Штамм вируса зеленой крапчатой мозаики огурца вирог-43м для вакцинации растений огурца

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной генетики и представляет собой бессимптомный штамм вируса зеленой крапчатой мозаики огурца. Формой вирионов штамма является жесткая палочка размером 270×18 нм, и штамм относится к РНК-содержащим вирусам. Изобретение задерживает развитие заболевания крапчатой мозаики огурца и позволяет повысить урожай. 2 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной генетики и представляет собой бессимптомный штамм вируса зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО), который можно использовать для защиты растений огурца путем вакцинации растений.

Метод вакцинации растений давно разработан и успешно применяется в сельском хозяйстве. Эффект вакцинации слабопатогенным (ослабленным) штаммом заключается в том, что размножение такого предварительно введенного штамма вируса служит препятствием для размножения родственного патогенного вируса. При введении в растение слабопатогенного штамма вируса эти растения приобретают "иммунитет" к сильнопатогенным штаммам. В этом случае слабопатогенный штамм называют вакцинным. "Иммунитет" проявляется либо в удлинении срока появления симптомов заболевания, либо вообще в его отсутствие в течение всего времени вегетации, что приводит к уменьшению потерь и сохранению урожая (К.С.Сухов, Т.С.Подъяпольская, Извекова Л.И. Иммунизация растений против патогенного действия вирусов. М.: Наука, 1979).

Существуют вакцинные штаммы для защиты растений томата от вируса табачной мозаики томата: это ВТМ V-69 (Сухов К.С., Подъяпольская Т.С., Извекова Л.И. и др. Вакцинный штамм вируса табачной мозаики V-69: получение, свойства и практическое применение. Известия АН СССР. Серия биол. 1982, 1:113-125) и L11А (Nishiguchi М, Kikuchi S, Kiho Y, Ohno T, Meshi Т, Okada Y. Molecular basis of plant viral virulence; the complete nucleotide sequence of an attenuated strain of tobacco mosaic virus. Nucleic Acids Res. Aug 1985, 12; 13(15):5585-90). Ослабленные штаммы также используются для защиты перца от мягкой крапчатой мозаики перца (Ichiki TU, Nagaoka EN, Hagiwara K, Uchikawa K, Tsuda S, Omura Т.. Integration of mutations responsible for the attenuated phenotype of Pepper mild mottle virus strains results in a symptomless cross-protecting strain. Arch Virol. Oct; 150(10):2009-20. Epub 2005 Jun 22).

Нам не известны ослабленные штаммы ВЗКМО, используемые для защиты растений огурца. Выделение и применение таких штаммов может существенно повысить урожай, поскольку ВЗКМО в форме резкой зеленой мозаики поражает листья и плоды, вызывая значительные потери (до 40%). Вирус длительно сохраняется в семенах (1-2%) и затем быстро распространяется от растения к растению при ручной обработке, через почву и орудия труда.

Задачей данного изобретения являлось получение бессимптомного на растениях огурца вакцинного штамма ВЗКМО. Эта задача была решена с помощью штамма ВИРОГ-43М, который был получен в результате селекции патогенных штаммов ВЗКМО. Бессимптомные изоляты отбирались с помощью метода серодиагностики со специфической к ВЗКМО антисывороткой и препаративной очисткой. Штамм хранится в коллекции Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Штамм ВИРОГ-43М имеет следующие морфологические характеристики: форма вирионов - жесткая палочка размером 270×18 нм. На растениях огурца и кабачка бессимптомен.

Штамм ВИРОГ-43М накапливается в листьях огурца в меньшей концентрации (0,5-0,75 мкг/г свежей ткани), чем патогенный ВЗКМО (1,5-2,0 мкг/г).

Штамм ВИРОГ-43А относится к РНК-содержащим вирусам и имеет следующую первичную структуру генома:

