Последовательность днк и получение аллергена пыльцы трав phl p 4 с помощью рекомбинантных способов

Изобретение относится к генной инженерии, в частности к обеспечению генетической последовательности основного аллергена пыльцы трав Phl p 4. Фрагменты этой последовательности, комбинации ее частичных последовательностей и точечные мутанты обладают гипоаллергенным действием. Рекомбинантные молекулы ДНК и полипептиды, которые происходят от них, фрагменты, новые комбинации частичных последовательностей и варианты могут использоваться для терапии заболеваний, связанных с аллергией на пыльцу. Протеины, полученные с помощью рекомбинантных способов, могут применяться для in vitro и in vivo диагностики аллергических заболеваний на пыльцу. 12 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 6 табл.

 

Предпосылки изобретения

Настоящее изобретение относится к обеспечению генетической последовательности основного аллергена пыльцы трав Phl p 4. Изобретение также относится к фрагментам, новым комбинациям частичных последовательностей и точечным мутантам, которые обладают гипоаллергенным действием. Молекулы рекомбинантной ДНК и полипептиды, которые происходят от них, фрагменты, новые комбинации частичных последовательностей и варианты могут использоваться для терапии заболеваний, связанных с аллергией на пыльцу. Белки, полученные рекомбинантными способами, могут использоваться для in vitro и in vivo диагностики аллергических заболеваний на пыльцу.

Аллергии типа 1 являются важными во всем мире. До 20% популяции населения в промышленно развитых странах страдают от таких заболеваний, как аллергический ринит, конъюнктивит или бронхиальная астма. Эти аллергии вызываются аллергенами, присутствующими в воздухе (аэроаллергенами), которые высвобождаются из различных источников, таких как пыльца растений, клещи, коты или собаки. До 40% страдающих от аллергий такого типа, в свою очередь, демонстрируют специфическую IgE реактивность на аллергены пыльцы трав (Freidhoff и др., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190 - 2001).

Вещества, которые запускают аллергию типа 1, представляют собой белки, гликопротеины или полипептиды. После попадания в организм через слизистые оболочки эти аллергены реагируют с молекулами IgE, связанными с поверхностью тучных клеток у чувствительных индивидуумов. Если две молекулы IgE являются поперечно связанными между собой с помощью аллергена, то это приводит к высвобождению медиаторов (например, гистамина, простагландинов) и цитокинов эффекторной клеткой и, таким образом, к соответствующим клиническим симптомам.

Разграничение делается межу основными и второстепенными аллергенами в зависимости от относительной частоты, с которой индивидуальные молекулы аллергенов вступают в реакцию с антителами IgE у особей, которые страдают от аллергии.

В случае тимофеевки луговой (Phaleum pratense). Phl p 1 (Petersen и др., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796), Phl p 5 (Matthiesen и Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen и др., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 105-109), Phl p 6 (Petersen и др., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54). Phl p 2/3 (Dolecek и др., 1993, FEBS 335 (3), 299-304), Phl p 4 (Haavik и др., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta и др., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer и др., 1996 и др., J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) и Ph p 13 (Suck и др., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck и др., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402) были идентифицированы в качестве основных аллергенов.

Phl p 4 был упомянут как основной гликопротеин, обладающий молекулярным весом от 50 до 60 кДа (Haavik и др., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268). Молекула Phl p 4 является устойчивой к трипсину (Fischer и др., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198), и 70-88% особей, страдающих от аллергии на пыльцу трав, имеют IgE антитела против этой молекулы (Valenta и др., 1993, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294; Rossi и др., 2001, Allergy 56: 1180-1185; Man, 2003, Clin. Exp. Allergy 33: 43-51). Были описаны гомологичные молекулы, полученные из других родственных видов трав (Su и др., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455: Jaggi и др., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348; Jaggi и др., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83: 845-852; Leduc-Brodard и др., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072; 14-17). Эти гомологичные молекулы Роасеае образуют группу аллергенов 4, молекулы которой имеют высокую перекрестную реактивность с одним или более моноклональными мышиными антителами и с антителами IgE человека (Fahlbusch и др., 1993 Clin. Exp. Allergy 23: 51-60; Leduc-Brodard и др., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072; Su и др., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97: 210; Fahlbusch и др., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807; Gavrovic-Jankulovic и др., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6): 361-367; Stumvoll и др., 2002, Biol. Chem. 383: 1383-1396; Grote и др., 2002, Biol. Chem. 383: 1441-1445; Anderson и Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130: 87-107; Mart, 2003, Clin. Exp. Allergy, 33 (I): 43-51).

В противовес упомянутым выше основным аллергенам Phleum pratense (Phl р 1, Phl p 2/3, Phl p 5а и 5b, Phl p 6 и Phl p 13), первичная структура Phl p 4 еще не установлена. Кроме того, не получено полной последовательности молекул группы 4 из других видов трав.

