Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина

Изобретение относится к генетической инженерии растений. Сущность изобретения: конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pBi-P5CS, размером 14681 п.н., обеспечивающую перенос целевой последовательности ДНК в геном растений и экспрессию гена P5CS люцерны, состоящую из следующих элементов:

- ДНК векторной плазмиды размером 13915 п.н.; - фрагмента ДНК, содержащего кДНК гена Δ1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазы размером 2148 п.н.; - промотора 35S РНК из генома вируса мозаики цветной капусты; - 3'НТР области гена нопалинсинтазы. Сконструированную рекомбинантную плазмиду pBi-P5CS, несущую ген Δ1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазы, переносят в штамм Agrobacterittm tumefaciens AGL0 с последующей прямой трансформацией листовых дисков Nicotiana tabacum SR1 сокультивацией с агробактерией. Отбор и генерацию производят непосредственно на средах, содержащих NaCl. Способ позволяет получать стрессоустойчивые растения табака с повышенным уровнем содержания пролина без использования антибиотиков. 3 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии высших растений, и касается способа получения трансгенных растений с повышенным содержанием пролина.

Известны два способа получения трансгенных растений с модифицированным метаболизмом пролина: с помощью повышения экспрессии гена Δ1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазы (P5CS), отвечающего за синтез пролина (Hu С-А. A., Delauney A.J., Verma D.P.S. // Proc. Natd. Acad. Sci. USA. 1992. V.89. P.9354-9358), либо снижения активности фермента пролиндегидрогеназы, определяющего скорость деградации пролина (Kiyosue Т., Yoshiba Y., Yamagichi-Shinozaki K., Shinozaki K // Plant Cell. 1996. V.8. P.1323-1335). Основным недостатком данных способов является низкая экологическая безопасность, поскольку отбор трансформантов производят на средах, содержащих антибиотик (канамицин).

Наиболее ближайшим к заявленному способу-прототипом, является способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина, заключающийся в клонировании кДНК гена P5CS из фасоли (Vigna aconitifolid) под контролем конститутивного промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты, передаче полученной рекомбинантной плазмиды pBi-P5CS в штамм агробактерии (Agrobacterium tumefaciens) и получении трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum) с помощью отбора и генерации на селективной среде с канамицином (Kavi Kishor P.B, Hong Z., Miao G. et. al. // Plant Physiol. 1995. V.108. P.1387-1394).

Основными недостатками прототипа являются:

- необходимость введения в геном растений гена устойчивости к канамицину в составе Т-ДНК рекомбинантной плазмиды, который не играет никакой другой функциональной роли, кроме возможности отбора;

- использование для отбора трансгенных растений селективной среды с добавлением антибиотика канамицина, что не позволяет сразу отбирать растения с повышенным содержание пролина, а требует дополнительной стадии отбора растений на устойчивость к канамицину.

Технической задачей настоящего изобретения является повышение экологической безопасности способа.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК путем выделения кодирующей последовательности гена P5CS с помощью обратной транскрипции суммарной РНК, выделенной из проростков люцерны (Medicago truncatula), и последующей ПЦР-реакции со специфическими праймерами, с последующим клонированном полученной последовательности в полилинкер Т-ДНК области бинарной векторной плазмиды pBi101 (Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. // EMBO J. 1987. V.6. P.3301-3307). В результате получают рекомбинантную плазмидную ДНК pBi-P5CS, размером 14681 п.н., обеспечивающую перенос целевой последовательности ДНК в геном растений и экспрессию гена P5CS люцерны.

Плазмида состоит из следующих элементов:

- ДНК векторной плазмиды размером 13915 п.н.;

- фрагмента ДНК, содержащего кДНК гена Δ1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазы размером 2148 п.н.;

- Промотора 35S РНК из генома вируса мозаики цветной капусты;

- 3'НТР области гена нопалинсинтазы.

Сконструированную рекомбинантную плазмиду pBi-P5CS, несущую ген Δ1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазы, переносят в штамм агробактерий (Agrobacterium tumefaciens) AGL0 с последующей прямой трансформацией листовых дисков табака (Nicotiana tabacum) SR1 кокультивацией с агробактерией с последующим отбором и генерацией непосредственно на средах, содержащих NaCl.

