Новые факторы роста фибробластов

Изобретение относится к медицине и касается применения полипептида FGF-9 или его биологически активного фрагмента для получения лекарственного средства для лечения рассеянного склероза. Полипептид может быть на 94-95% идентичен последовательности, простирающейся от аминокислоты 1 до аминокислоты 208 человеческого FGF-9, представленной на фиг.3 (SEQ ID NO: 5). Изобретение обеспечивает стимуляцию миелинизации, пролиферации и выживания нейронов, олигодендроцитов, улучшенную регенерацию нервов. 5 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл.

 

В настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой 60/251837 от 8 декабря 2000 г., которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Предпосылки создания изобретения

Факторы роста фибробластов играют важную роль в различных биологических функциях, включая, например, пролиферацию, дифференцировку и развитие клеток.

Описание изобретения

Были выявлены новые нуклеотидные, полипептидные последовательности и их регуляторные нуклеиновые кислоты, которые кодируют фактор роста фибробластов (FGF), предпочтительно FGF-20 (обозначенный в предварительной заявке, соответствующей настоящей заявке, как FGF-21) или FGF-23 (обозначенный в указанной выше публикации как FGF-22), которые представляют собой класс полипептидов, участвующих в развитии, дифференцировке и морфогенезе, например в передаче сигнала клетка-клетка, и пролиферации клеток. FGF по настоящему изобретению, его фрагменты и производные обладают одной или несколькими из приведенных далее видов биологической активности, включая (но не ограничиваясь ими): FGF-активность и FGF-специфическую иммуногенную активность. Согласно настоящему изобретению выявлены по меньшей мере два новых класса FGF, например FGF-20 и FGF-23.

Под понятием «FGF-активность» понимают, например, способность ускорять заживление ран; способность увеличивать выживание нейронов; стимуляцию клеточной пролиферации, например пролиферации стволовых клеток, фибробластов, нейронов, клеток глии, олигодендроцитов, клеток Шванна или их клеток-предшественников; модуляцию дифференцировки клеток; индукцию эмбрионального развития; стимуляцию роста невритов; повышение способности восстанавливаться после повреждения нерва или нейрона; стимуляцию миелинизации; стимуляцию ангиогенеза; активность в отношении связывания с рецептором; модуляцию онкогенеза и т.д.

Под понятием «FGF-специфическая иммуногенная активность» понимают, например, способность полипептида FGF вызывать селективный для FGF иммунологический ответ, например, иммунологический ответ, селективный для FGF-20 млекопитающих. Так, стимуляция антител, Т-клеток, макрофагов, В-клеток, дендритных клеток и т.д. аминокислотной последовательностью, выбранной из FGF млекопитающих, например FGF, представленных на фиг.1 и 2, является примером иммуногенной активности. Эти ответы можно оценивать обычными методами.

FGF, такой как FGF-20 или-23, представляет собой полноразмерный полипептид млекопитающих, имеющий аминокислотную последовательность, которую можно получать из природного источника и которая обладает одной или несколькими из вышеперечисленных видов активности. Они могут иметь последовательности, представленные на фиг.1 и 2, с открытыми рамками считывания, которые начинаются инициирующим кодоном и заканчивается стоп-кодоном. Они содержат встречающиеся в естественных условиях нормальные, встречающиеся в естественных условиях мутантные и встречающиеся в естественных условиях полиморфные, в том числе полиморфизмы одного нуклеотида (ОНП), и т.д. последовательности. Природные источники включают, например, живые клетки, например, полученные из тканей или целых организмов, культивированные линии клеток, включая первичные и иммортализованные линии клеток, полученные с помощью биопсии ткани и т.д.

Настоящее изобретение относится также в фрагментам FGF млекопитающих. Фрагменты предпочтительно являются «биологически активными». Под понятием «биологически активный» понимают, что полипептидный фрагмент обладает активностью в живой системе или в сочетании с компонентами живой системы. Виды биологической активности включают указанные выше виды активности, например PGF-активность, активность в отношении связывания с рецептором FGF и FGF-иммуногенную активность. Фрагменты можно получать с помощью любого приемлемого метода, например химического синтеза, генной инженерии, расщепления продуктов и т.д. Биологически активный фрагмент FGF включает полипептиды, которые имеют аминокислотные последовательности, выделенные или модифицированные либо на С-, либо на N-конце протеина.

Любые известные из литературы фрагменты нуклеиновых кислот и полипептидные фрагменты FGF-20 и FGF-23 или гомологи этих фрагментов исключены из объема настоящего изобретения, например фрагмент g5762262, который аналогичен последовательности, описанной для шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Известные из литературы нуклеотидные и аминокислотные последовательности доступных нуклеиновых кислот можно идентифицировать путем анализа опубликованных баз данных.

Настоящее изобретение относится также к FGF-20, который имеет выведенную последовательность аминокислот 1-211, приведенную на фиг.1, и FGF-23, который имеет выведенную последовательность аминокислот 1-169, приведенную на фиг.2. FGF-20 имеет предсказанную молекулярную массу примерно 23,5 кДа и предсказанное значение pI примерно 9,25. FGF-23 имеет предсказанную молекулярную массу примерно 19,6 кДа и предсказанное значение pI примерно 12,32.

Для протеинов степень идентичности означает количество идентичных аминокислот/на общее количество аминокислотных остаток в протеине. Степень аналогичности обозначает (количество идентичных аминокислотных остатков плюс количество замененных в результате консервативных замен аминокислот (типа V на L и т.д))/на общее количество аминокислотных остатков. Для ДНК идентичность означает то же, что и аналогичность, и обозначает количество идентичных нуклеотидов/на всю длину нуклеиновой кислоты.

Полипептид FGF по изобретению, например, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.1 и 2, можно проанализировать с использованием любых пригодных методов в отношении идентичности других структурных и/или функциональных доменов в полипептиде, включая области мембранного спэннинга, гидрофобные области. Например, полипептид FGF можно анализировать с помощью методов, описанных, например, у Kyte и Doolittle, J. Mol. Biol, 157:105, 1982; EMBL Protein Predict; Rost и Sander, Proteins, 19:55-72, 1994.

Другие гомологи FGF по настоящему изобретению можно получать с помощью различных методов из источников, взятых из организма млекопитающих или организмов, не относящихся к млекопитающим. Например, для отбора гомологов можно применять гибридизацию с олигонуклеотидами, выведенными из последовательностей, представленных на фиг.1 и 2, например, с использованием методов, описанных у Sambrook и др., Molecular Cloning, глава 11, 1989. Такие гомологи могут иметь различные количества нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, идентичных и аналогичных GENE. Относящиеся к млекопитающим организмы включают, например, грызунов, мышей, крыс, хомячков, обезьян, свиней, коров и т.д. Организмы, не относящиеся к млекопитающим, включают, например, позвоночных, беспозвоночных животных, полосатую перцину, цыплят, Drosophila, С.elegans, Xenopus, дрожжи, такие как S.pombe, S.cerevisiae, дождевые черви, прокариотические организмы, растения, Arabidopsis, вирусы, артемии и др.

Изобретение относится также к специфическим для FGF аминокислотным последовательностям, например к определенным аминокислотным последовательностям, которые входят в состав конкретных последовательностей, представленных на фиг.1 и 2, мотивам консервативных аминокислот, входящих в состав FGF по настоящему изобретению. Для отбора последовательностей, специфических для FGF, можно применять сравнительные анализы родственных протеинов, таких как другие родственные FGF (см., например, у Venkataraman и др., Proc. Natl. Acad. Sci., 96: 3658-3663, 1999).

Например, проводили сравнительный анализ последовательностей протеинов FGF-20 и -23 и на основе консервативных областей гомологии, представленных на фиг.1 и 2, получали аминокислотные мотивы. Настоящее изобретение относится к любой нуклеиновой кислоте или ее полипептидным последовательностям, например полипептидам, которые содержат 3 или более консервативных или гомологичных остатков, таких, например, как LYGS, HELP, VQGTR, RIEENGHNTY, QFEENWYNTY, AGTPSA, AAERSA и т.д. Другие специфические и/или консервативные аминокислотные последовательности можно идентифицировать с помощью общепринятых методов, например путем исследования баз данных ген/протеин с использованием набора компьютерных программ BLAST. FGF-специфическую аминокислотную последовательность или мотив можно применять для создания пептидов в виде антигенов с целью получения иммунного ответа на него. Антитела, полученные в результате такой иммунизации, можно применять в качестве специфического зонда для протеина FGF млекопитающих для диагностических или исследовательских целей.

Как отмечалось выше, полипептиды по настоящему изобретению могут содержать различные аминокислотные последовательности FGF (например, полноразмерные последовательности, т.е. последовательности, имеющие стартовый кодон и стоп кодон, как представлено на фиг.1 и 2, зрелую аминокислотную последовательность (т.е. когда полипептид FGF получают в виде предшественника, который процессируется с образованием зрелого полипептида или его фрагментов). Пригодные фрагменты включают, например, фрагменты, которые содержат или состоят практически из любого из вышеуказанных доменов и специфических и консервативных аминокислотных последовательностей.

Можно выбрать фрагмент полипептида FGF по настоящему изобретению, обладающий специфической биологической активностью, например активностью в отношении связывания с рецептором FGF или иммуногенной активностью.

Методы оценки этих активностей описаны ниже и в примерах. Эти пептиды можно идентифицировать и получать согласно методам, описанным в ЕР 496162. Пригодный фрагмент может содержать или практически состоять, например, из 9 последовательных аминокислот, предпочтительно примерно из 10, 15, 20, 30, 40 и т.д. последовательных аминокислот, представленных на фиг.1 и 2.