Определение N-терминальной аминокислотной последовательности до настоящего времени не было успешным. Однако причина этого является неизвестной. Fischer и др. (J. Allergy Clin. Immunol., 1996; 98: 189-198) предполагают, что существует N-терминальное блокирование, однако при этом удалось очистить внутренний пептид после разложения с помощью лизилэндопептидазы и определить его последовательность: IVALPXGMLK (SEQ ID NO 7).

Этот пептид имеет гомологию с пептидными последовательностями аллергенов амброзии полыннолистной Amb a1 и Amb a2 и подобность с последовательностями в белках кукурузы (Zm58.2), томата (lat 59, lat 56) и табака (G10) (Fischer и др., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 198-198). Для основного аллергена группы 4 Lollium perenne были описаны пептидные фрагменты, которые имеют следующую последовательность: FLEPVLGLIFPAGV (SEQ ID NO 8) и GLIEFPAGV (SEQ ID NO 9) (Jaggi и др., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348).

Кроме того, были получены пептиды из аллергенов группы 4 из Dactylus glomerata с помощью ферментативного разложения, эти последовательности были секвенированы:

DIYNYMEPYVSK (P15, SEQ ID NO 10),

VDPTDYFGNEQ (P17, SEQ ID NO 11),

ARTAWVDSGAQLGELSY (P20, SEQ ID NO 12) и

GVLFNIQYVNYWFAP (P22, SEQ ID NO 13) (Leduc-Brodard и др., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072).

С помощью протеолиза были также получены пептиды из группы 4 аллергенов субтропической бермудской травы (Cynodon dactylon), их подвергали секвенированию:

KTVKPLYIITP (S, SEQ ID NO 14),

KQVERDFLTSLTKDIPQLYLKS (V49L, SEQ ID NO 15),

TVKPLYIITPITAAMI (T33S, SEQ ID NO 16),

LRKYGTAADNVIDAKVVDAQGRLL (T35L, SEQ ID NO 17),

KWQTVAPALPDPNM (P2, SEQ ID NO 18),

VTWIESVPYIPMGDK (V26L, SEQ ID NO 19),

GTVRDLLXRTSNIKAFGKY (L25L, SEQ ID NO 20),

TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS (T22L, SEQ ID NO 21),

YRDLDLGVNQVVG (P3, SEQ ID NO 22),

SATPPTHRSGVLFNI (V20L, SEQ ID NO 23), и

AAAALPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD (V14L, SEQ ID NO 24) (Liaw и др., 2001, Biochem. Biophys. Research Communication 280: 738-743).

Однако эти описанные пептидные последовательности для Phl p 4 и аллергенов группы 4 до настоящего времени не приводили к выяснению полной первичной структуры аллергенов группы 4.

Объект, на котором основывается настоящее изобретение, таким образом, заключается в обеспечении полной последовательности ДНК Phl p 4 и соответствующей рекомбинантной ДНК, на основе которой аллерген Phl p 4 может экспрессироваться как белок и становится доступным для фармакологического применения как таковой или в модифицированной форме.

Список фигур

Фигура 1: Внутренняя последовательность ДНК (SEQ ID NO 25) гена Phl p 4. Ампликоны, полученные с помощью геномной ДНК, клонировали с вырожденными праймерами №30 (смысловой) и №37 (антисмысловой), оба представлены в скобках, после чего секвенировали. Представленные последовательности представляют общий типичный элемент из 6 клонов. Специфический смысловой праймер №82, полученный из этой последовательности, представлен с помощью подчеркивания.

Фигура 2: 3′-конец последовательности нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO 26) гена Phl p 4

Ампликоны были получены при использовании специфического смыслового праймера №82 (представлен в скобках) и анкерного праймера в 3′-RACE ПЦР с кДНК Phleum pratense, после чего их подвергали секвенированию. Показанная последовательность представляет собой общий типичный элемент, полученный из 3 процессов секвенирования и охватывает 3′-конец гена Phl p 4 до стоп кодона (подчеркнут двойной чертой). Границы последовательности, используемые для конструирования антисмысловых праймеров №85 и №86, представлены подчеркнутыми.

Фигура 3: Расположение пептидов Phl p 4 в дедуцированной аминокислотной последовательности аллергена Phl p 4 (SEQ ID NO 2).

Пептиды P1-P6 (SEQ ID NO 27-32), полученные из аминокислотного секвенирования очищенного и фрагментированного аллергена Phl p 4, могут однозначно быть определены для аминокислотной последовательности гена Phl p 4, который имеет происхождение от этой последовательности нуклеиновой кислоты.

Фигура 4: Определение идентичности рекомбинантного Phl p 4 (rPhl p 4) с помощью моноклональных антител 5Н1 (блот А) и 3С4 (блот В), которые являются специфическими для nPhl p 4, при использовании анализа Вестерн-блоттинга.

