Варианты основного аллергена phl p 1 из тимофеевки луговой

Изобретение относится к фармацевтически важным вариантам основного аллергена Phl p 1 из тимофеевки луговой. Получение мономерных молекул рекомбинантного варианта аллергена, которые являются растворимыми и стабильными в физиологическом растворе, осуществляют с помощью прокариотических экспрессионных систем и последующей очистки. Мономерные молекулы аллергена являются высокоэффективными при создании фармацевтических композиций для иммунотерапии аллергий, в запуске которых принимает участие основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой. 22 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к вариантам основного аллергена Phl p 1 из тимофеевки луговой, которые характеризуются тем, что получение, до сих пор невозможное, мономерных молекул, являющихся растворимыми и стабильными в физиологической среде, может быть осуществлено с помощью прокариотических экспрессионных систем и их последующей очистки.

Предпосылки изобретения

Аллергии типа 1 являются важными во всем мире. До 20% популяции населения в промышленно развитых странах страдают от таких заболеваний, как аллергический ринит, конъюнктивит или бронхиальная астма, вызываемых аллергенами, присутствующими в воздухе (аэроаллергенами), которые высвобождаются из различных источников, таких как пыльца растений, клещи, коты или собаки. До 40% пациентов, страдающих от аллергий такого типа, в свою очередь, демонстрируют специфическую IgE (иммуноглобулин Е) реактивность в случае пыльцы трав (Freidhoff и др., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-201).

Вещества, которые запускают аллергию типа 1, представляют собой белки, гликопротеины или полипептиды. После попадания в организм через слизистые оболочки эти аллергены реагируют с молекулами IgE, связанными с поверхностью тучных клеток у чувствительных людей. Если две молекулы IgE являются поперечно-связанными между собой с помощью аллергена, то это приводит к высвобождению медиаторов (например, гистамина, простагландинов) и цитокинов эффекторной клеткой и, таким образом, к соответствующим клиническим симптомам.

Разграничение делается между основными и второстепенными аллергенами в зависимости от относительной частоты встречаемости пациентов, страдающих аллергией, которые имеют антитела IgE против определенных аллергенов. В случае тимофеевки луговой (Phaleum pratense) Phl p 1 (Petersen и др., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796), Phl p.5 (Matthiesen и Löwenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen и др., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 105-109), Phl p 6 (Petersen и др., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54) и Phl p 2/3 (Dolecek и др., 1993) были охарактеризованы в качестве основных аллергенов, a Phl p 4 (Löwenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1-62) и группы 10 и 11 из Lollium perenne (Ansari и др., J. Allergy Clin. Immunol. 80, 229-235) в качестве второстепенных аллергенов.

Группа 1, которая включает Phl p 1 из тимофеевки луговой, была классифицирована в качестве одной из наиболее релевантных групп аллергенов пыльцы трав (Tamborini, Е. и др., Eur. J. Biochem. 1997, 249: 886-894). Другие представители группы 1 из других трав в некоторых случаях имеют более чем 95%-ную гомологию с Phl p 1 (Petersen, А. и др., J. Allergy Clin. Immunol. 1995, 95: 987-994). Благодаря такой высокой гомологии реакции с аллергенами других перекрестно-реагирующих видов также происходят в случае сенсибилизации травами. По этой причине такие молекулы представляются очень важными для соответствующих диагностических и терапевтических подходов. При терапевтическом применении таких аллергенов используют реакцию с клетками Т-хелперов, при этом происходит переориентация патологических ТН2 клеток в тип ТН1. Это вызывает изменение профиля цитокинов так, что В-клетки стимулируются с образованием IgG вместо IgE.

Классический подход к эффективному терапевтическому лечению аллергий представляет собой специфическую иммунотерапию или гипосенсибилизацию (Feibig, 1995, Allergo J. 4 (6), 336-339), Bousquet и др., J. Allergy Clin. Immunol. 102(4)б 558-562), при этом пациенту подкожно вводят природные экстракты аллергенов в увеличивающихся дозах.

Однако в этом способе существует риск возникновения аллергических реакций или даже анафилактического шока. Для того, чтобы минимизировать этот риск, используются новые препараты в форме аллергоидов. Они представляют собой химически модифицированные экстракты аллергенов, которые имеют значительно сниженную IgE реактивность, но идентичную реактивность Т-клеток, по сравнению с необработанным экстрактом (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7), 377-382).