Полипептид по настоящему изобретению может также иметь 100%-ную или более низкую степень идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг.1 и 2. Для целей последующей дискуссии понятие идентичность последовательностей обозначает, что одни и те же нуклеотиды или аминокислоты, которые присутствуют в последовательности, представленной на фиг.1 и 2, присутствуют в соответствующем положении в последовательности(ях), с которой(ыми) проводится сравнение. Полипептид, последовательность которого идентична менее чем на 100% аминокислотным последовательностям, представленным на фиг.1 и 2, может содержать различные замены относительно встречающейся в естественных условиях последовательности, включая замены гомологичных и негомологичных аминокислот. Ниже приведены примеры замен гомологичных аминокислот. Сумма идентичных и гомологичных остатков, деленная на общее количество остатков в последовательности, с которой осуществляют сравнение полипептида FGF, равна проценту сходства последовательностей. Для расчета идентичности и сходства последовательностей можно их линеаризировывать и производить расчет с использованием любого требуемого метода, алгоритма, компьютерной программы и т.д., включая, например, FASTA, BLAST. Полипептид, последовательность которого идентична менее чем на 100% аминокислотным последовательностям, представленным на фиг.1 и 2, может быть идентичен этим последовательностям на 99, 98, 97, 95, 90,5, 90, 85, 70% и примерно др 60%.

Настоящее изобретение относится также к мутеинам полипептида FGF FGF-21 и -23, т.е. любому полипептиду, аминокислотная последовательность которого отличается от аминокислотной последовательности, получаемой из природного источника (фрагмент FGF млекопитающих не должен отличаться по аминокислотной последовательности от встречающегося в естественных условиях FGF, хотя он отличается по количеству аминокислот). Таким образом, мутеины полипептида FGF содержат аминокислотные замены, инсерции и делеции, включая не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты.

Мутеины аминокислотой последовательности FGF по изобретению можно получать также на основе исследования гомологии с последовательностями из баз данных генетических банков, например из Genbank, EMBL. Исследование гомологии последовательностей можно осуществлять с помощью различных методов, включая алгоритмы, на которых основана серия компьютерных программ BLAST, алгоритма Смита-Уотермана и т.д. Мутеин(ы) можно интродуцировать в последовательность путем идентификации и линеаризации аминокислот внутри определенного домена, которые идентичны и/или гомологичны для полипептидов, и последующей модификации аминокислот на основе такого сравнительного анализа последовательностей. Например, последовательность FGF по настоящему изобретению идентична последовательностям различных известных FGF, например, описанных у Venkataraman и др. в Proc. Natl. Acad. Sci, 96: 3658-3663, 1999. Сравнительный анализ последовательностей этих полипептидов, прежде всего остатков консервативных аминокислот, которые приведены в таблице 1 у Venkataraman с соавторами, позволяет выявить остатки, модификация которых, вероятно, может восстанавливать, снижать или устранять биологическую активность FGF, например способность связываться с рецептором, и т.д. Например, если сравнительный анализ последовательностей позволил выявить консервативные аминокислоты в двух или большем количестве доменов, то можно ожидать, что элиминация или замена этой(их) аминокислоты(т) окажет отрицательное воздействие на биологическую активность.

Аминокислотную замену можно осуществлять, заменяя одну гомологичную аминокислоту на другую. Гомологичные аминокислоты можно идентифицировать на основе размера их боковой цепи и степени поляризации, они включают небольшие неполярные аминокислоты: цистеин, пролин, аланин, треонин; небольшие полярные аминокислоты: серин, глицин, аспартат, аспарагин; большие полярные аминокислоты: глутамат, глутамин, лизин, аргинин; аминокислоты со средней полярностью: тирозин, гистидин, триптофан; большие неполярные аминокислоты: фенилаланин, метионин, лейцин, изолейцин, валин. Гомологичные аминокислоты можно группировать также следующим образом: аминокислоты с незаряженными неполярными R-группами: глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин; кислотные аминокислоты (отрицательно заряженные): аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; основные аминокислоты (положительно заряженные): лизин, аргинин, гистидин. Гомологичные аминокислоты включают также аминокислоты, описанные у Dayhoff в Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978 и у Argos в EMBO J. 8, 779-785, 1989.

Изобретение относится также к мутантным полипептидам и мутантным нуклеиновым кислотам, кодирующим эти полипептиды. Таким образом, настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям, представленным на фиг.1 и 2, где эти нуклеиновые кислоты кодируют полипептид, в котором аминокислота(ты) в одном или нескольких положениях заменена(ы) или удалены в результате делеции или и заменены и удалены, и полипептид, кодируемый этой нуклеиновой кислотой, обладает биологической активностью, например повышенной способностью к восстановлению нерва или нейрона после повреждения. Полипептид-мутеин и, соответственно, кодирующая его нуклеотидная последовательность может иметь аминокислотную последовательность, представленную на фиг.1 и 2, за исключением того, что в одном или нескольких положениях присутствует замена на гомологичные аминокислоты, например, в котором присутствуют 1, 5, 10, 15 или 20 замен. Воздействие модификации на указанные виды активности можно оценивать с помощью методов, которые описаны выше, ниже и которые хорошо известные специалисту в данной области. Например, в данной области известны различные методы оценки активности FGF, включая, например анализы, которые позволяют оценить выживание нервов и другие виды нейтротропной активности, например, описанные в примерах и у Kanda и др., Int. J.Devl. Neuroscience, 12(3): 191-200, 1999, и активности в отношении связывания с FGF-рецептором.

Как отмечалось выше, аминокислотные замены можно осуществлять также на основе аналогии с другими родственными FGF. Другие мутации можно выбирать общепринятым методом путем модификации или мутации нуклеотидной последовательности, представленной на фиг.1 и 2, и отбора тех мутаций, которые оказывают воздействие на одну или несколько видов активности, например, оценивая активность с помощью описанных ниже методов и примеров.

Выделенный из млекопитающих FGF по настоящему изобретению, его фрагменты или несущие замены полипептиды могут также включать различные модификации, которые представляют собой модификацию липидов, метилирование, фосфорилирование, гликозилирование, ковалентные модификации (например, R-группы аминокислоты), замену аминокислоты, делецию аминокислоты или добавление аминокислоты. Модификации полипептида можно осуществлять с помощью различных методов, включая рекомбинацию, синтетические, химические и другие методы.

Полипептиды по настоящему изобретению (например, полноразмерные, их фрагменты, их мутанты) можно использовать для различных целей, например в анализах, в качестве иммуногенов для получения антител, как описано ниже, в качестве биологически активных агентов (например, обладающих одной или несколькими видами активности, связанной с FGF по настоящему изобретению).

Полипептид PGF по настоящему изобретению, его производное или фрагмент можно объединять с одним или несколькими структурными доменами, функциональными доменами, доменами, которые можно обнаружить, антигенными доменами и/или с представляющим интерес требуемым полипептидом в порядке, который не встречается в природе, т.е. он может представлять собой не встречающийся в естественных условиях полипептид. Полипептид, обладающий указанными особенностями, представляет собой химерный или слитый полипептид. Такой химерный полипептид можно получать с помощью различных методов, включая химические, синтетические, квазисинтетические методы и/или методы рекомбинации. Химерная нуклеиновая кислота, кодирующая химерный полипептид, может содержать непрерывные различные домены или области требуемых полипептидов (например, с множеством N-концевых доменов для стабилизации или повышения активности), или они могут прерываться открытой рамкой считывания, например могут содержать интроны, сайты сплайсинга, энхансеры и т.д. Химерную нуклеиновую кислоту можно получать с помощью различных методов (см., например, патент США 5439819). Домен или требуемый полипептид может обладать любым необходимым свойством, включая биологическую функцию, такую как передача сигнала, усиление роста, направленный перенос в клетке (например, сигнальная последовательность, последовательность, осуществляющая направленный перенос, например направленный перенос в эндоплазматический ретикулум или ядро) и т.д., структурную функцию, такую как гидрофобную, гидрофильную, функцию мембранного спэннинга и т.д., функции рецепторного лиганда и/или функции, которые можно обнаружить, например, при объединении с ферментом, флуоресцентным полипептидом, зеленым флуоресцентным протеином (Chalfie и др., Science, 263: 802, 1994; Cheng и др., Nature Biotechnology, 14: 1996; Levy и др., Nature Biotehnology, 14: 610, 1996) и т.д. Кроме того, полипептид или его часть можно использовать в качестве селектируемого маркера при интродукции в клетку-хозяина. Например, нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность по настоящему изобретению, можно сливать в рамке считывания с требуемой кодирующей последовательностью, и она может действовать в качестве метки для целей очистки, селекции или индикации. Область слияния может кодировать сайт расщепления для облегчения экспрессии, выделения, очистки и т.д.

Полипептид по настоящему изобретению можно согласно изобретению получать в системе экспрессии, например, in vivo, in vitro, в бесклеточной системе, рекомбинантно, путем клеточного слияния и т.д. Модификации полипептида, связанные с такими системами, включают гликозилирование, замену аминокислот (например, с помощью различных наиболее часто встречающихся кодонов), процессирование полипептида, такое как переваривание, расщепление, воздействие активности эндопептидаз или экзопептидаз, присоединение химических фрагментов, включая липиды и фосфаты и т.д.

Полипептид по настоящему изобретению можно выделять из природных источников, трансформированных клеток-хозяев (культура клеток или клетки) с помощью общепринятых методов, включая экстракцию с использованием детергентов (например, неионогенного детергента, Тритона Х-100, CHAPS, октилглюкозида, Igepal CA-630), осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотами, анион- или катионобменную хроматографию, фосфоцеллюлозную хроматографию, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, гидроксиапатитную хроматографию, лектиновую хроматографию, гель-электрофорез. При необходимости можно применять стадии рефолдинга протеина для достижения конфигурации зрелого протеина. И наконец, для стадий очистки можно применять жидкостную хроматографию высокого разрешения (ЖХВР). Полипептид FGF можно выделять также согласно методам, описанным для других протеинов FGF, хорошо известных специалистам в данной области, например согласно методам выделения различных FGF, описанных в патентах US 5604293, 5395756, 5155214, 4902782 и у Santos-Ocampo и др., J. Biol. Chem., 271: 1726-1731, 1996 (очистка FGF из бактерии-хозяина, например Е.coli). Другой подход предусматривает экспрессию FGF рекомбинантным путем с использованием аффинной метки (Flag-эпитоп, НА-эпитоп, myc-эпитоп, 6xHis, связывающий мальтозу протеин, хитиназа и т.д.) с последующей очисткой с помощью аффинной хроматографии с использованием конъюгированного антитела к метке.

