в течение ночи при 4°С. Затем планшеты промывали дважды 0,05% Твином-20 в ЗФР. Неспецифическое связывание блокировали инкубированием этих планшетов с 10% ФТС в ЗФР в течение дополнительных 2 часов при комнатной температуре. Затем добавляли пробы или стандартные концентрации рекомбинантного цитокина (15,625-2000 пг/мл, ImmunoKontakt) в ФТС-ЗФР и выдерживали в течение 3 часов при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 4 раза ЗФР-Твин перед добавлением меченого биотином моноклонального антитела против IL-8 человека (1 мкг/мл, ImmunoKontakt) и выдерживали в течение еще одного часа при комнатной температуре. После 4 промывок добавляли конъюгат стрептавидин-пероксидаза (0,5 мкг/мл, KPL, Bioreba, Reinach, Switzerland) и выдерживали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты опять промывали и добавляли субстрат (ТМВ-пероксидазу, KPL) и выдерживали в течение 10-30 минут. Ферментативную реакцию останавливали добавлением 1 н. HCl. Оптическую плотность считывали при 450 нм в планшет-ридере ELISA (Dynex Technologies). Предел детектирования был приблизительно 30 пг/мл. Количества TNF-α, высвобождаемые в супернатанты клеточных культур, измеряли с использованием коммерчески доступного набора ELISA (R&D Systems).

Амплификация эпителиального активатора-78 нейтрофилов (ENA-78) с использованием обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)

Тотальную клеточную РНК экстрагировали из клеток НТ29 в чашках для культуры ткани с использованием способа с Тризолом (GIBCO-BRL). РНК, выделенную из кишечных эпителиальных клеток, обратно-транскрибировали обратной транскриптазой вируса мышиного лейкоза Молони (Perkin Elmer, адрес). Пробы РНК (0,5 мкг тотальной РНК), 0,5 единиц ингибитора РНКазы, 1 мМ каждый из dNTP, 0,5 нмоль/мл специфического 3'-праймера, 5 мМ MgCl₂ и 1,25 единиц обратной транскриптазы инкубировали в общем объеме 10 мкл реакционной смеси, содержащей буфер для фермента, поставляемый изготовителем. Эту реакционную смесь инкубировали в течение 30 минут при 42°С и затем нагревали в течение 5 минут при 95°С. Затем обратно-транскрибированные продукты амплифицировали ДНК-полимеразой Gold (Perkin Elmer) на термоциклере (Biolabo, Scientific Instruments, Chatel St Denis, Switzerland). ПЦР выполняли в общем объеме 50 мкл с использованием 10 мкл обратно-транскрибированных продуктов в ПЦР-буфере, 2 мМ MgCl₂, 5 мкМ каждого из dNTP, 0,2 нмоль/мл как 3'-антисмыслового, так и 5'-смыслового ENA-78-специфических праймеров (CGTTCTCAGGGAGGCTC и TCCTTCGAGCTCCTTGTG соответственно. Keates et al., 1997 Am. J. Physiol 273 G75-G82) и 1,25 единиц ДНК-полимеразы. После начальной денатурации в течение 10 минут при 95°С пробы амплифицировали с использованием 35 циклов денатурации при 94°С в течение 45 секунд, отжига при 60°С в течение 1 минуты и удлинения при 72°С в течение 1 минуты и 30 секунд с последующей стадией удлинения в течение 7 минут при 72°С. Все пробы подвергали ОТ-ПЦР с использованием β-актина в качестве положительного контроля. Пробы ОТ-ПЦР-продуктов наносили на 1,2% агарозные гели (содержащие этидийбромид) в буфере ТАЭ и разделяли электрофорезом при 150 В в течение 1 часа. ОТ-ПЦР-продукты визуализировали под УФ-светом. Точный размер полос определяли сравнением с маркерами размеров ДНК (Boehringer Mannheim).

Результаты

LTA из видов Lactobacillus ингибируют Е. coli- или LPS-индуцированные высвобождения IL-8, TNF-α и ENA-78 клетками НТ29

Авторы изобретения исследовали, могут ли грамположительные бактерии или их производные также стимулировать кишечные эпителиальные клетки НТ29 человека. Различные грамположительные организмы инкубировали с клетками НТ29 в присутствии или в отсутствие человеческого молока в качестве источника sCD14. В противоположность Е. coli, грамположительные бактерии L. sakei, L. casei, штамм L. acidophilus La10 и штамм L. johnsonii Lal, а также Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidus были неспособны стимулировать высвобождение IL-8 клетками НТ29 даже в присутствии sCD14. Кроме того, не наблюдали секреции IL-8 при добавлении LTA из La1, La10 или из Staphylococcus aureus при концентрациях до 100 мкг/мл.