1GTTTTAATTTTTATAATTAAACCAACAACAACAACAACAACAAACATTTTAAAACAACAA
61TGGCAAACATTAATGAACAAATCAACAATCAACGTGATGCTGCTGCTAGCGGGAGAAATA
121ATCTCGTTAGTCAGCTAGCATCAAAGAGGGTGTATGACGAGGCCGTTCGCTCGTTAGATC
181ATCAAGATAGACGCCCAAAAATGAACTTTTCTCGTGTGGTCAGTACAGAGCACACCAGGC
241TTATCACCGATGCGTATCCGGAGTTTTCGATTAGTTTCACCGCTACCAAGAACTCAGTTC
301ATTCCCTTGCGGGAAGTCTGAGGCTTCTTGAATTGGAGTACATGATGATGCAGGTACCTT
361ATGGTTCACCTTGCTTTGATATTGGCGGTAATTACACGCAGCATTTATTTAAAGGCAGAT
421CATATGTACATTGCTGCAATCCGTGCCTGGATCTTAAAGACGTTGCGAGGAATGTGATGT
481ACAATGACATAATTACGCAACATGTGCAGAGGCATAAAGGATCTGGTGGATGCAGACCTC
541TTCCGACTTTCCAGATAGATGCTTTCAGGAGGTACGAAGATTCGCCCGTTGCAGTCACCT
601GTCCAGACGTTTTCCAAGAATGTTCCTATGATTTCGGGAGTGGCAGGGATAATCATGCGG
661TCTCATTGCATTCGATTTATGATATCCCTTATTCTTCGATCGGACCAGCTCTTCATAGGA
721AAAACGTGAGAGTCTGTTATGCAGCCTTTCATTTCTCGGAGGCGTTGCTCTTAGGTTCGC
781CCGTGGGTAATTTAAATAGTATAGGGGCTCAATTTAGGGTTGATGGTGACGATGTGCATT
841TTCTTTTTAGTGAGGAGTCAACTTTGCATTATACTCATAGTTTAGAGAATATTAAGTTAA
901TCGTAATGCGTACTTATTTTCCTGCTGATGATAGGTTCGTGTATATTAAGGAGTTTATGG
961TTAAGCGTGTGGACACTTTCTTCTTTAGGTTGGTTAGGGCAGACACACATATGCTTCATA
1021AATCTGTAGGGCACTATTCGAAGTCGAAATCTGAGTATTTTGCGTTGAACACCCCCCCGA
1081TTTTTCAAGATAAGGCCACGTTTTCTGTGTGGTTTCCCGAAGCGAAACGGAAGGTGTTGA
1141TACCTAAGTTCGAACTCTCGAGATTTCTTTCTGGAAATGTGAAAGTCTCTAGGATGCTTG
1201TCGATGCTGATTTTGTCCATACCATTATTAATCACATTAGCACGTACGATAACAAGGCTT
1261TAGTGTGGAAGAATGTTCAGTCTTTTGTAGAATCTATACGCTCTAGGGTAATTGTAAACG
1321GAGTTTCCGTGAAATCTGAATGGAACGTGCCGATCGATCAGCTTACTGATATCTCATTCT
1381CGATATTCCTTCTCGTGAAGGTTAGAAAGGTGCAGATTGAGCTAATGTCTGATAAGGTCG
1441TGATCGAGGCGAGGGGTTTGCTTCGGAGGTTCGCTGATAGTCTTAAATCCGCCGTAGAAG
1501GACTAGGTGACTGCGTCTATGATGCTCTAGTTCAAACCGGTTGGTTTGACACCTCCAGCG
1561ACGAACTGAAAGTATTGCTACCTGAACCGTTTATGACCTTTTCAGATTACCTCGAAGGGA
1621TGTACGAGGCAGATGCGAAAATTGAGAGAGAGAGTGTCTTTGAGCTGCTTGCTTCTGGAG
1681ATGATCTGTTCAAGAAGATTGATGAGATAAGGAACAATTACAGCGGAGTTGAATTTGATG
1741TGGAGAAATTTCAAGAATTCTGTAAAGAACTGAATGTTAATCCCATGCTAATTGGTCATG
1801TGATCGAAGCTATTTTTTCGCAGAAGGCAGGGGTGACAGTCACGGGCCTAGGCACGCTCT
1861CTCCTGAGATGGGTGCTTCCGTTGCGTTGTCCAATAATTCTGTAGATACATGTGATGATA
1921TGGATGTAACTGAGGATATGGAGGAAATAGTGTTGATGGCAGACAAGAATCACTCTTACA
1981TTTCTCCAGAAATGTCGAGATGGGCTAATATGAAATATGGCAATAATAACGGGGCCTTAG
2041TTGAATACAAGGTCGGAACCTCGATGACTTTACCTGCCACCTGGGCAGAAAAGGGTAAGG
2101CTGTCTTACCGTTGTCGGGAATCTGTGTGAGAAAGCCCCAATTTTCAAAGCTACTCGATG
2161AGGAGGACGACTTGAGGTTGTCAAACATGAATTTCTTTAAGGTGAGTGATCTAAAGTTAA
2221AGAAGACTATCACTCCAGTTGTTTATACTGGGACCATTCGAGAGAGGCAGATGAAGAATT
2281ATATCGATTATCTATCGGCTTCTCTGGGTTCTACGCTTGGTAATCTTGAGAGAATTGTCA
2341GGAGTGATTGGAATGGTACCGAGGAGAGCATGCAAACTTTTGGATTGTACGATTGTGAGA
2401AGTGCAAGTGGTTGCTGTTACCATCCGAGAAGAAACACGCCTGGGCTGTAGTCCTAGCGA
2461GTGATGATACCACTCGTATAATCTTCCTGTCGTATGATGAATCCGGTTCTCCTATAATTG
2521ATAAGAAAAATTGGAAGCGGTTCGCTGTCTGTTCTGATACTAAAGTTTATAGTGTGATTC
2581GTAGTTTAGAAGTCTTAAATAAGGAGGCCATAGTCGATCCTGGGGTGCATATAACTTTAG
2641TCGATGGGGTGCCGGGCTGTGGAAAAACTGCAGAAATTATAGCGAGGGTCAATTGGAAAA
2701CTGACCTTGTGTTGACTCCCGGAAGGGAAGCGGCTGCTATGATCAGGCGAAGAGCCTGTG