Физическая карта плазмиды pBi-P5CS с указанием генетических маркеров приведена на фиг.1, где P5CS - нуклеотидная последовательность гена P5CS люцерны; 35S CaMV - промотор гена 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; NOS PolyA - терминатор гена нопалинсинтазы из Ti-плазмиды агробактерий (Agrobacterium tumefaciens); NPTII-ген неомицинфосфотрансферазы II; LB, RB - левая и правая границы Т-ДНК области.

Определяющими отличительными признаками заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

- в качестве векторной плазмиды используют вектор pBi101, в котором ген β-глюкуронидазы был заменен на кДНК гена Δ1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазы, что позволило получить конструкцию меньшего размера, более оптимальную для трансформации, в то время как в прототипе был использован вектор pBi121, где целевой ген с промотором и терминатором был встроен за геном β-глюкуронидазы;

- отбор трансгенных растений осуществляют непосредственно на стрессовом фоне (на среде, содержащей 200 mM NaCl), что позволяет получать стрессоустойчивые формы растений и повысить экологическую безопасность способа за счет возможности исключения из сконструированной рекомбинантной плазмиды pBi-P5CS гена устойчивости к антибиотику канамицину.

Изобретение поясняется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Конструирование генетической конструкции pBi-P5CS.

Клонирование кДНК гена Δ1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазы (P5CS) в составе вектора pBi101 осуществляли в один этап посредством тройного лигирования. В конструкцию собирали три фрагмента: промотор 35S РНК из плазмиды pRT104, кДНК P5CS и часть плазмиды pBi101, содержащую в Т-области ген NPTII и 3'-нетранслируемый участок гена нопалинсинтазы, включающий сигнал полиаденилирования.

Кодирующая последовательность гена P5CS была выделена с помощью обратной транскрипции суммарной РНК, выделенной из проростков люцерны (Medicago truncatula), и последующей ПЦР-реакции со специфическими праймерами. В качестве праймеров использовались олигонуклеотиды, гомологичные 5'- и 3'- районам кодирующей последовательности гена P5CS (праймеры: 5'-gttcatctcatagctgtactatcat-3'; 5'-caagtgaacttccttgcctgccgtc-3'). Полученная кДНК гена P5CS длиной 2252 п.н. с включенными сайтами SalI и Есl136II была обработана рестриктазами SalI и Есl136II. Плазмида pRT104 была обработана рестриктазами HindIII и Sfr274I (XhoI). Плазмида pBi101 была обработана рестриктазами HindIII и Есl136II. Продукты рестрикции разделяли в 1% агарозном геле, гель окрашивали раствором бромистого этидия в воде (1 мкг/мл) и методом сорбции ДНК на силикагеле выделяли фрагменты: ДНК P5CS длиной 2148 п.н., фрагмент pRT104 длиной 441 п.н., соответствующий 35S промотору, фрагмент pBi101 длиной 11996 п.н. Выделенные фрагменты были обработаны ДНК-лигазой, лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli штамма XL1 Blue. Трансформанты высевали на чашку с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл канамицина. Клоны, несущие рекомбинантные плазмиды со встроенным геном, отбирали методом ПЦР анализа ДНК отдельных колоний E.coli с праймерами на нуклеотидную последовательность P5CS люцерны.

Пример 2

Получение трансгенных растений, несущих конструкцию pBi-P5CS.