Поскольку известно, что sCD14 узнает компоненты как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий, авторы испытывали, могут ли компоненты грамположительных организмов, такие как LTA, действовать в качестве антагонистов действия грамотрицательных бактерий на клетки НТ29. Для этой цели клетки НТ29 стимулировали LPS (10 и 100 нг/мл) в присутствии или в отсутствие человеческого молока в качестве источника sCD14 и различных количеств LTA либо из La1 (фиг.1А), либо из La10 (фиг.1В). Как и ожидалось, клетки НТ29, подвергнутые действию 10 или 100 нг/мл LPS Е. coli в присутствии sCD14, высвобождали значительные количества IL-8 (фиг.1, пунктирные линии). Добавление LTA либо из La1 (фиг.1А, сплошные линии), либо из La10 (фиг.1В, сплошные линии) вызывало заметное уменьшение LPS-индуцированной секреции IL-8. Эта ингибиторная активность была зависимой от дозы, причем полное ингибирование наблюдается с использованием 100-1000-кратного избытка LTA. Для подтверждения, что ингибирующая активность LTA была общим явлением, испытывали антагонистическую активность LTA на реакции клеток НТ29 на другой источник LPS. Как показано на фиг.2А, LTA из La1 ингибировала секрецию IL-8 клетками НТ29, стимулированными 10 или 100 нг/мл LPS из Salmonella enteridis. Кроме того, LTA из La1 оказывала антагонистическое влияние на действие цельных Е. coli-sCD14 на клетки НТ29 (фиг.2В).

Как показано на фиг.3, как LTA из La1, так и LTA из La10 также ингибировали индуцированное LPS Е. coli высвобождение TNF-α клетками НТ29. Кроме того, LPS-индуцированная экспрессия мРНК ENA-78, также заметно ингибировалась LTA из La1 (фиг.4). Следует отметить, что наблюдаемые ингибирующие активности LTA Lactobacillus не были вызваны цитотоксическим действием препаратов LTA на клетках НТ29, так как не смогли детектировать значимого высвобождения LDH (лактатдегидрогеназы) в культуральных супернатантах (данные не показаны).

LTA из La1 и La10 ингибируют LPS-индуцированное высвобождение IL-8 дифференцированными клетками НТ29.

Как показано на фиг.5, дифференцированные клетки НТ29, стимулированные 10 нг/мл LPS E. coli в присутствии человеческого молока, высвобождали значительные количества IL-8 (пунктирная линия). Как и прежде, LTA из La1 или из La10 (сплошные линии) вызывали зависимое от дозы уменьшение этой секреции. Полное ингибирование наблюдали при 5000-кратном избытке LTA.

LTA из La1 ингибирует LPS-стимуляцию моноцитов человека.

Ряд LTA взаимодействуют с мембраносвязанным CD 14 на моноцитах и макрофагах крови и стимулируют секрецию различных цитокинов. Таким образом, авторы изобретения анализировали секрецию IL-8 и TNF-α PBMC, подвергнутым действию LTA Lactobacillus. PBMC инкубировали в присутствии увеличивающихся количеств LTA Lactobacillus (100-10000 нг/мл) в течение 30 минут перед добавлением LPS E. coli в концентрации 1 нг/мл. Как показано на фигуре 6, при отдельном предоставлении LTA La1 стимулировала секрецию IL-8 в концентрациях 5 мкг/мл или более высоких (фиг.6А), однако не наблюдали стимуляции высвобождения TNF-α при любой из испытанных концентраций. Кроме того, хотя LTA из La1 имела лишь слабое антагонистическое действие на LPS-индуцированную секрецию IL-8 PBMC (фиг.6В), она ингибировала более значительно LPS-индуцированную секрецию TNF-α зависимым от дозы образом (фиг.6С). LTA из La10, одна или с LPS, не оказывала значимого действия на продуцирование IL-8 или TNF-α.

Биологическая активность деацилированной LTA

Деацилирование LTA приводит к потере клеточных биологических активностей. Это предполагает, что липидная часть LTA является критической для иммуномодуляторной активности. Таким образом, авторы изобретения испытывали действие деацилирования липотейхоевых кислот (LTA) на их антагонизм в отношении LPS в клеточных моделях данного изобретения. Как показано на фиг.7, антагонистическая активность LTA из La1 (фиг.7А) и из La10 (фиг.7В) в отношении LPS-sСD14-индукции IL-8 клетками НТ29 была значимо более слабой после деацилирования. Таким образом, антагонистическая активность LTA Lactobacillus в клеточной системе авторов данного изобретения также опосредована липидной частью молекулы.