Полоса 1: Общий экстракт Е.coli, содержащий фрагмент 1-200 rPhl p 4

Полоса 2: Общий экстракт E.coli, содержащий фрагмент 185-500 rPhl p 4

Полоса 3: Общий экстракт E.coli, содержащий rPhl p 4

Полоса 4: Очищенный nPhl p 4 из Phleum pratense

(←): терминальные или расщепленные фрагменты С-терминального фрагмента rPhl p 4 или цельной молекулы rPhl p 4

Фигура 5: Определение реактивности рекомбинантного Phl p 4 (rPhl p 4) при использовании IgE из сыворотки крови особей, страдающих аллергией на пыльцу трав, с помощью анализа Вестерн-блоттинга. Экстракты трансформированных клеток E.coli, которые экспрессируют либо полный ген Phl р 4, либо N-терминальный фрагмент 1-200, либо С-терминальный фрагмент 185-500, разделяли в SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозные фильтры. Блоты инкубировали с сывороткой крови, полученной от доноров А, В или С, которые страдают аллергией на пыльцу трав, связанный IgE последовательно определяли колориметрическим способом при использовании античеловеческого антитела IgE, конъюгированного со щелочной фосфатазой.

Полоса 1: Общий экстракт E.coli, содержащий фрагмент 1-200 rPhl p 4

Полоса 2: Общий экстракт E.coli, содержащий фрагмент 185-500 rPhl p 4

Полоса 3: Общий экстракт E.coli, содержащий rPhl p 4

Полоса 4: Очищенный nPhl р 4 из Phleum pratense

Номера, используемые выше и ниже для нуклеотидных или аминокислотных последовательностей "SEQ ID NO", относятся к списку последовательностей, приложенному к описанию.

Описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает, в первую очередь, генетическую последовательность основного аллергена Phl p 4 пыльцы трав с тремя обнаруженными доминантными последовательностями (SEQ ID NO 1, 3 и 5), полученными в результате полиморфизмов одного нуклеотида (SNP).

Таким образом, настоящее изобретение относится к молекуле ДНК, соответствующей нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 5, и молекулы ДНК, соответствующей нуклеотидной последовательности, которая кодирует основной аллерген Phl p 4 из Phleum pratense.

Изобретение также охватывает фрагменты, новые комбинации или частичные последовательности, а также точечные мутанты, которые обладают гипоаллергенным действием.

Изобретение, таким образом, относится к соответствующим частичным последовательностям, комбинации частичных последовательностей или мутантов, полученных на основе замен, удаления или присоединения, которые кодируют иммуномодуляторный, реактивный по отношению к Т-клеткам фрагмент аллергенов группы 4 Роасеае.

В дополнение к группе 4 аллергенов других видов трав группа 13 аллергенов также представляет собой интерес в связи с настоящим изобретением, поскольку они демонстрируют очень близкий к аллергенам группы 4 молекулярный вес при определении методом SDS-PAGE и трудно разделяются с помощью биохимических способов (Suck и др., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332, Suck и др., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). С помощью белковой последовательности и ДНК последовательности в соответствии с изобретением, которые в настоящее время впервые стали доступными, можно однозначно показать, что группы 4 и 13 являются существенно различными аминокислотными последовательностями.

При наличии знаний о последовательности ДНК природных аллергенов в настоящее время стало возможным получить эти аллергены как рекомбинантные белки, которые могут использоваться для диагностики и терапии аллергических заболеваний (Scheiner и Kraft, 1995, Allergy 50: 384-391).

Классический подход к эффективному терапевтическому лечению аллергий представляет собой специфическую иммунотерапию или гипочувствительность (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet и др., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4): 558-562). В соответствии с этим способом пациенту подкожно вводят экстракты природного антигена в увеличивающихся дозах. Однако при использовании такого способа существует риск аллергических реакций или даже анафилактического шока. Для того чтобы минимизировать этот риск, используются прогрессивные препараты в форме аллергоидов. Они представляют собой химически модифицированные экстракты, которые обладают значительно сниженной IgE реактивностью, но идентичной реактивностью Т-клеток по сравнению с необработанными экстрактом (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382).

Даже более существенная оптимизация терапии будет возможна с помощью аллергенов, полученных при использовании рекомбинантных способов. Определенные смеси аллергенов с высокой степенью очистки, которые приготовлены с помощью рекомбинантных способов, необязательно приравниваемых к индивидуальным моделям сенсибилизации пациентов, могут заменять экстракты из природных источников аллергенов, в дополнение к различным аллергенам они содержат относительно высокое количество иммуногенных, но неаллергенных вторичных белков.

Реальные перспективы, которые могут приводить к достоверной гипосенсибилизации с помощью продуктов экспрессии, предлагаются в виде специфично мутированных рекомбинантных аллергенов, в которых эпитопы IgE являются специфическим образом делегированными без повреждения эпитопов Т-клеток, которые являются существенными для терапии (Schramm и др., 1999, Immunol. 162: 2406-2414).

Дальнейшая возможность для терапевтического влияния на равновесие возбужденных ТН-клеток у больных, страдающих аллергией, представляет собой иммунотерапевтическую ДНК вакцинацию. Такая вакцинация вовлекает обработку способной к экспрессии ДНК, которая кодирует релевантные аллергены. Исходное экспериментальное подтверждение аллерген-специфического влияния на иммунный ответ было предоставлено на грызунах с помощью инъекции ДНК, кодирующей аллерген (Hsu и др., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544).

