Высвобождаемые полимерные конъюгаты на основе алифатических биоразлагаемых сшивающих агентов

Описаны активированные полимерные производные бицина, а также полученные с их помощью конъюгаты. Также описаны способы получения и применения производных бицина. 5 н. и 19 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл.

 

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к разветвленным полимерам, применимым для увеличения времени циркуляции биологически активных веществ in vivo. Данное изобретение также относится к конъюгатам, изготовленным с этими полимерами.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Некоторые исходные концепции «прикрепления» пептидов или полипептидов к поли(этиленгликолю) ПЭГ и подобным водорастворимым поли(алкиленоксидам) раскрыты в патенте США № 4179337, описание которого включено здесь в качестве ссылки. Полипептиды, модифицированные этими полимерами, проявляют меньшую иммуногенность/антигенность и циркулируют в кровотоке в течение более длительного времени, чем немодифицированные варианты.

Для конъюгации поли(алкиленоксидов) одну из концевых гидроксильных групп превращают в реакционноспособную функциональную группу. Этот процесс зачастую называют «активацией», а продукт называют «активированным поли(алкиленоксидом)». Другие, по существу неантигенные полимеры, «активизируют» или функционализируют подобным образом.

Активированные полимеры подвергают взаимодействию с терапевтическими агентами, имеющими нуклеофильные функциональные группы, которые служат в качестве области присоединения. Одной нуклеофильной функциональной группой, обычно используемой как область присоединения, являются ε-аминогруппы лизинов. Свободные карбоксильные группы, соответствующим образом активированные карбонильные группы, окисленные углеводородные части молекулы и меркаптогруппы также могут быть использованы в качестве области присоединения.

Инсулин и гемоглобин находятся среди первых конъюгированных терапевтических агентов. Эти сравнительно крупные полипептиды содержат несколько свободных ε-амино областей присоединения. Могло быть присоединено достаточное число полимеров для снижения иммуногенности и увеличения времени циркулирования без значительной потери биологической активности.

Однако было обнаружено, что излишняя конъюгация полимеров и/или конъюгация, вовлекающая терапевтически активные части молекулы, в которых группы связаны с биологической активностью, часто приводит к потере активности и, следовательно, к потере терапевтической эффективности. Это зачастую происходит с пептидами низкой молекулярной массы, которые имеют незначительное число областей присоединения, не связанных с биологической активностью. Многим непептидным лекарственным средствам также не хватает достаточного количества областей присоединения для получения благоприятной модификации полимера.

Одним вариантом преодоления указанных выше проблем является применение более длинных полимеров с большей молекулярной массой. В зависимости от требуемой молекулярной массы, эти вещества могут быть трудными для получения и дорогими для использования. Кроме того, иногда они дают незначительное улучшение по сравнению с более легкодоступными полимерами.

Другим альтернативным предложением является присоединение двух цепей полимера через кольцо триазина к аминогруппам белка. Смотри, например, Enzyme, 26, 49-53 (1981) и Proc. Soc. Exper. Biol. Med., 188, 364-9 (1988). Триазин, однако, является токсичным веществом, содержание которого трудно снизить до приемлемых уровней после конъюгации. Кроме того, триазин представляет собой плоскостную группу и может быть замещен только двойным полимером. Плоская структура жестко фиксирует на месте две цепи полимера. Это ограничивает преимущества полимерной конъюгации примерно до такой же степени, которая достигается при увеличении длины полимерной цепи. Таким образом, полимеры, активированные без участия триазина, внесли бы существенный вклад в уровень техники.

В указанных выше случаях, однако, биологически активные полимерные конъюгаты были получены при наличии по существу устойчивых к гидролизу связей (мостиков) между полимером и исходной биологически активной частью молекулы. Таким образом, были получены долговечные конъюгаты, которые скорее являются постоянно связанными, чем пролекарствами как таковыми (где исходная молекула в конечном итоге высвобождается in vivo).

В общедоступных патентах США №№ 5643575, 5919455 и 6113906 описаны дополнительные усовершенствования, относящиеся к многоцепочечным ПЭГ, имеющим общую точку присоединения к нуклеофилу через алифатический линкер. В отличие от более ранних разветвленных полимерных конъюгатов на основе триазина, алифатические линкеры дают возможность избежать токсического действия триазина, а также дают другие преимущества. Кроме того, с годами также были предложены некоторые способы получения пролекарств. Пролекарства включают в себя химические производные биологически активного исходного соединения, которое, при введении, будет, в конечном счете, высвобождать активное исходное соединение in vivo. Применение пролекарств позволяет изменять начало и/или продолжительность действия биологически активного соединения in vivo. Пролекарства часто представляют собой биологически инертные или по существу неактивные формы исходного или активного соединения. На скорость высвобождения активного лекарственного средства влияет несколько факторов, в том числе скорость гидролиза линкера, который соединяет исходное биологически активное соединение с носителем пролекарства.

Были описаны некоторые пролекарства на основе сложноэфирных или фосфатных связей. В большинстве случаев главным образом сложноэфирный тип связи, используемый для получения пролекарств, обеспечивает t_1/2 для гидролиза вплоть до нескольких дней в водном окружении. Хотя можно было ожидать, что было получено пролекарство, большинство конъюгатов выводится из организма до достижения достаточной степени гидролиза in vivo. Таким образом, было бы предпочтительным предоставить пролекарства, которые имеют связь, дающую возможность более быстрому гидролизу связи полимер-лекарственное средство in vivo с тем, чтобы исходное лекарственное соединение образовывалось быстрее.

Также были описаны пролекарства, основанные на амидных или карбаматных связях. В общем, известно, что амидные связи высокоустойчивы к гидролизу. Однако недавно было обнаружено, что C-концевые амиды ε-аминокислот легко подвергаются гидролизу при 25°C и pH 7,4, когда N-конец N-гидроксиэтилирован одной или двумя гидроксиэтильными группами. Бис N-2-гидроксиэтилглициновый (бициновый) тип молекул является ключом для таких реакций гидролиза. Такие группы бицинового типа недавно были использованы в синтезе пролекарств, смотри общедоступную заявку на выдачу патента США 10/218,167, содержание которой включено здесь в качестве ссылки.

Все еще существует свободное пространство для усовершенствования в области создания пролекарств. Настоящее изобретение относится к такому усовершенствованию.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте данное изобретение относится к соединениям формулы (I):

где R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из по существу неантигенных полимерных остатков, H, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, аралкилов и концевых разветвленных групп, при условии, что R₁ и R₂ оба не являются H;

Z выбран из частей молекулы, активно транспортируемых в клетки-мишени, гидрофобных частей молекулы, бифункциональных связующих частей молекулы и их комбинаций;

Y_1-3 могут быть одинаковыми или различными и выбраны из O, S или NR₁₁;

L₁ и L₂ могут быть одинаковыми или различными бифункциональными линкерами;

R₃-R₁₁, R₂₄ и R₂₅ могут быть одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из водорода, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-19 разветвленных алкилов, C_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, C_2-6 замещенных алкенилов, C_2-6 замещенных алкинилов, C_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 гетероалкилов, замещенных C_1-6 гетероалкилов, C_1-6алкокси, фенокси и C_1-6гетероалкокси;

L₃ и L₄ могут быть одинаковыми или различными и выбраны из:

-C(О)(CR₃₀R₃₁)Y₁₅(CR₃₂R₃₃)C(О)- или

-C(O)(CR₃₀R₃₁)(CR₃₂R₃₃)C(O)-

где Y₁₅ выбран из O, S, NR₃₄ или CH₂, и

R_30-34 могут быть одинаковыми или различными и выбраны из H, алкила, алкенила, алкинила, гетероалкила или арила;

A выбрано из уходящих групп, функциональных групп, биологически активных частей молекулы и OH;

a, b, c, d и e независимо равны 0 или 1,

m, n, o и p независимо представляют собой положительные целые числа,

f и g равны 0 или 1, при условии, что

по меньшей мере одно из (f + a) или (g + c) равняется 2.

Другой аспект данного изобретения включает в себя бифункциональные соединения, образующиеся в тех случаях, когда, по меньшей мере один из (R₁) и (R₂) представляет собой полимерный остаток, включающий в себя как альфа, так и омега концевые связующие группы. В этом аспекте данного изобретения возможно присоединить два эквивалента биологически активного компонента лекарственного средства, белка, полипептида, олигонуклеотида и т.д. к полимерной (предпочтительно ПЭГ) бициновой системе. Пример такого бифункционального полимерного конъюгата проиллюстрирован ниже в виде формул (IIa) и (IIb):

где Z представляет собой где Y₄ представляет собой O, S или NR₁₁ и L₅ представляет собой бифункциональный мостик, а все остальные варианты описаны выше.

Также описаны способы получения соединений по настоящему изобретению и способы лечения с их использованием.

Для целей настоящего изобретения, понятно, что термин «остаток» означает часть соединения, к которому он относится, которая остается после проведения реакции замещения, в которой присоединяется несущая часть полимерного пролекарства.

Для целей настоящего изобретения понятно, что каждый термин «полимерный остаток» или «ПЭГ остаток» означает часть полимера или ПЭГ, которая остается после его реакции с биологически активным соединением.

Для целей настоящего изобретения понятно, что термин «алкил» включает в себя прямые, разветвленные, замещенные, например, гало-, алкокси-, нитро-, C_1-2алкилы, C_3-8 циклоалкилы или замещенные циклоалкилы, и т.д.

Для целей настоящего изобретения, понятно, что «замещенный» включает в себя добавление или замещение одного или более атомов, находящихся в функциональной группе или соединении одним или более различными атомами.

Для целей настоящего изобретения замещенные алкилы включают в себя карбоксиалкилы, аминоалкилы, диалкиламины, гидроксиалкилы и меркаптоалкилы; замещенные алкенилы, в том числе карбоксиалкенилы, аминоалкенилы, диалкениламины, гидроксиалкенилы и меркаптоалкенилы; замещенные алкинилы, в том числе карбоксиалкинилы, аминоалкинилы, диалкиниламины, гидроксиалкинилы и меркаптоалкинилы; замещенные циклоалкилы, в том числе такие части молекулы, как 4-хлорциклогексил; арилы, в том числе такие части молекулы, как нафтил; замещенные арилы, в том числе такие части молекулы, как 3-бром-фенил; аралкилы, в том числе такие части, как толуил; гетероалкилы, в том числе такие части, как этилтиофен; замещенные гетероалкилы, в том числе такие части, как 3-метокси-тиофен; алкокси включает в себя такие части молекулы, как метокси; и фенокси включает в себя такие части молекулы, как 3-нитрофенокси. Понятно, что гало- включает в себя фтор, хлор, йод и бром.

Термин «достаточные количества» для целей настоящего изобретения будет означать количество, при котором достигается терапевтический эффект, в том смысле, как это понимает специалист в данной области.

Для целей настоящего изобретения будет понятно, что «по сути неантигенный» и «по существу неантигенный» включает в себя все полимерные материалы, которые в данной области подразумеваются нетоксичными и не вызывают заметный иммунный ответ у млекопитающих.

