Способ получения биомассы in vitro

Способ включает заготовку эксплантов, их стерилизацию, помещение эксплантов для каллусообразования и роста биомассы в стерильные пробирки с модифицированной питательной средой Мурасиге-Скуга с добавлением ростовых стимуляторов, термостатирование при 26±1°С. Стерилизацию эксплантов осуществляют в дистиллированной воде воздействием ультразвуковых колебаний с интенсивностью 1...2 Вт/кв.см на рабочей частоте 22...44 кГц в течение 3...6 мин. На этапах каллусообразования и роста биомассы пробирки с эксплантами погружают в водную среду и осуществляют через нее воздействие ультразвуковыми колебаниями с интенсивностью не менее 10...15 Вт/кв.см на частоте 22...44 кГц. Воздействие проводят со стороны дна пробирок с периодичностью не реже 1 раза в сутки в течение не менее 6 мин на каждом этапе. Прирост биомассы составляет 87,40-176,53%. Способ позволяет получить оздоровленный посадочный материал, увеличить эффективность стерилизации, увеличить способность неинфицированных эксплантов образовывать каллус. 5 табл.

 

Изобретение предназначено для использования в области сельского хозяйства и биотехнологии и может быть использовано для получения оздоровленного посадочного материала (микроразмножения при оздоровлении растений), выведении новых сортов и получения биомассы (каллуса) растительного сырья для фармацевтической и косметической промышленности.

В настоящее время актуальным является получение биомассы (каллуса) растительного сырья для выведения новых сортов растений, придание им устойчивости к различным видам бактерий, грибов и вирусов, сорнякам, насекомым-вредителям и другим неблагоприятным факторам окружающей среды, а также для получения экстрактов биологически активных веществ из растительного сырья и сохранения видов исчезающих растений, занесенных в Красную книгу.

Наиболее широко распространенными способами получения биомассы (каллуса) для указанных целей являются биотехнологические способы роста культур клеток и тканей in vitro [1, 2, 3, 4]. Все известные способы получения биомассы in vitro предполагают изоляцию зон роста в виде различных эксплантов из исходного растения, стерилизацию их и помещение в стерильных условиях на питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) с заданным составом ростовых веществ. Для накопления биомассы (каллуса) обычно используются первичные экспланты в виде проростков семян, частей листьев и стеблей, пазушных и апикальных меристем и почек клубней или корнеплодов растений.

Общим недостатком всех известных способов является их низкая производительность (эффективность), обусловленная:

- низкой эффективностью стерилизации (менее 50%) исходного материала (эксплантов);

- малой долей эксплантов, образующих каллус (эффективность каллусообразования не более 30...40% от общего количества неинфицированных эксплантов);

- недостаточным приростом биомассы образовавшегося каллуса (не более 60% от исходной массы).

Перечисленные недостатки ограничивают возможность применения известных способов для промышленного производства.

В связи с этим возникает необходимость повышения эффективности способов получения биомассы in vitro на всех этапах осуществления процесса: стерилизация, каллусообразование и рост биомассы. Как правило, это осуществляют при помощи дополнительных воздействий на различных этапах реализации процесса (применение различных стерилизующих растворов, добавлением ростовых факторов каллусообразования, температурным воздействием и воздействием различных излучений).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ получения биомассы in vitro по патенту РФ 2222933 [5], принятый за прототип. Способ получения биомассы in vitro, по [5], включает заготовку эксплантов из проростков, тканей или клеток, их стерилизацию, помещение эксплантов для каллусообразования и роста биомассы в стерильные пробирки с модифицированной питательной средой Мурасиге-Скуга с добавлением ростовых факторов каллусообразования, термостатирование при температуре 26±1 градус Цельсия и относительной влажности 70%.

На этапе роста биомассы в известном способе осуществляется воздействие посредством индуктора последовательностью однонаправленных импульсов магнитной индукции с амплитудным значением 0,05 Тл, периодом 5, 12 с, скважностью от 100 до 4500, причем апикальную часть экспланта ориентируют противоположно направлению вектора магнитной индукции, а число импульсов устанавливают от 10 до 100.

Способ позволяет увеличить количество образующейся биомассы in vitro. В этом случае рост биомассы происходит только на неинфицированных эксплантах, образовавших каллус.

При этом основные потери исходного материала из-за инфицирования и отсутствия каллусообразования не были устранены.

Таким образом, прототип не позволяет повысить производительность процесса и довести эффективность способа получения биомассы in vitro до промышленного применения.

В предлагаемом способе получения биомассы in vitro решается задача увеличения производительности процесса получения биомассы за счет повышения эффективности всех основных стадий этого процесса:

- стерилизации исходного материала (эксплантов) без применения химических дезинфицирующих растворов;

- увеличения способности неинфицированных эксплантов образовывать каллус;

- увеличения получаемой биомассы не только за счет увеличения прироста на каждом образовавшем каллус неинфицированном экспланте, но и за счет увеличения числа неинфицированных и образующих каллус первичных эксплантов.