Настоящее изобретение, таким образом, относится к молекуле ДНК, которая описана выше или ниже, или к соответствующему рекомбинантному экспрессионному вектору в качестве лекарственного средства. Соответствующие белки, полученные с помощью рекомбинантных способов, могут использоваться для терапии и для in vitro и in vivo диагностики аллергий на пыльцу.

С целью получения рекомбинантного аллергена клонированную нуклеиновую кислоту лигировали к экспрессинному вектору, и эту конструкцию экспрессировали в приемлемом хозяйском организме. После биохимической очистки этот рекомбинантный аллерген является доступным для определения с помощью антител IgE при использовании известных способов.

Настоящее изобретение, таким образом, также относится к рекомбинантному экспрессионному вектору, который содержит молекулу ДНК, описанную выше или ниже, функционально связанную с экспрессионной контрольной последовательностью, и организму хозяина, трансформированному с помощью указанной молекулы ДНК или с помощью указанного экспрессионного вектора.

Изобретение также относится к применению, по крайней мере, одной молекулы ДНК, описанной выше или ниже, или, по крайней мере, одного экспрессионного вектора, описанного выше, для получения лекарственного средства для иммунотерапевтической ДНК вакцинации пациентов, имеющих аллергии, в запуск которых вовлечены аллергены группы 4 Роасеае, и/или для предотвращения таких аллергий.

Как уже было указано, изобретение также может использоваться в качестве существенного компонента при получении препарата, содержащего рекомбинантный аллерген или нуклеиновую кислоту, для специфической иммунотерапии. В данном случае существует целый ряд возможностей. Во-первых, белок с незаряженной первичной структурой может быть составной частью препарата. Во-вторых, посредством специфической делеции эпитопов IgE цельной молекулы или получения индивидуальных фрагментов, которые кодируют эпитопы Т-клеток, может использоваться гипоаллергенная (аллергоидная) форма в соответствии с изобретением для терапии для того, чтобы предотвратить нежелательные побочные эффекты. Наконец, нуклеиновая кислота сама по себе, если лигирована с эукариотическим экспрессионным вектором, дает препарат, который при непосредственном применении модифицирует аллергическое иммунное состояние в терапевтическом смысле.

Таким образом, изобретение относится к рекомбинантным молекулам ДНК, которые соответствуют SEQ ID NO 1, 3 или 5, где нуклеотидная последовательность в положениях 1-69 имеет происхождение от аминокислотной последовательности N-терминального конца Phl p 4. При этом тут используются кодоны, преимущественные для E.coli. От положения 70 последовательность соответствует таковой, которая была идентифицирована в геномной ДНК и кДНК Phleum pratense. Настоящее изобретение, таким образом, также относится к молекуле ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 или SEQ ID NO 5, начиная от положения 70, которая кодирует полипептид, обладающий свойствами основного аллергена Phl p 4 из Phleum pratense.

Кроме того, настоящее изобретение относится к полипептиду, кодируемому одним или более описанными выше молекулами ДНК, предпочтительно в случае, когда они используются в качестве лекарственного средства.

Они представляют собой, в частности, полипептиды в соответствии с SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 или SEQ ID NO 6, где положения аминокислот 1-33 были определены с помощью N-терминального секвенирования аминокислот изолированного природного аллергена Phl p 4. Положения 24-500 имеют происхождение от последовательности ДНК в соответствии с SEQ ID NO 1, 3 и 5. Вариабельные аминокислоты в положениях 6, 7, 8 и 9 происходят от N-терминального белкового секвенирования различных препаратов природного Phl р 4 (Таблица 1). В соответствии с этим изобретение также относится к способу получения полипептидов такого типа с помощью культивирования хозяйского организма в соответствии с пунктом 11 и изоляции соответствующего полипептида из культуры.

Изобретение также относится к применению, по крайней мере, одного полипептида, описанного выше, для получения лекарственного средства для диагностики и/или лечения аллергий, в запуск которых вовлечены аллергены группы 4 Роасеае, и для предотвращения таких аллергий.

Эти полипептиды или белки в соответствии с изобретением, которые действуют в качестве аллергенов для человека, присутствуют в пыльцевых зернах Phleum pratense. Пыльцевые зерна других видов Роасеае, таких как, например, Lollium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus, среди прочих, содержат гомологичные молекулы аллергена (группа 4 аллергенов).

Гомология этих молекул была продемонстрирована через их иммунологическую перекрестную реактивность как с мышиными моноклональными антителами, так и с человеческими антителами IgE.

Следовательно, изобретение также относится к последовательностям, которые являются гомологичными последовательности ДНК Phl p 4 и соответствующим молекулам ДНК аллергенов группы 4 из других растений рода Роасеае, таких как, например, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus, Triticum aestivum и Hordeum vulgare, которые благодаря существующей гомологии последовательностей гибридизуются с ДНК Phl p 4 в жестких условиях или имеют перекрестную иммунологическую реактивность по отношению к Phl p 4.

Следующий способ осуществляли при определении белковой последовательности и последовательности ДНК Phl p 4.