Настоящее изобретение относится также к нуклеиновым кислотам, таким как ДНК и РНК, кодирующим полипептиды FGF и их фрагменты по настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота, кодирующая FGF (например, FGF-20 или -23) или его фрагмент, представляет собой нуклеиновую кислоту, которая имеет нуклеотидную последовательность, полученную из природного источника. Таким образом, она включает встречающиеся в естественных условиях нормальные, встречающиеся в естественных условиях мутантные и встречающиеся в естественных условиях полиморфные аллели (например, ОНП) и т.д. Природные источники включают, например, живые клетки, полученные из тканей и всего организма, опухоли, культивируемые линии клеток, включая первичные и иммортализованные линии клеток.

Нуклеотидная последовательность по изобретению может содержать полную кодирующую последовательность, представленную на фиг.1 и 2, их вырожденные последовательности и их фрагменты. Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может также представлять собой нуклеиновую последовательность, комплементарную на 100%, например антисмысловую последовательность, любой указанной выше или ниже нуклеотидной последовательности.

Нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению можно получать из широкого разнообразия различных источников. Ее можно получать из ДНК или РНК, например полиаденилированной мРНК, например, выделенных из тканей, клеток или всего организма. Нуклеиновую кислоту можно получать непосредственно из ДНК или РНК или из библиотеки кДНК. Нуклеиновую кислоту можно получать из клетки или ткани (например, из сердца эмбриона или взрослой особи или из скелетных клеток или тканей) на конкретной стадии развития, имеющей требуемый генотип, фенотип и т.д.

Как описано выше для полипептида FGF, нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид по настоящему изобретению, может включать только кодирующую последовательность, кодирующую последовательность и дополнительную кодирующую последовательность (например, последовательности, кодирующие лидерный, секреторный, осуществляющий направленный перенос, обладающий ферментативной активностью, флуоресцентный или другие диагностические пептиды), кодирующие последовательности и некодирующие последовательности, например нетранслируемые последовательности на 5'- или 3'-конце, или последовательности, расположенные внутри кодирующей последовательности, например интроны. Нуклеотидная последовательность, представляющая собой нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид без перерывов, обозначает, что нуклеотидная последовательность содержит последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность FGF, и кодирующая последовательность не прерывается или в нее не входят некодирующие нуклеотиды, например отсутствует(ют) интрон(ы). Такую нуклеотидную последовательность также можно обозначать как непрерывную. Геномную ДНК, кодирующую ген FGF человека, мыши или другого млекопитающего и т.д., можно получать обычным путем.

Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может также содержать контролирующую экспрессию последовательность, функционально связанную с описанной выше нуклеиновой кислотой. Понятие «контролирующая экспрессию последовательность» обозначает нуклеотидную последовательность, которая регулирует экспрессию полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, с которой она функционально связана. Экспрессию можно регулировать на уровне мРНК или полипептида. Таким образом, контролирующая экспрессию последовательность включает связанные с мРНК элементы и связанные с протеином элементы. Такие элементы включают промоторы, энхансеры (вирусные или клеточные), последовательности, связывающиеся с рибосомами, терминаторы транскрипции и т.д. Контролирующая экспрессию последовательность функционально связана с нуклеотидной кодирующей последовательностью, когда контролирующая экспрессию последовательность расположена так, что воздействует на экспрессию кодирующей последовательности или обусловливает ее экспрессию. Например, когда промотор функционально связывают с 5'-концом кодирующей последовательности, экспрессия кодирующей последовательности находится под контролем промотора. Контролирующие экспрессию последовательности могут быть гетерологичными или эндогенными относительно нормального гена.

Нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению можно выбирать на основе гибридизации нуклеиновых кислот. Способность препаратов двух одноцепочечных нуклеиновых кислот гибридизоваться друг с другом является мерой комплементарности их нуклеотидных последовательностей, например мерой спаривания нуклеотидов, таких как А-Т, G-C и т.д. Изобретение относится также к нуклеиновым кислотам и их комплементам, которые гибридизуются с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную на фиг.1 и 2. Нуклеотидная последовательность, гибридизирующаяся с последней последовательностью, должна иметь комплементарную цепь нуклеиновой кислоты или действовать в качестве матрицы для нее в присутствии полимеразы (т.е. соответствующего фермента, участвующего в синтезе нуклеиновой кислоты). Настоящее изобретение включает обе цепи нуклеиновой кислоты, например смысловую цепь и антисмысловую цепь.

Условия гибридизации можно выбирать в зависимости от нуклеиновых кислот, которые имеют требуемый уровень нуклеотидной комплементарности с нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг.1 и 2. Нуклеиновая кислота обладает способностью гибридизоваться с такой последовательностью, если уровень комплементарности между нуклеиновыми кислотами предпочтительно составляет, например, примерно 85%, более предпочтительно 90%, 92% и еще более предпочтительно 95%, 97% или 100%. Настоящее изобретение относится, в частности, к нуклеотидным последовательностям, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг.1 и 2, в расслабленных или строгих условиях гибридизации.

Нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с последовательностями FGF, можно выбирать различными путями. Например, блоты (т.е. матрицы, содержащие нуклеиновую кислоту), матричные кристаллы и другие матрицы, содержащие представляющие интерес нуклеиновые кислоты, можно инкубировать в растворе для предварительной инкубации (6xSSC, 0,5% ДСН, 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, 5х раствор Денхардта и 50% формамида) при 30°С в течение ночи, а затем гибридизовать с обнаруживаемым нуклеотидным зондом (см. ниже) в растворе для гибридизации (например, 6xSSC, 0,5% ДСН, 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося и 50% формамида) при 42°С в течение ночи, согласно известным методам. Блоты можно отмывать в строгих условиях, которые позволяют получать, например, менее 5% ошибочных спариваний комплементарных пар (например, двукратная отмывка в 0,1% SSC и 0,1% ДСН в течение 30 мин при 65°С), т.е. отбирая последовательности, идентичные на 95% или более. Другие примеры строгих условий включают (но не ограничиваясь ими) конечную отмывку при 65°С в водном буфере, содержащем 30 мМ NaCl и 0,5% ДСН. Другой пример строгих условий предусматривает гибридизацию в 7% ДСН, 0,5М NaPO₄, pH 7, 1 мМ ЭДТК при 50°С, например, в течение ночи, с последующей одной или двумя отмывками 1%-ным раствором ДСН при 42°С.

В то время как отмывки в строгих условиях дают возможность получать менее 5% ошибочных спариваний, расслабленные или менее строгие условия отмывки (например, двукратная отмывка в 0,2% SSC и 0,5% ДСН в течение 30 мин при 37°С) могут обеспечивать получение до 20% ошибочных спариваний. Другой пример условий пониженной строгости предусматривает (но не ограничиваясь им) конечную отмывку при 42°С в буфере, содержащем 30 мМ NaCl и 0,5% ДСН. Отмывку и гибридизацию можно также осуществлять согласно методам, описанным у Sambrook и др., Molecular Cloning, глава 9.

Гибридизация может также основываться на расчете температуры плавления (Tm) гибрида, полученного в результате слияния зонда и его мишени, согласно методу, описанному у Sambrook и др. Как правило, температуру плавления Tm, при которой короткие олигонуклеотиды (содержащие 18 или менее олигонуклеотидов) будут выплавляться из последовательности-мишени, получают из следующего уравнения: Tm=(количество А и Т)×2°С+(количество С и G)×4°C. Для более длинных молекул Tm=81,5+16,6log10[Na+]+0,41(%GC)-600/N, где [Na+] обозначает молярную концентрацию ионов натрия, % GC обозначает процент пар оснований GC в зонде и N обозначает длину. Гибридизацию можно осуществлять при температуре на несколько градусов ниже указанной температуры для того, чтобы иметь гарантию гибридизации зонда и мишени. Ошибочные спаривания можно получить путем дальнейшего снижения температуры.

Строгие условия можно выбирать для выделения последовательностей и их комплементов в случае, когда нуклеотидные последовательности зонда (например, олигонуклеотида FGF) и нуклеиновой кислоты-мишени комплементарны по меньшей мере примерно на 95%, предпочтительно на 97%.

Согласно настоящему изобретению нуклеиновая кислота или полипептид могут иметь одно или несколько различий в нуклеотидной или аминокислотной последовательности, представленной на фиг.1 и 2. Изменения или модификации в нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности можно осуществлять с помощью любого доступного метода, включая направленный или случайный мутагенез.

Нуклеиновая кислота, кодирующая FGF млекопитающих, такой как FGF-20 или -23, по изобретению может содержать нуклеотиды, которые присутствуют в встречающемся в естественных условиях гене, например, встречающиеся в естественных условиях полиморфизмы, нормальные или мутантные аллели (нуклеотидные или аминокислотные), мутации, обнаруженные в природной популяции млекопитающих, таких как человек, обезьяны, свиньи, мыши, крысы или кролики. Например, нуклеиновая кислота или полипептид человеческого FGF содержит нуклеотиды или аминокислоты, которые присутствуют в человеческой популяции в естественных условиях. Понятие «встречающийся в естественных условиях» подразумевает, что нуклеиновую кислоту можно получать из природного источника, например ткани или клеток животного, общей воды организма, клеток из культуры ткани, образцов, полученных для судебной медицины. Встречающиеся в естественных условиях мутации могут включать делеции (например, укороченные N- или С-концы), замены, инверсии или добавления нуклеотидной последовательности. Эти гены можно выявлять и выделять путем гибридизации нуклеиновых кислот с использованием методов, известных специалистам в данной области. Нуклеотидная последовательность, кодирующая FGF млекопитающего по изобретению, может содержать кодоны, которые присутствуют в встречающемся в естественных условиях гене, транскрипте или кДНК, например, представленные на фиг.1 и 2, или она может содержать вырожденные кодоны, которые кодируют эти же самые аминокислотные последовательности. Например, может оказаться желательным изменить кодоны в последовательности с целью оптимизации экспрессии последовательности в требуемом хозяине.

Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может представлять собой, например, ДНК, РНК, синтетическую нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид нуклеиновую кислоту, модифицированные нуклеотиды или их смеси. ДНК может представлять собой двухцепочечную или одноцепочечную ДНК. Нуклеотиды, из которых состоит нуклеиновая кислота, могут быть соединены различными известными связями, например сложноэфирной, сульфаматной, сульфамидной, фосфортиоатной, фосфорамидатной, метилфосфонатной, карбаматной и т.д. в зависимости от поставленной задачи, например, для достижения устойчивости к нуклеазам, таким как РНКаза Н, улучшенной стабильности in vivo и т.д. (см., например, патент US 5378825).

В нуклеиновых кислотах могут быть сделаны различные модификации, такие как присоединение обнаруживаемых маркеров (авидин, биотин, радиоактивные элементы), фрагментов, улучшающих гибридизацию, обнаружение или стабильность. Нуклеиновые кислоты можно также присоединять к твердым подложкам, например, к нитроцеллюлозе, магнитным или парамагнитным микросферам (например, как описано, в патентах США 5411863, 5543289; например, представляющие собой ферромагнитные, супермагнитые, парамагнитные, суперпарамагнитные подложки, подложки из оксида железа и полисахарида), к найлону, агарозе, диазотизированной целлюлозе, твердым латексным микросферам, полиакриламидам и т.д., в зависимости от требуемого метода (см., например, патенты US 5470967, 5476925, 5478893).

Следующим объектом настоящего изобретения являются олигонуклеотиды или нуклеиновые кислоты-зонды. Такие олигонуклеотиды или нуклеиновые кислоты-зонды можно применять, например, для обнаружения, количественной оценки или выделения нуклеиновой кислоты FGF млекопитающего в тестируемом образце или для идентификации гомологов FGF. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения нуклеиновые кислоты можно использовать в качестве олигонуклеотидных зондов, например, в ПЦР, методе дифференциального обнаружения, в генных чипах (например, Affymetrix GeneChips; см. патенты US 5143854, 5424186, 5874219, PCT WO 92/10092, РСТ WO 90/150070) и в других доступных методах. Обнаружение может требоваться для различных целей, включая исследование, диагностику и судебную медицину. Для целей диагностики может требоваться выявление присутствия или определение количественного содержания нуклеотидной последовательности в образце, который может быть получен из ткани, клеток, общей воды организма и т.д. Предпочтительный способ по настоящему изобретению представляет собой способ обнаружения нуклеиновой кислоты, который предусматривает контакт нуклеиновой кислоты-мишени в тестируемом образце с олигонуклеотидом в условиях, эффективных для осуществления гибридизации между мишенью и олигонуклеотидом; и обнаружение гибридизации. Олигонуклеотид по изобретению можно также использовать в амплификации синтетической нуклеиновой кислоты, такой как ПЦР (например, см. Saiki и др., Science, 241:53, 1988; патент US 4683202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis и др. (ред.), Academic Press, New York, 1990); для дифференциального обнаружения (см., например, Liang и др., Nucl. Acid. Res., 21: 3269-3275, 1993; патент US 5599672; WO 97/18454).

Обнаружение можно осуществлять при использовании комбинации с олигонуклеотидами других генов, например генов, участвующих в трансдукции сигнала, росте, развитии рака, апоптозе, или любых генов, упомянутых выше или ниже, и т.д. Олигонуклеотиды можно применять также для оценки мутаций, например, используя технологию репарации ДНК с ошибочными спариваниями, описанную в патенте US 5683877, патенте US 5656430, у Wu и др., Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 8779-8783, 1992.

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут содержать любую непрерывную нуклеотидную последовательность, представленную на фиг.1 и 2, или ее комплемент или любые последовательности или их комплементы. Эти олигонуклеотиды (нуклеиновые кислоты) по настоящему изобретению могут иметь любой требуемый размер, например, состоять из 10-200 нуклеотидов, 12-100, предпочтительно 12-50, 12-25, 14-16, по меньшей мере примерно из 15, по меньшей мере примерно из 20, по меньшей мере примерно из 25 и т.д. Олигонуклеотиды могут содержать не встречающиеся в естественных условиях нуклеотиды, например инозин, АЗТ (азидотимидин), ЗТС и т.д. Олигонуклеотиды могут быть на 100% идентичны или комплементарны последовательности, представленной на фиг.1 и 2, или могут нести ошибочные спаривания или замены нуклеотидов, например 1, 2, 3, 4 или 5 замен. Например, олигонуклеотиды могут быть идентичные на 70-99%, например идентичны на 90, 95 или 97% последовательности, представленной на фиг.1 или 2. Согласно настоящему изобретению олигонуклеотид может входить в состав набора, который включает требуемый буфер (например, фосфатный, трис-буфер и т.д.), композицию для обнаружения и т.д. Олигонуклеотид, как известно в данной области, может быть меченным с помощью радиоактивной или нерадиоактивной меток с использованием методов, приведенных в данном описании, или может быть немеченым.

Следующим объектом настоящего изобретения является нуклеотидная последовательность, уникальная для FGF млекопитающего. Под уникальной FGF-последовательностью понимают определенный порядок нуклеотидов, который встречается в FGF, например, характерный для нуклеотидных последовательностей, представленных на фиг.1 и 2, но редко или нечасто встречается в других нуклеиновых кислотах, прежде всего, не встречается в нуклеиновой кислоте животных, предпочтительно млекопитающих, таких как человек, крыса, мышь и т.д. Уникальные нуклеотидные последовательности включают последовательности или их комплементы, кодирующие аминокислотные последовательности, представленные в 1 и 2 и на фиг.1 и 2. Такие последовательности можно применять в качестве зондов согласно любому из представленных в настоящем описании или включенных в него в качестве ссылки методов. Под объем изобретения подпадают как смысловые, так и антисмысловые нуклеотидные последовательности. Уникальную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению можно определять с помощью общепринятых методов. Нуклеиновую кислоту, содержащую такую уникальную последовательность, можно применять в качестве зонда для гибридизации с целью выявления присутствия, например, человеческого или мышиного FGF в образце, содержащем смесь нуклеиновых кислот, например, при использовании метода Нозерн-блоттинга. Гибридизацию можно осуществлять в строгих условиях (см. выше) для отбора нуклеиновых кислот (и их комплементов, которые могут содержать кодирующую последовательность), идентичных зонду по меньшей мере на 95% (т.е. комплементарных), но можно использовать также менее строгие условия. Уникальную нуклеотидную последовательность FGF можно также сливать в рамке считывания, либо на 5'-, либо на 3'-конце, с различными нуклеотидными последовательностями, указанными в настоящем описании, включая кодирующие последовательности других фрагментов FGF, ферментов, GFP (гамма-фетопротеин) и т.д., контролирующими экспрессию последовательностями и т.д.

Как уже было отмечено, гибридизацию можно осуществлять в различных условиях в зависимости от требуемой селективности, например, согласно методам, описанным у Sambrook и др., Molecular Cloning, 1989. Например, для специфического обнаружения FGF по настоящему изобретению олигонуклеотид можно гибридизовать с нуклеиновой кислотой-мишенью в условиях, при которых олигонуклеотид гибридизуется только с ней, например, если олигонуклеотид на 100% комплементарен мишени. Если требуется отобрать нуклеиновые кислоты-мишени, комплементарные нуклеотиду меньше чем на 100%, например комплементарные по меньшей мере примерно на 99, 97, 95, 90, 86,4, 85, 79, 67%, можно применять другие условия.

Нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению можно метить с помощью любого пригодного метода. Нуклеиновую кислоту можно метить с помощью радиоактивных меток, таких как ³²Р, ³⁵S, ¹²⁵I, ³H или ¹⁴С (указаны некоторые наиболее часто применяемые метки). Введение радиоактивной метки можно осуществлять с помощью любого метода, такого, например, как терминальное мечение 3'- или 5'-конца с помощью радиоактивно меченного нуклеотида, полинуклеотидкиназы с использованием дефосфорилирования с помощью фосфатазы или без него) или лигазы (в зависимости от конца, который должен нести метку). Можно применять также нерадиоактивное мечение, объединяя нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению с фрагментами, которые обладают иммунологическими свойствами (антигены, гаптены), специфической аффинностью в отношении определенных реагентов (лиганды), свойствами, позволяющими обнаружить завершение ферментативных реакций (ферменты или коферменты, субстраты ферментов или другие субстанции, участвующие в ферментативной реакции), или характерными физическими свойствами, такими как флуоресценция, или испускание, или абсорбция света требуемой длины волны и т.д.

Нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, включая олигонуклеотиды, антисмысловые нуклеиновые кислоты и т.д., можно применять для обнаружения экспрессии FGF в целом организме, тканях, клетках и т.д. с использованием различных методов, включая Нозерн-блоттинг, ПЦР, гибридизацию in situ, дифференциальное обнаружение, определение последовательностей нуклеиновых кислот, дот-блоттинг и т.д. Такие нуклеиновые кислоты особенно полезны для определения распределения экспрессии FGF, например специфичных для клеток и/или субклеточных изменений экспрессии. Уровни FGF можно определять индивидуально или в сочетании с другими генными продуктами, прежде всего, другими генными продуктами, участвующими в физиологии нейрона.

Нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению можно экспрессировать в ряде различных систем in vitro и in vivo в зависимости от поставленной задачи. Например, нуклеиновую кислоту можно встраивать в экспрессионный вектор, интродуцировать в требуемого хозяина и культивировать в условиях, эффективных для достижения экспрессии полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. Эффективные условия включают любые условия культивирования, которые пригодны для производства полипептида клеткой-хозяином, включая эффективные температуры, рН, среду, добавки к средам, в которых культивируют клетку-хозяина (например, добавки, которые амплифицируют или индуцируют экспрессию, такие как бутират или метотрексат, если кодирующая нуклеиновая кислота связана с геном dhfr), циклогексимид, плотность клеток, чашки для культивирования и т.д. Нуклеиновую кислоту можно интродуцировать в клетку с помощью любого эффективного метода, включая, например, метод «оголенной» ДНК, преципитацию фосфатом кальция, электропорацию, инъекцию, опосредуемую DEAE-декстраном трансфекцию, слияние с липосомами, ассоциацию с агентами, повышающими проникновение в клетки, вирусную трансфекцию. Клетка, в которую интродуцирована нуклеиновая кислота по настоящему изобретению, представляет собой трансформированную клетку-хозяина. Нуклеиновая кислота может иметь внехромосомную локализацию или может быть интегрирована в хромосому(ы) клетки-хозяина. Интеграция может быть стабильной или кратковременной. Экспрессионный вектор выбирают с точки зрения его совместимости с клеткой-хозяином. Клетки-хозяева включают клетки млекопитающих, например COS, CV1, ВНК, СНО, HeLa, LTK, NIH 3Т3, 293, РАЕ, человеческие клетки, такие как человеческий фибробласт, человеческие первичные опухолевые клетки, клетки семенников, глиомы и т.д., клетки насекомых, такие как Sf9 (S.frugiperda) и Drosophila, бактерий, таких как Е.coli, Streptococcus, бациллы, дрожжи, такие как Sacharomyces, S.cerevisiae, клетки грибов, клетки растений, эмбриональные стволовые клетки (например, клетки млекопитающих, таких как мышь или человек), нейронные стволовые клетки, фибробласты, клетки мышц, клетки сердца и Т-клетки.

Контролирующие экспрессию последовательности аналогичным образом выбирают с точки зрения их совместимости с хозяином и поставленной задачи, например для достижения большого числа копий, больших количеств, индукции, амплификации, контролируемой экспрессии. Другие последовательности, которые можно применять, включают энхансеры, такие как выделенные из ОВ-40 (обезьяний вирус 40), ЦМВ (цитомегаловирус), РСВ (респираторно-синцитиальный вирус), индуцибельные промоторы, специфические для клеточного типа элементы или последовательности, позволяющие осуществлять селективную или специфическую для клетки экспрессию. Промоторы, которые можно применять для контроля экспрессии, включают, например, эндогенный промотор, промоторы других генов, пути трансдукции сигнала в клетке, промоторы MMTV (вирус опухоли молочных желез мышей), ОВ-40, trp, lac, tac или фага Т7 для бактериальных хозяев; или промоторы альфа-фактора, алкогольоксидазы или ГГР (гипофизарный гормон роста) для дрожжей. Промоторы РНК, такие как Т7 или SP6, можно использовать для получения транскриптов РНК (см., например, Melton и др., Nucleic Acid Res., 12(18): 7035-7056, 1984; Dunn и Studier, J. Mol. Biol., 166: 427-435, 1984; патент US 5891636; Studier и др., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, 85: 60-89, 1987).

Нуклеиновую кислоту или полипептид по настоящему изобретению можно применять в качестве маркера размера в электрофорезе и хроматографии нуклеиновых кислот или протеинов и т.д. Определенные рестрикционные фрагменты можно определять сканированием последовательности в отношении сайтов рестрикции для расчета размера и осуществления соответствующего расщепления рестриктазами.

Полипептид FGF и нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению можно «выделять (изолировать)». Понятие «выделенный» означает, что полипептид FGF или нуклеиновая кислота находятся в форме, в которой они не присутствуют в их естественном окружении или в природе, например, они являются более концентрированными, более очищенными, отделенными от компонентов, присутствуют в клеточном лизате, в котором происходит экспрессия гетерологичного гена FGF. Для экспрессии FGF как гетерологичного гена в трансфектированной клеточной линии ген по настоящему изобретению интродуцируют в клетку согласно описанным выше методам, в условиях, в которых происходит экспрессия гена. Понятие «гетерологичный» означает, что ген интродуцировали в клеточную линию с «помощью человека». Пути интродукции гена в клетку описаны выше. Трансфектированную (или трансформированную) клетку, экспрессирующую ген FGF, можно лизировать согласно описанным в примерах методам и применять согласно способу по изобретению в виде лизата (т.е. в «выделенном» виде) или клеточную линию можно применять в интактном виде.

Как правило, понятие «эффективные условия» означает, например, среды, в которых достигается требуемое действие. Такие условия включают, например, буферы, окислители, восстановители, рН, кофакторы, температуру, концентрации ионов, приемлемый возраст и/или стадию клетки (например, конкретную часть клеточного цикла или конкретную стадию, на которой происходит экспрессия конкретных генов), в случае, когда используются клетки, условия культивирования (включая субстрат, содержание кислорода, диоксида углерода и т.д.).

Для повышения стабильности интродуцируемую нуклеиновую кислоту можно модифицировать, например, придавая ей устойчивость к клеточным ферментам, окислению, восстановлению, нуклеазам и т.д. или повышая ее способность проникать в клетки. Можно применять любые приемлемые агенты для модификации, включая, например, фосфоротиоаты, метилфосфонаты, фосфодиэфиры олигонуклеотида, связанные с акридиновым интеркалирующим агентом и/или гидрофобным хвостом, производные псоралена, модификации 2'-рибозы, производные пентозных сахаров, азотсодержащие производные и т.д. (см., например, патент US 5576208 и патент US 5744362). Выше описаны другие производные, модификации и т.д., которые можно применять согласно изобретению. В целом, антисмысловая нуклеиновая кислота по настоящему изобретению для повышения способности проникать в клетку и/или стабильности может содержать мономеры встречающихся в естественных условиях нуклеотидов, не встречающихся в естественных условиях нуклеотидов и их комбинации.

Антисмысловую нуклеиновую кислоту можно вводить в виде «оголенной» нуклеиновой кислоты, в виде комплекса или в инкапсулированном виде с другими агентами, которые облегчают ее проникновение в клетку, ее можно инъецировать в клетки или интродуцировать с помощью любых пригодных средств введения.

Настоящее изобретение относится также к способам применения FGF по настоящему изобретению, такого как FGF-20 и FGF-23. Такие методы предусматривают введение эффективного количества FGF или кодирующей FGF нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению хозяину для одной или нескольких следующих целей: увеличение выживания и/или пролиферации, например, нейронов, олигодендроцитов, клеток Шванна, стволовых клеток, прежде всего нейронных стволовых клеток, эндотелиальных клеток, кератиноцитов и любого типа клеток, которые обладают способностью реагировать на воздействие FGF-20 или FGF-23, например клеток, которые экспрессируют на своей клеточной поверхности родственный рецептор (такой как FGFR 1-4), или их предшественников; усиление заживления ран; модуляция дифференцировки клеток; индукция эмбрионального развития; стимуляция роста невритов; повышение способности восстанавливаться после повреждения нерва или нейрона; стимуляция миелинизации; стимуляция ангиогенеза; активность в отношении связывания с рецептором.

Настоящее изобретение относится также к показаниям и способам применения FGF по настоящему изобретению, такого как FGF-20 и FGFO-23 или нуклеиновой кислоты, кодирующей FGF. Такие способы включают введение эффективного количества FGF по настоящему изобретению пациенту для одной или нескольких следующих целей: повышение способности нерва или аксона восстанавливаться после повреждения, стимуляция миелинизации, ангиогенеза, заживления ран, заживления язв, индукция репарации дефекта кости, увеличение срока жизнеспособности трансплантатов и индукция эмбрионального развития. Вышеуказанные показания для применения связаны с потенциальной активностью FGF в отношении увеличения выживания и/или пролиферации клеток, ингибирования и/или стимуляции дифференцировки определенных типов клеток. FGF может индуцировать выживание/пролиферацию стволовых клеток, клеток-прародителей, предшественников и зрелых клеток следующего происхождения: нейроны, олигодендроциты, клетки Шванна, эндотелиальные клетки, кератиноциты и другие типы клеток, которые экспрессируют любой из рецепторов FGF. Кроме того, FGF могут индуцировать дифференцировку прародителей нейронов путем индукции роста/удлинения неврита.

Для оценки активности FGF в отношении вышеперечисленных клеточных функций можно применять следующие анализы in vitro и in vivo.

Анализы in vitro

Индукция пролиферации олигодендроцитов in vitro. Олигодендроциты, применяемые для оценки воздействий факторов роста (ФР) на пролиферацию клеток, представляют собой либо олигодендроциты созданных клеточных линий, таких как N 20.1, либо первичные олигодендроциты грызунов. Первичные олигодентроциты грызунов (крыс) и прародители олигодендроцитов можно выделять и очищать с помощью любого из следующих методов: метод дифференциальной адгезии (Mitrovic и др., 1994), центрифугирование в градиенте Перкола (Mattera и др., Neurochem. Int., 6(1):41-50, 1984 и Kim и др., J.Neurol. Sci., декабрь: 62(1-3): 295-301, 1983) и иммуносепарация. Вне зависимости от источника олигодендроцитных клеток (первичные клетки или клеточная линия) или метода их выделения и очистки анализ пролиферации олигодендроцитов можно осуществлять в течение 3, 5 и 7 дней. Позитивными контролями являются представители семейства FGF, такие как FGF-2 или FGF-9. Клеточную пролиферацию оценивают с помощью МТТ (бромида (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) и анализа включения ³Н-тимидина. Другие анализы пролиферации олигодендроцитов описаны также у Danilenko и др., Arch. Biochein. Biophys., январь 1:361(1): 34-46, 1999.

Индукция роста невритов

Анализы с использованием клеток линии PC 12. Новых представителей семейства FGF можно тестировать в отношении индукции дифференцировки и роста неврита с использованием клеточной линии PC-12 (полученной из крысиной опухоли феохромоцитомы) (Rydel, 1987, Dreen, 1976).