Еще более существенная оптимизация терапии будет возможна при использовании аллергенов, полученных с помощью рекомбинантных способов. Определенные смеси аллергенов с высокой степенью очистки, полученных с помощью рекомбинантных способов, необязательно подобранные для индивидуальных пациентов, позволяют очистить экстракты, полученные из природных источников аллергенов, поскольку таковые в дополнение к различным аллергенам содержат относительное большое количество иммуногенных, но не аллергенных сопутствующих белков. Реальные перспективы, которые могут приводить к достоверной гипосенсибилизации с помощью продуктов экспрессии, предлагаются при использовании специфически мутированных рекомбинантных аллергенов, в которых эпитопы IgE являются специфически делетированными без разрушения эпитопов Т-клеток, которые являются существенными для терапии (Schramm и др., 1999, J. Immunol. 162, 2406-2414).

Дальнейшая возможность для терапевтического воздействия на нарушенное равновесие Th-клеток у пациентов, страдающих от аллергии, представляет собой лечение с помощью экспрессируемой ДНК, которая кодирует релевантные аллергены. Первичное экспериментальное подтверждение аллерген-специфического влияния на иммунный ответ было получено на грызунах путем инъекции ДНК, кодирующей аллерген (Hsu и др., 1996, Nature Medicine 2 (5), 540-544).

Phl p 1 представляет собой белок, содержащий 240 аминокислот и сайт n-гликозилирования. Фракция гликозилирования составляет 5% молекулярного веса, в природном белке она составляет приблизительно 30-35 кДа (Petersen и др., Allergy Clin. Immunol. 1995, 95: 987-994, Suck и др., J. Immunol. Meth. 1999, 229: 73-80). Последовательность нуклеиновой кислоты Phl p 1 является известной (Laffer и др., J. Allergy Clin. Immunol. 1994, 94: 689-698; Petersen и др., J. Allergy Clin Immunol. 1995, 95: 987-94) и может, таким образом, использоваться для рекомбинантного получения молекулы.

Предыдущие попытки получения молекулы с помощью рекомбинантных способов в бактериальной или эукариотической системах, таких как, например, дрожжи, для получения стабильной мономерной формы, однако, были неуспешными по причине их слабой растворимости: В случае бактериальной экспрессии Phl p 1 откладывается в виде телец включения (Vrtala и др., J. Allergy Clin. Immunol, 1996: 97: 781-7) и вначале должен подвергнуться денатурации перед очисткой. Денатурирующий агент последовательно удаляют. Однако таким образом невозможно достичь полного повторного свертывания белка в природную растворимую конформацию (Andersson, Lidholm, Int. Arch. Allergy Immunol. 2003; 130: 87-107). Одной из возможных причин, препятствующих образованию стабильной конформации, может быть отсутствие гликозилирования. Однако стабильный Phl p 1 не был получен даже в эукариотических системах, в которых гликозилирование является возможным (K.Grobe, Dissertation, 1998, University of Hamburg). Таким образом, причина отсутствия растворимости, как предполагают, заключается в протеолитической активности, которая приводит к саморазрушению молекулы (Grobe и др., Eur. J. Biochem. 1999; 263: 33-40; Kirsten Gehlhar, Dissertation, 1998, Medical University of Lübeck, Germany). Кроме того, гидрофобные взаимодействия также являются возможной причиной агрегации.

Задача, на которой основывается настоящее изобретение, заключается в обеспечении вариантов основного аллергена Phl p 1 из тимофеевки луговой, отличающихся улучшенной растворимостью, и которые и в то же время в полной мере сохраняют терапевтически и диагностически важные иммунологические свойства, а также могут быть, таким образом, очищены с получением фармацевтически приемлемой формы.

Фигуры

Фигура 1: Электрофорез в SDS-полиакриламидном геле nPhl p 1 дикого типа (n = природный) и вариантов свертывания LM и НМ вариантов аллергена rPhl р 1 1-А236С (r = рекомбинантный) в восстановительных условиях (в присутствии дитиотреитола DTT) и в невосстановительных условиях (без DTT).

Полоса 1: Стандартные молекулярные веса (10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 160, 220 кДа, лабораторный набор маркерных белков, Invitrogen, Karlsruhe, Germany).

Полоса 2: Экстракт из пыльцы Phleum pratense

Полоса 3: nPhl p 1

Полоса 4: rPhl p 1-LM

Полоса 5: rPhl p 1-HM

Фигура 2: Гель-фильтрация rPhl p 1-HM и rPhl p 1-LM на колонке с Сефакрилом S100.

Фигура показывает, что два варианта свертывания имеют различные средние молекулярные веса.

Фигура 3: Ферментативный аллерго-сорбентный анализ (EAST) для количественной оценки связывания IgE с вариантами свертывания rPhl р 1-А236С -LM и -НМ.