Природный аллерген Phl p 4 очищали и изолировали с помощью описанных способов (Fahlbusch и др. 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807, Suck и др. 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). Микроочистку и удаление незначительных количеств аллергенов группы 13 осуществляли с помощью способа, описанного Suck и др. (2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). Аминокислотную последовательность N-терминального конца этого Phl p 4, изолированного из Phleum pratense, определяли с помощью разложения Эдмана. N-терминальные последовательности (Р1а - f), представленные в Таблице 1, определяли с помощью различных серий Phl p 4. Согласованная последовательность для первых 15 положений рассматривается как следующая последовательность: YFPP′P′AAKEDFLGXL (SEQ ID NO 33). Положение 14 нельзя определить; вероятно, это положение занимает цистеин. Различные аминокислоты в положениях 6, 7, 8 и 9 в различных сериях отображают вариации в смысле изоформ. Положения 4 и 5 заняты гидроксипролином (P′), что было однозначно определено с помощью специфических анализов препаратов р1-а и -b.

Обработка Phl p 4, денатурированного в SDS, эндопептидазой Glu-C (Promega, Heidelberg, Germany) давала различные пептиды. Аминокислотные последовательности, показанные в Таблице 1, определяли для двух пептидов (Р2 и Р3). Два пептида (Р4 и Р5) очищали при использовании расщепления с применением эндопептидазы Lys-C (Roche, Mannheim, Germany), после этого осуществляли секвенирование (Таблица 1). Дополнительный пептид (Р6) изолировали с помощью CNBr расщепления и определяли аминокислотную последовательность (Таблица 1).

Аминокислотные последовательности N-терминального конца и внутренних пептидов 2 и 6 использовали в качестве основы для конструирования вырожденных праймеров. Ампликоны получали со смысловым праймером №30 и антисмысловым праймером №37 (Таблица 2) при использовании геномной ДНК из Phleum pratense. Клоны, полученные из этих ампликонов, подвергали секвенированию (Фиг.1) и использовали для конструирования специфического смыслового праймера №82 (Таблица 2). Используя кДНК, полученную из репрезентативной популяции мРНК пыльцы Phleum pratense, и специфический смысловой праймер №82 в соответствии с изобретением, а также анкерный праймер AUAP (Life Technologies, Karlsruhe, Germany), осуществляли ПЦР в жестких условиях. Этот ампликон размером 450 кб подвергали секвенированию, а отсутствующую последовательность, таким образом, идентифицировали как 3′-конец гена Phl p 4 (Фиг.2). Основываясь на этой С-терминальной последовательности гена Phl р 4, определенной в соответствии с изобретением, конструировали специфические антисмысловые праймеры №85 и №86 (Таблица 2). Основываясь на N-терминальной аминокислотной последовательности пептида P1-a Phl p 4 (Таблица), конструировали вырожденный смысловой праймер №29, который имеет происхождение от ДНК, кодирующей аминокислоты в положениях 24-33 (LYAKSSPAYP (SEQ ID NO 34)).

ПЦР осуществляли с праймерами №29 и №86 при использовании геномной ДНК Phleum pratense. Этот продукт ПЦР использовали в качестве основы для второй ПЦР (гнездной ПЦР) с праймерами №29 и №85. Ампликоны встраивали в вектор pGEM T-easy (Promega, Heidelberg, Germany), подвергали клонированию и секвенированию. Эта последовательность начиналась в положении 24, рассчитанном для N-терминального конца, или положении 70 последовательности ДНК в соответствии с SEQ ID NO 1, 3 или 5 и простиралась до праймера №85 (положение 1402 в SEQ ID NO 1, 3 или 5), эта последовательность локализовалась в уже определенной С-терминальной части гена Phl p 4. Используя эти данные, может быть сконструирована полная аминокислотная последовательность молекулы Phl p 4 из первых 33 аминокислотных положений, определенных с помощью секвенирования белка, и дедуцирована в аминокислотную последовательность (477 положений), которая имеет происхождение от клонов, полученных с помощью праймеров №29/№85 и №82/анкерного праймера. Два клона перекрывались в 197 положениях своими нуклеотидными последовательностями. Пептид, кодируемый клоном №29/№85, перекрывался в 10 аминокислотных положениях с N-терминальной последовательностью (положения 1-33), определенной с помощью непосредственного аминокислотного секвенирования Phl р 4, при этом аминокислоты определяли с помощью двух соответствующих методов.

Аминокислотная последовательность Phl р 4, основанная на непосредственно определенных N-терминальных аминокислотах и дедуцированной аминокислотной последовательности, соответствовала последовательностям, приведенным в списке последовательностей под номерами SEQ ID NO 2, 4 и 6.

Продукты ПЦР получали со специфическим смысловым праймером №86 (Таблица 2) и специфическим антисмысловым праймером №86 при использовании как геномной ДНК, так и кДНК из Phelum pratense, после чего их подвергали непосредственному секвенированию.

Это позволяло исключить ошибки и обнаружить генетические вариации при проведении ПЦР (полиморфизмы одного нуклеотида).

