Питательная среда для выращивания бактерий рода haemophilus
Владельцы патента RU 2320714:
Открытое акционерное общество "Биомед" им. И.И. Мечникова" (RU)
Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской академии медицинских наук (RU)
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в медицине, в микробиологии в процессе приготовления питательной среды по отношению к бактериям рода Haemophilus. Питательная среда содержит аминопептид, гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, экстракт семян льна, глюкозу, карбонат натрия, НАД, гемин, хлорид натрия, агар и дистиллированную воду. Изобретение позволяет увеличить жизнеспособность клеток и уменьшить полиморфизм клеток в мазках. 1 табл.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается увеличения ростовых свойств питательной среды по отношению к бактериям рода Haemophilus - в частности Н.influenzae типа b - одного из трех основных возбудителей гнойного бактериального менингита, а также в отношении бескапсульного штамма Н.influenzae №8143 и штамма другого вида - Н.parainfluenzae.
Изобретение может быть использовано в медицине, в микробиологии, в микробиологической промышленности в процессе приготовления питательных сред.
Изобретение заключается в том, что в известной питательной среде, содержащей источник азотного питания (ферментативный гидролизат крови животных - аминопептид), гидролизат казеина средней степени расщепления, экстракт кормовых дрожжей (источник витаминов), НАД, гемин, соль, в качестве источника факторов роста используют экстракт семян льна.
Прототипом служит питательная среда для получения рестриктирующих эндонуклеаз из бактерий рода Haemophilus. При выращивании на агаровых вариантах этих питательных сред Н.influenzae и Н.parainfluenzae образуют мелкие колонии (около 0,5 мм в диаметре) и в мазках из этих колоний, окрашенных по Граму, отмечены типичные мелкие грамотрицательные палочки, очень полиморфные, часто встречаются нитевидные формы и кроме того остатки разрушенных клеток.
Цель изобретения: разработка рецептуры питательной среды, обеспечивающей увеличение жизнеспособности клеток Н.influenzae b, бескапсульного штамма Н.influenzae и Н.parainfluenzae, определяемой по KOE, и диаметра выросших колоний, а также уменьшения полиморфизма клеток в мазках, что облегчает (способствует использованию) использование питательной среды в лабораторной практике.
Цель достигается тем, что в качестве препарата, дополнительно стимулирующего рост гемофильных бактерий, используется растительный экстракт, приготавливаемый из семян льна и добавляемый к ранее запатентованной среде в количестве 0,21-0,27 мас.%. Предлагаемая среда лишена этих недостатков, т.е. Н.influenzae b образуют колонии диаметром около 1 мм (почти в 2 раза крупнее - на 180% при р=0,05) и KOE - 200% по сравнению с прототипом (при р=0,05); в мазках - более однородные грамотрицательные палочки. Такие же результаты получены в отношении бескапсульного штамма Н.influenzae и Н.parainfluenzae.
Питательную среду готовят следующим образом.
К ингредиентам предложенной ранее питательной среды, в заданном соотношении, включая глюкозу и агар, добавляют водный экстракт семян льна, который получают после добавления к семенам льна кипящей дистиллированной воды (1:20), 3 часов экстракции в процессе остывания, осветления через марлевый фильтр. Для хранения экстракт семян льна стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. В питательную среду после стерилизации также при 121°С в течение 15 мин и остывания до 45-50°С добавляют необходимые для гемофилов факторы роста - НАД и гемин (10 мкг/мл) и готовую питательную среду разливают в чашки Петри.
Выращивание Н.influenzae и Н.parainfluenzae, проводят при 37°С в течение 18-24 часов.
Процент жизнеспособных клеток определяют по КОЕ (высев из разведения 10-6 исходной взвеси густотой 10 ед.), диаметр колоний - путем их измерения с использованием специальной сетки с ценой деления 0,01 мм, морфологию клеток - в мазках из колоний, окрашенных по Граму.