Кроме того, в связи с тем что часть вызываемой NGF (фактор роста нервной ткани) реакции, как установлено, является результатом аутокринного индуцируемого NGF производства FGF-2, можно оценивать воздействия новых FGF на повышающую регуляцию производства NGF клетками PC-12 (Chevet и др., J. Biol. Chem., июль, 23: 274(3): 20901-8, 1999).

Рост невритов в спинных ганглиях крыс (СГК): СГК выделяют, отсекая СГК крысиных эмбрионов и культивируя их в нейробазальных средах; спепень удлинения отростка неврита в СГК оценивают визуально и количественно, определяя количество и длину невритов по сравнению с необработанными контролями.

Анализы осуществляют на клетках фибробластов и клетках эндотелиального происхождения. Для фибробластов используют модификацию анализа пролиферации клеток линии NIH 3Т3. Для определения воздействий FGF на индукцию пролиферации эндотелиальных клеток применяют следующие клетки: клетки линии HUVEC, микроваскулярные эндотелиальные клетки и эндотелиальные клетки аорты. Анализ in vitro для определения терапевтического потенциала FGF в качестве перспективного терапевтического агента для лечения ран, язв или повреждения кости можно осуществлять согласно известным из литературы методам.

Другие анализы, которые коррелируют с регенерацией ЦНС, включают анализы активации экспрессии гена, связанной с ростом или выживанием (Meiners и др., Dev. Biol., декабрь: 160(2): 480-493, 1993), модуляции in vivo других факторов роста (Yoshida, 1992), электрофизиологический анализ модуляции нейронов (Terlau, 1990), активности в качестве митогенов или факторов дифференцировки олигодендроцитов, клеток Шванна или астроцитов (Genburger, 1987; Stemple, 1988; Kalcheim, Dev. Biol., июль: 134(1): 1-10, 1989; Murphy, 1990), активности в качестве агента, способствующего выживанию in vitro кортикальных, гиппокампальных, моторных, сенсорных, симпатических или парасимпатических нейронов (Eckstein, 1994; Unsicker и др., Ann. N.Y. Acad. Sci, 638:300-305, 1991; Grothe и др., Int. J. Dev. Biol., февраль: 40(1): 403-410, 1996), активности в качестве агента, способствующего выживанию моторных нейронов in vitro или т.п.

Анализы in vivo

Активность новых FGF в отношении стимуляция миелинизации (ремиелинизации) можно оценить, например, с помощью следующих моделей: а) модели животных с дефицитом миелина, полученные, например, путем трансплантации клеток линии SVZ из животных-доноров, обработанных FGF, в мышей с дефицитом миелина, с последующей оценкой роста олигодендроцитов in vivo; б) модели демиелинизированных животных, например животных с индуцированным PLT (типирование примированными лимфоцитами) CR-EAE (CR-экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит) и животных, у которых CR-EAE индуцирован адоптивным переносом МВР (бруцеллин) (см. также анализы, описанные у Gumpel, 1992 и Hinks и др., Mol. Cell Neurosci., август: 14(2): 153-168, 1999).

Способность FGF индуцировать регенерацию нервов и защиту нервов можно оценивать с помощью следующих моделей in vivo: механическое повреждение/поражение (рассечение пути бахромчатого свода, седалищного нерва, спинного мозга, оптического нерва и рассечение СГК); модели повреждения нерва, вызванного цереброваскулярным инсультом, таким как окклюзия сонной артерии, временная окклюзия МСАО и церебральный гипоксидно-ишемический инсульт; и химически индуцированная деградация нерва в результате индуцированных МТРТ повреждений или индуцированных КК (киановая кислота) припадков.

Как правило, анализы in vivo включают, например, оценку восстановления потери нейронов после ишемии гиппокампа (Sasaki, 1992; MacMillan и др., Can. J.Neurol. Sci, февраль: 20(1): 37-40, 1993), увеличения выживания кортикальных нейронов после перфорантных повреждений проводящего пути (Gomez-Pinilla, 1992; Peterson и др., J.Neurosci., февраль: 1:16(3): 886-898, 1996), защиту базальных холинэргических нейронов переднего мозга от повреждения, вызванного деградацией, и снижения индуцированного МРТР или индуцированного повреждениями потери нейронов черного вещества (Anderson и др., Nature, март: 24: 332(6162): 360-361, 1998; Otto, 1989; Gomez-Pinilla, 1992; Otto, 1990); и продолжительности роста клеток-прародителей нейронов in vitro в виде «нейросфер» (см. обзор Svendsen и др., Trends Neurosci., август: 22(8): 357-364, 1999). Можно использовать также модели травматического инсульта, такие как рассечение оптического нерва (Sievers, 1987); рассечение седалищного нерва (Cordeiro и др., Plast Reconstr. Surg., июнь: 83(6): 1013-1019, 1989; Khouri и др., Microsurgery, 10(3): 206-209, 1989); рассечение СГК (Aebischer и др., J.Neurosci. Res., июль: 23(3): 282-289, 1989; рассечение спинного мозга (Cheng и др., Science, июль: 26:273(5274):510-513, 1996); и повреждение лицевого нерва (Kuzis, 1990); модели цереброваскулярного инсульта, такого как церебральный гипоксидно-ишемический инсульт (MacMillen, 1993) и окклюзия МСА (Kawamata и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, июль: 22:94(15): 8179-8184, 1997; Schabitz, 1999); и другие модели деградации нерва, такие как обработка КК (киановая кислота) (Liu и др., Brain Res., октябрь: 29:626(1-2):335-338, 1993) или поражение моторного нейрона у мыши с нарушенной координацией (качающейся из стороны в сторону) (Ikeda и др., Neurol. Res., декабрь: 17(6): 445-448, 1995).

Под понятием «введение» понимают, что FGF, нуклеиновую кислоту, кодирующую FGF, или другое действующее вещество переносят к мишени, например пораженной, поврежденной ткани и т.д. FGF можно вводить в любую мишень (например, in vivo, in vitro или in situ), включая клетки в культуре и хозяев, которые имеют поражение, состояние или болезнь, подлежащие лечению, используя эффективный путь, пригодный для достижения описанного выше действия, например, содержащую FGF композицию можно вводить с помощью инъекции непосредственно в или вблизи ее области-мишени. Ее можно вводить также местно, энтерально, парентерально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, перорально, назально, интрацеребрально, интравентрикулярно, внутрь полостей, внутрь черепа, имплантировать в требуемую область, например, в форме гелеобразной пены, заполненного коллагеном проводника для нерва и т.д., в зависимости от локализации области-мишени, подлежащей обработке. FGF можно вводить также непрерывно с помощью осмотического насоса. FGF можно вводить также в виде нуклеиновой кислоты, которая поглощается клеткой. Методы введения нуклеиновых кислот описаны выше и включают также другие общепринятые известные в данной области методы.

Эффективное количество FGF для введения в мишень. Эффективные количества представляют собой такие количества, которые позволяют обеспечивать требуемое действие, предпочтительно благоприятное терапевтическое действие. Такое количество можно определять общепринятым образом, например осуществляя эксперименты по определению зависимости действия от дозы, в которых различные дозы вводят в клетки-мишени для того, чтобы определить эффективное количество для достижения требуемой цели, например стимуляции роста неврита или увеличение выживания нейронов. Количество выбирают на основе различных факторов, включая среды, в которые вводят FGF (например, пациент с поражением головного мозга, животное-модель, клетки в культуре ткани и т.д.), локализацию клеток, подлежащих обработке, возраст, состояние здоровья, пол и вес пациента или животного, подлежащего лечению, и т.д.

Одним из объектов настоящего изобретения являются способы лечения повреждений нейронов, таких как поражение и травма нерва, поражение и травма спинного мозга, поражение нервной ткани, вызванное, например, приступами ишемической болезни, инфарктом, кровотечением и аневризмой; лечение нервных болезней, таких как нейродегенеративные заболевания, например болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, хорея Гентингтона, рассеянный склероз, миелопатия, миелит и сирингомиелия и т.д., которые заключаются во введении эффективного количества FGF по настоящему изобретению.

FGF по настоящему изобретению можно применять для лечения нейродегенеративных и связанных с димиелинизацией болезней ЦНС (центральная нервная система) и ПНС (периферическая нервная система), отличающихся деструкцией нейронов и олигодендроцитов. FGF можно применять в качестве ремиелинизирующего терапевтического агента для лечения рассеянного склероза и других первичных и вторичных связанных с димиелинизацией болезней ЦНС или ПНС. Первичные связанные с димиелинизацией болезни ЦНС включают адренолейкодистрофии, лейкоэнцефалопатии (такие как прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию), энцефаломиелиты (типа острого рассеянного энцефаломиелита). Вторичная димиелинизация ЦНС характеризуется образованием связанных с димиелинизацией поражений в ЦНС после травм, токсического поражения (цианид, гексахлорфан) или ишемии («удар»). Связанные с димиелинизацией болезни ПНС включают первичные заболевания типа синдрома Гийена-Барре (СГБ), парапротеинемии, хроническую воспалительную связанную с димиелинизацией полиневропатию (CIDP). Кроме того, FGF можно использовать для лечения нейродегенеративных заболеваний ЦНС и ПНС, при которых поражение нейронов является следствием повреждения/травмы (механическое, химическое, цереброваскулярный инсульт и воспаление, связанное с инфекцией и аутоиммунной реакцией) и для лечения других нейродегенеративных болезней.

FGF по изобретению можно применять также для увеличение срока жизнеспособности трансплантатов. Например, FGF можно применять для увеличения срока жизнеспособности трансплантатов (например, аллогенных, изогенных или аутологичных) различных клеток, тканей или органов, таких как кожа, пучки, сухожилия, кость, почки, роговицы или т.п. Трансплантаты клеток в ЦНС или ПНС нейронного, глиального происхождения или полученные из стволовых клеток также подпадают под объем изобретения. Предназначенный для пересадки материал можно получать из природных источников или путем размножения in vitro клеток или тканей, предназначенных для трансплантации, или путем использования дифференцированных или недифференцированных стволовых клеток. Понятие «увеличивать» в контексте настоящего описания обозначает увеличение срока жизнеспособности и/или пролиферации трансплантированных клеток, тканей или органов, обработанных FGF, по сравнению с необработанными клетками, тканями или органами. Методы оценки срока жизнеспособности трансплантатов являются общепринятыми.