Роль взаимодействия sCD14-LTA в ингибировании эффектов LPS-sCD14

Для понимания, каким образом LTA может проявлять свое антагонистическое действие на грамотрицательные бактерии, выполняли различные процедуры обработки, в которых клетки НТ29 прединкубировали с LTA из La1 либо sCD14 молока человека, либо LPS E. coli. При прединкубации клеток НТ29 в течение 4 часов с LTA La1 (50 и 100 мкг/мл) с молоком человека или без него и промывании дважды бессывороточной средой с последующей обработкой в течение 20 часов LPS (100 нг/мл) в присутствии молока секреция IL-8 не прекращалась (фиг.8А). Однако, когда эти клетки прединкубировали в течение 4 часов с LTA La1 (1-50 мкг/мл) в присутствии sCD14 и затем, без промывания, обрабатывали (стимулировали) в течение 24 часов LPS (100 нг/мл), уровень продуцирования IL-8 был похожим на уровень, полученный при инкубировании клеток НТ29 в течение 24 часов с LTA, LPS и sCD14 вместе (фиг.8В). Фиг.8С показывает уровень продуцирования IL-8, полученный после добавления источника sCD14 к клеткам, прединкубированным в течение 4 часов с LTA La1 (1-50 мкг/мл) и LPS (100 нг/мл). Этот уровень был сходным с количеством, полученным при инкубировании клеток НТ29 в течение 24 часов со смесью LTA, LPS и sCD14. Сходные результаты получали, когда эти клетки прединкубировали в течение 4 часов с LPS (100 нг/мл) и источником CD 14 перед добавлением LTA (фиг.8D).

Кишечные эпителиальные клетки (IEC) не экспрессируют CD 14 и требуют растворимой формы для ответа на LPS in vitro (Pugin, J., et al., 1993 PNAS 90:2744-2748). Авторы изобретения показали ранее, что грамотрицательные бактерии и LPS опосредуют продуцирование провоспалительных цитокинов в IEC через действие sCD14 молока человека (Labeta, М.О., et al., 2000, J Exp Med 191:1807-1812). Однако IEC не являются нечувствительными к различным источникам LTA, несмотря на присутствие sCD14. Поскольку другие исследования предполагают, что связывание LTA с мембранами эукариотических клеток требует жирной кислоты в качестве части молекулы и поскольку белки, связывающие жирные кислоты, экспрессируются только на дифференцированных IEC в верхней части кишечной ворсинки, авторы данного изобретения исследовали также действия LTA-молока на дифференцированные НТ29. Интересно, что LTA все еще не могли индуцировать никакой реакции, тогда как LTA из штамма L. johnsonii La1 и штамма L. acidophilus La10 были способны стимулировать высвобождение IL-8 из моноцитов крови.

Эти результаты предоставляют дополнительное подтверждение пробиотического статуса штамма L. johnsonii La1 и штамма L. acidophilus La10 и предполагают терапевтическую роль их LTA в борьбе с заболеваниями, вызываемыми грамотрицательными бактериями или их производными.

Пример 2. Смесь для новорожденных

Для получения смеси для новорожденных авторы готовят следующую смесь, содержащую на 100 мл смеси: 0,5-5%, предпочтительно 2%, пептидов, 0,2-10%, предпочтительно 4%, жира, 1-25%, предпочтительно 8%, не относящихся к леванам углеводов (в том числе лактозу 65%, мальтодекстрин 20%, крахмал 15%) и по меньшей мере 10⁶ КОЕ/мл следующих штаммов: Lactobacillus acidophilus NCC 90 (CNCM 1-2332) или Lactobacillus johnsonii NCC 533 (CNCM 1-1225), в комбинации со следовыми количествами витаминов и олигоэлементов для удовлетворения суточных потребностей, и 0,01-2%, предпочтительно 0,3%, минеральных веществ и 50-90%, предпочтительно 75%, воды.

Пример 3. Применение в молочных продуктах

Один или более штаммов Lactobacillus acidophilus NCC 90 (CNCM 1-2332) или Lactobacillus johnsonii NCC 533 (CNCM 1-1225) согласно данному изобретению могут быть использованы для приготовления кисло-молочных (ферментированных), подобных йогурту молочных продуктов.