2761CCCTGCACAA3TCACCTGTAGCTACTAGTGATAACGTTAGGACTTTTGACTCTTTCGTAA
2821TGAATAAGAA3GTTTTTAAATTTGATGCCGTTTATGTAGATGAGGGTCTTATGGTCCATA
2881CGGGGTTGCTCAACTTCGCGTTGAAGATTTCAGGTTGTAAAAAAGCCTTTGTCTTCGGTG
2941ATGCTAAGCAAATTCCGTTTATTAATAGGGTTATGAATTTTGATTATCCTAAGGAATTAA
3001GAACTTTAATAGTTGATAACGTAGAGCGTAGGTATATTACCCATAGGTGTCCTAGAGATG
3061TCACTAGCTTTCTTAATACTATTTATAAAGCTGCGGTTTCTACCACTAGTCCGGTTGTAC
3121ATTCCGTGAAGGCAATAAAGGTTTCTGGGGCTGGTATTCTGAGGCCCGAGTTGACGAAGA
3181TCAAAGGGAAGATCATAACGTTTACTCAGTCTGATAAACAATCCTTGATCAAGAGTGGGT
3241ACAATGATGTGAATACTGTGCATGAGATTCAAGGGGAGACCTTTGAGGAAACGGCGGTTG
3301TACGTGCGACACCGACTCCAATAGGTCTGATTGCTCGAGATTCACCACACGTGTTGGTGG
3361CTTTAACGCGGCATACCAAGGCAATGGTGTATTATACCGTTGTGTTCGATGCCGTTACAA
3421GCATAATAGCAGATGTGGAAAAGGTCGATCAGTCAATTCTGACCATGTTTGCTACTACTG
3481TGCCTACCAAATAGCAATTAACGCAGAACTCTCTGTATGTTCACCGCAATATTTTCCTCC
3541CTGTCACTAAGACAGGGTTTTATACGGATATGCAGGAGTTCTATGATAGGTGCCTTCCAG
3601GGAATTCCTTTGTTTTGAACGATTTCGATGCCGTCACCATGCGGTTGAGGGATAACGAAT
3661TTAATTTGCAACCTTGTAGATTAACTTTAAGTAATTTAGATCCGGTGCCGGCTTTGATCA
3721AGAGTGAGGCAAAAGATTTTCTGGTTCCCGTATTGCGAACGGCTTGCGAAAGGCCACGTA
3781TTCCGGGTCTTCTCGAAAATCTTGTTGCTATGATAAAGAGGAATATGAATACTCCTGATT
3841TGGCTGGAACCGTGGACATAACTAACATGTCTATTTCTATAGTAGATAATTTCTTTTCTT
3901CCTTTGTTAGGGACGAGGTTCTACTTGATCATTTAGATTGCGTTAGAGCTAGTTCTATGC
3961AGAGTTTTTCTGATTGGTTTTCTTGTCAGCCAACCTCGGCGGTTGGCCAGTTAGCTAATT
4021TTAATTTCATAGATTTACCTGCCTTTGATACATATATGCATATGATTAAGAGGCAGCCTA
4081AGAGTCGGTTAGATACTTCAATTCAGTCCGAATATCCGGCCTTGCAAACTATTGTATATC
4141ATCTGAAGGTGGTAAACGCAGTTTTCGGGCCGGTTTTTAAGTATCTGACTACTAAGTTTC
4201TTAGCATGGTAGATAATTCTAAGTTTTTCTTTTATACTAGAAAAAAGCCAGAGGATCTGC
4261AGGAGTTTTTCTCGGATCTTTCTTCCCATTCTGATTATGAAATTCTTGAGCTCGATGTTT
4321CTAAATATGATAAGTCGCAGTCCGATTTCCATTTCTCCATCGAGATGGCAATTTGGGAAA
4381GGCTAGGACTAGATGATATTTTAGCTTGGATGTGGTCCATGGGTCATAAGAGAACTATAC
4441TGCAAGACTTCCAAGCTGGAATAAAGACGCTCATTTATTATCAAAGGAAGTCTGGTGATG
4501TAACTACTTTTATAGGTAATACTTTTATTATTGCAGCGTGCGTAGCTAGTATGTTACCGT
4561TAGATAAGTGTTTTAAGGCTAGTTTTTGTGGTGATGATTCGTTAATCTACCTTCCTAAGG
4621GTTTGGAGTATCCTGATATTCAGGCTACCGCCAATTTGGTTTGGAATTTTGAGGCGAAAC
4681TTTTCCGGAAGAAGTATGGTTACTTCTGCGGGAAATATATCATTCATCACGCCAACGGCT
4741GTATTGTTTACCCTGACCCTTTAAAGTTAATTAGTAAATTAGGTAGTAAGAGTCTTGTCG
4801GGTATGAGCATGTCGAGGAGTTTCGTATATCTCTCCTTGATGTCGCTCATAGTTTGTTTA
4861ATGGTGCTTATTTCCATTTGCTCGACGATGCAATCCACGAGTTGTTTCCTAATGCTGGGG
4921GTTGCAGTTTTGTAATAAATTGTTTGTGTAAGTACTTGAGTGATAAGCGCCTTTTCCGTA
4981GTCTTTATATAGATGTCTCTAAGTAAGGTGTCGGTCGAGAACTCGTTGAAACCTGAGAAA
5041TTCGTTAAAATTTCCTGGGTTGACAAGTTGCTCCCTAATTACTTTTCTATTCTTAAGTAC
5101CTATCTATAACTGACTTTAGTGTAGTTAAAGCTCAGAGTTATGAATCCCTCGTGCCTGTC
5161AAGTTGTTGCGTGGTGTTGATCTTACAAAACACCTTTATGTCACACTGTTGGGCGTTGTG
5221GTTTCTGGTGTATGGAACGTACCGGAATCCTGTAGGGGTGGTGCTACTGTTGCTTTGGTT
5281GACACAAGGATGCATTCTGTTGCAGAAGGAACTATATGCAAATTTTCAGCTCCCGCCACC
5341GTCCGCGAATTCTCTGTTAGGTTCATCCCTAACTATTCTGTCGTGGCTGCGGATGCCCTT
5401CGCGATCCTTGGTCTTTATTTGTAAGGCTCTCTAACGTAGGTATTAAGGATGGTTTTCAT
5461CCATTAACTTTAGAGGTCGCCTGTTTAGTTGCCACTACTAATTCTATTATAAAAAAGGGG
5521CTTAGAGCTTCTGTAGTTGAGTCTGTTGTCTCTTCCGATCAGTCGATTGTTCTAGATTCT