Опыты по оценке сроков жизнеспособности трансплантатов являются традиционными и хорошо известны в данной области. Общепринятые анализы in vitro включают, например, использование МТТ, MTS (мазок из измельченной ткани), включение Thy, подсчет живых/погибших клеток (например, методом двойного окрашивания с помощью кальцеина AM и гомодимера этидия-EthD-1), оценку общего количества клеток, например, с помощью микроскопа или с помощью физических методов подсчета клеток, таких как использование счетчиков клеток крови. Общепринятые методы in vivo включают, например, для оценки ЦНС определение улучшения нейрологической функции, или методы визуализации, такие как реакция помутнения Мейнике (MTR), системы сигнализации о неисправности (MRS), компьютерная томография (КТ) или ЯМР-томография с использованием Gd (гадолиний) или без него.

Другие состояния, которые можно лечить согласно настоящему изобретению, включают предупреждение повреждения миокарда вследствие инфаркта миокарда (МИ), индукцию ангиогенеза, заживление ран, заживление язв, предупреждение деструкции костной ткани и индукцию образования новой костной ткани, увеличения сроков жизнеспособности трансплантатов и индукцию эмбрионального развития.

Различные виды активности FGF можно использовать для лечения описанных выше болезней/состояний, которые включают: увеличение выживания и/или пролиферации клеток, ингибирование и/или стимуляция дифференцировки следующих типов клеток: индукцию выживания/пролиферации стволовых клеток, прародителей, предшественников или зрелых клеток следующего происхождения: нейроны, олигодендроциты, клетки Шванна, эндотелиальные клетки, кератиноциты, остеобласты и другие типы клеток, которые экспрессируют любой тип рецепторов FGF. Кроме того, FGF оказывает воздействие на индукцию дифференцировки прародителей нейронов путем индукции роста/удлинения невритов, что можно применять для лечения любого типа повреждения/поражения нейронов.

Понятие «лечение» подразумевает любое воздействие, результатом которого является улучшение состояния, вызванного поражением, или болезни, такое как увеличение выживания нейронов, глии, олигодендроцитов, астроцитов, клеток Шванна и т.д., стимуляция роста неврита, стимуляция миелинизации, стимуляция пролиферации клеток и т.д., как указано выше. Для лечения таких поражений и болезней FGF можно включать в состав композиций или применять кодирующие его нуклеиновые кислоты и вносить в область поражения или болезни, например, с помощью хирургических методов.

FGF по изобретению можно применять также для осуществления любого описанного способа лечения путем введения нуклеиновой кислоты, например, с использованием методов генной терапии. Носитель, предназначенный для введения гена, может быть вирусного или невирусного происхождения (см. общие методы у Jolly, Cancer Gene Therapy, 1:51-64, 1994; Kimura, Human Gene Therapy, 5:845-852, 1994; Connelly, Human Gene Therapy, 1:185-193, 1995; и у Kaplitt, Nature Genetics, 6:148-153, 1994). Носители, применяемые в генной терапии для введения конструкций, которые включают кодирующую последовательность лекарственного средства по изобретению, можно вводить либо местно, либо системно. Основой этих конструкций могут быть вирусные или невирусные векторы. Экспрессию таких кодирующих последовательностей можно индуцировать с помощью эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Экспрессия кодирующей последовательности может быть либо конститутивной, либо регулируемой.

Настоящее изобретение относится также к рекомбинантным ретровирусам, которые конструируют для переноса или экспрессии выбранных, представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты. Ретровирусные векторы, которые можно применять, включают векторы, описанные в ЕР 04157314; WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25689; WO 93/25234; патенте США 5219740; WO 93/11230; WO 93/10218; у Vile и Hart, Cancer Res., 53:3860-3864, 1993; Vile и Hart, Cancer Res., 53: 962-967, 1993; Ram и др., Cancer Res., 53: 83-88, 1993; Takamiyta и др., J.Neurosci, 33: 493-503, 1992; Baba и др., J.Neurosurg., 79: 729-735, 1993; патенте US 4777127; патенте Великобритании 2200651 и в ЕР 0345242. Предпочтительные рекомбинантные ретровирусы описаны в WO 91/02805.

Линии упаковывающих клеток, пригодные для применения с указанными выше ретровирусными векторными конструкциями, легко можно создавать (см. опубликованные заявки РСТ WO 95/30763 и WO 92/05266) и использовать для создания линий клеток-продуцентов (также обозначенные как векторные линии клеток) для получения рекомбинантных вирусных частиц. Согласно особенно предпочтительным вариантам осуществления изобретения линии упаковывающих клеток получают, используя в качестве родительских клетки человека (например, клетки линии НТ1080) или норки, получая тем самым рекомбинантные ретровирусы, которые могут выживать, несмотря на инактивацию в человеческой сыворотке.

В настоящем изобретении также применяют векторы, основой которых являются альфавирусы, которые могут функционировать в качестве носителей для введения генов. Такие векторы можно конструировать из широкого разнообразия альфавирусов, включая, например, векторы на основе вируса Синдбиса, лесного вируса Семлики (АТСС VR-67; ATCC VR-1247), вируса реки Росс (Ross River) (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) и венесуэльского вируса энцефалита лошадей (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532). Репрезентативные примеры таких векторных систем включают системы, описанные в патентах US 5091309, 5217879 и 5185440 и в опубликованных заявках РСТ WO 92/10578, WO 94/21789, WO 95/27069, WO 95/27044 и WO 95/07994.

Основой носителей для введения генов по настоящему изобретению могут также быть парвовирусы, такие как векторы на основе адено-ассоциативных вирусов (ААВ). Репрезентативные примеры ААВ-векторов включают векторы, описанные у Srivastava в WO 93/09239, Samulski и др., J.Vir., 63: 3822-3828/ 1989; Mendelson и др., Virol., 166: 154-165, 1988 и у Flotte и др., P.N.A.S., 90: 10613-10617, 1993.

Репрезентативные примеры аденовирусных векторов включают векторы, описанные у Berkner, Biotechniques, 6: 616-627, 1988; Rosenfeld и др., Science, 252:431-434, 1991; WO 93/19191; Kolls и др., P.N.A.S., 215-219, 1994; Kass-Eisler и др., P.N.A.S., 90: 11498-11502, 1993; Guzman и др., Circulation, 88: 2838-2848, 1993; Guzman и др., Cir. Res., 73: 1202-1207, 1993; Zabner и др., Cell, 75: 207-216, 1993; Li и др., Hum. Gene Ther., 45: 403-409, 1993; Cailaud и др., Eur. J. Neurosci., 5: 1287-1291, 1993; Vincent и др., Nat. Genet, 5: 130-134, 1993; Jaffe и др., Nat. Genet., 1: 372-378, 1992; и Levrero и др., Gene, 101: 195-202, 1992. Примеры аденовирусных векторов для генной терапии, которые можно применять согласно настоящему изобретению, включают также векторы, описанные в WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984 и WO 95/00655. Можно применять введение ДНК, связанной с «убитым» аденовирусом, согласно методу, описанному у Curiel, Hum. Gene Ther., 3: 147-154, 1992.

Другие носители для введения генов и методы их применения включают поликатионную конденсированную ДНК, связанную с «убитым» аденовирусом или не связанную с ним, например описанную у Curiel, Hum. Gene Ther., 3: 147-154, 1992; связанную с лигандом ДНК, например, описанную у Wu, J.Biol. Chem., 264: 16985-16987, 1989; носители для введения в клетки, основой которых являются эукариотические клетки, описанные, например, в заявке на патент US, сер. №08/240030, поданной 9 мая 1994 г. и заявке на патент US, сер. №08/404796; отложение фотополимеризованных материалов гидрогелей; ружье ручного действия для переноса частиц гена, описанное в патенте US 5149655; ионизирующее излучение, описанное в патенте US 5206152 и в WO 92/11033; нейтрализацию заряда нуклеиновой кислоты или слияние с клеточными мембранами. Дополнительные подходы описаны у Philip, Mol. Cell Biol., 14: 2411-2418, 1994 и у Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 1581-1585, 1994.

Можно применять также «оголенную» ДНК. Примеры методов интродукции «оголенной» ДНК описаны в WO 90/11092 и в патенте US 5580859. Эффективность поглощения можно повысить с помощью биоразлагаемых латексных гранул. Покрытые ДНК латексные гранулы эффективно транспортируются в клетки после инициации гранулами эндоцитоза. Метод можно дополнительно усовершенствовать путем обработки гранул для повышения гидрофобности и тем самым облегчения разрыва эндосомы и высвобождения ДНК в цитоплазму. Липосомы, которые могут действовать в качестве носителей для введения гена, описаны в патенте US 5422120 и в опубликованных заявках РСТ WO 95/13796, WO 94/23697 и WO 91/14445 и в ЕР 0524968.

Другие невирусные системы для введения, которые можно использовать, включают механические системы введения, такие как описанные у Woffendin и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(24): 11581-11585, 1994. Кроме того, кодирующую последовательность и сам продукт экспрессии можно вводить с помощью отложения фотополимеризованных материалов гидрогелей. Другие общепринятые методы введения генов, которые можно применять для введения кодирующей последовательности, включают, например, метод переноса частиц гена с помощью ружья ручного действия, описанный в патенте US 5149655; применение ионизирующего излучения для активации перенесенного гена, что описано в патенте US 5206152 и в опубликованной заявке РСТ WO 92/11033.