Полиморфизмы одного нуклеотида были обнаружены для последовательности ДНК SEQ ID NO 1 представлены в Таблице 3. Некоторые из этих полиморфизмов одного нуклеотида приводили к получению модифицированных аминокислот. Таковые представлены в Таблице 4. Кроме того, клоны ДНК, которые приводят к расхождению аминокислот в отношении доминантных последовательностей SEQ ID NO 2, 4 и 6, подвергали секвенированию (Таблица 5). Эти вариации аминокислот считаются изоформами молекулы Phl p 4. Существование таких изоформ ожидается благодаря гетерогенному изоэлектрическому поведению природного Phl p 4. Все аллергены пыльцы, известные до сих пор, имеют такие изоформы. Тот факт, что фрагмент ДНК, определяемый праймерами №29 и №86, на самом деле кодирует белок, который является идентичным с природным аллергеном Phl p 4, может также быть продемонстрирован, среди прочих, тем, что гомологичные пептидные последовательности в дедуцированной аминокислотной последовательности рекомбинантной молекулы Phl p 4 в соответствии с изобретением обнаружены для идентифицированных внутренних пептидов Р3, Р4 и Р5 (Таблица 1) природного Phl p 4. Описанная аминокислотная последовательность Phl p 4 показывает, что это основная молекула, которая имеет рассчитанную изоэлектрическую точку 8,99 (SEQ ID NO 2), 8,80 (SEQ ID NO 4) или 9,17 (SEQ ID NO 6), при этом эта молекула состоит из 500 аминокислот. Количественный аминокислотный состав представлен в Таблице 6. Рассчитанный молекулярный вес рекомбинантного Phl p 4 составляет 55,762 (SEQ ID NO 2), 55,734 (SEQ ID NO 4) или 55,624 (SEQ ID NO 6) дальтон. Этот рассчитанный молекулярный вес очень хорошо согласуется с молекулярным весом природного Phl p 4, который составляет 55 кДа, указанный молекулярный вес определен с помощью SDS-PAGE (Fahlbusch и др., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807 и Suck и др., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).

Молекулярные веса в пределах от 50 до 60 кДа также были описаны для группы аллергенов 4 родственных видов трав (Su и др., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455; Jaggi и др., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348; Jaggi и др., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83: 845-852; Leduc-Brodard и др., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072; 14-17).

Для получения рекомбинантного белка Phl р 4 последовательности ДНК в соответствии с SEQ ID NO 1, 3 и/или 5, кодирующие Phl p 4 встраивали в экспрессионные векторы (например, pProEx, pλCro, pSE 380). Для N-терминальных аминокислот, определенных в результате секвенирования, использовали оптимизированные для Е.coli кодоны.

После трансформации в Е.coli, экспрессии и очистки рекомбинантного Phl р 4 с помощью различных способов разделения белок подвергали процессу повторной сборки.

Этот белок rPhl p 4, полученный таким образом, давал одну полоску при проведении SDS-PAGE, которая соответствовала тому же весовому интервалу, что и для природного Phl р 4. Иммунологическая реактивность rPhl p 4 была продемонстрирована с помощью реакции с мышиными моноклональными антителами 5Н1 и 3С4, которые были индуцированы при использовании природного Phl p 4 и перекрестной реакции с гомологичными белками (группа 4) Poaceae (Fahlbusch и др., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807; Gavrovic-Jankulovic и др., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6): 361-367) (Фиг.4). rPhl p 4 реагирует с антителами IgE у пациентов, страдающих аллергией, которые демонстрируют IgE реактивность с природным Phl p 4. Эта IgE реактивность и, таким образом, действие в качестве аллергена было продемонстрировано как в точечном тесте, Вестерн-блоттинге, так и после адсорбции аллергена на полистироловых микротитровальных планшетах. Определение с помощью Вестерн-блоттинга представлено на Фигуре 5. При проведении реакции rPhl p 4 с базофилами пациентов, страдающих аллергией и реактивных по группе 4 аллергенов пыльцы трав, было показано, что базофилы стимулируются с увеличением экспрессии активационного маркера CD 203с. Эта активация базофилов с помощью rPhl p 4 ясно показывает, что эта молекула функционально действует в качестве аллергена. Этот rPhl p 4 аллерген может, таким образом, использоваться для высокоспецифической диагностики пациентов, страдающих аллергией на пыльцу трав. Такая диагностика может быть осуществлена в условиях in vitro с помощью определения специфических антител (IgE, IgG1-4, IgA) и реакции с IgE-нагруженными эффекторными клетками (например, базофилами крови) или в условиях in vivo с помощью тестовой кожной реакции и провокации на реакционном органе.

Реакция rPhl p 4 с Т-лимфоцитами пациентов, страдающих от аллергии, может быть определена с помощью аллерген-специфической стимуляции Т-лимфоцитов с целью пролиферации и синтеза цитокинов Т-клетками как в свежеприготовленных лимфоцитах крови, так и в известных линиях и клонах Т-клеток, реактивных по nPhl p 4.