Для целей настоящего изобретения будет понятно, что «положительное целое число» будет означать положительное целое число, предпочтительно примерно от 1 до 6, и более предпочтительно 1 или 2.

Одно основное преимущество настоящего изобретения состоит в том, что бициновый линкер дает возможность управлять скоростью гидролиза пролекарства, предпочтительно высвобождая компоненты в чистом виде с различными скоростями in vivo, а также и in vitro. Например, различные бифункциональные части молекулы, в том числе остатки аминокислот или коротких пептидов, могут быть включены как часть любого из L_1-3 для изменения скорости гидролиза пролекарства и/или поступления в клетку, и т.д. in vivo и in vitro.

Другое преимущество данного изобретения состоит в том, что эти целевые соединения, доставляемые посредством полимерной транспортной системы, зачастую демонстрируют заметное увеличение растворимости в воде и продолжительность циркулирования in vivo.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг.1-11 схематически представлены способы получения соединений по настоящему изобретению, которые подробно описаны в описании и примерах.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

A. ФОРМУЛА (I)

В одном варианте осуществления данное изобретение относится к соединениям формулы (I)

где R₁ и R₂ могут быть одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из по существу неантигенных полимерных остатков, H, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, аралкилов и концевых разветвленных групп, при условии, что R₁ и R₂ оба не являются H;

Z выбран из частей молекулы, активно транспортируемых в клетку-мишень, гидрофобных частей молекулы, бифункциональных связующих частей молекулы и их комбинаций;

Y_1-3 могут быть одинаковыми или различными и выбраны из О, S или NR₁₁;

L₁ и L₂ могут быть одинаковыми или различными бифункциональными линкерами; R₃-R₁₁, R₂₄ и R₂₅ могут быть одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из водорода, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-19 разветвленных алкилов, C_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, C_2-6 замещенных алкенилов, C_2-6 замещенных алкинилов, C_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 гетероалкилов, замещенных C_1-6гетероалкилов, C_1-6 алкокси, фенокси и C_1-6 гетероалкокси;

L₃ и L₄ могут быть одинаковыми или различными и выбраны из: -C(O)(CR₃₀R₃₁)Y₁₅(CR₃₂R₃₃)C(O)- или -C(О)(CR₃₀R₃₁)(CR₃₂R₃₃)C(О)-

где Y₁₅ выбран из O, S, NR₃₄ или CH₂, и

R_30-34 могут быть одинаковыми или различными и выбраны из H, алкила, алкенила, алкинила, гетероалкила или арила;

A выбрано из уходящих групп, функциональных групп, биологически активных частей молекулы и OH;

a, b, c, d, и e независимо равны 0 или 1,

m, n, o, и p независимо представляют собой положительные целые числа,

f и g равны 0 или 1, при условии, что

по меньшей мере один из (f + a) или (g + c) равняется 2.

В некоторых предпочтительных аспектах данного изобретения один или более из R₁ и R₂ включает в себя неантигенный полимерный остаток, такой как группа полиэтиленгликоля (ПЭГ). Необязательно, R_1-2 включает в себя кэп-группировку, обозначенную здесь как J. Предпочтительные J группы, используемые для кэппирования полимера, включают в себя такие части молекулы, как OH, NH₂, SH, CO₂H, части C_1-6 алкила, такие как CH₃, и соединения формул (IIIa) и (IIIb):

где все переменные определены ранее.

Другим вариантом осуществления изобретения являются соединения формул IV и V:

гдеа, b, c, d, f и gявляются положительными целыми числами, и все остальные переменные определены выше.

В другом аспекте данного изобретения R₁ и R₂ вместе с атомами, к которым они присоединены, могут образовывать мостиковую структуру, имеющую формулу:

где R_70-80 могут быть одинаковыми или различными и выбраны из водорода, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-19 разветвленных алкилов, C_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, C_2-6 замещенных алкенилов, C_2-6 замещенных алкинилов, C_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 гетероалкилов, замещенных C_1-6 гетероалкилов, C_1-6 алкокси, фенокси и C_1-6гетероалкокси;

n' представляет собой положительное целое число, предпочтительно от примерно 1 до примерно 7, а все остальные переменные определены ранее.

В отношении других переменных, которые составляют формулы настоящего изобретения, в некоторых аспектах данного изобретения предпочтительными являются следующие:

в некоторых аспектах, R₁ и R₂ представляют собой остатки полиалкиленоксида, и, более предпочтительно, остатки полиэтиленгликоля.

В других аспектах R₁ и R₂ представляют собой концевые разветвленные группы, на основе бицина, более подробно описанные ниже, дающие возможность многочисленным ветвлениям полимерных цепей; R₃-R₁₀, и R_24-25 каждый представляет собой водород; a, b, c, d, f, m, n, o и p каждый предпочтительно равны 1;

e предпочтительно равно 0 или 1;

Z представляет собой , как определено выше, или, альтернативно, Z содержит аминокислотный остаток, пептидный остаток, группу, активно транспортируемую в клетку-мишень, гидрофобную или обладающую комбинацией таких свойств, так, что при объединении с биологически активными A группами, образуются пролекарства, которые высвобождаются из бициновой полимерной части формул (I), (II), и т.д. Также смотри общедоступный USSN 09/758,993, содержание которого включено здесь в качестве ссылки.

B. ПО СУЩЕСТВУ НЕАНТИГЕННЫЕ ПОЛИМЕРЫ

Как указано выше, R₁ и R₂ каждый предпочтительно является водорастворимым полимерным остатком, которые предпочтительно являются по существу неантигенными, такие как полиалкиленоксиды (ПАО) и, более предпочтительно, полиэтиленгликоли, такие как mПЭГ. С целью иллюстрации, а не для ограничения, остаточные части R₁ и R₂, содержащие полиэтиленгликоль, могут быть выбраны из:

J-О-(CH₂CH₂О)_x-,

J-О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂C(О)-О-,

J-O-(CH₂CH₂O)_Х-CH₂CH₂NR₁₂-,

J-O-(CH₂CH₂O)_Х-CH₂CH₂SH-,

-OC(О)CH₂-О-(CH₂CH₂0)_x-CH₂C(О)-О-,

-NR₁₂CH₂CH₂-О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂CH₂NR₁₂- и

-SHCH₂CH₂-О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂CH₂SH-.

где x означает степень полимеризации;

R₁₂ выбран из водорода, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенилов, C_2-6 алкинилов, C_3-12 разветвленных алкилов, C_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, C_2-6 замещенных алкенилов, C_2-6 замещенных алкинилов, C_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 гетероалкилов, замещенных C_1-6гетероалкилов, C_1-6 алкокси, фенокси и C_1-6гетероалкокси, и J представляет собой кэп-группировку, описанную выше в отношении формулы II.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления, R_1-2 выбраны из CH₃-О-(CH₂CH₂О)_x-, CH₃-О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂C(О)-О-, CH₃ О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂CH₂NH- и CH₃-О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂CH₂SH-, где x представляет собой положительное целое число, предпочтительно выбранное таким образом, что средняя молекулярная масса составляет от примерно 2000 до примерно 25000 Да. В альтернативных аспектах данного изобретения, молекулярная масса полимера находится в пределах от нескольких сотен до 40000 или более, в зависимости от требований специалиста. ПЭГ главным образом представлен структурой: -О-(CH₂CH₂О)_х-,

а R₁ и R₂ предпочтительно содержат остатки этой формулы.

Степень полимеризации для полимера (x) может составлять от примерно 10 до примерно 2300. Представляет число повторяющихся единиц в полимерной серии и зависит от молекулярной массы полимера. Часть молекулы (J) представляет собой кэпгруппировку, описанную выше, т.е. группу, которая находится на конце полимера, и, в некоторых аспектах, может быть выбрана любая из NH₂, OH, SH, CO₂H, C_1-6 алкилов или других концевых активирующих групп ПЭГ, известных специалистам в данной области.

Также подходят полипропиленгликоли, разветвленные производные ПЭГ, описанные в общедоступном патенте США № 5643575 (патент '575), «звездчатые-ПЭГ» и многолучевые ПЭГ, описанные в каталоге «Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Application», Shearwater Corporation, 2001. Описание любого изложенного ниже включено здесь в качестве ссылки. Ветвление, представленное в патенте '575, дает вторичное или третичное ветвление от бициновой группы, как способ увеличения загрузки полимера биологически активной молекулой или ферментом из одной точки присоединения. Будет понятно, что водорастворимый полимер может быть функционально активирован для присоединения к бифункциональным связующим группам, если требуется, без лишних экспериментальных работ.

Хотя ПАО и ПЭГ могут существенно различаться по средней молекулярной массе, предпочтительно, R₁ и R₂ каждый имеет среднюю молекулярную массу от примерно 2000 до примерно 25000 Да в большинстве аспектов данного изобретения.

Включенные здесь полимерные вещества предпочтительно растворимы в воде при комнатной температуре. Не ограничивающий перечень таких полимеров включает в себя полиалкиленоксидные гомополимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиолы, их сополимеры и их блок-сополимеры, при условии, что сохраняется водорастворимость этих блок-сополимеров.

Еще в одном варианте осуществления и в качестве альтернативы полимерам, основанным на ПАО, R₁ и R₂ каждый необязательно выбран из одного или нескольких по сути неантигенных веществ, таких как декстран, поливиниловые спирты, полимеры на основе углеводов, гидроксипропилметакриламида (HPMA), полиалкиленоксидов, и/или их сополимеров. Смотри также общедоступный патент США № 6153655, содержание которого включено здесь в качестве ссылки. Специалистам в данной области будет понятно, что используют один и тот же тип активации, описанный здесь как для ПАО, так и для ПЭГ. Специалистам в данной области также понятно, что приведенный выше перечень является только иллюстрирующим, и что рассматриваются все полимерные вещества, обладающие описанными здесь свойствами, и что также рассматриваются другие производные полиалкиленоксида, такие как полипропиленгликоли, и т.д.

Полимеры по настоящему изобретению также могут быть сополимеризованы с бифункциональными веществами, такими как поли(алкиленгликоль)диамины, для получения взаимопроникающих полимерных сетей, подходящих для использования в проницаемых контактных линзах, раневых повязках, устройствах для доставки лекарственных средств и подобном. Пространственные ограничения и водорастворимость таких разветвлений могут быть легко определены специалистами в данной области. Предпочтительно, однако, чтобы молекулярная масса полимеров с множественным ветвлением не превышала 80000 дальтон.

C. БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ МОСТИКОВЫЕ ГРУППЫ: L₁, L₂, L₃ и L₄

Во многих аспектах данного изобретения и, в частности, в формуле (I), L₁, L₂, L₃ и/или L₄ представляют собой мостиковые группы, которые облегчают присоединение бицинового производного к полимерным цепям, например, R₁ и/или R₂. Получаемое соединение может быть либо прямым, либо осуществляться через дополнительные соединяющие группы, известные специалистам в данной области. В описании упомянуты другие L_х группы, и понятно, что они могут быть выбраны из тех же групп, что и L₁. В этом аспекте данного изобретения, L₁ и L₂ могут быть одинаковыми или различными, и выбраны из:

-NR₁₉(CR₁₄R₁₅)_tO-

-NR₁₉(CR₁₄R₁₅)_t(CR₁₆CR₁₇О)_qNR₁₉-

-О(CR₁₄R₁₅)_tNR₁₉-

-О(CR₁₄R₁₅)_tO-

-NR₁₉(CR₁₄R₁₅)_tNR₁₉-

-NR₁₉(CR₁₄R₁₅)_t(CR₁₆CR₁₇О)_q-

-NR₁₉(CR₁₆CR₁₇O)_t-

-NR₁₉(CR₁₆CR₁₇О)_t(CR₁₄R₁₅)_qNR₁₉-

-NR₁₉(CR₁₆CR₁₇О)_t-

-O(CR₁₄R₁₅)_t-NR₁₉-

-O(CR₁₄R₁₅)_tNR₁₉-

-O(CR₁₄R₁₅)_tO-

-O(CR₁₆CR₁₇O)_tNR₁₉-

где R₁₄-R₁₇ и R₁₉ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенилов, C_2-6 алкинилов, C_3-19 разветвленных алкилов, C_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, C_2-6 замещенных алкенилов, C_2-6 замещенных алкинилов, C_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_{1 6}гетероалкилов, замещенных C_1-6гетероалкилов, C_1-6алкокси, фенокси и C_1-6гетероалкокси; и

R₁₈ выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенилов, C_2-6 алкинилов, C_3-19 разветвленных алкилов, C_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, C_2-6 замещенных алкенилов, C_2-6 замещенных алкинилов, C_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 гетероалкилов, замещенных C_1-6 гетероалкилов, C_1-6алкокси, фенокси и C_1-6 гетероалкокси, NO₂, галоалкила и галогена; и

t и q каждые представляют отдельно выбранные положительные целые числа, предпочтительно от примерно 1 до примерно 4.

В других аспектах данного изобретения L₁ и/или L₂ могут включать в себя аминокислотный остаток. Аминокислота может быть выбрана из любых известных природных L-аминокислот, например, аланина, валина, лейцина, изолейцина, глицина, серина, треонина, метионина, цистеина, фенилаланина, тирозина, триптофана, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, лизина, аргинина, гистидина, пролина и/или их комбинаций, нескольких, без конкретного указания. В тех случаях, когда L₁ и/или L₂ включают в себя пептид, размеры данного пептида находятся в пределах от примерно 2 до примерно 10 аминокислотных остатков. В другом предпочтительном варианте осуществления данным пептидом является Gly-Phe-Leu-Gly.

Аминокислотные остатки предпочтительно имеют формулу

где X' представляет собой O, S или NR₂₆, Y₅ представляет собой О, S или NR₂₇, а R₂₆, R₂₇ и R₂₈ независимо выбраны из той же группы, которая определяет R₃, но каждый предпочтительно представляет собой H или низший алкил (т.е. C_1-6 алкил); и f представляет собой положительное целое число от примерно 1 до примерно 10, предпочтительно 1.

Производные и аналоги природных аминокислот, а также различные известные в данной области неприродные аминокислоты (D или L), гидрофобные или не гидрофобные, также входят в объем данного изобретения. Только для примера, аналоги аминокислот и производные включают в себя: 2-амино-адипиновую кислоту, 3-аминоадипиновую кислоту, бета-аланин, бета-аминопропионовую кислоту, 2-аминомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, пиперидиновую кислоту, 6-аминокапроновую кислоту, 2-аминогептановую кислоту, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминоизомасляную кислоту, 2-аминопимелиновую кислоту, 2,4-аминомасляную кислоту, десмозин, 2,2-диаминопимелиновую кислоту, 2,3-диаминопропионовую кислоту, н-этилглицин, N-этиласпарагин, 3-гидроксипролин, 4-гидроксипролин, изодесмозин, алло-изолейцин, N-метилглицин, саркозин, N-метилизолейцин, 6-N-метил-лизин, N-метилвалин, норвалин, норлейцин, орнитин и другие, которых слишком много, чтобы упоминать, перечисленные в 63 Федеральном регистре (Fed. Reg.), 29620, 29622, включенные здесь в качестве ссылки.

Например, короткими пептидами являются пептиды, в диапазоне от 2 до примерно 10 или более аминокислотных остатков, упомянутых выше.

Более предпочтительно, L₁ и L₂ могут быть одинаковыми или различными и выбраны из:

-NH(CH₂CH₂)₂О-

-NH(CH₂CH₂)(CH₂CH₂O)NH-

-O(CH₂CH₂)NH-

-O(CH₂CH₂)O-

-NH(CH₂CH₂)NH-

-NH(CH₂CH₂)(CH₂CH₂O)-

-NH(CH₂CH₂O)-

-NH(CH₂CH₂O)(CH₂)NH-

-NH(CH₂CH₂O)₂-

-O(CH₂)₃NH-

-O(CH₂)₃O-

-O(CH₂CH₂O)₂NH-

В другом варианте осуществления данного изобретения L₃ и L₄ могут быть одинаковыми или различными, и выбраны из:

-C(О)CR₃₀R₃₁OCR₃₂R₃₃C(О)-;

-C(О)CR₃₀R₃₁NR₃₄CR₃₂R₃₃C(О)-;

-C(O)CR₃₀R₃₁SCR₃₂R₃₃C(O)-, или

-C(О)(CR₃₀R₃₁)_nC(О)-;

где R_30-34 независимо выбраны из H, C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_1-6 гетероалкила или арила, и

n представляет собой положительное целое число, предпочтительно примерно от 2 до 3.

Предпочтительно, L₃ и L₄ выбраны из

-C(О)CH₂OCH₂C(О)-;

-C(О)CH₂NHCH₂C(О)-;

-C(О)CH₂SCH₂C(О)-;

-C(О)CH₂CH₂CH₂C(О)-, или

-C(О)CH₂CH₂C(О)-.

Основным преимуществом данного изобретения является то, что специалист может контролировать скорость гидролиза или высвобождения биологически активной части молекулы или лекарственного средства из полимерной бициновой платформы. В зависимости от выбранных специфических линкеров, специалист в данной области может модифицировать соединения для управления скоростью гидролиза. Этот предпочтительный аспект изобретения позволяет специалисту регулировать скорость, с которой биологически активная часть молекулы доставляется в намеченную мишень. В тех ситуациях, в которых было бы желательно быстрое высвобождение биологической части молекулы или лекарственного средства, включение линкеров L₃ и L₄ обеспечивает более высокую скорость гидролиза. Напротив, для прежних полимерных платформ на основе бицина, описанных в общедоступной патентной заявке США 10/218,167, где высвобождение данной части молекулы или лекарственного средства из указанной платформы зачастую зависит от условий, таких как pH, или присутствия ферментов, линкеры L₃ и L₄ благодаря нехимерному взаимодействию, способны значительно увеличить скорость, при которой биологически активная часть молекулы или лекарственное средство высвобождается из полимерной платформы независимо от условий рН или присутствия или отсутствия ферментов. В присутствии ферментов, однако, скорость гидролиза будет контролироваться либо нехимерным взаимодействием, когда возможно, либо ферментативными реакциями, которые в любом случае протекают быстрее. Таким образом, скорость гидролиза в высокой степени зависит от типа линкеров, используемых между самой бициновой частью молекулы и ПЭГ-частью. Таким образом, данное изобретение позволяет использовать и постоянные, и высвобождаемые линкеры на любой ветви бициновой части молекулы, при условии, что, по меньшей мере, одна из ветвей включает в себя высвобождаемые части линкеров L₁-L₃ или L₂-L₄.

D. Z ЧАСТИ МОЛЕКУЛЫ И ИХ ФУНКЦИЯ

В одном аспекте данного изобретения Z представляет собой L₅-C(=Y₄), где L₅ представляет собой бифункциональный линкер, выбранный из группы, которая характеризует L₁ и L₂, и Y₄ выбран из тех же групп, которые характеризуют Y_1-3. В этом аспекте данного изобретения группа Z служит в качестве мостика между группой А и остатком бициновой транспортной формы.

В других аспектах данного изобретения Z представляет собой часть молекулы, которая активно транспортируется в клетку-мишень, гидрофобную часть молекулы и их комбинации. Хотя Z предпочтительно является моновалентным, необязательно Z может быть бивалентным или мультивалентным, так, что дает возможность присоединения более чем одной А группы к полимеру на основе бицина. Для достижения активного переноса Z может включать в себя аминокислоту, пептидный остаток или остаток полиамина, например, любой из описанных выше в отношении L₁ и L₂, остаток сахара, остаток жирной кислоты, C_6-18 алкил, замещенный арил, гетероарил, -C(=О), -C(=S) или -C(=NR₂₉), где R₂₉ представляет собой H, низший алкил, и т.д.

Этот аспект данного изобретения в широком смысле основан на том принципе, что биологически активные вещества, подходящие для включения в конъюгаты лекарственного средства с полимером на основе бицина, сами могут быть веществами/соединениями, которые не являются активными после гидролитического высвобождения из композиции, соединенной с бицином, но которые станут активными после прохождения дальнейшего химического процесса/реакции. В этом варианте осуществления терапевтический или диагностический агент, пептид, полипептид и т.д., который доставляется в кровоток посредством полимерной системы на основе бицина, будет оставаться неактивным до проникновения или до активного переноса в интересующую клетку-мишень, где он активируется химическими процессами, протекающими внутри клетки, например ферментом или ферментативной системой, присутствующей в этой ткани или клетке.

Пролекарства по данному аспекту изобретения изготовляют таким образом, что гидролиз полимерного конъюгата на основе бицина, протекающий in vivo, расщепляет конъюгат с высвобождением активного биологического вещества (здесь обозначенного «А») во внеклеточную жидкость, оставаясь связанным с Z-частью. Биологически активные вещества в данном аспекте изобретения предпочтительно, но не исключительно, представляют собой терапевтические и/или диагностические агенты с небольшой молекулярной массой. Например, одна возможная комбинация Z-A представляет собой лейцин-доксорубацин, другая комбинация представляет собой связанный с аминокислотой камптотецин или паклитаксел, а ткань, подвергаемая лечению, представляет собой опухолевую ткань.

Не привязываясь к какой-либо теории или гипотезе, как может работать данное изобретение, считается, что в зависимости от дополнительной части молекулы, выбранной в качестве усилителя переноса, скорость транспорта биологически активного вещества в опухолевые клетки представляется доставкой биологически активного вещества во внеклеточное пространство ткани, например ткани, демонстрирующей эффект EPR, в защищенной форме и/или в форме ускоренного переноса.