Пример 1 (оптимальный). Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:
| Аминопептид | 0,8 |
| Гидролизат казеина | 0,8 |
| Дрожжевой экстракт | 0,4 |
| Экстракт семян льна | 0,24 |
| НАД | 0,001 |
| Гемин | 0,001 |
| Глюкоза | 0,2 |
| Хлорид натрия (NaCl) | 0,3 |
| Карбонат натрия (Na2CO3) | 0,06 |
| Агар | 1,3 |
| Дистиллированная вода | остальное |
Пример 2 (минимальный). Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:
| Аминопептид | 0,75 |
| Гидролизат казеина | 0,75 |
| Дрожжевой экстракт | 0,35 |
| Экстракт семян льна | 0,21 |
| НАД | 0,001 |
| Гемин | 0,001 |
| Глюкоза | 0,2 |
| Хлорид натрия (NaCl) | 0,3 |
| Карбонат натрия (Na2CO3) | 0,06 |
| Агар | 1,3 |
| Дистиллированная вода | остальное. |
Пример 3 (максимальный). Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:
| Аминопептид | 0,8 |
| Гидролизат казеина | 0,8 |
| Дрожжевой экстракт | 0,4 |
| Экстракт семян льна | 0,24 |
| НАД | 0,001 |
| Гемин | 0,001 |
| Глюкоза | 0,2 |
| Хлорид натрия (NaCl) | 0,3 |
| Карбонат натрия (Na2CO3) | 0,06 |
| Агар | 1,3 |
| Дистиллированная вода | остальное. |
Данные по КОЕ, диаметру колоний и морфологии клеток изученных штаммов на предлагаемой и известной среде приведены в табл.1.
| Таблица 1 | ||||
| Наименование штамма | Питательная среда | Показатели качества сред: | ||
| при высеве из 106 | морфология клеток в мазке | |||
| КОЕ | диаметр колоний, мм | |||
| Н.influenzae b | Предлагаемая (оптимальный вариант) | 197 | 0,93 | довольно однородные тонкие палочки |
| р=0,05* | p=0,05* | |||
| Среда сравнения (прототип) | 98 | 0,51 | полиморфные палочки, встречаются нитевидные формы и остатки разрушенных клеток | |
| Н.influenzae, бескапсульный штамм | Предлагаемая (оптимальный вариант) | 172 | 0,89 | довольно однородные тонкие палочки |
| p=0,05* | p=0,05* | |||
| Среда сравнения (прототип) | 90 | 0,48 | полиморфные палочки, встречаются нитевидные формы и остатки разрушенных клеток | |
| H.parainfluenzae | Предлагаемая (оптимальный вариант) | 212 | 0,97 | довольно однородные тонкие палочки |
| p=0,05* | p=0,05* | |||
| Среда сравнения (прототип) | 110 | 0,54 | полиморфные палочки, встречаются нитевидные формы и остатки разрушенных клеток | |
| * по непараметрическому критерию "u" (Вилкоксона-Манна-Уитни). |
Качественные характеристики используемых экстрактов и гидролизата
- Кислотный гидролизат казеина средней степени расщепления
Аминный азот - (0,34-0,40)%
Общий азот - (0,55-0,65)%
Степень расщепления белка - 0,57-0,67
Содержание хлоридов - (1,6-1,8)%
рН 4,5-4,7
- Дрожжевой экстракт
Возможно использование экстракта кормовых дрожжей (ЭКД) или импортного дрожжевого экстракта (ДЭ)
ЭКД - аминный азот - (1,9-2,3)%; рН 5,2-6,2
ДЭ - аминный азот - (2,0-3,0)%; рН 6,5-7,0
- Экстракт семян льна
20 г лекарственной формы «льна семена» заливают 400 мл кипящей дистиллированной воды (1:20), настаивают 2 ч, фильтруют;
сухой остаток - (0,5-0,7)%; рН 5,7-6,1.
Кроме приведенной области применения предложенная питательная среда может служить основой в следующих случаях:
- при дифференциации бактерий рода Haemophilus в случае исключения из состава среды фактора роста - гемина выросшие колонии не будут относиться к виду Н.influenzae; при исключении и НАД, и гемина выросшие колонии не относятся к бактериям рода Haemophilus, нуждающимся в одном из перечисленных факторов роста;
- при добавлении соответствующих ингибирующих добавок среда может служить основой для селективной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus - путем добавления бацитрацина (100 мкг/мл).
Питательная среда для выращивания бактерий рода Haemophilus, содержащая источники азотного питания, витаминов, НАД, гемин, хлорид натрия, карбонат натрия, глюкозу, агар и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она содержит в качестве стимулятора роста экстракт семян льна при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| аминопептид | 0,75-0,85 |
| гидролизат казеина | 0,75-0,85 |
| дрожжевой экстракт | 0,35-0,45 |
| экстракт семян льна | 0,21-0,27 |
| НАД | 0,001 |
| гемин | 0,001 |
| глюкозу | 0,2 |
| хлорид натрия | 0,3 |
| карбонат натрия | 0,06 |
| агар | 1,3 |
| дистиллированная вода | остальное |