Основываясь на описанной ДНК последовательности rPhl р 4, клонировали частичные последовательности, кодирующие пептиды, имеющие от 50 до 350 аминокислот, в экспрессионные векторы. Эти частичные последовательности охватывали последовательно полную последовательность rPhl р 4 при перекрывании, по крайней мере, 12 наличествующих аминокислот. Экспрессированные пептиды соответствовали фрагментам Phl р 4. Эти Phl р 4 фрагменты не реагировали индивидуально или как смесь с IgE антителами больных, страдающих аллергией, или реагировали только до некоторой степени, так, что они могли быть классифицированы как гипоаллергенные. В противовес этому, смесь этих фрагментов способна в той же степени, что и полный рекомбинантный или природный Phl р 4, стимулировать Т-лимфоциты больных, страдающих аллергией на пыльцу трав, имеющих реактивность по отношению к Phl р 4.

Фигура 4 показывает в качестве примера характеристику двух таких фрагментов Phl р 4, соответствующих аминокислотам 1-200 и 185-500 при связывании с Phl р 4-специфическими моноклональными мышиными антителами. С-терминальный фрагмент 185-500 реагирует только с моноклональным антителом 5Н1, в то время как N-терминальный фрагмент 1-200 четко реагирует с моноклональным антителом 3С4. Из Фигуры 5 можно увидеть, что фрагмент 185-500 реагирует не так сильно с IgE из сыворотки крови больных, страдающих аллергией В и С, то есть является менее аллергенным, чем фрагмент 1-200, который имеет сниженную IgE реактивность (гипоаллергенность), по крайней мере, с сывороткой пациентов С.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к молекуле ДНК, описанной выше и ниже, кодирующей фрагмент 1-200, с аминокислотами 1-200 Phl р 4, и молекуле ДНК, кодирующей фрагмент 285-500 с аминокислотами 285-500 Phl р 4.

Триплеты, кодирующие цистеины, были модифицированы с помощью сайт-специфического мутагенеза таким образом, что они кодируют другие аминокислоты, предпочтительно серин. Готовили оба варианта, в которых индивидуальные цистеины были заменены, и те, в которых различные комбинации двух цистеиновых радикалов или все 5 цистеинов были модифицированы. Экспрессированные белки таких цистеиновых точечных мутантов имели значительно сниженную или нулевую реактивность с IgE антителами больных, страдающих аллергией, но реагировали с Т-лимфоцитами таких пациентов. Настоящее изобретение, таким образом, также относится к молекуле ДНК, описанной выше и ниже, в которой один, более или все цистеиновые радикалы соответствующего полипептида были заменены другой аминокислотой с помощью сайт-специфического мутагенеза.

Иммуномодуляторная активность гипоаллергенных фрагментов, которые соответствуют полипептидам, имеющим эпитопы Т-клеток, и такие гипоаллергенные точечные мутанты (например, цистеиновые полиморфизмы) были продемонстрированы с помощью их реакции с Т-клетками больных, страдающих аллергией на пыльцу трав.

Такие гипоаллергенные фрагменты или точечные мутанты цистеинов могут быть использованы в качестве препаратов для гипосенсибилизации больных, страдающих аллергией, поскольку они реагируют с равной эффективностью с Т-клетками, но благодаря сниженной или полностью отсутствующей IgE реактивности приводят к снижению побочных эффектов, опосредованных антителами IgE.

Если нуклеиновые кислоты, кодирующие гипоаллергенные варианты Phl p 4 или немодифицированную ДНК, кодирующую Phl p 4, лигировали с экспрессионным вектором человека, то такие конструкции могли также использоваться в качестве препаратов для иммунотерапии (ДНК вакцинация).

Наконец, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат, по крайней мере, одну молекулу ДНК, описанную выше, или, по крайней мере, один экспрессионный вектор, описанный выше, и необязательно также активные ингредиенты и/или адъюванты для иммунотерапевтической ДНК вакцинации пациентов, которые имеют аллергии, в запуск которых вовлечены аллергены группы 4 Роасеае, и/или для предотвращения таких аллергий.

Дополнительная группа фармацевтических композиций в соответствии с изобретением включает, вместо ДНК, по крайней мере, один полипептид, описанный выше, и является приемлемой для диагностики и/или лечения указанных аллергий.

Фармацевтические композиции в контексте настоящего изобретения включают в качестве активных ингредиентов полипептид в соответствии с изобретением или экспрессионный вектор и/или их соответствующие фармацевтически используемые производные, включая их смеси во всех соотношениях. Активные ингредиенты в соответствии с изобретением могут быть облачены в приемлемую дозированную форму вместе с, по крайней мере, одним твердым, жидким и/или полужидким наполнителем или вспомогательным веществом и необязательно в комбинации с одним или более дополнительными активными ингредиентами.

Особенно приемлемые вспомогательные вещества представляют собой иммуностимуляторную ДНК или олигонуклеотиды, которые имеют фрагменты CpG.