Концентрация ингибитора связывания в молях/л представлена по горизонтальной оси, степень ингибирования в [%] представлена по вертикальной оси. Измерение осуществляли при использовании nPhl p 1 на твердой фазе и типичной сыворотки пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу трав.

Подробное описание изобретения

Неожиданно было показано, что встраивание дополнительного цистеинового остатка, предпочтительно на карбокси-терминальном участке (в частности, от положения аминокислоты 140, весьма предпочтительно между положениями 230 и 240) молекулы, приводит к улучшенной растворимости в соответствии с изобретением при неизменной активности IgE и реактивности Т-клеток.

Изобретение, таким образом, относится к вариантам основного аллергена Phl р 1 из тимофеевки луговой, которые имеют дополнительный остаток Cys по сравнению с вариантом дикого типа, а также к фрагментам и вариантам, полученным на основе молекул, которые обладают такими же или подобными благоприятными свойствами.

Изобретение, кроме того, касается способа получения вариантов рекомбинантного основного аллергена rPhl p 1 в соответствии с изобретением, который характеризуется тем, что с помощью способов, которые известны сами по себе, основной триплет, кодирующий остаток Cys, встраивают в ген Phl p 1 путем инсерции или замены, ген, модифицированный таким образом, сверхэкспрессируют в организме хозяина, а вариант аллергена, полученный с помощью сверхэкспрессии, очищают.

Способ прокариотического рекомбинантного получения и очистки может быть осуществлен при использовании или без использования компонента слияния, введенного путем генетической инженерии, что всегда приводит к получению одних и тех же продуктов. Если используют компонент слияния, то он предпочтительно представляет собой His-метку. Способы очистки будут варьировать в зависимости от экспрессионного вектора или системы.

Настоящее изобретение, таким образом, охватывает специфически модифицированную первичную последовательность рекомбинантного аллергена rPhl p 1, которая улучшает рекомбинантный способ получения в бактериальной или иной экспрессионной системе, а также его последующую очистку.

Изобретение, таким образом, относится к молекулам ДНК, которые кодируют варианты аллергена в соответствии с изобретением (SEQ ID NO:1).

Рекомбинантные белки являются аутопротеолитически инактивированными и могут, таким образом, храниться в стабильной мономерной форме в физиологическом или другом забуференном растворе в зависимости от способа применения. Стимуляция Т-клеток не демонстрирует никаких значительных различий между рекомбинантным и природным Phl p 1.

Рекомбинантные варианты аллергена и полученные из него фрагменты или варианты могут, таким образом, использоваться для терапии аллергических заболеваний индуцированных пыльцой трав.

Благодаря такой фармацевтической приемлемости настоящее изобретение также относится к новым вариантам аллергена, которые используются в качестве лекарственных средств. Варианты аллергена и фрагменты, полученные с помощью рекомбинантных способов, могут, таким образом, использоваться для диагностики аллергий на пыльцу.

При получении основного аллергена Phl p 1 из тимофеевки луговой, модифицированного с помощью генетической инженерии, аминокислотная замена является следствием целевой замены нуклеотида, например, с помощью ПЦР. В особо предпочтительном воплощении в мутанте rPhl p 1-A236C в соответствии с последовательностью SEQ ID NO 2 аланин в положении 236 заменен на цистеин. Однако сайт замены может находиться также в любом желательном сайте молекулы. В общем случае, однако, он будет расположен на С-терминальном участке молекулы, предпочтительно от положения 140, в частности, между положениями 230 и 240.

Как следствие замены, протеолитическая активность, известная для Phl p 1, одновременно устраняется.

Как дополнительный неожиданный эффект при проведении изоляции и очистки молекулы в соответствии с изобретением возникают два варианта свертывания, которые могут быть полностью отделены друг от друга. В то время, как первый конформационный вариант, который называется rPhl p 1-LM (LM = низкий молекулярный вес) демонстрирует поведение, подобное таковому для природного белка, по причине подобности или идентичности их движения при проведении SDS-PAGE в невосстановительных условиях (Фиг.1) и гель-фильтрации (например, на Сефакрил S-100, смотри Фиг 2), второй вариант свертывания, который называется rPhl p 1-НМ (НМ = высокий молекулярный вес), существует в отличной форме свертывания. Их IgE реактивности также отличаются. В то время, как rPhl p 1-LM имеет реактивность, сравнимую с таковой для природного белка, rPhl p 1-НМ не так хорошо связывается с IgE антителами и является особенно приемлемым для специфической иммунотерапии благодаря своей гипоаллергенности (смотри Фиг.3). В принципе, однако, оба варианта свертывания являются приемлемыми для терапевтического и диагностического применения.

