Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и аллергена

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к конъюгатам из гидроксиалкилкрахмала и аллергена, в которых по меньшей мере один гидроксиалкилкрахмал ковалентно связан с аллергеном для гипосенсибилизации. Конъюгаты HAS-аллерген дают сравнимый с природными аллергенами эпитопный профиль, что позволяет повысить эффективность иммунотерапии. 13 з.п. ф-лы, 5 ил.

 

ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение относится к соединениям, которые включают конъюгат из гидроксиалкилкрахмала (HAS) и аллергена, причем HAS либо непосредственно либо через линкер ковалентно связан с аллергеном. Изобретение относится далее к способам получения соответствующих конъюгатов, а также к их применению в качестве лекарственных средств.

Избыточные специфические реакции иммунной системы против экзогенных веществ в настоящее время объединяются понятием аллергия. Согласно классификации Coombus и Gell аллергические реакции можно подразделить на типы от I-IV, которые, в частности, можно дифференцировать по классам антител, принимающих участие в реакции, по распознаваемым антигенам, а также индуцированным эффекторным механизмам.

Аллергенами, соответственно этому, называют соединения, которые могут провоцировать аллергическую иммунную реакцию, в более узком смысле аллергическую иммунную реакцию немедленного типа (тип I), на коже и слизистой оболочке. Как правило, в случае аллергенов речь идет о полипептидах или протеинах с молекулярной массой от примерно 5000 Да до примерно 80000 Да. Полипептиды могут быть растительного, животного или микробиологического происхождения. Полипептиды далее могут находиться в виде составных частей домашней пыли.

Аллергены индуцируют антитела IgE, которые с помощью своей постоянной части связываются с поверхностью тучных клеток и за счет этого вызывают дегрануляцию тучных клеток. Высвобождаемые тучными клетками вещества (гистамины, протеолитические ферменты и медиаторы воспаления) вызывают прямо или косвенно симптомы аллергии, обычно ринит, конъюнктивит и/или бронхиальную астму.

Опосредованные IgE аллергии немедленного типа (тип I) представляют собой самую сильную аллергическую форму реакции. Вплоть до 20% людей в промышленных странах страдают аллергическими симптомами типа I. В настоящее время аллергиков лечат наряду с медикаментозной терапией путем специфической иммунотерапии, так называемой гипосенсибилизацией (Kleine-Tebbe и др., Pneumologie, 5, 438-444 (2001)).

В случае классической гипосенсибилизации подкожно вводят в возрастающих количествах специфический экстракт аллергена, пока не достигают индивидуальной поддерживающей дозы. При продолжении лечения эту дозу вводят повторно, причем используют различные протоколы лечения (Klimek и др., Allergologie und Umweltmedizin, Schattauer Verlag, c. 158 и последующие).

Эффект лечения при этом, по-видимому, находится в тесной связи с используемыми во время поддерживающей фазы количествами аллергена. При повышении вводимых количеств аллергена, однако, в принципе, увеличивается риск опосредованной IgE реакции страдающего аллергией пациента. Другими словами, применение терапии также ограничивается аллергической реакцией пациента и возникающим вместе с этим у пациента риском анафилактического шока.

Эффект лечения проявляется в уменьшении аллергических симптомов, которое приводит к индивидуальному снижению потребности в лекарственных средствах, соответственно к повышению толерантности по отношению к аллергену.

Уже предлагалось получение отдельных аллергенных полипептидов путем рекомбинантной экспрессии и использование для гипосенсибилизации (патент ФРГ 10041541).

Для получения аллергенов с уменьшенными свойствами связывания IgE их модифицируют с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) и используют для гипосенсибилизации. Соответственно этому, во множестве публикаций описывается получение конъюгатов ПЭГ-аллерген, которые образуются за счет ковалентной связи аллергена с полиэтиленгликолем. Mosbech и др. (Allergy, 45 (2), 130-141 (1990)) сообщают, например, о лечении взрослых аллергиков, страдающих астмой, с помощью конъюгатов ПЭГ-домашняя пыль и о иммунологической реакции после лечения. Авторы обнаружили клиническое повышение действия, если дозировка аллергена является достаточной для снижения количества специфического IgE и/или для индуцирования реакций IgG, в особенности IgG4.

Аналогично Schafer и др. (Ann. Allergie, 68 (4), 334-339 (1992)) сообщают об исследовании, при котором используют аллергенную композицию из смеси пыльцы трав, модифицированной ПЭГ, для гипосенсибилизации взрослых. Результаты сравнивают с таковыми, получаемыми за счет гипосенсибилизации при применении частично очищенной смеси пыльцы трав. Лечение осуществляют в рамках двойного слепого исследования. За счет модификации с помощью ПЭГ частоту и масштаб побочных действий можно уменьшать примерно на 50%. В обеих, подвергаемых лечению группах установлено значительное улучшение в отношении аллергической реакции.

Конъюгаты на основе ПЭГ, однако, не имеют встречающейся в природе структуры, для которой описаны пути расщепления in vivo.

Наряду с конъюгатами на основе ПЭГ также получены и исследованы другие производные аллергенов. Так, известны модифицированные декстраном аллергены, которые получают за счет конъюгации с карбоксиметилдекстраном. Некоторые исследования с β-лактоглобулином показали, что реакция антител по отношению к декстрановым конъюгатам значительно ослаблена по сравнению с немодифицированными соединениями (Kobayashi и др., J. Agric. Food Chem., 49 (2), 823-831 (февраль 2001); Hattori и др., Bioconjug. Chem., 11 (1), 84-93 (январь-февраль 2000)).