Еще в одном варианте усилитель переноса (Z) выбран из известных веществ для транспортной системы клеточных мембран. Только для примера, известно, что клетки активно переносят некоторые питательные вещества и эндокринные факторы, и подобное, и такие питательные вещества, или их аналоги, охотно используют для усиления активного транспорта биологически эффективных веществ в клетки-мишени. Примеры таких питательных веществ включают в себя аминокислотные остатки, пептиды, например короткие пептиды, размер которых находится в пределе от примерно 2 до примерно 10 остатков, или более, простые сахара и жирные кислоты, эндокринные факторы и подобное.

Короткими пептидами, например, являются пептиды в диапазоне от 2 до примерно 10, или более, аминокислотных остатков, как упомянуто выше.В данном варианте осуществления изобретения считается, что таким пептидным ускорителям переноса не нужно быть гидрофобными, но полагают, что они действуют другими путями для усиления захвата и/или защиты соединенных агентов небольшой молекулярной массой от преждевременного гидролиза в системном кровотоке. Например, полагают, что пептидные ускорители переноса, например, такие как, полиаргинин, и другие ускорители переноса сходной молекулярной массы, пространственно препятствуют отщеплению биологически активного агента гидролитическими ферментами плазмы, но затем расщепляются в клетке-мишени под действием различных пептидов и/или протеаз, таких как катепсины.

В некоторых предпочтительных аспектах Z представляет собой гидрофобную часть молекулы. Не привязываясь к какой-либо теории или гипотезе какой вклад вносит гидрофобность в эффективность, считается, что гидрофобная часть ингибирует внеклеточное отщепление усилителя переноса от биологически активного агента, ингибируя воздействие гидролитических ферментов, и т.п., присутствующих во внеклеточном тканевом пространстве, например в плазме. Таким образом, некоторые предпочтительные усилители переноса включают в себя, например, гидрофобные аминокислоты, такие как аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, пролин, фенилаланин, тирозин и триптофан, а также и неприродные производные, такие как γ-аминокислота и ее аналоги, как упомянуто выше.

Еще в одном варианте, ускоритель переноса представляет собой гидрофобную органическую часть молекулы. Только для примера органическая часть представляет собой алкил длиной C_6-18, или более, замещенный арилом или гетероарилом, или незамещенный. Также предполагают, что ускоритель переноса, представленный органической частью, охватывает и включает в себя органические функциональные группы, содержащие, например, -C(=S) и/или -C(=О).

E. ГРУППЫ А ФОРМУЛЫ (I)

1. Уходящие группы

В тех аспектах, где A представляет собой уходящую группу, подходящие части молекулы включают в себя, без ограничения, такие группы, как N-гидроксибензотриазолил, галоген, N-гидроксифталимидил, п-нитрофенокси, имидазолил, N-гидроксисукцинимидил; триазолидинилтион, O-ацилмочевины или

или

другие подходящие уходящие группы будут очевидны специалистам в данной области.

Для целей настоящего изобретения под уходящими группами подразумеваются такие группы, которые способны взаимодействовать с нуклеофилом, находящимся в желаемой мишени, т.е. биологически активной части молекулы, бифункциональном спейсере, промежуточном веществе, и т.д. Данные мишени, таким образом, содержат группу для замещения, как, например, NH₂ группы, находящиеся в белках, пептидах, ферментах, природных или химически синтезированных терапевтических молекулах, таких как доксорубицин, спейсерах, таких как однозамещенные диамины.

Соединения по данному изобретению также могут включать в себя спейсерную группу между бициновой группой и уходящей группой или, если требуется, присоединенным целевым веществом (лекарственным средством). Спейсерная часть молекулы может представлять собой гетероалкил, алкокси, алкил, содержащий до 18 атомов углерода или даже дополнительную полимерную цепь. Спейсерные части молекулы могут быть добавлены с использованием стандартных методик синтеза. Понятно, что эти части молекулы, выбранные для (A), также могут взаимодействовать с другими частями молекулы, помимо биологически активных нуклеофилов.

2. Функциональные группы

«A» также могут быть функциональными группами. Не ограничивающие примеры таких функциональных групп включают в себя малеимидил, винил, остатки сульфона, гидрокси, амино, карбокси, меркапто, гидразид, карбазат и подобные, которые могут быть присоединены к бициновой части через амин-содержащий спейсер. После присоединения к бициновой части функциональная группа (например, малеимид) может быть использована для присоединения бицин-полимера к мишени, такой как остаток цистеина полипептида, аминокислотному или пептидному спейсеру, и т.п.

3. Биологически активные части молекулы

В тех вариантах формулы (I), где A представляет собой остаток соединения, содержащего амин- или гидроксил-. Не ограничивающий перечень таких подходящих соединений включает в себя остатки органических соединений, ферментов, белков, полипептидов и т.д. Органические соединения включают в себя, без ограничения, такие части, как антрациклиновые соединения, включающие даунорубицин, доксорубицин; п-аминоанилиновый иприт, мелфалан, Ara-C (цитозинарабинозид) и родственные антиметаболические соединения, например гемцитабин, и т.п. Альтернативно, данной частью молекулы может быть остаток сердечно-сосудистого средства, содержащего амин или гидроксил, противоопухолевого средства, такого как камптотецин и паклитаксел, противоинфекционного, противогрибкового, такого как нистатин, флуконазол и амфотерицин B, средства для снятия состояния тревоги, желудочно-кишечного средства, средства для активации центральной нервной системы, анальгезирующего, средства для фертильности, средства для контрацепции, противовоспалительного средства, стероидного вещества, вещества и т.п.

В дополнение к вышесказанному биологически активная часть молекулы также может представлять собой остаток фермента, белка, полипептида, олигонуклеотида, моноклональных антител, одноцепочечных антиген-связывающих белков (SCA), таких как, CC49, а также рассматриваются их фрагменты. Подходящие белки включают в себя, но не только, полипептиды, ферменты, пептиды и подобное, имеющие, по меньшей мере, одну доступную группу для присоединения полимера, например, ε-амино, цистинилтио, N-концевую аминогруппу, включают в себя вещества, обладающие физиологическими или фармакологическими действиями, а также вещества, способные катализировать реакции в органических растворителях.

Представляющие интерес белки, полипептиды и пептиды, включают в себя, но не ограничиваются, гемоглобин, сывороточные белки, такие как факторы крови, в том числе факторы VII, VIII и IX; иммуноглобулины, цитокины, такие как интерлейкины, т.е. с IL-1 по IL-13, и т.п., α, β и γ интерфероны, колониестимулирующие факторы, в том числе, гранулоцитарные колониестимулирующие факторы, тромбоцитарные факторы роста и белок, активирующий фосфолипазу (PLAP). Другие белки, в основном представляющие биологический и терапевтический интерес, включают в себя инсулин, растительные белки, такие как лектины и рицины, факторы некроза опухоли и родственные им белки, факторы роста, такие как трансформирующие факторы роста, такие как TGFα или TGFβ и эпидермальные факторы роста, гормоны, соматомедины, эритропоэтин, пигментарные гормоны, гипоталамические релизинг-факторы, антидиуретические гормоны, пролактин, хориоидный гонадотропин, фолликулостимулирующий гормон, тиреотропный гормон, тканевой активатор плазминогена, и подобное. Представляющие интерес иммуноглобулины включают в себя IgG, IgE, IgM, IgA, IgD и их фрагменты.

Некоторые белки, такие как интерлейкины, интерфероны и колониестимулирующие факторы, также существуют в негликозилированной форме, обычно как результат применения рекомбинантных технологий. Негликозилированные варианты также находятся среди белков настоящего изобретения.

Ферменты, представляющие интерес, включают в себя углевод-специфичные ферменты, протеолитические ферменты, оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы. Не ограничиваясь конкретными примерами, примеры ферментов, представляющих интерес, включают в себя аспарагиназу, аргиназу, аргининдезаминазу, аденозиндезаминазу, супероксиддисмутазу, эндотоксиназы, каталазы, химотрипсин, липазы, уриказы, аденозиндифосфатазу, тирозиназы и билирубиноксидазу. Представляющие интерес углевод-специфичные ферменты включают в себя глюкозоксидазы, глюкодазы, галактозидазы, глюкоцереброзидазы, глюкоуронидазы и т.п.

Здесь включена также любая часть биологического полимера, демонстрирующего биологическую активность in vivo. Эта часть включает в себя аминокислотные последовательности, нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК), пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК), фрагменты антител, одноцепочечные связывающие белки, смотри, например, патент США № 4946778, описание которого включено здесь в качестве ссылки, связывающие молекулы, включающие в себя слитые антитела или фрагменты, поликлональные антитела, моноклональные антитела и каталитические антитела.

Белки или их части могут быть получены или выделены с использованием методик, известных специалистам в данной области, таких как культуры тканей, экстракция из источников животного происхождения, или методиками рекомбинантных ДНК. Рассматриваются также источники трансгенных белков, полипептидов, аминокислотных последовательностей и подобные. Такие вещества получают из трансгенных животных, т.е. мышей, свиней, коров, и т.п., у которых указанные белки выделяются в молоко, кровь или ткани. Трансгенные насекомые и бакуловирусные системы экспрессии также рассматриваются в качестве источников. Более того, мутантные варианты белков, такие как мутантные интерфероны, также входят в объем данного изобретения.

Другими белками, представляющими интерес, являются аллергенные белки, такие как амброзия, антиген E, пчелиный яд, клещевой аллерген, и подобное. Вышесказанное является иллюстрацией белков, подходящих для настоящего изобретения. Понятно, что эти белки, определенные здесь, не упомянутые особо, но имеющие доступную аминогруппу, также подразумеваются и входят в объем настоящего изобретения.

В предпочтительном аспекте данного изобретения амино- или гидроксил-содержащее соединение, представляет собой биологически активное соединение, которое подходит для медицинского или диагностического использования при лечении животных, например млекопитающих, в том числе людей, для состояний, при которых требуется такое лечение. Подразумевается, что вышеуказанный перечень является иллюстрирующим и не ограничивающим для соединений, которые могут быть модифицированы. Для специалистов в данной области будет очевидно, что другие такие соединения/композиции могут быть изменены подобным образом без проведения излишних экспериментальных работ. Понятно, что биологически активные вещества, не упомянутые отдельно, но имеющие подходящие группы присоединения, также предусмотрены и входят в объем настоящего изобретения.

Единственным ограничением в отношении типа амино- или гидроксил-содержащих молекул, подходящих для включения в данное изобретение, является наличие доступного, по меньшей мере, одного (первичного или вторичного) амина- или гидроксила, который может вступать в реакцию и связываться с полимерным конъюгатом, и отсутствие значительной потери биологической активности после высвобождения и регенерации исходного соединения системой пролекарства.