Предлагаемый способ получения биомассы in vitro включает заготовку эксплантов из различных частей растений (проростков, тканей или клеток), их стерилизацию, помещение эксплантов для каллусообразования и роста биомассы в стерильные пробирки с модифицированной питательной средой Мурасиге-Скуга с добавлением ростовых стимуляторов каллусообразования, термостатирование при температуре 26±1 градус Цельсия и относительной влажности 70%. Стерилизацию эксплантов осуществляют в дистиллированной воде воздействием на экспланты ультразвуковыми колебаниями с интенсивностью 1...2 Вт/кв.см на рабочей частоте 22...44 кГц в течение 3...6 минут. После помещения эксплантов на питательную среду, на этапах каллусообразования и роста биомассы пробирки с эксплантами погружают в водную среду и осуществляют через нее воздействие ультразвуковыми колебаниями с интенсивностью не менее 10...15 Вт/кв.см на частоте 22...44 кГц со стороны дна пробирок с периодичностью не реже 1 раза в сутки в течение не менее 6 минут на каждом этапе.

Сущность предлагаемого способа заключается:

- в рациональном (оптимальном по интенсивности и времени) воздействии на помещенные в стерильную воду экспланты ультразвуковыми колебаниями, обеспечивающими стерилизующий эффект за счет формирования и захлопывания в водной среде на поверхности эксплантов кавитационных пузырьков [6]. При этом происходит разрушение патогенных форм без применения каких-либо химических стерилизующих веществ;

- в рациональном (оптимальном по интенсивности и времени) воздействии ультразвуковыми колебаниями на экспланты, находящиеся в стерильных пробирках на питательной среде. УЗ колебания, распространяясь в водной среде, проникают через стенки пробирок и питательную среду к поверхности эксплантов. При воздействии ультразвуковых колебаний на экспланты, находящиеся в питательной среде, интенсифицируются процессы массообмена и проникновения питательной среды внутри эксплантов и растущей биомассы. Ускорение процессов массообмена [6] обеспечивает интенсификацию подвода питательной среды к поверхности экспланта и растущей биомассы, а звукокапиллярный эффект [6] обеспечивает эффективное проникновение питательной среды по капиллярам эксплантов и через поры к растущей биомассе.

Способ осуществляют следующим образом. Берется по 40 пробирок с питательной средой и эксплантами. Эксплантами являлись зародышевые листки проростков семян и пазушные почки растений гречихи, картофеля и сои.

Эффективность стерилизации (Э₁) определяют по количеству неинфицированных эксплантов после стерилизации (с) в процентах от исходного количества стерилизуемых эксплантов (х):

Эффективность каллусообразования (Э₂) определяют по количеству стерильных эксплантов, образовавших каллус в пробирках с питательной средой (k) в процентах, от исходного количества вводимых в культуру эксплантов (х):

Прирост биомассы определяют в граммах и процентах.

Прирост биомассы в граммах - это разница между конечным и начальным весом биомассы, образовавшейся за определенный промежуток времени.

Прирост биомассы в процентах - это разница между конечным и начальным весом биомассы за определенный промежуток времени, отнесенный к начальному весу каллуса в культивационной пробирке.

Результаты стерилизации эксплантов по способу, принятому за прототип (без ультразвука), и по предложенному способу представлены в таблице 1.

Таблица 1
Результаты стерилизации эксплантов
Вариант	Исходное количество эксплантов, шт.	Количество неинфицированных эксплантов, шт.	Эффективность стерилизации, %
Гречиха
Прототип	30	19	63,30
Предложенный способ	30	27	90,00
Картофель
Прототип	30	19	63,30
Предложенный способ	30	26	86,70
Соя
Прототип	40	25	62,50
Предложенный способ	40	31	77,50

Эффективность каллусообразования по предложенному способу представлена результатами эксперимента, приведенными в таблице 2.

Таблица 2 Результаты каллусообразования из эксплантов
Вариант	Исходное количество эксплантов, %	Количество пробирок с каллусом, %	Эффективность каллусообразования, %
Гречиха
Прототип	30	5	16,70
Предложенный способ	30	12	40,00
Картофель
Прототип	50	12	24,00
Предложенный способ	50	21	42,00
Соя
Прототип	25	8	32,00
Предложенный способ	31	15	48,40

Результаты прироста биомассы представлены в таблицах 3, 4 и 5.

Таблица 3
Прирост биомассы картофеля
Вариант	Начальная масса каллуса, г	Конечная масса каллуса, г	Прирост биомассы
Абсолютный, г	Средний, г	Абсолютный, %	Средний, %
1	2	3	4	5	6	7
Прототип	0,035	0,071	0,036	0,036	102,86	57,69
	0,042	0,080	0,038		90,48
	0,053	0,093	0,040		75,47
	0,061	0,090	0,029		47,54
	0,067	0,099	0,032		47,76
	0,074	0,108	0,034		45,95
	0,083	0,119	0,036		43,37
	0,089	0,126	0,037		41,57
	0,094	0,133	0,039		41,49
0,099	0,139	0,040	40,40
Предложенный способ	0,043	0,106	0,063	0,061	146,51	98,54
	0,049	0,114	0,065		132,65
	0,051	0,123	0,072		141,18
	0,056	0,109	0,053		94,64
	0,062	0,121	0,059		95,16
	0,064	0,130	0,066		103,13
	0,077	0,127	0,050		64,94
	0,083	0,145	0,062		74,70
	0,091	0,160	0,069		75,82
0,097	0,152	0,055	56,70