Далее получают поперечно сшитые высокомолекулярные аллергены, так называемые аллергоиды. Эти продукты можно получать, например, путем модификации аллергенов с помощью формальдегида или глутарового альдегида. Соответствующие продукты могут выпускаться Allergopharma, Joachim Ganser KG, 21462 Рейнбек; HAL Allergie GmbH, 40554 Дюссельдорф; и SmithKline Beecham Pharma GmbH, Benckard, 80716 Мюнхен.

Широкий обзор в отношении диапазона различных способов получения биоконъюгатов, в общем, представлен G.T. Hermanson (Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996). Связывание олиго- и полисахаридов с протеинами происходит при этом по меньшей мере через лизиновые (-NH₂) или цистеиновые (-SH) боковые цепи и реже через боковые цепи аспарагиновой или глутаминовой кислоты (-СООН), или также через тирозиновые (арил-ОН) боковые цепи.

Производные крахмала, однако, до сих пор не были использованы для модификации аллергенов.

Гидроксиэтилкрахмал (HES), например, представляет собой замещенное производное углеводного полимера, амилопектина, составляющего до 95% кукурузного крахмала. HES обладает благоприятными реологическими свойствами и в настоящее время клинически используется в качестве кровезаменителя и гемодилюционной терапии (Sommermeyer и др., Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278 (1987); и Weidler и др., Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498 (1991)).

Амилопектин состоит из звеньев глюкозы, причем в основных цепях имеются α-1,4-гликозидные связи,однако, в местах разветвлений α-1,6-гликозидные связи. Физико-химические свойства этой молекулы определяются, по существу, типом гликозидных связей. Из-за изогнутой α-1,4-гликозидной связи образуются спиральные структуры примерно с 6 звеньями глюкозы на виток.

Физико-химические, а также биохимические свойства полимера HES можно изменять за счет замещения. Введения гидроксиэтильной группы можно достигать путем щелочного гидроксиэтилирования. За счет реакционных условий можно использовать различную реакционную способность соответствующей гидроксильной группы в незамещенной мономерной глюкозе в отношении к гидроксиэтилированию, благодаря чему можно оказывать влияние на тип замещения.

Поэтому HES характеризуется, по существу, молекулярно-массовым распределением и степенью замещения. Степень замещения при этом можно указывать как DS («степень замещения»), которая относится к доле замещенной мономерной глюкозы в расчете на все звенья глюкозы, или как MS («молекулярное замещение»), которым обозначают число гидроксиэтильных групп на звено глюкозы.

Растворы HES находятся в виде полидисперсных композиций, в которых отдельные молекулы отличаются друг от друга по степени полимеризации, числу и расположению мест разветвления, а также по типу замещения. HES таким образом является смесью соединений с различной молекулярной массой. Соответственно этому определенный раствор HES характеризуется средней молекулярной массой при помощи статистических величин. При этом M_n рассчитывают как простое среднеарифметическое в зависимости от числа молекул (среднечисловая молекулярная масса), в то время как M_w, среднемассовая молекулярная масса, представляет собой зависимую от массы измеряемую величину.

Таким образом, задачей изобретения является получение улучшенных производных аллергенов, в особенности производных аллергенов, которые обеспечивают депо-эффект и поэтому их нужно менее часто вводить.

Поставленная задача решается конъюгатами из гидроксиалкилкрахмала (HAS) и аллергена, в которых по меньшей мере один гидроксиалкилкрахмал ковалентно связан с аллергеном.

Согласно изобретению неожиданно установлено, что конъюгаты HAS-аллерген особенно предпочтительно можно использовать для специфической иммунотерапии. Надежность гипосенсибилизации повышается за счет применения предлагаемых согласно изобретению конъюгатов. Предлагаемые согласно изобретению конъюгаты одновременно обладают более высоким периодомполураспада in vivo, в связи с чем путем конъюгирования с HAS достигается депо-эффект, положительно влияющий на клиническую эффективность. В особенности по сравнению с водными экстрактами аллергенов депо-эффект предлагаемых согласно изобретению конъюгатов имеет преимущество, а именно для достижения терапевтического действия их нужно менее часто вводить.

По сравнению с немодифицированными аллергенами предлагаемые согласно изобретению конъюгаты HAS-аллерген можно получать таким образом, что они обладают уменьшенным связыванием со специфичным к аллергену IgE. Конъюгаты HAS-аллерген согласно особенно предпочтительному варианту осуществления могут обладать только очень незначительной или вообще не обладать специфической связью со специфичным к аллергену IgE. Предлагаемые согласно изобретению конъюгаты таким образом можно вводить в повышенной дозировке, что опять увеличивает вероятность успешной гипосенсибилизации.

По сравнению со сшитыми аллергоидами конъюгаты HAS-аллерген согласно настоящему изобретению обладают преимуществом, заключающимся в том, что они могут давать сравнимый с природным аллергеном эпитопный профиль. Таким образом можно повышать эффективность иммунотерапии. В противоположность этому сополимеризация аллергенов с формальдегидом или глутаровым альдегидом приводит к плохо определяемым высокомолекулярным соединениям (Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6 (4), 315-365 (1990)), которые могут создавать неприродные эпитопы, так что в отдельном случае их действие нужно исследовать.

В конъюгате по меньшей мере один гидроксиалкилкрахмал связан с аллергеном. Под объем изобретения подпадают, естественно, также продукты связывания, которые обладают несколькими молекулами гидроксиалкилкрахмала и одной молекулой аллергена или несколькими молекулами аллергена и одной молекулой гидроксиалкилкрахмала.

Гидроксиалкилкрахмал в конъюгате может быть непосредственно связан с аллергеном или связан с аллергеном через линкер. Далее гидроксиалкилкрахмал может быть связан с полипептидной цепью или с одной или несколькими сахаридными цепями аллергенного гликопротеина.