Для этого готовят 1 л молочного продукта, содержащего 2,8% жиров и дополненного 2% сухим сепарированным молоком и 6% сахарозой, его пастеризуют при 96°С в течение 30 минут и затем его температуру понижают до 42°С. Предварительные культуры незагущающегося штамма Streptococcus thermophilus и невязкого штамма Lactobacillus bulgaricus реактивируют в стерильной культуральной среде MSK, содержащей 10% восстановленного сухого молока и 0,1% коммерческого дрожжевого экстракта.

Предварительную культуру одного или более штаммов реактивируют также в среде, содержащей 10% восстановленного сухого молока и 0,1% коммерческого дрожжевого экстракта с 1% сахарозой. Затем пастеризованный молочный продукт инокулируют 1% каждой из этих реактивированных предварительных культур и затем этому молочному продукту дают ферментироваться при 32°С, пока рН не достигнет показателя 4,5. Таким образом получают ферментированные молочные подобные йогурту продукты и их хранят при 4°С.

Пример 4. Сухой корм для комнатных животных

Кормосмесь готовят из приблизительно 58% по весу кукурузы, приблизительно 6% по весу клейковины кукурузы, приблизительно 23% по весу куриной кормовой муки, солей, витаминов и минеральных веществ, составляющих остальную часть.

Эту кормосмесь подают в предварительный кондиционер и увлажняют. Затем увлажненную кормосмесь подают в экструдер с пропариванием и превращают в студень (желируют). Желированный матрикс, покидающий экструдер, продавливается через головку экструдера и экструдируется. Экструдат нарезают на кусочки, пригодные для скармливания кошкам, сушат при приблизительно 110°С в течение приблизительно 20 минут и охлаждают для образования шариков. В этой временной точке готовят лиофилизированный порошок одного или более штаммов следующих видов Lactobacillus для нанесения на эти шарики: Lactobacillus johnsonii NCC 533 (CNCM 1-1225) или Lactobacillus acidophilus NCC 90 (CNCM 1-2332). Полученный таким образом порошок обеспечивают в таком количестве, чтобы соответствующее количество поглощения с пищевым рационом для комнатного животного было равно приблизительно 1,0Е+07-1,0Е+9 КОЕ/день. Некоторую часть этого порошка смешивают в первую массу шариков и расфасовывают. Второе количество этого порошка отмеряют и смешивают с липидным носителем, который затем разбрызгивают на вторую массу шариков. Эти шарики расфасовывают после того, как покрытие было в достаточной степени высушено при 50-60°С в течение нескольких минут.

Подобный сухой корм для собак предназначается, в частности, для уменьшения воспалительного процесса, связанного с бактериальной колонизацией.

1. Композиция для уменьшения или предупреждения воспалительных процессов, связанных с бактериально опосредованным заболеванием или LTA/LPS-опосредованными нарушениями в желудочно-кишечном тракте у человека или животных, включающая в качестве активного ингредиента липотейхоевую кислоту из молочнокислых бактерий, принадлежащих к роду Lactobacillus.

2. Композиция по п.1, где липотейхоевая кислота из молочно-кислых бактерий была отобрана по ее способности связываться с CD 14 и по ее неспособности индуцировать высвобождение противовоспалительных цитокинов, таких как IL-8 или TNF-α, из кишечных эпителиальных клеток.

3. Композиция по любому из пп.1 или 2, где липотейхоевая кислота происходит из молочно-кислых бактерий, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus johnsonii.

4. Композиция по п.3, где молочно-кислой бактерией является Lactobacillus johnsonii CNCM1-1225 или Lactobacillus acidophilus CNCM1-2332.

5. Композиция по п.1, которая содержит молочно-кислые бактерии, продуцирующие указанную липотейхоевую кислоту, или супернатант их культуры.

6. Композиция по п.1, где липотейхоевая кислота присутствует в количестве, которое соответствует количеству бактерий, варьирующемуся от 10⁵ КОЕ/г до приблизительно 10¹⁶ КОЕ/г.

7. Применение по меньшей мере одной липотейхоевой кислоты из молочнокислой бактерии, принадлежащей к роду Lactobacillus и/или продуцирующей ее молочно-кислой бактерии и/или супернатанта ее культуры для приготовления композиции, предназначенной для уменьшения или предупреждения воспалительных процессов, связанных с бактериально опосредованным заболеванием или LTA/LPS-опосредованными нарушениями в желудочно-кишечном тракте, костях, коже, глазах, ушах, легких и полости рта человека или животных.

8. Применение по п.7, где композиция является пищевой композицией или энтеральным питанием для вскармливания новорожденных, кормления животных или клинического питания.