Полученная по примеру 1 конструкция pBi-P5CS, несущая кДНК гена Δ1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазы, была использована для прямой трансформации клеток агробактерий (Agrobacterium tumefaciens) штамма AGL0 известным способом, описанным в (Horsch R., Fry J., Hoffman N. et al. // Plant Molecular Biology Manual. Dordrecht. Kluwer Academic Publishers. 1988, P.A5/1-A5/9). Для агробактериальной трансформации в качестве исходных эксплантов использовали листья трехнедельных растений табака (Nicotiana tabacum) SR1. Отбор трансформантов проводили на питательной среде Мурашиге и Скуга (МС) (Murasige Т., Skoog F. // Physiol. Plant. 1962. V.15, P.473-497) с добавлением 200 mM NaCl. На фиг.2 представлены результаты селекции листовых дисков табака, трансформированных конструкцией pBi-P5CS и контрольной конструкцией pBi101, которая представляет базовый вектор, без целевого гена, где

А, Б - трансформация конструкциями pBi101 и pBi-P5CS, отбор на среде, содержащей 200 mM NaCl;

В - трансформация конструкцией pBi101, отбор на канамицине.

На фиг.2А видно, что каллусообразование на листовых дисках с конструкцией pBi-P5CS на среде с 200 mM NaCl происходило нормально, тогда как диски с контрольной конструкцией pBi101 (фиг.2Б) некротизировались. Листовые диски с контрольной конструкцией на среде с канамицином развивались нормально и давали побеги (фиг.2В).

На фиг.3 представлена электрофореграмма ПЦР-анализа геномной ДНК проростков трансгенных растений на наличие встройки кДНК гена Δ1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазы. Нанесения по дорожкам: 1-2 - трансгенные табаки SR1, экспрессирующие ген Δ1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазы; 3 - нетрансгенные табаки SR1 (отрицательный контроль): 4, 5 - трансгенные табаки SR1, экспрессирующие ген Δ1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазы. Из фиг.3 видно, что ПЦР-анализ с праймерами на нуклеотидную последовательность P5CS подтверждает наличие нуклеотидной последовательности P5CS люцерны в геномах отобранных растений.

Трансформанты, несущие конструкцию pBi-P5CS, были проанализированы на содержание свободного пролина в листовой ткани. Для измерения использовали растения одного возраста (2-3 недели), выращенные стерильно в условиях климатокамеры, листья отбирали приблизительно одного размера с одного уровня растений в каждом эксперименте. Содержание пролина в листовых экстрактах оценивали по методу Бэйтса (Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D. // Plants and Soil. 1973. V.39. P.205-207) в микрограммах (мкг) свободного на грамм сырой массы (гсм) образца. Результаты измерений приведены в таблице.

Таблица
№№	Трансгенное растение	мкг/гсм
Опыт	контроль
1	P5CS №2		767
2	P5CS №3		701
3	P5CS №4		711
4	P5CS №8		849
5	P5CS №9		675
6	P5CS №13		2067
7	P5CS №14		688
8	P5CS №17		1053
9	P5CS №18		1497
10	P5CS №20		1810
11	P5CS №23		2132
12	P5CS №24		1933
13		pBi №1	80
14		pBi №2	134
15		pBi №3	211
16		pBi №4	118

Из представленных в таблице данных видно, что полученные трансгенные растения табака, содержащие рекомбинантную плазмиду pBi-P5CS, имеют повышенный в несколько раз уровень содержания пролина, по сравнению с контрольными растениями.

Таким образом, предлагаемый способ отвечает требованиям экологической безопасности и позволяет получать трансгенные растения, несущие кДНК гена P5CS и эффективно повышать уровень содержания пролина в трансгенных растениях, что увеличивает их стрессоустойчивость.

Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина, включающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей ген Δ1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазы, передачу полученной плазмидной ДНК в штамм Agrobacterium tumefaciens, инфицирование последним растительного материала, отбор трансгенных растений на селективной питательной среде с последующим тестированием отобранных трансформантов на повышенное содержание пролина, отличающийся тем, что конструируют и передают в штамм указанной бактерии рекомбинантную плазмидную ДНК pBi-P5CS, состоящую из следующих элементов:

ДНК векторной плазмиды pBI101, не содержащей ген бета-глюкуронидазы;

фрагмента ДНК, содержащего кДНК гена Δ1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазы из Medicago truncatula размером 2148 п.н.;

промотора 35S РНК из генома вируса мозаики цветной капусты;

3'НТР области гена нопалинсинтазы, при этом отбор трансгенных растений осуществляют на питательной среде, содержащей 200 mM NaCl.