Гидроксиалкилкрахмал (HAS)

В рамках настоящего изобретения понятие "гидроксиалкилкрахмал" используют для обозначения производных крахмала, замещенных гидроксиалкильной группой. Гидроксиалкильная группа предпочтительно содержит от 2 до 4 атомов углерода. Обозначаемая как "гидроксиалкилкрахмал" группа таким образом предпочтительно состоит из гидроксиэтилкрахмала, гидроксипропилкрахмала и гидроксибутилкрахмала. Особенно предпочтительным является применение гидроксиэтилкрахмала (HES) в качестве компонента связывания в случае всех вариантов осуществления изобретения.

Согласно изобретению, предпочтительно, гидроксиэтилкрахмал, используемый для получения конъюгатов, имеет среднюю молекулярную массу (среднемассовую молекулярную массу) 1-300 кДа, причем особенно предпочтительна средняя молекулярная масса от 5 кДа до 200 кДа. Гидроксиэтилкрахмал далее может иметь молекулярную степень замещения 0,1-0,8 и соотношение замещения С₂:С₆ в пределах 2-20, в каждом случае в расчете на гидроксиэтильные группы.

Аллергены

В рамках настоящего изобретения аллергенами, в первую очередь, называют соединения, которые могут провоцировать аллергические иммунные реакции, в более узком смысле опосредованные IgE аллергические реакции (тип I). Далее охватываются производимые от последовательности аллергена пептиды, как, например, продукты расщепления, получаемые в результате ферментативных расщеплений. Соответствующие аллергены используют для специфической иммунотерапии и они имеются в продаже.

Аллергены можно выделять из природных источников. Так, например, в случае пыльцевых аллергенов получают экстракты аллергенов из соответствующей пыльцы. Далее аллергены можно получать, например, рекомбинантным путем.

В случае аллергенов речь идет предпочтительно о соединениях, которые выбирают из группы, состоящей из полипептидов, протеинов и гликопротеинов.

Способы получения

Согласно одному аспекту изобретение относится к способам получения конъюгатов HAS-аллерген, в которых HAS либо непосредственно либо через линкер ковалентно связан с аллергеном. Связывание при этом можно осуществлять различными путями. Общая структура синтеза неогликопротеина при использовании линкера представлена на фиг.1.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способам получения конъюгатов HAS-аллерген, в случае которых HES связывают с ε-NH₂-группой, с α-NH₂-группой, с SH-группой, с СООН-группой или с -С(NH₂)₂-группой аллергена.

Изобретение относится далее к способам, в случае которых HES связывают с ε-NH₂-группой протеина при помощи восстановительного аминирования. Альтернативно этому изобретение относится к способам, в случае которых аллерген связывают с редуцирующими концевыми группами гидроксиэтилкрахмала.

Согласно следующему варианту осуществления изобретение относится к способам, в случае которых для связывания с аллергеном в HAS вводят активную группу. Активной группой может быть, например, альдегидная группа, тиольная группа или аминогруппа.

Аллерген и олиго- или полисахарид могут связываться друг с другом непосредственно либо за счет применения линкера. В качестве линкера можно использовать любой сшивающий агент. Линкером может быть, например, бифункциональный линкер или гомо- или гетеробифункциональный кросс-линкер.

Коммерчески доступны и специалисту известны многочисленные сшивающие агенты, которые могут быть использованы в рамках настоящего изобретения, как, например, SMCC (сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат) (см. список в алфавитном порядке под названием «Cross-linking Reagents» в каталоге продуктов фирмы Perbio и www.piercenet.com).

Настоящее изобретение согласно другому варианту осуществления относится к получаемым описанными способами конъюгатам HAS-аллерген.

Ниже представлены в общих чертах некоторые способы синтеза конъюгатов HAS-аллерген. Специалист в области биоконъюгатов не будет иметь проблем при выборе из описанных таких способов, которые особенно пригодны в отношении решаемых задач (выбираемый аллерген, выбираемый HAS и т.д.).

Прямое связывание немодифицированного HAS с аллергенными протеинами путем восстановительного аминирования

Простой и мягкий способ, который можно осуществлять без модификации HAS, представляет собой прямое связывание HAS с ε-аминогруппами аллергенного протеина путем восстановительного аминирования в присутствии NaCN/BH₃ (G.R. Gray, Arch. Biochem. Biophys., 163, 426-428 (1974)) (фиг. 2.1a).

В качестве восстановителей можно использовать также пиридинборановый комплекс и другие аминоборановые комплексы, которые являются более стабильными и которыми более легко манипулировать (J.C. Cabacungan и др., Anal. Biochem., 124, 272-278 (1982)). В противоположность ацилированию модифицированная аминогруппа протеина, кроме того, в физиологических условиях остается положительно заряженной. Поэтому воздействия на третичную структуру протеина при восстановительном аминировании меньше. В случае этого способа, однако, исчезает циклическая структура редуцирующего сахара.

Способ связывания модифицированного HAS.

Окисление редуцирующего конца с получением альдоновых кислот

В случае редко используемого окисления с помощью иода (или брома) до соответствующей альдоновой кислоты (G. Ashwell, Methods Enzymol., 28, 219-222 (1972)) исчезает циклическая структура редуцирующего сахара (фиг. 2.1b), кроме того, необходим тщательный контроль за реакцией для избежания неспецифического окисления. Образовавшуюся карбоксильную группу в присутствии EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) (J. Lunngren, I.J. Goldstein, Methods Enzymol., 247, 116-118 (1994)) можно связывать с ε-аминогруппами лизиновых боковых цепей аллергенного протеина или через гидразидный линкер (см. фиг.3). Аналогично для связывания также можно использовать имеющиеся в полисахаридных структурах карбоксильные группы, например, маннуроновой, глюкуроновой или сиалиновой кислот.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения получают соединения, состоящие из конъюгата HES-аллерген, в котором аллерген специфически связан с редуцирующими концевыми группами гидроксиэтилкрахмала. Для этого редуцирующие концевые группы предварительно подвергают селективному окислению, например, согласно способу, описанному Hashimoto и др. (Kunstoffe, Kautschuk, Fasern, 9, 1271-1279 (1992)) для окисления редуцирующей концевой альдегидной группы сахарида.