Изобретение, таким образом, также относится к различным формам свертывания варианта аллергена rPhl p 1 в соответствии с изобретением, а также к их применению для терапевтических и диагностических целей. Обе формы свертывания являются хорошо растворимыми, стабильными в мономерной форме и не выявляют протеолитической/аутопротеолитической активности.

Варианты аллергена в соответствии с изобретением могут быть получены, например, с помощью двух процессов получения, изложенных ниже - с использованием и без использования искусственного компонента слияния.

1) Экспрессия с использованием искусственного компонента слияния (His-метка)

В случае применения His-метки очистку изначально нерастворимого сырьевого белка осуществляют при использовании множества этапов разделения, которые включают один или более этапов ион металла-хелатной афинной хроматографии и удаление His-метки. Для предварительной и заключительной очистки можно использовать множество других хроматографических способов и этапов де- и ренатурации.

Получение формы свертывания rPhl р 1-LM:

- денатурация телец включения, изолированных из хозяйского организма при использовании хлорида гуанидина,

- ренатурация растворенного белка на хелатной аффинной хроматографической колонке,

- удаление His-метки,

- первая гель-фильтрация,

- хелатная аффинная хроматография,

- изоляция целевого белка из вытекающего потока второй, заключительной гель-фильтрации.

Другая форма свертывания - rPhl р 1-НМ может быть получена в этом варианте очистки путем осуществления следующих этапов процесса:

денатурация телец включения, изолированных из организма-хозяина при использовании хлорида гуанидина,

ренатурация растворенного белка на хелатной аффинной хроматографической колонке,

удаление His-метки,

первая гель-фильтрация,

хелатная аффинная хроматография,

элюирование целевого белка с помощью градиента имидазола,

вторая, заключительная гель-фильтрация.

2) Экспрессия при отсутствии компонента слияния (без His-метки).

- Денатурация телец включения, изолированных из организма-хозяина при использовании хлорида гуанидина, при которой, как описано ниже, получают одну или другую форму свертывания в зависимости от длительности процесса денатурации.

- Ренатурация растворенного белка в буферном растворе, где предпочтительно используют 20-50 мМ Трис/HCl рН 7-8, но при этом также возможно использование других буферов и значений рН (например, 7-10,5). Для разведения порцию денатурирующего раствора предпочтительно прибавляют к предпочтительно взболтанному или иным образом перемешанному, например, путем декантации, пипетирования или прокачивания; буферному раствору в количестве, которое в несколько раз превышает ее объем (приблизительно от 10 до 80 раз, предпочтительно от 20 до 60 раз превышает объем денатурирующего раствора), однако буферный раствор может также прибавляться к денатурирующей порции. Соотношение добавленного раствора не является критическим; таким образом, полное количество может прибавляться в одной порции в течение нескольких секунд или альтернативно (но преимущественно в этом нет необходимости) однородно распределенным на несколько часов.

- Концентрация и очистка ренатурированного белка с помощью хелатной аффинной хроматографии и последующее элюирование при использовании градиента имидазола (предпочтительно используют ступенчатый градиент, но непрерывный градиент также является возможным). Альтернативно или дополнительно к хелатной аффинной хроматографии можно также необязательно осуществлять хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия и/или анионообменную хроматографию (молекулы должны быть полностью обработаны с помощью хроматографии).

- Заключительная гель-фильтрация.

Альтернативные стабильные формы свертывания LM и НМ могут быть получены в данной заявке, в частности, с минимальной перекрестной контаминацией при использовании различного времени инкубации на этапе денатурации. Для получения формы LM инкубацию, в основном, осуществляют в течение периода времени от приблизительно 10 до 50 часов. В общем случае, однако, используют интервал от 10 до 40 часов, предпочтительно от 15 до 30 часов, при этом интервал от 18 до 22 часов является особенно предпочтительным.

Для варианта НМ требуются значительно более продолжительные периоды инкубации. Они составляют порядка от 60 до 120 часов. Однако инкубацию обычно проводят в течение от 70 до 100 часов, в частности предпочтительно в пределах от 80 до 90 часов.

После этапа денатурации во всех случаях проводят этап разведения так, как описано выше, буферным раствором.

Интервал приблизительно от 50 до 60 часов представляет фазу повторного свертывания. Этап разведения, вероятно, фиксирует процесс свертывания, при этом не наблюдается никаких кинетик.