Таблица 4
Прирост биомассы гречихи
Вариант	Начальная масса каллуса, г	Конечная масса каллуса, г	Прирост биомассы
Абсолютный, г	Средний, г	Абсолютный, %	Средний, %
1	2	3	4	5	6	7
Прототип	0,055	0,120	0,065	0,077	118,18	136,29
	0,046	0,109	0,063		136,96
	0,038	0,108	0,070		184,21
	0,056	0,154	0,098		175,00
	0,052	0,095	0,043		82,69
	0,072	0,179	0,107		148,61
	0,078	0,193	0,115		147,44
	0,074	0,179	0,105		141,89
	0,044	0,094	0,050		113,64
0,049	0,105	0,056	114,28
Предложенный способ	0,077	0,212	0,135	0,103	175,32	176,53
	0,046	0,132	0,086		186,96
	0,063	0,157	0,094		149,20
	0,068	0,196	0,128		188,23
	0,056	0,160	0,104		185,71
	0,060	0,170	0,110		183,33
	0,052	0,138	0,086		165,38
	0,062	0,170	0,108		174,19
	0,047	0,130	0,083		176,59
0,051	0,143	0,092	180,39

Таблица 5
Прирост биомассы сои
Вариант	Начальная масса каллуса, г	Конечная масса каллуса, г	Прирост биомассы
Абсолютный, г	Средний, г	Абсолютный, %	Средний, %
1	2	3	4	5	6	7
Прототип	0,193	0,222	0,029	0,035	15,13	34,52
	0,15	0,178	0,027		18,34
	0,190	0,230	0,040		21,56
	0,117	0,151	0,034		29,42
	0,111	0,152	0,041		37,78
	0,093	0,135	0,042		45,17
	0,074	0,111	0,037		50,29
0,052	0,082	0,030	58,45
Предложенный способ	0,114	0,171	0,057	0,094	50,57	87,40
	0,131	0,213	0,082		62,97
	0,117	0,200	0,083		71,55
	0,135	0,236	0,101		75,47
	0,100	0,179	0,079		79,93
	0,096	0,175	0,079		83,52
	0,127	0,236	0,109		86,61
0,139	0,270	0,131	94,70

Таким образом, в результате реализации предлагаемого способа получения биомассы in vitro была решена проблема увеличения производительности процесса получения биомассы за счет повышения эффективности всех основных стадий этого процесса:

- увеличения эффективности стерилизации с 60% до 90% без применения химических стерилизаторов;

- увеличения в два раза способности неинфицированных эксплантов образовывать каллус;

- увеличения, практически в два раза, получаемой биомассы за счет увеличения прироста на каждом образовавшем каллус неинфицированном экспланте;

- многократное (не менее 10 раз) увеличение эффективности способа, то есть производительности получения конечного продукта - биомассы из заготовленного полевого исходного сырья (нестерилизованных эксплантов).

Технический результат предлагаемого решения выражается в том, что полученные результаты позволяют использовать предложенный способ для промышленного применения, например, при получении биомассы лекарственных растений для последующего экстрагирования или сельскохозяйственных растений для дальнейшего получения оздоровленных растений - регенерантов.

В настоящее время Бийским технологическим институтом Алтайского государственного технического университета ведется подготовка к серийному производству биомассы лекарственных и сельскохозяйственных растений на основе предложенного способа.

Список литературы

1. Патент РФ №2286053.

2. Патент РФ №2279212.

3. Патент РФ №2180165.

4. Патент РФ №2282352.

5. Патент РФ №2222933 (прототип).

6. Хмелев В.Н. Многофункциональные ультразвуковые аппараты и их применение в условиях малых производств, сельском хозяйстве и домашнем хозяйстве / В.Н.Хмелев, О.В.Попова. - Барнаул: изд. АлтГТУ, 1997, - 160 с.

Способ получения биомассы in vitro, включающий заготовку эксплантов из проростков, тканей или клеток, их стерилизацию, помещение эксплантов для каллусообразования и роста биомассы в стерильные пробирки с модифицированной питательной средой Мурасиге-Скуга с добавлением ростовых стимуляторов каллусообразования, термостатирование при температуре 26±1°С и относительной влажности 70%, отличающийся тем, что стерилизацию эксплантов осуществляют в дистиллированной воде воздействием на экспланты ультразвуковыми колебаниями с интенсивностью 1...2 Вт/см² на рабочей частоте 22...44 кГц в течение 3...6 мин, после помещения эксплантов на питательную среду на этапах каллусообразования и роста биомассы пробирки с эксплантами погружают в водную среду и осуществляют через нее воздействие ультразвуковыми колебаниями с интенсивностью не менее 10...15 Вт/см² на частоте 22...44 кГц со стороны дна пробирок с периодичностью не реже 1 раза в сутки в течение не менее 6 мин на каждом этапе.