Активирование гидроксильной группы HAS

Один из самых употребительных способов неспецифического активирования полисахаридов представляет собой введение во взаимодействие с бромцианом (CNBr) (С. Chu и др., Infect. Immun., 40, 245-256 (1983)) (фиг. 2.1с). Активированные гидроксильные группы ацилируют лизиновые, цистеиновые и гистидиновые боковые цепи протеина. Этот способ связывания, однако, может иметь недостатки, которые сводятся к высокому значению рН, а также к токсичности и плохой манипулируемости.

Альтернативой CNBr является CDAP (1-циано-4-диметиламино-пиридинийтетрафторборат) (A. Lees и др., Vaccine, 14, 190-198 (1996); D.E. Shafer и др., Vaccine, 18, 1273-1281 (2000)) с повышенной реакционной способностью цианогруппы, что позволяет осуществлять реакцию в намного более мягких условиях.

В общем, неспецифические активирования полисахаридов могут приводить к многократному замещению и тем самым к перекрестным сшивкам между полисахаридом и протеином. Путем выбора реакционных условий этому, однако, в значительной степени можно препятствовать.

Введение альдегидных групп

Также в нередуцирующие полисахариды можно вводить альдегидные группы за счет отщепления вицинальных гидроксильных групп с помощью NaIO₄ (J.M. Bobbit, Ad. Carbohydr. Chem., 11, 1-41 (1956)) (фиг. 2.1d), причем за счет концентрации раствора периодата натрия можно достигать достаточной селективности. Особенно легко окисляемой является сиалиновая кислота (S.M. Chamov и др., Biol. Chem., 267, 15916-15922 (1992)).

Повышения скорости реакции в случае прямого восстановительного аминирования при использовании редуцирующих полисахаридов можно достигать за счет введения альдегидных групп, которые не циклизуются до полуацеталей. Этого можно достигать путем восстановления редуцирующего конца до получения редуцированного сахара и последующего селективного окисления вицинальных диолов в раскрытом редуцированном сахаре (Y.C. Lee, R.T. Lee, Neoglycoproteins: Preparation and Application, Academic Press, San Diego, 1994) (фиг. 2.1d).

Наряду с прямым связыванием модифицированных альдегидными группами полисахаридов с аминогруппами протеина за счет восстановительного аминирования этим путем также возможно модифицирование полисахарида с помощью бифункциональных гидразидных линкеров (см. ниже).

Введение аминогрупп

По сравнению с полисахаридами, в случае олигосахаридов (с количеством углеводных мономерных звеньев вплоть до 20) на основании несколько более высокой реакционной способности создаются лучшие возможности превращения редуцирующего сахара за счет восстановительного аминирования в гликамины или в гликозиламины с интактной циклической структурой (фиг. 2.2).

Для связывания модифицированных аминогруппами полисахаридов с различными функциональными группами боковых цепей протеина предлагается использование бифункционального линкера (см. ниже).

Введение аминогрупп путем восстановительного аминирования

В противоположность синтезу гликамина путем восстановительного аминирования с помощью NH₃ или алифатических аминов (В. Kuberan и др., Glycoconj. J., 16, 271-281 (1999)), при использовании ароматических аминов, как, например, бензиламин (Т.Yoshide, Methods Enzymol., 247, 55-64 (1994)), 2-(4-аминофенил)этиламин (АРЕА) (H.D. Grimmecke, H. Brade, Glycoconj. J., 15, 555-562 (1998)) или 4-трифторацетамидоанилин (Е. Kallin, Methods Enzymol., 247, 119-123 (1994)), при сравнимых условиях можно достигать более высоких выходов (фиг. 2.2а).

В то время как в случае АРЕА для селективной реакции используют разную реакционную способность алифатических и ароматических аминогрупп, с помощью 4-трифторацетамидоанилина получают монозащищенное соединение (альтернативно также используют бензилоксикарбониламиноанилин (М. Barström и др., Carbohydr. Res., 328, 525-531 (2000)), причем за счет последующего отщепления трифторацетильной группы снова высвобождается ароматическая аминогруппа. К тому же обнаружено, что гликамины до отщепления трифторацетильной защитной группы можно стабилизировать путем простого N-ацетилирования с помощью уксусного ангидрида.

Введение аминогрупп путем N-гликозилирования

N-Гликозилирование (фиг. 2.2b) позволяет сохранять циклическую структуру редуцирующего сахара. Получаемые путем взаимодействия с гидрокарбонатом аммония нестабильные β-гликозиламины (I.D. Manger и др., Biochemistry, 31, 10724-10732 (1992); I.D. Manger и др., Biochemistry, 31, 10733-10740 (1992); S.Y.C. Wong и др., Biochem. J., 296, 817-825 (1993); Е. Meinjohannes и др., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1, 549-560 (1998)) можно стабилизировать путем последующего ацилирования с помощью ангидрида хлоруксусной кислоты и путем аминолиза превращать в l-N-глицильные соединения со свободной аминогруппой. Аналогично N-гликозилирование можно осуществлять с помощью аллиламина и после стабилизации за счет N-ацетилирования фотохимическим путем присоединять цистеамин по двойной связи (D.Ramos и др., Angew. Chem., 112, 406-408 (2000)).