Тонкая очистка для отделения LM и НМ является возможной при использовании хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия или достигается с помощью гель-фильтрации, при этом формы имеют значительно отличающиеся друг от друга продолжительности удержания.

Варианты аллергена в соответствии с изобретением могут быть получены с высокой степенью очистки в виде своих вариантов свертывания LM и НМ, при этом они имеют ценные фармацевтически релевантные свойства. Таким образом, они могут использоваться в виде смеси, но также и индивидуально, для диагностики (в частности, rPhl р 1-LM благодаря сохранению IgE активности) и терапии (в частности, rPhl р 1-НМ благодаря сниженной IgE активности) аллергических заболеваний.

Изобретение, таким образом, также относится к применению вариантов аллергена и/или их фармацевтически используемых производных, включая их смеси во всех соотношениях, для получения лекарственного средства для специфической иммунотерапии (гипосенсибилизации) и диагностики аллергий, в запуск которых вовлечен основной аллерген Phl р 1 из тимофеевки луговой.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей вариант аллергена в соответствии с изобретением и/или его фармацевтически используемые производные, включая их смеси во всех соотношениях и, если это является желательным, наполнители и/или вспомогательные вещества. Активные ингредиенты в соответствии с изобретением могут быть превращены в приемлемую дозированную форму вместе с, по крайней мере, одним твердым и/или полужидким наполнителем или вспомогательным веществом и, если это является желательным, в комбинации с одним или более дополнительными ингредиентами.

Если молекулы ДНК, на которых основываются варианты аллергена в соответствии с изобретением, являются лигированными с приемлемым экспрессионным вектором, то эти конструкции могут в дополнение использоваться в качестве препаратов для иммунотерапии (ДНК вакцинация).

Изобретение, таким образом, также относится к рекомбинантному экспрессионному вектору на основе ДНК, который содержит молекулу ДНК в соответствии с изобретением, для лечения аллергий, в запуск которых вовлечен основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой, с помощью иммунотерапевтической ДНК вакцинации.

Изобретение также относится к применению указанного экспрессионного вектора и/или его производных, включая их смеси во всех соотношениях, для получения лекарственного средства для лечения аллергий, в запуск которых вовлечен основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой, с помощью иммунотерапевтической ДНК вакцинации.

В завершение изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей указанный экспрессионный вектор и/или его фармацевтически приемлемые производные, включая их смеси во всех соотношениях, для получения лекарственного средства для лечения аллергий, в запуск которых вовлечен основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой, с помощью иммунотерапевтической ДНК вакцинации.

Для целей настоящего изобретения фармацевтические композиции могут использоваться в качестве терапевтических агентов для людей и в ветеринарной медицине. Приемлемые наполнители представляют собой органические или неорганические вещества, которые являются приемлемыми для парентерального введения и не реагируют с вариантами основного аллергена Phl p 1 из тимофеевки луговой в соответствии с изобретением. Приемлемыми для парентерального введения, в частности, являются растворы, предпочтительно растворы на основе масла или водные растворы, а также суспензии, эмульсии или имплантаты. Варианты аллергена в соответствии с изобретением могут также быть лиофилизированы, а полученные лиофилизаты используют, например, для получения препаратов для инъекций. Указанные композиции могут быть подвергнуты стерилизации и/или включать вспомогательные вещества, такие как лубриканты, консерванты, стабилизаторы и/или смачивающие агенты, эмульгаторы, соли для модификации осмотического давления, буферные вещества и/или множество других активных ингредиентов.

Кроме того, композиции отсроченного высвобождения могут быть получены например, путем адсорбции соответствующей композиции вариантов аллергена в соответствии с изобретением на гидроксиде алюминия.

Дальнейшие селективные модификации в различных положениях, например, для увеличения гипоаллергенности, конечно, также являются возможными при осуществлении мутаций в соответствии с изобретением. Эти модификации могут представлять собой, например, химические модификации экстракта аллергена (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7), 377-382). Однако они могут быть осуществлены на уровне ДНК с помощью генетической инженерии, где, например, инсерции, делеции и замены аминокислот, расщепление белка на фрагменты и слияние белка или его фрагментов с другими белками или пептидами являются приемлемыми.

С учетом высокой степени гомологии в рамках группы 1 основных аллергенов пыльцы трав все описанные в данной заявке эффекты для Phl p 1, относящиеся к совершенствованию растворимости с помощью введения остатка Cys, и возникновение вариантов свертывания также могут ожидаться для других представителей этой группы.