F. СИНТЕЗ БИЦИН-СВЯЗАННЫХ ПОЛИМЕРОВ

Синтез конкретных полимеров на основе бицина изложен в Примерах. Обращаясь к Фиг.1, с целью иллюстрации, один предпочтительный способ включает в себя:

1) взаимодействие заблокированного бифункционального линкера с ангидридом, таким как, например, дигликолевый ангидрид, с образованием заблокированного бифункционального спейсера, такого как:

2) присоединение заблокированного бифункционального спейсера к каждому гидроксилу кислой защищенной молекуле бицина такой как:

где tBu представляет собой защитную группу, а все остальные переменные такие же как указано ранее для формулы (I)

3) разблокирование полученного в результате промежуточного соединения и его взаимодействие с активированным полимером, таким как PNP-ПЭГ или SC-ПЭГ в основных условиях взаимодействия,

4) снятие защиты с бициновой кислоты и последующее активирование данной кислоты подходящей активирующей группой, такой как тиазолидинилтион, в условиях связывания.

Будет понятно, что другие, известные в данной области защитные группы, могут быть использованы вместо t-Bu. Активированный ПЭГ или полимерное производное бицина теперь способно вступать в реакцию и конъюгироваться с лекарственным средством, пептидом, спейсером и т.п.

Не ограничивающий перечень подходящих агентов связывания включает в себя 1,3-диизопропил-карбодиимид (DIPC), любой подходящий диалкилкарбодиимид, 2-гало-1-алкил-пиридиний галиды (реактивы Mukaiyama), 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид (EDC), циклический ангидрид пропанфосфоновой кислоты (PPACA) и фенилдихлорфосфаты, и т.д., доступные, например, из коммерческих источников, таких как Sigma-Aldrich Chemical, или синтезированные с использованием известных технологий.

Предпочтительно, заместители вступают в реакцию в инертном растворителе, таком как тетрагидрофуран (THF), ацетонитрил (CH₃CN), метиленхлорид (DCM), хлороформ (CHCl₃), диметилформамид (DMF) или их смеси. Подходящие основания включают в себя диметиламинопиридин (DMAP), диизопропилэтиламин, пиридин, триэтиламин, KOH, калий t-бутоксид и NaOH и т.п. Обычно реакции проводят при температуре от примерно 0°C до примерно 22°C (комнатная температура).

Альтернативный способ получения производных бицина включает в себя:

1) взаимодействие одного эквивалента удлиненного заблокированного бифункционального линкера с одним эквивалентом кислотной защищенной бициновой частью молекулы с получением производного, такого как:

где tBu представляет собой защитную группу, а все остальные переменные такие же, как указано ранее для формулы (I).

2) разблокирование полученного в результате промежуточного соединения и его взаимодействие с активированным полимером, таким как PNP-ПЭГ или SC-ПЭГ при основных условиях связывания,

3) снятие защиты с бициновой кислоты и последующее активирование данной кислоты подходящей активирующей группой, такой как тиазолидинилтион, в условиях связывания.

Еще в одном способе получения производных бицина:

1) сначала удлиненный заблокированный бифункциональный линкер вступает в реакцию с кислым защищенным бициновым промежуточным соединением с образованием:

2) затем второй блок-бифункциональный линкер вступает в реакцию с промежуточным соединением стадии 1 с образованием:

3) затем полученное выше результирующее промежуточное соединение разблокируют и подвергают взаимодействию с активированным полимером, таким как PNP-ПЭГ или SC-ПЭГ в основных условиях связывания,

4) наконец, с бициновой кислоты снимают защиту, а затем активируют подходящей активирующей группой, такой как тиазолидинилтион, в условиях связывания.

Независимо от выбранного способа, некоторые предпочтительные соединения, которые получаются в результате описанных здесь методик синтеза, включают в себя:

где А1 представляет собой уходящую группу, такую как:

или другие уходящие группы, такие как описаны выше в разделе E 1.

Взаимодействие бицин-активированных полимеров с подходящей мишенью приводит в результате к трансформации активированного полимера в конъюгаты, превращая А₁ в А₂, где А₂ представляет собой остаток биологически активной части молекулы, спейсера и т.п.

G. МНОЖЕСТВЕННАЯ ЗАГРУЗКА ПОЛИМЕРА

Еще в одном аспекте данное изобретение относится к многоразветвленным полимерным соединениям на основе бицина. В частности, основное производное бицина дополнительно модифицируют с целью включения в него одной или более концевых групп ветвления. Предпочтительно, концевые группы ветвления представляют собой группы формулы:

где Y₅ представляет собой O, S или NR₄₆;

L₆ представляет собой бифункциональный линкер, выбранный из той же группы, которая определяет L₁;

L₈ представляет собой бифункциональный линкер, выбранный из той же группы, которая определяет L₃;

R₄₀-R₄₆ могут быть одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из водорода, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-19 разветвленных алкилов, C_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, C_2-6 замещенных алкенилов, C_2-6 замещенных алкинилов, C_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 гетероалкилов, замещенных C_1-6гетероалкилов, C_1-6алкокси, фенокси и C_1-6гетероалкокси;

j, j', k и k' каждый независимо равен 0 или положительному целому числу;

q равно 0 или 1;

u, h, v и w независимо выбранные положительные целые числа;

R₅₀ выбран из группы, состоящей из по существу неантигенных полимерных остатков, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, аралкилов, и

где L₇ представляет собой бифункциональный линкер, выбранный из той же группы, которая определяет L₁;

L₉ представляет собой бифункциональный линкер, выбранный из той же группы, которая определяет L₃;

R₆₀ выбран из группы, состоящей из по существу неантигенных полимерных остатков, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, аралкилов, а все остальные переменные определены выше.

Полученные в результате разветвленные производные бицина имеют структуру, представленную в формуле:

где все переменные уже определены выше.

Как показано ниже и в примерах, промежуточное соединение производного бицина, содержащее заблокированный первичный амин, вступает в реакцию с двумя эквивалентами активированного бицинового полимера с образованием бициновой полимерной системы, содержащей до четырех цепей полимера, которые соединяются в одной точке присоединения на биологически активной молекуле, ферменте, мишени и т.п. Этот процесс можно повторять до образования восьмицепочечного производного путем взаимодействия двух эквивалентов полимерного производного бицина с четырьмя цепями, описанного выше, с одним эквивалентом блокированного первичного аминного производного бицина.

H. ДИАГНОСТИКА IN VIVO

Еще один аспект данного изобретения относится к конъюгатам по изобретению, необязательно полученных с диагностической меткой, связанной с описанным выше усилителем переноса, где метку выбирают для целей диагностики или визуализации. Таким образом, подходящую метку получают путем связывания любой подходящей части молекулы, например, аминокислотного остатка, с любым стандартизованным излучающим изотопом, рентгеноконтрастной меткой, магнитно-резонансной меткой или другими нерадиоактивными метками, подходящими для магнитно-резонансной визуализации, метками флуоресцентного типа, метками, проявляющими видимые цвета и/или способными флуоресцировать при ультрафиолетовой, инфракрасной или электрохимической стимуляции, для возможности визуализации опухолевой ткани во время хирургических вмешательств, и т.д. Необязательно, диагностическую метку включают в конъюгированную терапевтическую часть молекулы, или связывают с ней, давая возможность проводить мониторинг распределения терапевтического биологически активного вещества в организме пациента животного или человека.

Еще в одном варианте изобретения меченые конъюгаты по изобретению можно легко получить способами, известными в данной области, с подходящей меткой, в том числе, например, радиоизотопными метками. Только для примера, они включают в себя ¹³¹Иод, ¹²⁵Иод, ^99mТехнеций и/или ¹¹¹Иод для получения радиоиммуносцинтиграфических агентов для селективного захвата опухолевыми клетками in vivo. Например, в области техники существует ряд способов связывания пептида с Tc-99m, в том числе, просто для примера, показанные в патентах США №№ 5328679; 5888474; 5997844 и 5997845, включенные здесь в качестве ссылки.

Приблизительно, для анатомической локализации опухолевой ткани в организме пациента, конъюгированную метку вводят в организм пациента или животного с подозрением на наличие опухоли. Через промежуток времени, достаточный для локализации меченого иммуноглобулина в месте (местах) расположения опухоли, регистрируют сигнал, подаваемый меткой, например, визуально, рентгеновской радиографией, компьютерной томографией, ЯМР-томографией, инструментальным выявлением люминесцентной метки, фотосканирующим устройством, таким как гамма-камера или любым другим способом или прибором, в соответствии с природой выбранной метки.

Обнаруженный сигнал затем преобразуют в изображение или анатомически и/или физиологически определяют размер опухоли. Изображение делает возможным определить местоположение опухоли in vivo и разработать соответствующую тактику лечения. В этих вариантах осуществления изобретения меченая часть молекулы сама по себе является терапевтическим средством, определяемый сигнал предоставляет данные о локализации во время лечения, обеспечивая основу для последующих диагностических и терапевтических вмешательств.

I. СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ

Другой аспект настоящего изобретения относится к способам лечения различных состояний млекопитающих. Данные способы включают в себя введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества пролекарства, такого как конъюгат доксорубицин-бицин, связанный с ПЭГ, полученный, как описано здесь. Данные композиции эффективны, среди прочего, для лечения опухолевого заболевания, снижения массы опухоли, профилактики метастазирования опухолей и профилактики рецидивов роста опухоли/новообразования у млекопитающего.

Количество вводимого пролекарства будет зависеть от исходной молекулы, например, пептида, полипептида, белка, фермента и т.п., заключенной в нем. Главным образом, количество пролекарства, используемого в способах лечения, составляет такое количество, при котором эффективно достигается желаемый терапевтический результат у млекопитающих. Естественно, дозы различных соединений пролекарства будут в некоторой степени варьировать в зависимости от исходного соединения, скорости гидролиза in vivo, молекулярной массы полимера и т.д. Специалист в данной области определит оптимальную дозу пролекарства, выбранную исходя из клинического опыта и терапевтических показаний. Конкретные дозы будут очевидны для специалиста без проведения излишних экспериментальных работ.

Композиции по настоящему изобретению могут быть включены в одну или несколько фармацевтических композиций для введения млекопитающим. Фармацевтические композиции могут быть в форме раствора, суспензии, таблетки, капсулы или подобного, полученные в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Предполагается также, что такие композиции можно вводить пероральным и/или парентеральным путем, в зависимости от желания специалиста. Раствор и/или суспензия данной композиции может быть использован, например, в качестве носителя для инъекции или инфильтрации данной композиции любыми способами, известными в данной области, например, внутривенной, внутримышечной, подкожной инъекцией и подобным.

Такое введение также можно осуществить путем инфузии в пространство или полость тела, а также ингаляционным и/или интраназальным путем. В предпочтительных аспектах данного изобретения, однако, пролекарства вводят парентерально млекопитающему, нуждающемуся в этом.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры служат для дальнейшего понимания изобретения, но не для какого-либо ограничения фактического объема данного изобретения. Подчеркнутые и выделенные жирным шрифтом номера, указанные в данных Примерах, соответствуют номерам, показанным на Фиг. с 1 по 11.

Общие методики. Все реакции проводили в атмосфере азота или аргона. Коммерческие реактивы использовали без дополнительной очистки. Все соединения ПЭГ сушили под вакуумом или азеотропной дистилляцией из толуола перед использованием. Спектры ЯМР получали, используя Varian Mercury®300 ЯМР спектрометр и дейтерированный хлороформ в качестве растворителя, если не оговорено особо. Химические сдвиги (δ) представлены в частях на миллион (ppm) слабого поля из тетраметилсилана (TMS).