Получение аминогрупп из альдоновых кислот

В альдоновые кислоты, получаемые путем окисления редуцирующих полисахаридов, за счет взаимодействия с диаминами можно вводить свободные аминогруппы. Это возможно путем реакции кислоты с карбодиимидами и диаминами. Альтернативно лактоны, получаемые за счет дегидратации альдоновых кислот, можно вводить во взаимодействие с диаминами (S.Frie, Дипломная работа, Специальное учебное заведение, Гамбург, 1998).

Реакции связывания модифицированного HES и аллергенных протеинов при помощи бифункциональных линкеров

Настолько же разнообразными, как функциональные группы модифицированного HES и протеиновые боковые цепи, которые нужно связывать друг с другом через линкер, являются также существующие возможности реакций (на фиг.3 представлены общепринятые активирования с помощью линкеров).

В случае реакционноспособных групп можно проводить различие между реакционной способностью в отношении аминогрупп (сложные NHS-эфиры, сложные имидоэфиры и арилазиды), альдегидных групп и (в присутствии EDC) групп карбоновых кислот (гидразиды) или SH-групп (малеинимиды, галогенацетаты или пиридилдисульфиды).

Реагенты с реакционной способностью в отношении аминогрупп

Из реагентов связывания самыми употребительными являются реакционноспособные в отношении аминогрупп кросс-линкеры. При этом сложные N-гидроксисукцинимидоэфиры (сложные NHS-эфиры) (фиг. 3.1а) представляют собой самую общепринятую форму активирования. При этом при отщеплении NHS образуются ацилированные соединения. Другую возможность модификации первичных аминов представляют сложные имидоэфиры (F.C. Hartman, F. Wold, Biochemistry, 6, 2439-2448 (1967)) (фиг. 3.1b), причем образуются имидоамиды (амидины). Сложные имидоэфиры многократно используют в качестве протеиновых кросс-линкеров и они отличаются минимальной реакционной способностью по отношению к другим нуклеофильным соединениям. Далее имеются различные арилазидные линкеры (фотореактивные кросс-линкеры), в случае которых путем фотолиза образуются короткоживущие нитрены. За счет расширения цикла из них (вместо неспецифической инсерции) образуются дегидроазепины, которые предпочтительно реагируют с нуклеофильными соединениями, в особенности с аминами (фиг. 3.1с).

Благодаря множеству выпускаемых реагентов связывания с активностью в отношении аминогрупп и разнообразных линкеров имеются другие возможности реакций, которые, например, во взаимодействии с изоцианатами и изотиоцианатами все больше теряют значение.

Реагенты с реакционной способностью в отношении карбонильных или карбоксильных групп

Гидразидные линкеры используют для связывания соединений с карбонильными или карбоксильными группами (D.J. О'Shanessy, М. Wilchek, Anal. Biochem., 191, 1-8 (1990)) (фиг. 3.2). В то время как альдегиды превращаются в гидразоны, которые можно стабилизировать путем восстановления с помощью NaCN/BH₃, карбоксильные группы в присутствии EDC реагируют с образованием имидных связей. Активированные гидразидом линкеры представляют собой многостороннюю альтернативу в отношении восстановительного аминирования и в отношении активирования карбоксила с помощью "нулевой длины" кросс-линкеров, как карбонилдиимидазол (CDI).

Реагенты с реакционной способностью в отношении сульфгидрильных групп

Реагенты связывания с реакционной способностью в отношении SH представляют собой второй большой класс кросс-линкеров. Реакции связывания изначально включают два пути реакций: алкилирование (фиг. 3.3а-b) или дисульфидный обмен (фиг. 3.3с). При образовании стабильной простой тиоэфирной связи, наряду с алкилированием с помощью α-галогенацетатов двойная связь малеимидов селективно вступает во взаимодействие с группами SH путем реакции присоединения по Михаэлю. Тиол-дисульфидный обмен представляет собой другую специфичную в отношении сульфгидрильных групп реакцию. При этом особенно предпочтительной оказывается реакция с пиридилдисульфидами (J. Carlsson и др., Biochem. J., 173, 723-737 (1978)), так как при отщеплении 2-пиридона можно достигать полного превращения в смешанные дисульфиды.

Кросс-линкеры

Для синтеза предлагаемых согласно изобретению биоконъюгатов HAS-аллерген используют вышеуказанные реакции связывания за счет разнообразных гомо- и гетеробифункциональных кросс-линкеров.

Гомобифункциональные кросс-линкеры

Симметричные гомобифункциональные линкеры (см., например, представленные на фиг. 4.1) на обоих концах содержат одну и ту же реакционноспособную группу и пригодны для связывания соединений с одинаковыми функциональными группами. Согласно существующим реакциям связывания коммерчески доступны соответствующие бифункциональные линкеры, например, со сложной бис-имидоэфирной, бис-сукцинимидной, бис-гидразидной и бис-малеинимидной функциональностями.

Недостаток при применении гомобифункциональных линкеров заключается в том, что даже при использовании большого избытка кросс-линкера при активировании первого соединения полностью нельзя предотвращать поперечное сшивание (S. Bystrick и др., Glycoconj. J., 16, 691-695 (1999)). Необходимо его полное отделение перед связыванием со вторым соединением и это может быть затруднительным при нестабильности активированного промежуточного продукта (например, чувствительность к гидролизу активированных с помощью NHS соединений). Как реакционная способность в отношении аминогрупп, так и гидролиз сложных NHS-эфиров усиливаются с повышающимся значением рН, вследствие чего реакции в физиологических условиях (рН 7) осуществляют в забуференных растворах (время полураспада сложного NHS-эфира DSP при температуре 0°С и значении рН 7 составляет 4-5 часов, при рН 8,6 только еще 10 минут; A.J. Lomant, G. Fairbanks, J. Mol. Biol., 104, 243-261 (1976)).