Даже при отсутствии дополнительных комментариев предполагается, что специалист в данной области техники будет способен использовать приведенное выше описание в широком смысле. Воплощения, представленные ниже в Таблицах 1 и 2 в качестве примеров для варианта rPhl p 1-A236C, будут, таким образом, просто рассматриваться как иллюстративное раскрытие, которое абсолютно не ограничивает изобретение любым образом.

Все хроматографические материалы являются коммерчески доступными от Amersham Bioscience (Freiburg, Germany).

Выбор иона металла в описанных способах хелатной аффинной хроматографии не является критическим, при этом могут использоваться как Ni, так и Cu.

Пример 1: изоляция rPhl p 1-A236C-LM и НМ

- вариант очистки при использовании His-метки

Кодирующую последовательность для Phl p 1 амплифицировали с помощью ПЦР при использовании 5′- и 3′-специфических олигонуклеотидов и лигировали в вектор pProEx (GIBCO, La Jolla, USA) через рестрикционные сайты Ehe I и Hind III. 3′-праймер модифицировали от GC до TG в положениях оснований 706/707 таким образом, что триплет, кодирующий аланин, превращали в триплет, кодирующий цистеин (Essential Molecular Biology; Т.A.Brown ред. IRL Press, Oxford, 1994). Трансформацию осуществляли при использовании микроорганизма Е.coli. Исходный выбранный вектор обеспечивал 6×His последовательность, расположенную на N-терминальном конце, после которой следовала последовательность узнавания для TEV протеазы. Рекомбинант, первоначально в виде 6×His-меченной молекулы rPhl p 1-A236C, которая присутствует в качестве нерастворимых агрегатов после бактериальной экспрессии, растворяли после предварительной очистки в 6 М хлориде гуанидина (GdmCl), 50 мМ Трис/HCl, 500 мМ NaCl, pH 8,0). После этого проводили двухстадийную Ni-хелатную аффинную хроматографию.

На первом этапе белки, связанные с хелатирующей Сефарозой, в условиях денатурации переводили с помощью градиента в течение периода времени 90 минут из денатурирующего раствора в буфер, состоящий из 50 мМ фосфатного буфера и 500 мМ NaCl (pH 7,4). После этого проводили постепенное элюирование с помощью 500 мМ имидазола в фосфатном буфере. Ренатурированный слитый белок расщепляли на rPhl p 1 и 6×His компонент слияния с помощью специфической TEV протеазы.

Для подготовки ко второй аффинной хроматографии осуществляли гель-фильтрацию при использовании Сефадекса G-25 и фосфатного буфера в качестве элюента, в результате чего удаляли имидазол.

Повторно забуференную белковую смесь потом использовали для второй Ni-хелатной аффинной хроматографии. В этом случае обнаруживали в вытекающем потоке некоторые из успешно расщепленных rPhl p 1. Таковые представляли собой LM форму молекулы. Кроме нерасщепленных молекул конформационный вариант НМ также оставался прикрепленным к колонке, очевидно, благодаря имеющимся остаткам гистидина. Этот расщепленный вариант элюировали перед нерасщепленными слитыми белками в градиенте имидазола, что давало возможность получить эту форму с высокой степенью очистки. На заключительном этапе гель-фильтрацию с помощью Супердекса 75 осуществляли для окончательной очистки и перевода в желаемый растворитель.

Таблица 1
Обзор процессов получения и очистки в соответствии с изобретением при использовании His-метки
1. Экспрессия
2. Изоляция телец включения
3. Денатурация
4. Ni-хелатная аффинная хроматография 1 (ренатурирующая)
5. Удаление His-метки
6. Гель-фильтрация
7. Ni-хелатная аффинная хроматография 2:	Вытекающий поток: rPhl p 1-LM Элюат: rPhl p 1-HM Нерасщепленный слитый белок His-rPhl р 1
8. Гель-фильтрация (Супердекс 75)

Пример 2: Изоляция rPhl p 1-A236C-LM и -НМ

очистка варианта без использования His-метки

Сначала процедуру проводили в соответствии с Примером 1, но при этом выбранный вектор не обеспечивал слитого белка в качестве первичного продукта. Рекомбинант, первоначально в виде молекул rPhl p 1-А236С, которые присутствовали в виде нерастворимых агрегатов (телец включения) после бактериальной экспрессии, растворяли после предварительной очистки в 6 М хлориде гуанидина (GdmCl), 50 мМ Трис/HCl, рН 8,0). После этого осуществляли разведение в 40 раз в 20 мМ Трис рН 8,0. С этой целью денатурирующий раствор декантировали в раствор для разведения при перемешивании с помощью магнитной мешалки.

a) Получение формы LM

Тельца включения инкубировали в денатурирующем растворе в течение 20 часов и последовательно разводили так, как описано выше.

b) Получение формы НМ

Тельца включения инкубировали в денатурирующем растворе в течение 85 часов и последовательно разводили так, как описано выше.