Такие композиции могут использоваться в качестве терапевтических агентов или диагностических агентов в медицине и ветеринарии. Приемлемые наполнители представляют собой органические или неорганические вещества, которые являются приемлемыми для парентерального введения и не оказывают неблагоприятного воздействия на активные ингредиенты в соответствии с изобретением. Особенно приемлемыми для парентерального введения являются растворы, предпочтительно те, которые основаны на масле, или водные растворы, кроме того, суспензии, эмульсии или имплантаты. Активный ингредиент в соответствии с изобретением может также быть лиофилизирован, и полученный лиофилизат используют, например, для получения инъекционных препаратов. Указанные композиции могут быть стерильными и/или включать вспомогательные вещества, такие как лубриканты, консервирующие вещества, стабилизаторы и/или смачивающие агенты, эмульгаторы, соли для модификации осмотического давления, буферные вещества и/или множество других активных ингредиентов.

Кроме того, препараты замедленного высвобождения могут быть получены с помощью соответствующей композиции активного ингредиента в соответствии с изобретением.

Изобретение, таким образом, служит для совершенствования in vitro диагностики как часть идентификации запускающего аллергенного компонента пациент-специфического спектра сенсибилизации. Изобретение также служит для получения значительно улучшенных препаратов для специфической иммунотерапии аллергий на пыльцу трав.

Значения приведены для трех доминантных последовательностей в следующем порядке SEQ ID NO 2 /SEQ ID NO 4/ SEQ ID NO 6.

1. Молекула ДНК, соответствующая нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, которая состоит из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 5, кодирующая полипептид, обладающий свойствами основного аллергена Phl p 4 Phleum pratense.

2. Молекула ДНК, включающая нуклеотидную последовательность по п.1, которая начинается с положения 70, кодирующая полипептид, обладающий свойствами основного аллергена Phl p 4 из Phleum pratense.

3. Молекула ДНК, которая гибридизуется с молекулой ДНК по п.1 или 2, в жестких условиях и имеет происхождение от последовательностей ДНК видов Роасеае.

4. Молекула ДНК, соответствующая частичной последовательности или комбинации частичных последовательностей по любому из пп.1-3, которая кодирует иммуномодуляторный, реактивный в отношении Т-клеток фрагмент аллергенов группы 4 Роасеае, выбранный из группы, которая состоит из

фрагмента 1-200 с аминокислотами 1-200 Phl p 4,

фрагмента 185-500 с аминокислотами 185-500 Phl p 4.

5. Рекомбинантный ДНК экспрессионный вектор, включающий молекулу ДНК по любому из пп.1-4, функционально связанную с контролирующей экспрессию последовательностью.

6. Рекомбинантная клонирующая система, включающая молекулу ДНК по любому из пп.1-4, функционально связанную с контролирующей экспрессию последовательностью.

7. Организм хозяина, трансформированный молекулой ДНК по любому из пп.1-4 или экспрессионным вектором по п.5, который позволяет получать полипептид, обладающий свойствами основного аллергена Phl p 4 Phleum pratense.

8. Способ получения полипептида, кодируемого последовательностью ДНК по любому из пп.1-4, путем культивирования организма хозяина по п.7 и выделения соответствующего полипептида из культуры.

9. Полипептид, обладающий свойствами основного аллергена Phl p 4 Phleum pratense, который кодируется последовательностью ДНК по любому из пп.1-4.

10. Полипептид по п.9 в качестве лекарственного средства для диагностики и лечения аллергий, в запуск которых вовлечены аллергены группы 4 Роасеае.

11. Фармацевтическая композиция, содержащая, по крайней мере, один полипептид по п.10, а также необязательно дополнительные активные ингредиенты и/или вспомогательные вещества для диагностики и лечения аллергий, в запуск которых вовлечены аллергены группы 4 Роасеае.

12. Применение, по крайней мере, одного полипептида по п.10 для получения лекарственного средства для диагноостики и лечения аллергий, в запуск которых вовлечены аллергены группы 4 Роасеае, и/или для предупреждения таких аллергий.

13. Молекула ДНК по любому из пп.1-4 в качестве лекарственного средства для диагностики и лечения аллергий, в запуск которых вовлечены аллергены группы 4 Роасеае.

14. Рекомбинантный экспрессионный вектор по п.5 в качестве лекарственного средства для диагностики и лечения аллергий, в запуск которых вовлечены аллергены группы 4 Роасеае.

15. Фармацевтическая композиция, содержащая, по меньшей мере, одну молекулу ДНК по п.13 или, по меньшей мере, один экспрессионный вектор по п.14 и необязательно дополнительные активные ингредиенты и/или вспомогательные вещества для иммунотерапевтической ДНК-вакцинации пациентов, которые имеют аллергии, в запуск которых вовлечены аллергены группы 4 Роасеае, и/или для предупреждения таких аллергий.

16. Применение, по меньшей мере, одной молекулы ДНК по п.13 или, по меньшей мере, одного экспрессионного вектора по п.14 для получения лекарственного средства для иммунотерапевтической ДНК-вакцинации пациентов, которые имеют аллергии, в запуск которых вовлечены аллергены группы 4 Роасеае, и для предотвращения таких аллергий.