Гетеробифункциональные кросс-линкеры

С помощью гетеробифункциональных реагентов связывания (см., например, представленные на фиг. 4.2) можно связывать друг с другом соединения с различными функциональными группами. Линкеры снабжены двумя различными реакционноспособными группами, и за счет комбинирования различных реакций связывания можно селективно осуществлять взаимодействие с одним концом кросс-линкера. Так, например, одна сторона линкера обладает активностью в отношении аминогруппы, другая - в отношении сульфгидрильной группы, благодаря чему по сравнению с гомобифункциональными линкерами достигают лучшей возможности контролирования реакции.

Сначала во взаимодействие вступает более реакционноспособная или более нестабильная сторона гетеробифункционального линкера. Так как сложные NHS-эфиры могут реагировать не только с аминогруппами с образованием стабильной амидной связи, но и с сульфгидрильными и гидроксильными группами, гетеробифункциональный линкер сначала вступает во взаимодействие с аминосоединением. Малеинимидная группа в противоположность этому обладает не только большей селективностью, но также большей стабильностью в водном растворе, так что активированный промежуточный продукт можно очищать и затем селективно вводить во взаимодействие с соединением с сульфгидрильной активностью.

При выборе кросс-линкера руководствуются не только родом функциональных групп, которые нужно использовать для связывания, но и желательной длиной и составом, так называемого поперечного мостика, спейсера. Так, некоторые спейсеры, в особенности таковые с жесткой циклической структурой, как, например, SMCC или MBS, приводят к возникновению специфической реакции антител (J.M. Peeters и др., J. Immunol. Methods, 120, 133-143 (1989)) и таким образом могут быть менее пригодны для иммуногенов гаптен-носитель и применения in vivo.

В отношении подбора линкеров согласно фиг.4 выпускаются специфически расщепляемые линкеры, которые могут раскрываться за счет расщепления дисульфидом (например, DSP, DTME или DTBP) или расщепления периодатом (диолы, как BMDB или DST) и которые используют для изучения биоспецифических промежуточных реакций или для очистки неизвестных структур-мишеней.

Используемые сокращения выпускаемых реагентов связывания производятся от систематических названий соединений, как, например, DMA (Dimethyladipimidat=диметиладипимидат), DMS (Dimethylsuberimidat=диметилсуберимидат), GMBS (N-(γ-Maleimidobutyryloxy)siccinimidester=сложный N-(γ-малеимидобутирилокси)сукцинимидоэфир) и т.д.

Обзор в отношении различных гетеробифункциональных кросс-линкеров, которые, например, можно использовать для связываний сульфгидрильных групп, представлен на фиг.5.

Большое разнообразие в данном случае представляют собой активированные малеинимидом линкеры, чаще всего в сочетании с активированием в виде сложного NHS-эфира. Эти линкеры с реакционной способностью в отношении сульфгидрильных групп и аминогрупп представляют собой водонерастворимые линкеры, образующие линейные алкильные мостики, как, например, AMAS, GMBS и EMCS, или, как SMCC, SMPB или MBS, обладают жесткой циклической структурой. Оба УФ-активных линкера SMPB и MBS обычно используют для иммунохимических способов, таких как твердофазный иммуноферментный анализ.

С помощью M₂C₂H сверх того получают линкер с такой же жесткой мостиковой связью, как в случае SMCC, однако, с активированием гидразидом для связывания соединений с сульфгидрильной и карбонильной или карбоксильной активностью.

В противоположность водонерастворимым линкерам, которые перед реакцией сначала нужно растворять в органическом растворителе, таком как диметилформамид или диметилсульфоксид, имеются линкеры в виде сложных NHS-эфиров с гидрофильными сульфогруппами (J.V. Staros, Biochemistry, 21, 3950-3955 (1982)), как, например, сульфо-GMBS, сульфо-EMCS и сульфо-SMCC, кроме того, водорастворимые варианты некоторых линкеров.

Наряду с активированными малеинимидом гетеробифункциональными линкерами для связываний сульфгидрильных групп применяются различные галогенацетаты, как, например, SIA (и бромсодержащий аналог), SIAB и SBAP (фиг. 5.2), и пиридилдисульфиды, как SPDP и LC-SPDP и Sulfo-LC-SPDP (фиг. 5.3), в сочетании с активированием в виде сложного NHS-эфира для связывания аминогрупп. Галогенацетатные группы можно вводить в аминированные полисахариды также путем реакции со свободной кислотой и водорастворимым карбодиимидом (N.J. Davies, S.L. Flitisch, Tetrahedron Lett., 32, 6793-6796 (1991)) или с соответствующим ангидридом (I.D. Manger и др., Biochemistry, 31, 10733-10740 (1992); S.Y.C. Wong и др., Biochem. J., 300, 843-850 (1994)) (см. фиг. 2.2b).

В отношении связывания синтетических олигосахаридов с боковыми SH-цепями протеинов с помощью гетеробифункциональных малеинимидных линкеров в литературе имеются различные примеры (V. Fernandez-Santana и др., Glycoconj. J., 15, 549-553 (1998); G. Ragupathi и др., Glycoconj. J., 15, 217-221 (1998); W. Zou и др., Glycoconj. J., 16, 507-515 (1999); R. Gonzalez-Lio, J. Thiem, Carbohydr. Res., 317, 180-190 (1999)). Кроме того, также используют прямое связывание иодацетатамидных производных олигосахаридов для специфического гликозилирования протеинов (N.J. Davies, S.L. Flitsch, Tetrahedron Lett., 32, 6793-6796 (1994); S.Y.C. Wong и др., Biochem. J., 300, 843-850 (1994)).

Модификация гликопротеинов в углеводной части с помощью поли- и олигосахаридов

Альтернативно аминокислотным боковым цепям протеина, в случае гликопротеинов также связанные олигосахариды имеют другие места связывания для образования предлагаемых согласно изобретению конъюгатов (J.J. Zara и др., Anal. Biochem., 194, 156-162 (1991)).