500 мМ NaCl прибавляли к соответствующей порции разведения (ренатурация). Растворенные молекулы в ренатурирующей порции концентрировали посредством Cu-хелатной аффинной хроматографии и элюировали с помощью 200 мМ имидазола в фосфатном буфере одноэтапно (или постепенно с помощью 500 мМ имидазола в фосфатном буфере).

Хелатную аффинную хроматографию можно необязательно использовать для создания приемлемых условий перед элюированием белка, например, при использовании 3 М раствора NaCl для промывки и 3 М NaCl и 200 мМ раствора имидазола для элюирования. Элюат, который имел высокое содержание соли, можно потом непосредственно использовать для хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия. На заключительном этапе гель-фильтрацию с помощью Супердекса 75 осуществляли для окончательной очистки и перевода в желаемый растворитель.

Таблица 2
Обзор способов получения и очистки в соответствии с изобретением без использования His-метки
1. Экспрессия
2. Изоляция телец включения
3. Денатурация:	Длительность 20 часов: LM Длительность 85 часов: НМ
4. Разведение
5. Cu-хелатная аффинная хроматография
6. Гель-фильтрация (Супердекс 75)

Пример 3: Различное связывание IgE с аллергеном дикого типа и вариантами свертывания LM и НМ варианта rPhl p 1-A236C

Природный nPhl p 1 и рекомбинантные варианты rPhl р 1 НМ и LM сравнивали друг с другом в отношении силы их связывания с IgE в анализе ингибирования EAST, который осуществляли с помощью способа Suck и др. (Int. Arch. Allergy Immunol. 200; 121: 284-291) с пулом сывороток больных, страдающих аллергией (Фиг.3). Было обнаружено, что варианты НМ имели значительно сниженное связывание IgE по сравнению с природным белком Phl p 1, в то время, как вариант LM имел связывание IgE, которое было сравнимым с таковым для природного белка Phl р 1.

1. Рекомбинантный вариант аллергена rPhl p 1-А236С в соответствии с SEQ ID NO 2, отличающийся тем, что дополнительный остаток Cys введен путем замены Ala 236.

2. Молекула ДНК в соответствии с SEQ ID NO 1, которая кодирует вариант аллергена по п.1.

3. Способ получения варианта рекомбинантного основного аллергена rPhl р 1 по п.1, отличающийся тем, что с помощью известных методов

основной триплет, кодирующий остаток Cys, вводят в соответствующий ген путем вставки или замены,

модифицированный таким образом ген сверхэкспрессируют в организме хозяина и

полученный сверхэкспрессией вариант аллергена очищают.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что для получения варианта рекомбинантного основного аллергена rPhl р 1 в растворимой форме изначально нерастворимый неочищенный белок денатурируют, затем ренатурируют путем разбавления и очищают биохимическими методами.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что для получения варианта рекомбинантного основного аллергена rPhl р 1 в растворимой форме сверхэкспрессированный первоначально нерастворимый неочищенный белок, содержащий His-метку, предназначенную для целей очистки, очищают с использованием множества биохимических стадий, включающих две стадии металлохелатной аффинной хроматографии и удаление His-метки.

6. Рекомбинантный вариант аллергена по п.1, отличающийся тем, что он существует в различных формах свертывания.

7. Форма свертывания варианта аллергена rPhl p 1-LM по п.1, получаемая при осуществлении следующих этапов обработки:

сверхэкспрессии варианта аллергена rPhl p 1, содержащего His-метку, в организме хозяина,

денатурации тел включения, выделенных из организма хозяина при обработке хлоридом гуанидина,

ренатурации растворенного белка на колонке для хелат-аффинной хроматографии,

удаления His-метки,

гель-фильтрации,

дополнительной хелат-аффинной хроматографии,

выделения целевого белка из элюата,

гель-фильтрации.

8. Форма свертывания варианта аллергена rPhl p 1-НМ по п.1, получаемая при осуществлении следующих этапов обработки:

сверхэкспрессии варианта аллергена гРЫ р 1, содержащего His-метку в организме хозяина,

денатурации тел включения, выделенных из организма хозяина при обработке хлоридом гуанидина,

ренатурации растворенного белка на колонке для хелат-аффинной хроматографии,

удаления His-метки,

гель-фильтрации,

дополнительной хелат-аффинной хроматографии,

элюирования целевого белка в градиенте имидазола,

гель-фильтрации.