Метод ВЭЖХ. Реакционные смеси и чистота промежуточных соединений и конечных продуктов контролировали с помощью устройства Beckman Coulter System Gold® HPLC, используя колонку ZOBAX® 300 SB C-8 с обращенной фазой (150x4,6 мм) или колонку Phenomenex Jupiter® 300A C18 с обращенной фазой (150x4,6 мм) с многоволновым УФ-детектором, используя градиент 30-90% ацетонитрила в 0,5% трифторуксусной кислоте (TFA) со скоростью потока 1 мл/мин.

ПРИМЕР 1

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (1)

К раствору ди-трет-бутилдикарбоната (15 г, 86 ммоль) в 1,4-диоксане (150 мл), охлажденном до 5°C на ледяной бане, добавляли по каплям раствор 2,2'-(этилендиокси)бис(этиламин) (25,85 г, 174,4 ммоль) в 1,4-диоксане (100 мл) в течение 1 ч. Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение еще двух часов. Растворитель удаляли под пониженным давлением, и остаток растворяли в метиленхлориде (DCM, 150 мл), промывали водой (3 x 150 мл), сушили (MgSO₄), фильтровали, и растворитель выпаривали под пониженным давлением с получением на выходе соединения 1 (13,84 г, 68,8 ммоль, 80%). ¹³C ЯМР (75,5 МГц, CDCl₃) δ, 115,76, 79,03, 73,45, 70,12, 40,31, 28,39.

ПРИМЕР 2

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (3)

Раствор соединения 1 (3,0 г, 12,1 ммоль), дигликолевого ангидрида (2, 1,26 г, 10,9 ммоль), и DMAP (1,4 г, 11,5 ммоль) в безводном DCM (30 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Смесь промывали, используя 0,1 н. HCl (30 мл), и органический слой сушили (безводным сульфатом натрия), фильтровали, и растворитель удаляли под пониженным давлением с получением на выходе соединение 3 (1,5 г, 4,14 ммоль, 38%). ¹³C ЯМР (75,5 МГц, CDCl₃) δ, 173,37, 171,27, 169,94, 169,59, 157,81, 155,96, 81,15, 79,30, 71,78-68,76 (м), 41,59, 40,13, 38,94, 38,73, 28,27.

ПРИМЕР 3

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (6)

Раствор соединения 4 (24,0 г, 0,228 моль) и 5 (12,0 г, 0,061 моль) в безводном метиленхлориде (DCM, 400 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Реакционную смесь промывали водой (4 x 150 мл), и органический слой сушили над безводным сульфатом натрия, с последующей фильтрацией и удалением растворителя in vacuo с получением на выходе соединения 6 (6,1 г, 0,0279 моль, 46%). ¹³C ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) δ, 172,1, 81,4, 59,5, 57,0, 56,3, 27,8.

ПРИМЕР 4

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (7)

К раствору соединения 3 (0,5 г, 1,37 ммоль), 6 (0,090 г, 0,41 ммоль), DMAP (0,46 г, 3,8 ммоль), и трифлата скандия (0,04 г, 0,023 ммоль) в безводном DCM (10 мл), охлажденном до 0°C, добавляли EDC (0,35 г, 1,8 ммоль). Смесь оставляли на ледяной бане до нагревания до комнатной температуры в течение ночи. Данную смесь промывали водой, а затем 0,1 н. HCl. Органический слой сушили (безводным сульфатом натрия), фильтровали, и растворитель удаляли под пониженным давлением с получением соединения 7 (0,37 г, 0,41 ммоль, ˜100%).

¹³C ЯМР (75,5 МГц, CDCl₃) δ, 170,15, 169,38, 168,64, 155,73, 81,23, 79,05, 70,95, 69,86, 69,58, 68,33, 67,55, 63,18, 53,09, 52,85, 40,31, 38,59, 28,37, 28,14.

ПРИМЕР 5

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (8)

К раствору соединения 7 (0,38 г, 0,42 ммоль) в DCM (8 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (TFA, 2 мл) и раствор перемешивали в течение 15 минут при комнатной температуре, с последующим удалением растворителя под пониженным давлением с получением соединения 8 (0,38 г, 0,42 ммоль, ˜100 %). Структуру соединения 8 подтверждали с помощью¹³C ЯМР.

ПРИМЕР 6

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (10)

Готовили раствор соединения 8 (0,38 г, 0,42 ммоль) и DMAP (0,16 г, 1,3 ммоль) в безводном DCM (30 мл), 22 мл которого сначала добавляли к раствору соединения 9 (8,0 г, 0,66 ммоль) в DCM (30 мл). Полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов с последующим добавлением оставшегося раствора соединения 8 и перемешивали в течение еще 12 часов. Растворитель частично удаляли под пониженным давлением и продукт осаждали этиловым простым эфиром, фильтровали и остаток выкристаллизовывали из 2-пропанола (IPA, 160 мл) с получением на выходе соединения 10 (7,8 г, 0,63 ммоль, 95%). ¹³C ЯМР (75,5 МГц, CDCl₃) δ, 169,82, 169,10, 168,32, 155,87, 80,85, 71,51-67,28 (ПЭГ), 63,48, 62,88, 58,61, 55,80, 52,55, 40,44, 38,26, 27,88.

ПРИМЕР 7

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (11)

Раствор соединения 10 (6,7 г, 0,27 ммоль) в DCM (68 мл) и TFA (34 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 15 часов с последующим частичным удалением растворителя под пониженным давлением. Продукт осаждали этиловым простым эфиром, фильтровали, и промывали этиловым простым эфиром с получением на выходе соединения 11 (6,7 г, 0,27 ммоль, ˜100%). ¹³C ЯМР (75,5 МГц, CDCl₃) δ, 169,04, 168,67, 168,37, 155,94, 71,51-68,04 (ПЭГ), 63,48, 62,71, 58,59, 55,07, 52,84, 40,43, 38,23.

ПРИМЕР 8

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (12)

Раствор соединения 11 (6,9 г, 0,27 ммоль), 2-меркаптотиазолина (0,10 г, 0,84 ммоль), и DMAP (0,136 г, 1,12 ммоль) в DCM (70 мл) охлаждали до 0°C, с последующим добавлением EDC (0,16 г, 0,84 ммоль). Данной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 12 часов. Растворитель частично удаляли под пониженным давлением и продукт осаждали этиловым простым эфиром, фильтровали, и выкристаллизовывали из IPA (140 мл) с получением на выходе соединения 12 (6,0 г, 0,23 ммоль, 87%). ¹³C ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) δ, 201,05, 172,52, 169,10, 168,31, 155,85, 71,51-67,11 (ПЭГ), 63,46, 63,08, 60,47, 58,58, 55,33, 52,55, 40,44, 38,28, 28,71.

ПРИМЕР 9

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (13)

К раствору соединения 12 (2,0 г, 0,089 ммоль) и доксорубицин гидрохлорида (0,103 г, 0,179 ммоль) в смеси DCM/DMF (20 мл/20 мл) добавляли DMAP (0,043 г, 0,35 ммоль). Данную смесь перемешивали в атмосфере азота в течение 18 часов с последующим частичным удалением растворителя под пониженным давлением. Производное ПЭГ осаждали этиловым простым эфиром, собирали фильтрованием и дважды выкристаллизовывали из DMF/IPA (8 мл/32 мл) с получением на выходе соединения 13 (1,6 г, 0,065 ммоль, 73%). ¹³C ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) δ, 313,32, 186,56, 186,18, 169,50, 168,93, 168,55, 160,58, 155,99, 155,85, 155,23, 135,38, 135,05, 133,46, 133,28, 120,47, 119,39, 118,17, 111,14, 110,93, 100,54, 72,0-69,0 (ПЭГ), 68,01, 65,17, 63,67, 62,65, 58,68, 56,41, 54,07, 40,54, 38,40, 35,51, 33,56, 29,73, 16,69.

ПРИМЕР 10

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (15)

Раствор соединения 14 (3,0 г, 12,1 ммоль), 2 (1,26 г, 10,9 ммоль), и DMAP (1,4 г, 11,5 ммоль) в безводном DCM (30 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. Смесь промывают, используя 0,1 н. HCl (30 мл), и органический слой сушат (безводным сульфатом натрия), фильтруют, и растворитель удаляют под пониженным давлением с получением на выходе соединения 15. Структуру соединения 15 подтверждают с помощью ¹³C ЯМР.

ПРИМЕР 11

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (16)

К раствору соединения 15 (0,5 г, 1,37 ммоль), 6 (0,090 г, 0,41 ммоль), DMAP (0,46 г, 3,8 ммоль), и трифлата скандия (0,04 г, 0,023 ммоль) в безводном DCM (10 мл), охлажденном до 0°C, добавляют EDC (0,35 г, 1,8 ммоль). Смесь оставляют на ледяной бане до нагревания до комнатной температуры в течение ночи. Эту смесь промывают водой, а затем 0,1 н. HCl. Органический слой сушат (безводным сульфатом натрия), фильтруют, и растворитель удаляют под пониженным давлением с получением соединения 16. Структуру соединения 16 подтверждают, используя ¹³C ЯМР.

ПРИМЕР 12

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (17)

Соединение 17. К раствору соединения 16 (0,38 г, 0,42 ммоль) в DCM (8 мл) добавляют трифторуксусную кислоту (TFA, 2 мл), и раствор перемешивают в течение 15 минут при комнатной температуре, с последующим удалением растворителя под пониженным давлением с получением соединения 17. Структуру соединения 17 подтверждают, используя ¹³C ЯМР.

ПРИМЕР 13

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (18)

Готовят раствор соединения 17 (0,38 г, 0,42 ммоль) и DMAP (0,16 г, 1,3 ммоль) в безводном DCM (30 мл), 22 мл которого сначала добавляют к раствору 9a (8,0 г, 0,66 ммоль) в DCM (30 мл). Полученную в результате смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 часов с последующим добавлением оставшегося раствора соединения 18 и перемешивают в течение еще 12 часов. Растворитель частично удаляют под пониженным давлением и продукт осаждают этиловым простым эфиром, фильтруют, и остаток выкристаллизовывают из 2-пропанола (IPA, 160 мл) с получением на выходе соединения 18. Структуру соединения 18 подтверждают, используя ¹³C ЯМР.

ПРИМЕР 14

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (19)

Раствор соединения 18 (6,7 г, 0,27 ммоль) в DCM (68 мл) и TFA (34 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 15 часов, с последующим частичным удалением растворителя под пониженным давлением. Продукт осаждают этиловым простым эфиром, фильтруют и промывают этиловым простым эфиром с получением на выходе соединения 19. Структуру соединения 19 подтверждают с помощью ¹³C ЯМР.