Введение альдегидных групп путем окисления с помощью периодата натрия

Путем окисления с помощью периодата натрия также в нередуцирующие олигосахариды можно вводить альдегидные группы. В зависимости от выбора условий окисления могут селективно окисляться имеющиеся сиалиновые кислоты или менее селективно окисляться также остатки фукозы, маннозы, галактозы и N-ацетилглюкозамина (S.M. Chamov и др., J. Biol. Chem., 267, 15916-15922 (1992)). В качестве побочной реакции возможно образование альдегидных групп из N-концевого серина, цистеина или треонина (D.J. О'Shanessy, M. Wilchek, Anal. Biochem., 191, 1-8 (1990)).

Ферментативное введение альдегидных групп

Окисление гликопротеинов с помощью галактозаоксидазы приводит к образованию C₆-альдегидных групп в концевых галактозах или N-ацетилгалактозаминах. Особенно в гликопротеинах из животных клеток эти сахара не являются концевыми, так что их нужно делать доступными только на предшествующей стадии (D.J. O'Shanessy, M. Wilchek, Anal. Biochem., 191, 1-8 (1990)).

Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение относится далее к фармацевтическим композициям, содержащим предлагаемый согласно изобретению конъюгат HAS-аллерген. Предлагаемые согласно изобретению конъюгаты особенно предпочтительно пригодны для приготовления фармацевтических композиций, которые можно использовать для гипосенсибилизации аллергиков. Фармацевтические композиции в особенности пригодны для лечения аллергиков, у которых обнаруживают опосредованную IgE сенсибилизацию и наблюдают соответствующие клинические симптомы.

Соответственно этому предлагаемые согласно изобретению конъюгаты можно применять в особенности для приготовления фармацевтических композиций, которые пригодны для специфической иммунотерапии пациентов с клинически релевантными реакциями на аллергены немедленного типа, как, например, аллергики с аллергией на пыльцу, клещей, волосы (слюну) млекопитающих, грибы, укусы насекомых, пищевые продукты и натуральный каучук/латекс. Таким образом, иммунотерапия в особенности пригодна для лечения астматиков и пациентов, страдающих сенной лихорадкой.

Предлагаемые согласно изобретению композиции можно использовать в различных формах специфической иммунотерапии, в особенности в случае гипосенсибилизации. Так, гипосенсибилизацию можно осуществлять путем введения через слизистую оболочку, а также подкожного, орального, перорального или подъязычного введения предлагаемых согласно изобретению HES-конъюгатов. Далее гипосенсибилизацию можно осуществлять в форме различных протоколов лечения (предсезонное/постоянное).

В особенности в случае аллергиков с аллергией к укусам насекомых может быть предложено осуществление лечения по Rush-способу или ультра-Rush-способу (см. Kleine-Tebbe и др., Pneumologie, 5, 438-444 (2001)).

Для приготовления фармацевтических композиций предлагаемые согласно изобретению конъюгаты смешивают с пригодными для гипосенсибилизации носителями и/или вспомогательными веществами.

Конъюгат из HES и аллергенного гликопротеина

При получении конъюгатов HES-гликопротеин для связывания можно использовать, например, следующие типы функциональных групп гликопротеина:

А: тиольная группа цистеиновой боковой цепи;

В: альдегидная группа окисленного остатка галактозы.

В случае протеинов, которые негликозилированы, соответственно этому отсутствует альтернатива В.

HES отличается единственным редуцирующим концом. На основании этого структурного признака, в рамках настоящего изобретения особенно пригодно целенаправленное региоселективное связывание.

Для синтеза конъюгата HES-протеин можно использовать концепции химического лигирования, которые разработаны для конструкции протеинов большей величины из незащищенных пептидных фрагментов. Эти концепции базируются на выборе единичных реакционноспособных функциональных групп в сшиваемых фрагментах, которые в присутствии множества других функциональных групп в природных протеинах селективно реагируют друг с другом с образованием стабильного конечного продукта.

В общем, HES-препарат сначала переводят в определенный, высокоочищенный и хорошо охарактеризованный промежуточный продукт (реактивный HES), который затем спонтанно и региоселективно в физиологических условиях может реагировать с функциональной группой-мишенью аллергена.

Предпочтительным является селективное переведение редуцирующего конца HES в первичную аминогруппу (1-амино-HES). Этот "1-амино-HES" затем гибко адаптируют к реакции связывания с протеином, причем можно осуществлять различные пути синтеза, и стадии реакции за счет предварительно полученных реагентов (линкеров) можно объединить в одну стадию.

HS-реактивный HES

Ниже схематически описываются и оцениваются альтернативные способы получения HS-реактивного HES:

1. Восстановительное аминирование HES с помощью бифункционального линкера М₂С₂Н (фиг. 5.1.b) до HS-реактивного HES (А);

- очистка путем диализа и сушки вымораживанием;

- связывание протеина HS путем присоединения по Михаэлю.

Этот синтез обладает особыми преимуществами, так как он очень прост (одна стадия) и реакция с протеином-мишенью протекает очень селективно. Если токсичность производных гидразина вызывает проблемы, их нужно затем устранять за счет известных из уровня техники способов очистки.

2. Превращение HES-лактона (окисленный HES) с помощью бифункционального линкера М₂С₂Н (фиг. 5.1.b) в HS-реактивный HES (В);

- очистка путем диализа и сушки вымораживанием;

- связывание HS-протеина путем реакции присоединения по Михаэлю.

Эта реакция отличается от описанной выше в п. 1 дополнительными расходами на получение HES-лактона.