5581TTATCTGAGAAAGTTGAGCCTTTCTTCGATAAAGTCCCTATTTCAGCGGCCGTAATGGCG
5641AGAGACCCCAGTTATAGGTCTAGGTCGCAGTCTGTCGTTGGTCGTGGTAAGCGGCATTCT
5701АААССТССААATCGGAGGTCGGACTCTGCTTCTGAAGAGTCCAGTTCTGTATCTTTCGAA
5761GATGGCTTACAATCCGATCACGCCTAGCAAACTTATTGCGTTTAGTGCTTCCTATGTTCC
5821CGTTAGAACTТТАСТТААТТTTCTAGTGGCGTCGCAAGGTACTGCTTTCCAAACTCAGGC
5881AGGAAGAGATTCCTTCCGTGAGTCTTTGTCTGCGTTACCTTCATCTGTTGAAGATATTAA
5941TTCTAGGTTCCCGAGTGCGGGTTTTTACGCТТТССТСААСGGTCCTGTGTTGAGGCCTAT
6001CTTCGTTTCGCTTCTTAGCTCTACGGATACGCGTAATAGGGTCATTGAGGTTGTAGATCC
6061TAGCAATCCGACGACTGCTGAGTCGCTTAACGCAGTCAAGCGTACTGACGATGCGTCTAC
6121AGCCGCTAGGGCTGAGATAGATAATTTGATAGAGTCTATCTCTAAGGGGTTTGATGTTTA
6181TGACAGGGCTTCTTTTGAAGCCGCGTTTTCGGTAGTCTGGTCAGAGGCTAССАССТСТАА
6241GGCTTAGCCTTGAGGGTCTTCTGACGGTGGTGCACACCATAGTGCATAGTGCTTTCCCGT
6301ТСАСТТТААТCGAACGGTTTGCTCATTGGTTTGCGAAAACCTCTCGCGTGTGACGCTGAA
6361GTTTTTATGGGCAGTAATTCTGCAAGGGGTTCGAATCCCCCCTTTCCCCGGGTAGGGGCC
6421СА