9. Рекомбинантный вариант аллергена по п.1 в качестве лекарственного средства для специальной иммунотерапии аллергий.

10. Рекомбинантный вариант аллергена по п.6 в качестве лекарственного средства для специальной иммунотерапии аллергий.

11. Рекомбинантный вариант аллергена по п.7 в качестве лекарственного средства для специальной иммунотерапии аллергий.

12. Рекомбинантный вариант аллергена по п.8 в качестве лекарственного средства для специальной иммунотерапии аллергий.

13. Применение варианта аллергена по п.9 и/или его фармацевтически приемлемых производных, включая их смеси при любых соотношениях, для получения лекарственного средства для специальной иммунотерапии аллергий, в запуске которых принимает участие основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой.

14. Применение варианта аллергена по любому из пп.10-12 и/или его фармацевтически приемлемых производных, включая их смеси при любых соотношениях, для получения лекарственного средства для специальной иммунотерапии аллергий, в запуске которых принимает участие основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой.

15. Применение варианта аллергена по п.10 и/или его фармацевтически приемлемых производных, включая их смеси при любых соотношениях, для получения лекарственного средства для специальной иммунотерапии аллергий, в запуске которых принимает участие основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой.

16. Применение варианта аллергена по п.11 и/или его фармацевтически приемлемых производных, включая их смеси при любых соотношениях, для получения лекарственного средства для специальной иммунотерапии аллергий, в запуске которых принимает участие основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой.

17. Применение варианта аллергена по п.12 и/или его фармацевтически приемлемых производных, включая их смеси при любых соотношениях, для получения лекарственного средства для специальной иммунотерапии аллергий, в запуске которых принимает участие основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой.

18. Фармацевтическая композиция для специальной иммунотерапии аллергий, включающая вариант аллергена по п.9 и/или его фармацевтически приемлемые производные, включая их смеси при любых соотношениях, а также необязательно наполнители и/или вспомогательные вещества.

19. Фармацевтическая композиция для специальной иммунотерапии аллергий, включающая вариант аллергена по любому из пп.10-12 и/или его фармацевтически приемлемые производные, включая их смеси при любых соотношениях, а также необязательно наполнители и/или вспомогательные вещества.

20. Фармацевтическая композиция для специальной иммунотерапии аллергий, включающая вариант аллергена по п.10 и/или его фармацевтически приемлемые производные, включая их смеси при любых соотношениях, а также необязательно наполнители и/или вспомогательные вещества.

21. Фармацевтическая композиция для специальной иммунотерапии аллергий, включающая вариант аллергена по п.11 и/или его фармацевтически приемлемые производные, включая их смеси при любых соотношениях, а также необязательно наполнители и/или вспомогательные вещества.

22. Фармацевтическая композиция для специальной иммунотерапии аллергий, включающая вариант аллергена по п.12 и/или его фармацевтически приемлемые производные, включая их смеси при любых соотношениях, а также необязательно наполнители и/или вспомогательные вещества.

23. Применение варианта аллергена по п.1 и/или его производных, включая их смеси при любых соотношениях, для in vitro диагностики аллергий, в запуске которых принимает участие основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой.

24. Применение варианта аллергена по п.6 и/или его производных, включая их смеси при любых соотношениях, для in vitro диагностики аллергий, в запуске которых принимает участие основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой.

25. Применение формы свертывания варианта аллергена по п.7 и/или его производных, включая их смеси при любых соотношениях, для in vitro диагностики аллергий, в запуске которых принимает участие основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой.

26. Применение формы свертывания варианта аллергена по п.8 и/или его производных, включая их смеси при любых соотношениях, для in vitro диагностики аллергий, в запуске которых принимает участие основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой.

27. Вектор экспрессии на основе рекомбинантной ДНК, содержащий молекулу ДНК по п.2, для лечения аллергий, в запуске которых принимает участие основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой, путем иммунотерапевтической ДНК-вакцинации.

28. Применение вектора экспрессии по п.27 и/или его производного, включая их смеси при любых соотношениях, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения аллергий, в запуске которых принимает участие основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой, путем иммунотерапевтической ДНК-вакцинации.

29. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор экспрессии по п.27 и/или его фармацевтически приемлемые производные, включая их смеси при любых соотношениях, и необязательно наполнители и/или вспомогательные вещества, для лечения аллергий, в запуске которых принимает участие основной аллерген Phl p 1 из тимофеевки луговой, путем иммунотерапевтической ДНК-вакцинации.