3. Превращение HES с помощью гидрокарбоната аммония в 1-амино-HES (С);

- очистка путем сушки вымораживанием;

ацилирование 1-аминаля с помощью бром/иодацетангидрида без основного катализа с получением бром/иодацетамида (HS-реактивный HES (D));

- очистка путем диализа и сушки вымораживанием; связывание с HS-протеином путем алкилирования.

Этот способ является предпочтительным; он включает только две стадии и требует использования только очень простых реагентов. Способ таким образом требует очень небольших затрат. Масштаб синтеза является легкорасширяемым. Реакция с протеином-мишенью является очень селективной.

4. Превращение HES-лактона (окисленный HES) с помощью диамина (1,4-диаминобутан) по Frie (S. Frie, Дипломная работа, Специальное высшее учебное заведение, Гамбург, 1998) в амино- HES (Е);

ацилирование амино-HES с помощью бром/иодацетангидрида без основного катализа до бром/иодацетамида (HS-реактивный HES (F));

- очистка путем диализа и сушки вымораживанием; связывание с HS-протеином путем алкилирования.

Этот путь синтеза отличается от описанного выше в п. 3 дополнительными расходами на получение HES-лактона.

СНО-реактивный HES

Ниже схематически описываются и оцениваются альтернативные способы получения СНО-реактивного HES:

1. Применение амино-HES (Е) в качестве СНО-реактивного HES (G);

- связывание с СНО-протеином путем восстановительного аминирования.

Этот синтез очень прост и является недорогостоящим. Конкуренция внутренних лизинов может вызывать проблемы, которые можно легко контролировать за счет выбора реакционных условий.

2. Превращение HAS-лактона (окисленный HES) с помощью гидразина в гидразид (СНО-реактивный HES (Н));

- очистка путем диализа и сушки вымораживанием;

- связывание с СНО-протеином путем образования гидразона при рН 5-6; реакцию связывания предпочтительно нужно осуществлять in situ во время окислительного образования гидразона (ферментативно или химически) из остатков галактозы; необязательно осуществляют последующую восстановительную стабилизацию с помощью NaCN/ВН₃;

- ферментативное окисление галактоз предпочтительно нужно осуществлять с помощью связанного с полимером фермента для облегчения очистки от фермента.

Этот синтез очень прост и селективен (никакой конкуренции внутренних лизинов). Проблемы могут возникать по причине токсичности производных гидразина.

3. Дальнейшее превращение D или F с помощью гидрокарбоната аммония в глицинамиды (СНО-реактивные HES (Н) и (I));

- очистка путем диализа и сушки вымораживанием;

- связывание с СНО-протеином путем восстановительного аминирования.

Этот способ осуществляют в три стадии, однако, необходимы очень простые реагенты и, таким образом, он является недорогостоящим. Масштаб синтеза является легко расширяемым. Однако можно столкнуться с конкуренцией внутренних лизинов (см. выше).

4. Ацилирование амино-HES (С) или (Е) cBz-аминоуксусной кислотой с последующим гидрированием до аминоокси-HES (СНО-реактивный HES (К));

- связывание с СНО-протеином за счет оксимной связи при рН 5-6; предпочтительно реакцию связывания нужно осуществлять in situ во время окислительного образования (ферментативно или химически) из остатков галактозы;

- ферментативное окисление галактоз предпочтительно нужно осуществлять с помощью связанного с полимером фермента для облегчения очистки от фермента.

Этот синтез является дорогостоящим, однако, связывание с протеином-мишенью является таким же селективным, как в случае описанной в п. 2 реакции (никакой конкуренции внутренних лизинов).

1. Применение конъюгата из гидроксиалкилкрахмала и аллергена, в котором по меньшей мере один гидроксиалкилкрахмал ковалентно связан с аллергеном, для гипосенсибилизации.

2. Применение по п.1, причем гидроксиалкилкрахмал связан с аллергеном непосредственно или через линкер.

3. Применение по п.1, причем гидроксиалкилкрахмалом является гидроксиэтилкрахмал, гидроксипропилкрахмал или гидроксибутилкрахмал.

4. Применение по п.1, причем гидроксиэтилкрахмал имеет среднюю молекулярную массу от 1 до 300 к Да, предпочтительно среднюю молекулярную массу от 5 до 200 кДа.

5. Применение по п.1, причем гидроксиэтилкрахмал имеет молекулярную степень замещения от 0,1 до 0,8 и соотношение замещения С₂:С₆ в пределах от 2 до 20, в каждом случае в расчете на гидроксиэтильные группы.

6. Применение по п.1, причем аллерген выбран из группы, состоящей из полипептидов или протеинов.

7. Применение по п.6, причем аллергеном является гликопротеин.

8. Применение по п.7, причем гидроксиалкилкрахмал связан с полипептидной цепью или с одной или несколькими сахаридными цепями гликопротеина.

9. Применение по п.1 для гипосенсибилизации аллергиков, в случае которых обнаружена опосредованная IgE сенсибилизация или у которых наблюдались клинические симптомы.

10. Применение по п.1, причем специфическая иммунотерапия используется для лечения аллергий на пыльцу, клещей, волосы (слюну) млекопитающих, грибы, укусы насекомых, пищевые продукты и натуральный каучук/латекс.

11. Применение по п.1, причем терапия используется для лечения астматиков, страдающих сенной лихорадкой пациентов и пациентов, которые обладают другими клинически релевантными реакциями на аллергены мгновенного типа.

12. Применение по п.1, причем введение осуществляется подкожно, через слизистую оболочку, орально, перорально или подъязычно.

13. Применение по п.1, причем иммунотерапия в случае аэроаллергенов осуществляется предсезонно или постоянно.

14. Применение по п.1, причем иммунотерапия в случае аллергиков с аллергией к укусам насекомых осуществляется по Rush-способу или ультра-Rush-способу.