Первичную структуру вирусной РНК ВИРОГ-43М определяли с помощью автоматического секвенирования фрагментов кДНК, полученных методом праймер-опосредованной «прогулки по геному».

Для получения вакцины штамм сначала накапливают в растениях огурца в течение трех недель после заражения при температуре 18-25°С. Затем проводят выделение ослабленного штамма из листьев огурца и его очистку по методике. Такой препарат может храниться в ампулах в течение 1,5-3 лет при +5°С.

Вакцинация в производственных условиях осуществляется путем опрыскивания 10-12-дневных сеянцев огурца в стадии 1-2 развернутых настоящих листьев водным раствором вакцинного препарата с помощью бытовых пылесосов и прилагаемых к ним распылителей не менее чем за 3-4 дня до высадки в грунт.

Пример 1. Эксперименты по испытанию свойств штамма ВИРОГ-43М проводили в условиях лабораторных теплиц в трехкратной повторности по 100 растений в каждом опыте (таблица 1).

Таблица 1
Длительность сохранения бессимптомности ВИРОГ-43М в условиях лабораторного опыта и интерференция с патогенным штаммом ВЗКМО
Варианты опыта*Число бессимптомных растений в %Число растений с симптомами резкой мозаики, %
Время испытания после заражения ВИРОГ-43МВремя испытания (месяцы)Время испытания (месяцы)
1,52,02,53,01,52,02,53,0
ВИРОГ-43М10010098,098,0002,02,0
ВИРОГ-43М + ВЗКМО (через 2 недели после заражения ВИРОГ-43М)98,095,093,085,02,05,07,015,0
ВЗКМО0000100100100100
* Для заражения использовали препараты вирусов в концентрации 0,5 мкг/мл

В условиях лабораторного эксперимента растения огурца, зараженные ВИРОГ-43М, остаются бессимптомными в течение трех месяцев испытаний (табл.1), что свидетельствует о высокой генетической стабильности штамма ВИРОГ-43М.

Штамм ВИРОГ-43М обладает способностью к интерференции с патогенными штаммами ВЗКМО, так как обладает вакцинными свойствами, которые проявляются в длительном сохранении бессимптомности у вакцинированных растений после заражения их резким мозаичным штаммом ВЗКМО (табл.1).

Пример 2. Производственные испытания проводили в ЗАО агрокомбината «Московский» на площади по 1 га вакцинированных и невакцинированных посадок.

Таблица 2
Подавление развития мозаичного заболевания ВЗКМО на посадках огурца, обработанных ВИРОГ-43М
Варианты опыта и гибриды огурцаСроки наблюдений через 1 месяц после обработки ВИРОГ-43М и % резкой мозаики ВЗКМО в летнем обороте
1-й месяц2-й месяц3-й месяц4-й месяц
ВИРОГ-43М 0,5 мг/мл; F1 Кураж0,12,03,27,5
Без обработки2,012,234,151,5
ВИРОГ-43М,0,5 мг/мл; F1 Пассалимо5,411,019,334,2
Без обработки3,725,048,082,9

Исходя из приведенных в таблице данных, можно сделать вывод, что штамм ВИРОГ-43М обладает бессимптомностью, генетической стабильностью и способностью к интерференции с патогенными штаммами ВЗКМО. Следовательно, данный штамм может быть использован в практике защиты растений огурца от патогенного ВЗКМО, где на фоне резкой мозаики можно ожидать прибавки урожая не менее 25-30%.

Штамм вируса зеленой крапчатой мозаики огурца ВИРОГ-43М для вакцинации растений огурца.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. .
Изобретение относится к области вирусологии. .
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии
Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к аттенуированным штаммам вируса оспы коз

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии вирусов

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии вирусов

Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии
Изобретение относится к области биотехнологии
Наверх