ПРИМЕР 15

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (20)

Раствор соединения 19 (6,9 г, 0,27 ммоль), 2-меркаптотиазолина (0,10 г, 0,84 ммоль), и DMAP (0,136 г, 1,12 ммоль) в DCM (70 мл) охлаждают до 0°C с последующим добавлением EDC (0,16 г, 0,84 ммоль). Смеси дают нагреться до комнатной температуры и перемешивают в течение 12 часов. Растворитель частично удаляют под пониженным давлением и продукт осаждают этиловым простым эфиром, фильтруют и выкристаллизовывают из IPA (140 мл) с получением на выходе соединения 20. Структуру соединения 20 подтверждают с помощью ¹³C ЯМР.

ПРИМЕР 16

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ (21)

Соединение 21. К раствору соединения 20 (2,0 г, 0,089 ммоль) и доксорубицин гидрохлорида (0,103 г, 0,179 ммоль) в смеси DCM/DMF (20 мл/20 мл) добавляют DMAP (0,043 г, 0,35 ммоль). Эту смесь перемешивают в атмосфере азота в течение 18 часов с последующим частичным удалением растворителя под пониженным давлением. Производное ПЭГ осаждают этиловым простым эфиром, собирают фильтрованием и дважды выкристаллизовывают из DMF/IPA (8 мл/32 мл) с получением на выходе соединения 21. Структуру соединения 21 подтверждают, используя ¹³C ЯМР.

ПРИМЕР 17

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ 26

Соединение 26 получают в условиях, подобных условиям получения соединения 18.

ПРИМЕР 18

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ 29

Соединение 29 получают в условиях, подобных условиям получения соединения 21.

ПРИМЕР 19

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ 35

Соединение 35 может быть получено в условиях, подобных условиям получения соединения 13, за исключением того, что в реакцию вступает только один эквивалент соединения 3 и один эквивалент соединения 6.

ПРИМЕР 20

СИНТЕЗ СОЕДИНЕНИЯ 43

Соединение 43 может быть получено в условиях, подобных условиям получения соединения 13, за исключением того, что сначала один эквивалент соединения 3 взаимодействует с одним эквивалентом соединения 6, с образованием соединения 36. Затем один эквивалент соединения 36 взаимодействует с одним эквивалентом соединения 37 с образованием соединения 38. Остальные условия реакции являются такими же, с получением соединения 43.

ПРИМЕР 21

КОНЪЮГАЦИЯ БЕЛКА

Материалы и методы

Лизоцим белка куриного яйца (EC 3.2.1.17), лизоцим бактериального субстрата (Micrococcus lysodeikticus), иPBS буфер (10 мМ фосфат, pH 7,4, 138 мМ NaCl, и 2,7 мМ KCl) приобретали на фирме Sigma Inc. (St. Louis, MO). Трис-глицин SDS гель для электрофореза промышленного производства и рабочий буфер получали от фирмы Invitrogen (Carlsbad, CA). Плазму крыс, используемую для определения гидролиза конъюгатов in vitro, обрабатывали в EDTA и хранили замороженной. IL-2 приобретали на фирме PeproTech (Princeton, NJ), а GFP приобретали на фирме Clontech (Palo Alto, CA). Все измерения in vivo проводили трижды, а стандартное отклонение ±5 % было установлено для измерений in vitro.

Получение единичных конъюгатов ПЭГ-лизоцим

Лизоцим куриных яиц имеет молекулярную массу 14500 и 6 остатков лизина. При быстром перемешивании активированный порошкообразный ПЭГ, при молярном соотношении в реакции 1:1 (ПЭГ:лизоцим), добавляли к раствору лизоцима 5 мг/мл в 0,1 M фосфатном буфере, pH 7,3. После перемешивания в течение 45 мин при 25°C, реакционную смесь обрабатывали 0,2 M фосфатом натрия (pH 5,1) до конечного значения pH 6,5. Реакционную смесь подвергали диализу против 20 мМ фосфата натрия, pH 5,1, при 4°C, используя мембранный фильтр с границей пропускания молекулярной массы 6000-8000. Проводимость образца после диализа должна составлять менее 2 мСм. Выделение единичного конъюгата ПЭГ-лизоцим проводили на катион-обменной колонке (Poros, HS) с использованием системы растворителей 20 мМ фосфата натрия с pH 5,1 с градиентом NaCl. Пик единичного конъюгата ПЭГ-лизоцим собирали и концентрировали с использованием «ultrafree» фильтровальной центрифуги с мембраной 10k NMWL (Millipore Corp., Bedford, MA). Выход очищенного единичного коъюгата ПЭГ-лизоцим составил примерно 20-30%.

Получение множественных конъюгатов ПЭГ-лизоцим

При быстром перемешивании активированный ПЭГ линкер с молярным соотношением в реакции 30:1 (ПЭГ:лизоцим) добавляли к раствору лизоцима 5 мг/мл в 0,1 M фосфатном буфере, pH 7,3. После перемешивания в течение 45 мин при комнатной температуре реакционную смесь обрабатывали 0,2 M фосфатом натрия (pH 5,1) до конечного значения pH 6,5. Реакционную смесь разводили H₂O и разделяли на колонке Hiload Superdex 200 со скоростью 1 мл/мин. Колоночный буфер содержит 20 мМ фосфат натрия (pH 6,8) и 140 мМ NaCl. Фракции пика собирали и концентрировали с использованием «ultrafree» фильтровальной центрифуги с мембраной 30k NMWL (Millipore Corp., Bedford, MA). Выход очищенного множественного конъюгата ПЭГ-лизоцим составил примерно 85%, а число ПЭГ на молекулу лизоцима по данным флуориметрического анализа составило 5-6.

Определение концентрации

Концентрацию конъюгата ПЭГ-лизоцим определяли с помощью УФ используя коэффициент экстинкции 2,39 мл/мг.см при 280 нм в 0,1 M фосфате натрия, pH 7,3.

Анализ ферментативной активности лизоцима

В условиях проведения реакции, упомянутых выше, активность лизоцима исчезает после конъюгации только с единичным ПЭГ. На высвобождение лизоцима указывало восстановление активности лизоцима в различных условиях высвобождения и подтверждалось с помощью SDS гель-электрофореза. В типичном анализе активности лизоцима, 0,2 мл 0,02% (мас./об) M. lysodeikticus (субстрат) добавляли к 0,12-0,24 мкг лизоцима в 50 мкг 66 мМ фосфата калия, pH 6,2, содержащего 0,01% BSA, в 96-луночном титровальном планшете. Поглощение при 450 нм проводили в течение 5 мин. Скорость снижения поглощения использовали как меру ферментативной активности. Одна единица ферментативной активности вносила изменение 0,001 единиц оптической плотности/мин при 25°C при 450 нм.

Высвобождение лизоцима в плазму крыс и в химический буфер

Конъюгаты ПЭГ-лизоцим в фосфатном буфере, pH 6,5, подвергали буферному обмену с PBS, pH 7,4, для наблюдения за высвобождением в плазму крыс. Измеряли стабильности в PBS при 37°C. Конъюгаты также подвергали буферному обмену с H₂O для высвобождения в Трис-буфер, pH 8,5. Центрифужную пробирку CentriCon 10 K (Millipore Corp., Bedford, MA) использовали для единичных конъюгатов ПЭГ-лизоцим, тогда как CentriCon 30K использовали для множественных конъюгатов ПЭГ-лизоцим. Высвобождение лизоцима из единичных или множественных конъюгатов ПЭГ-лизоцим проводили при концентрации 0,15 мг/мл в атмосфере N₂. В указанное время брали аликвоты, нейтрализовали действием 0,2 M фосфата (pH 5,1) до pH 6,5, и хранили при -20°C до дальнейшего анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Таблица 1
Свойства ПЭГ-бицин-доксорубицина
Соединение	t1/2 (rp) ч	ММ	% активности	IC50(нМ)
13	3,2	25233	1,80	455

Таблица 2
Скорость высвобождения ПЭГилированного лизоцима в плазму крыс и в буфер *
Соединение	Плазма	PBS, 25°C	PBS, 37°C	pH 8.5, 37°C
13а	5	36	12	1,3
13b	6	48	15	2

*данные представлены в виде t_1/2в часах.

Высвобождение в плазму наблюдали в течение 3 дней, высвобождение в буфер с рН 8,5 в течение 5 дней и высвобождение в PBS в течение 7 дней. PBS содержит 138 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl и 10 мМ фосфата, pH 7,4. Высвобождение лизоцима определяли по восстановлению активности лизоцима и подтверждали с помощью гель-электрофореза.

1. Соединение, содержащее формулу (I)

где R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из полиалкиленоксида, Н, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенила, С_2-6 алкинила, аралкилов и концевых разветвленных групп;

Z выбран из частей молекулы, активно транспортируемых в клетки-мишени, гидрофобных частей молекулы, бифункциональных связующих частей молекулы и их комбинаций;

Y_1-3 могут быть одинаковыми или различными и выбраны из О, S или NR₁₁;

L₁ и L₂ могут быть одинаковыми или различными бифункциональными линкерами, выбранными из группы, состоящей из

-NR₁₉(CR₁₄R₁₅)_tO-;

-NR₁₉(CR₁₄R₁₅)_t(CR₁₆CR₁₇О)_qNR₁₉-;

-О(CR₁₄R₁₅)_tNR₁₉-;

-О(CR₁₄R₁₅)_tO-;

-NR₁₉(CR₁₄R₁₅)_tNR₁₉-;

-NR₁₉(CR₁₄R₁₅)_t(CR₁₆CR₁₇О)_q-;

-NR₁₉(CR₁₆CR₁₇O)_t-;

-NR₁₉(CR₁₆CR₁₇О)_t(CR₁₄R₁₅)_qNR₁₉-;

-O(CR₁₄R₁₅)_t-NR₁₉-;

-O(CR₁₄R₁₅)_tO-;

-O(CR₁₆CR₁₇O)_tNR₁₉-

где R₁₄-R₁₇ и R₁₉ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C_1-6 алкилов, С_2-6 алкенилов, С_2-6 алкинилов, С_3-12 разветвленных алкилов, С_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, С_2-6 замещенных алкенилов, С_2-6 замещенных алкинилов, С_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6гетероалкилов, замещенных С_1-6гетероалкилов, C_1-6алкокси, фенокси и C_1-6гетероалкокси; и

R₁₈ выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенилов, C_2-6 алкинилов, C_3-12 разветвленных алкилов, C_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, C_2-6 замещенных алкенилов, C_2-6 замещенных алкинилов, C_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 гетероалкилов, замещенных C_1-6 гетероалкилов, C_1-6алкокси, фенокси и C_1-6 гетероалкокси, NO₂, галоалкила и галогена; и

t и q каждые отдельно выбранные положительные целые числа, примерно от 1 до 4;

R₃-R₁₁, R₂₄ и R₂₅ могут быть одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из водорода, С_1-6 алкилов, С_2-6алкенила, С_2-6 алкинила, С_3-19 разветвленных алкилов, С_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, С_2-6 замещенных алкенилов, С_2-6 замещенных алкинилов, С_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 гетероалкилов, замещенных C_1-6 гетероалкилов, С_1-6алкокси, фенокси и С_1-6гетероалкокси;

L₃ и L₄ могут быть одинаковыми или различными и выбраны из

-C(О)CR₃₀R₃₁OCR₃₂R₃₃C(О)-;

-C(О)CR₃₀R₃₁NR₃₄CR₃₂R₃₃C(О)-;

-C(O)CR₃₀R₃₁SCR₃₂R₃₃C(O)-; или

-C(О)(CR₃₀R₃₁)_nC(О)-,

где R_30-34 независимо выбраны из Н, C_1-6 алкила, С_2-6 алкенила, С_2-6 алкинила, C_1-6 гетероалкила или арила, и

n представляет собой положительное целое число, от примерно 2 до примерно 3,

А выбрано из аминосодержащих биологически активных частей молекулы;

а, b, с, d и е независимо равны 0 или 1,

m, n, о и р независимо представляют собой положительные целые числа от 1 до 6,

f и g равны 0 или 1, при условии, что

по меньшей мере одно из (f+а) или (g+с) равняется 2.

2. Соединение по п.1, где каждый R₃-R₁₀, R_24-25 и R_30-34 представляет собой водород.

3. Соединение по п.1, где каждый а, b, с, d, f, g, m, n, о и р равен 1, а е равно 0 или 1.

4. Соединение по п.1, где каждый с и g равны 0.

5. Соединение по п.1, где каждый а и f равны 0.

6. Соединение по п.1, где каждый с, g и d равны 0.

7. Соединение по п.1, где каждый а, b и f равны 0.

8. Соединение по п.1, где R₁ включает полиэтиленгликоль.

9. Соединение по п.1, где R₂ включает полиэтиленгликоль.

10. Соединение по п.1, где R₁ или R₂ дополнительно содержат кэп-группировку J, выбранную из группы, состоящей из ОН, NH₂, SH, CO₂H, C_1-6 алкильных частей молекулы

11. Соединение по п.8, выбранное из группы, состоящей из

и (IIb)

12. Соединение по п.1, где R₁ выбран из группы, состоящей из

J-О-(CH₂CH₂О)_x-;

J-О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂C(О)-О-;

J-O-(CH₂CH₂O)_Х-CH₂CH₂NR₁₂-;

J-O-(CH₂CH₂O)_Х-CH₂CH₂SH-;

-OC(О)CH₂-О-(CH₂CH₂O)_x-CH₂C(О)-О-;

-NR₁₂CH₂CH₂-О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂CH₂NR₁₂-; и

-SHCH₂CH₂-О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂CH₂SH-,

где x означает степень полимеризации;

R₁₂ выбран группы, состоящей из водорода, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенилов, C_2-6 алкинила, C_3-12 разветвленных алкилов, C_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, C_2-6 замещенных алкенилов, C_2-6 замещенных алкинилов, C_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 гетероалкилов, замещенных C_1-6гетероалкилов, C_1-6 алкокси, фенокси и C_1-6гетероалкокси, и J представляет собой кэп-группировку.

13. Соединение по п.1, где R₂ выбран из группы, состоящей из

J-О-(CH₂CH₂О)_x-;

J-О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂C(О)-О-;

J-O-(CH₂CH₂O)_Х-CH₂CH₂NR₁₂-;

J-O-(CH₂CH₂O)_Х-CH₂CH₂SH-;

-OC(О)CH₂-О-(CH₂CH₂O)_x-CH₂C(О)-О-;

-NR₁₃CH₂CH₂-О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂CH₂NR₁₃-; и

-SHCH₂CH₂-О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂CH₂SH-,

где x означает степень полимеризации;

R₁₃ выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-6 алкилов, С_2-6 алкенилов, С_2-6 алкинила, С_3-12 разветвленных алкилов, С_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, С_2-6 замещенных алкенилов, С_2-6 замещенных алкинилов, С_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 гетероалкилов, замещенных C_1-6гетероалкилов, C_1-6 алкокси, фенокси и C_1-6гетероалкокси, и J представляет собой кэп-группировку.

14. Соединение по п.1, где R_1-2 индивидуально выбраны из группы, состоящей из

CH₃-О-(CH₂CH₂О)_x-;

CH₃-О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂C(О)-О-;

CH₃ О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂CH₂NH-; и

CH₃-О-(CH₂CH₂О)_x-CH₂CH₂SH-,

где х представляет собой степень полимеризации.

15. Соединение по п.1, где каждый R₁ и R₂ содержит полимерный остаток формулы -О-(СН₂СН₂О)_х-,

где х представляет собой степень полимеризации.

16. Соединение по п.15, где каждый R₁ и R₂ имеет среднюю молекулярную массу от примерно 2000 Да до примерно 25000 Да.

17. Соединение по п.1, где указанная концевая разветвленная группа содержит формулу

где Y₅ представляет собой О, S или NR₄₆;

L₆ представляет собой бифункциональный линкер, выбранный из той же группы, которая определяет L₁;

L₈ представляет собой бифункциональный линкер, выбранный из той же группы, которая определяет L₃;

R₄₀-R₄₆ могут быть одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из водорода, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-19 разветвленных алкилов, C_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, C_2-6 замещенных алкенилов, C_2-6 замещенных алкинилов, C_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 гетероалкилов, замещенных C_1-6гетероалкилов, C_1-6алкокси, фенокси и C_1-6гетероалкокси;

каждый j, j', k и k' независимо равен 0 или положительному целому числу;

q равно 0 или 1;

g, h, v и w независимо выбранные положительные целые числа от 1 до 6;

R₅₀ выбран из группы, состоящей из полиалкиленоксида, C_1-6 алкилов, С_2-6 алкенила, С_2-6алкинила, аралкилов, и

где L₇ представляет собой бифункциональный линкер, выбранный из той же группы, которая определяет L₁;

L₉ представляет собой бифункциональный линкер, выбранный из той же группы, которая определяет L₃;

R₆₀ выбран из группы, состоящей из полиалкиленоксида, C_1-6 алкилов, С_2-6 алкенила, С_2-6 алкинила и аралкилов.

18. Соединение по п.17, содержащее структуру

19. Соединение по п.17, содержащее структуру

20. Способ получения полимерного конъюгата, включающий в себя взаимодействие соединения формулы

где A₁ представляет собой уходящую группу;

R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из полиалкиленоксида, Н, C_1-6 алкилов, С_2-6 алкенила, С_2-6 алкинила, аралкилов и концевых разветвленных групп, при условии, что оба R₁ и R₂ не являются Н;

Z выбран из частей молекулы, активно транспортируемых в клетку-мишень, гидрофобных частей молекулы, бифункциональных связующих частей молекулы и их комбинаций;

Y_1-3 могут быть одинаковыми или различными и выбраны из О, S или NR₁₁;

L₁ и L₂ могут быть одинаковыми или различными бифункциональными линкерами, выбранными из группы, состоящей из

-NR₁₉(CR₁₄R₁₅)_tO-;

-NR₁₉(CR₁₄R₁₅)_t(CR₁₆CR₁₇О)_qNR₁₉-;

-О(CR₁₄R₁₅)_tNR₁₉-;

-О(CR₁₄R₁₅)_tO-;

-NR₁₉(CR₁₄R₁₅)_tNR₁₉-;

-NR₁₉(CR₁₄R₁₅)_t(CR₁₆CR₁₇О)_q-;

-NR₁₉(CR₁₆CR₁₇O)_t-;

-NR₁₉(CR₁₆CR₁₇О)_t(CR₁₄R₁₅)_qNR₁₉-;

-O(CR₁₄R₁₅)_t-NR₁₉-;

-O(CR₁₄R₁₅)_tO-;

-O(CR₁₆CR₁₇O)_tNR₁₉-

где R₁₄-R₁₇ и R₁₉ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C_1-6 алкилов, С_2-6 алкенилов, С_2-6 алкинилов, С_3-12 разветвленных алкилов, С_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, С_2-6 замещенных алкенилов, С_2-6 замещенных алкинилов, С_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6гетероалкилов, замещенных C_1-6гетероалкилов, C_1-6алкокси, фенокси и C_1-6гетероалкокси; и

R₁₈ выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-6 алкилов, C_2-6 алкенилов, C_2-6 алкинилов, C_3-12 разветвленных алкилов, C_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, C_2-6 замещенных алкенилов, C_2-6 замещенных алкинилов, C_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 гетероалкилов, замещенных C_1-6 гетероалкилов, C_1-6алкокси, фенокси и C_1-6 гетероалкокси, NO₂, галоалкила и галогена; и

t и q каждые отдельно выбранные положительные целые числа, примерно от 1 до 4;

R₃-R₁₁, R₂₄ и R₂₅ могут быть одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из водорода, С_1-6 алкилов, С_2-6алкенила, С_2-6 алкинила, С_3-19 разветвленных алкилов, С_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, С_2-6 замещенных алкенилов, С_2-6 замещенных алкинилов, С_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 гетероалкилов, замещенных C_1-6 гетероалкилов, С_1-6алкокси, фенокси и С_1-6гетероалкокси;

L₃ и L₄ могут быть одинаковыми или различными и выбраны из

-C(О)CR₃₀R₃₁OCR₃₂R₃₃C(О)-;

-C(О)CR₃₀R₃₁NR₃₄CR₃₂R₃₃C(О)-;

-C(O)CR₃₀R₃₁SCR₃₂R₃₃C(O)-; или

-C(О)(CR₃₀R₃₁)_nC(О)-,

где R_30-34 независимо выбраны из Н, C_1-6 алкила, С_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_1-6 гетероалкила или арила, и

n представляет собой положительное целое число, от примерно 2 до примерно 3 с амин-содержащим биологически активным агентом в условиях, удовлетворяющих образованию

где А₂ представляет собой остаток аминосодержащего биологически активного агента;

а, b, с, d и е независимо равны 0 или 1,

m, n, о и р независимо представляют собой положительные целые числа от 1 до 6,

f и g равны 0 или 1, при условии, что

по меньшей мере одно из (f+а) или (g+с) равняется 2.

21. Способ получения полимерной транспортной системы на основе бицина, включающий в себя

а) взаимодействие заблокированного бифункционального линкера с ангидридом с образованием удлиненного блокированного бифункционального спейсера формулы

b) присоединение блокированного бифункционального спейсера к каждому гидроксилу кислой защищенной молекулы бицина;

c) разблокирование полученного в результате промежуточного соединения и его взаимодействие с активированным полимером в основных условиях взаимодействия, и

d) снятие защиты с бициновой кислоты и последующая активация кислоты подходящей активирующей группой в условиях взаимодействия.

22. Применение соединения по п.1 для получения лекарственного средства, обладающего увеличенным периодом циркуляции in vivo.

23. Применение соединения по п.1 для обеспечения увеличенного периода циркуляции биологически активного агента in vivo.

24. Соединение по п.1, где А представляет собой аминосодержащую биологически активную часть молекулы, выбранную из группы, состоящей из олигонуклеотидов, белков, ферментов и органических соединений.