Настоящее изобретение относится также к способу стимуляции клеточной пролиферации, предусматривающему введение эффективного количества FGF-9 (см., например, Kanda и др., выше), FGF-20 или FGF-23 или их биологически актиных фрагментов. Понятие «стимуляции пролиферации» означает, что введение FGF приводит к делению или митозу клеток. FGF можно вводить в любой эффективной форме (нуклеиновая кислота или полипептид) любому приемлемому хозяину.

Например, одним из вариантов осуществления изобретения является способ идентификации агонистов и антагонистов FGF. В этих случаях может оказаться целесообразно вводить FGF в линии клеток, включая созданные и первичные клетки, такие как моторные нейроны спинного мозга. Созданные линии включают, например, клеточные линии, которые хранятся в Американской коллекции тканевых культур (atccc.org), включая, например, клетки DBTRG-05MG, PFSK-1, MSTO-211H, NCI-H378, NCI-N417, NCI-H526, HCN-1A, HCN-2, CATH.a, NG108-15, NCI-H446, NCI-H209, NCI-H146, NCI-H82, NCI-H345, NCI-Н510А, D283 MeD, D341 MeD, С6, IMR-32, Neuro-2a, NB41A3, ВС3Н1, А172, MpF, T98G[N-98-G], SCP, CCF-STTG1, DI, TNC1, CTX TNA2, PG-4 (S+L-), G355-5, SW 598 [SW-598; SW598], С6/LaCZ, 9L/lacZ, N1E-115, SH-SY5Y, BE(2)-M17, BE(2)-C, MC-IXC, SK-N-BE(2), CHP-212, C6/lacZ7, M059K, M059J, F98, RG2[D74], NCI-H250, NCI-H1915, OA1, ТЕ 615.Т, SVG p12, TE671, сублиния No 2, MBr Cl 1, SK-N-MC, SW 1088 [SW-1088; SW1088], SW 1783 [SW-1783; SW1783], U-87, MG, U-118 MG, U-138 MG, MDA-MB-361, DU 145, Hs 683, H4, 293, PC-12, P19, NTERA-2 cl.D1[NT2/D1], DCE C/D-1b, SK-N-AS, SK-N-FI, SK-N-DZ, SK-N-SH, предпочтительно Daoy, N20.1

Предполагаемые агонисты и антагонисты PGF можно вводить in vitro в клетки, в которые требуется вводить FGF, такие как описанные выше линии клеток, или предполагаемые агенты можно вводить in vitro или in vivo в клетки, которые в естественных условиях продуцируют FGF. Агонистическое или антагонистическое действие таких генов можно оценивать с помощью любого из множества известных в данной области методов, которые будут описаны ниже.

С помощью FGF по настоящему изобретению можно также стимулировать пролиферацию нейронных стволовых клеток. Полученные в результате клетки можно использовать в качестве источника нейронов для трансплантации обратно этому же пациенту, из которого они выделены (т.е. аутологически), что устраняет классические проблемы, связанные с аллогенной трансплантацией, такие как отторжение. Таким образом, способ по настоящему изобретению заключается во введении количества FGF, эффективного для стимуляции пролиферации и дифференцировки нейронных стволовых клеток, и обратной трансплантации этих стволовых клеток.

Настоящее изобретение относится также к антителам, которые специфически распознают FGF по настоящему изобретению. Понятие «специфическое в отношении FGF антитело» относится к антителу, которое распознает определенную последовательность аминокислот внутри FGF или включая FGF, например последовательности, представленной на фиг.1 и 2. Таким образом, специфическое антитело, как правило, должно связываться с более высокой аффинностью с аминокислотной последовательностью, т.е. эпитопом, представленной на фиг.1 и 2, чем с другим(ими) эпитопом(ами), например, что определяют и/или оценивают с помощью иммуноблоттинга или другого общепринятого иммунологического анализа. Таким образом, антитело, которое является специфическим для эпитопа человеческого FGF-21 можно применять для обнаружения присутствия эпитопа в образце, например в образце ткани, содержащей генный продукт человеческого FGF-21, отличая тем самым его от образцов, в которых этот эпитоп отсутствует. Такие антитела можно применять согласно каталогу фирмы Santa Cruz Biotechnoloy Inc., Research Product Catalog и, соответственно, на их основе можно приготавливать требуемую композицию.

Антитела, например поликлональные, моноклональные, рекомбинантные, химерные, гуманизированные, можно получать с помощью любого требуемого метода. Можно использовать также методы скрининга библиотек рекомбинантных иммуноглобулинов (см., например, Orlandi и др., Ргос. Natl. Acad. Sci, 86: 3833-3837, 1898; Huse и др., Science, 256: 127501281, 1989); методы стимуляции лимфоцитов in vitro (Winter и Milstein, Nature, 349: 293-299, 1991). Например, для производства моноклональных антител полипептид, представленный на фиг.1 и 2, можно вводить мышам, козам или кроликам подкожно и/или внутрибрюшинно с адъювантом или без него в количестве, эффективном для того, чтобы вызвать иммунный ответ. Антитела могут также представлять собой одноцепочечные антитела или Fab-фрагменты. Антитела могут представлять собой IgM, IgG, подтипы IgG2a, IgG1 и т.д. Антитела и иммунные ответы можно получать также с помощью введения «оголенной» ДНК (см., например, патенты US 5703055, 5589466, 5580895).

FGF или его фрагмент при применении для индукции антител не обязательно должны обладать биологической активностью; однако они должны обладать иммуногенной активностью, либо индивидуально, либо в сочетании с носителем. Пептиды, предназначенные для индукции FGP-специфических антител, могут иметь аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере из 5 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере из 10 аминокислот. Короткие фрагменты аминокислот FGF, например, состоящие из 5 аминокислот, можно сливать с фрагментами другого протеина, такого как гемоцианин лимфы улитки, или другого пригодного носителя и химерную молекулу использовать для производства антител. Области FGF, пригодные для индукции антител, можно отбирать эмпирически или, например, аминокислотную последовательность гена, выведенную из кДНК, можно анализировать, определяя области высокой иммуногенности. Анализ выбора соответствующих эпитопов описан, например, у Ausubel F.M. и др. (1989, Current Protocols in Molecular Biology, том 2, John Wiley & Sons).

Пригодные для получения антител последовательности включают линеаризованные последовательности, представленные на фиг.1 и 2. Антитела к таким последовательностям можно применять для выявления их различия от других транскриптов FGF (см. выше).

Конкретные антитела к FGF применяют для диагностики предпатологических состояний и хронических или острых заболеваний, которые характеризуются различиями в количестве или распределении FGF. Диагностические тесты в отношении FGF включают методы, основанные на применении антитела и метки для выявления FGF в общей воде организма, тканях или экстрактах тканей человека (или мыши и т.д., если используется мышь и т.д.).

Можно применять модифицированные или немодифицированные полипептиды и антитела по настоящему изобретению. Часто полипептиды и антитела метят, объединяя их либо ковалентно, либо нековалентно, с субстанцией, дающей сигнал, который можно обнаружить. Известно широкое разнообразие меток и методов конъюгации, и они подробно описаны в научной и патентной литературе. Приемлемые метки включают радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные агенты, хемилюминисцентные агенты, магнитные частицы и т.п. Применение таких методов описано в патентах US 3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 и 4366241.

Антитела и другие лиганды, которые связываются с FGF, можно использовать различными путями, в том числе в качестве терапевтического, диагностического агента и инструмента для коммерческих исследований, например для количественной оценки уровней полипептида FGF в живых организмах, тканях, клетках и т.д., для идентификации его клеточной локализации и/или распределения, для его очистки или для выявления полипептида, содержащего его фрагмент, для модуляции его функции, при анализе методом Вестерн-блоттинга, ELISA, иммунопреципитации, РИА и т.д. Настоящее изобретение относится к таким анализам, композициям и наборам для их осуществления и т.д. Используя эти и другие методы, антитела по настоящему изобретению можно применять для обнаружения полипептида FGF или его фрагментов в различных образцах, включая ткань, клетки, общую воду организма, мочу, цереброспинальную жидкость.

Кроме того, лиганды, которые связываются с полипептидом FGF по настоящему изобретению или его производным, можно получать также, например, с помощью библиотеки синтетических пептидов или аптамеров (см., например, Pitrung и др., патент US 5143854; Geysen и др., J. Immunol. Methods, 104:259-274, 1987; Scott и др., Science, 249:386. 1990; Black-well и др., Science, 250: 1104, 1990; Tuerk и др., Science, 249:505, 1990).

Настоящее изобретение относится также к полипептиду FGF, полученному с помощью требуемого метода, например, описанного в патенте US 5434050. Можно использовать меченый полипептид, например, для анализа связывания, например для идентификации субстанций, которые связываются или присоединяются к FGF, для оценки движения FGF в клетке in vitro, in vivo или в системе in situ и т.д.

Нуклеиновая кислота, полипептид, антитело, лиганд и т.д. по настоящему изобретению может находиться в выделенной форме. Понятие «выделенный» обозначает, что материал находится в форме, в которой он не присутствует в его естественном окружении или в природе, например, в более концентрированной, более очищенной, отделенной от компонентов форме и т.д. Выделенная нуклеиновая кислота включают, например, нуклеиновую кислоту, которая имеет последовательность FGF, отличную от хромосомной ДНК, присутствующей в живом организме, например, в виде полного гена, транскрипта или кДНК. Эта нуклеиновая кислота может представлять собой часть вектора или может быть встроенной в хромосому (путем специфического направленного встраивания гена или случайной интеграции в положение, отличное от нормального положения) и, кроме того, быть изолированной, т.е. иметь форму, которая не встречается в естественном окружении. Нуклеиновая кислота или полипептид по настоящему изобретению могут быть также практически очищенными. Под понятием «практически очищенный» подразумевают, что нуклеиновая кислота или полипептид отделены и практически не включают другие нуклеиновые кислоты или полипептиды, т.е. нуклеиновая кислота или полипептид представляют собой основной и активный компонент.

Настоящее изобретение относится также к трансгенному животному, например млекопитающему, кроме человека, такому как мышь, которое содержит FGF. Трансгенных животных можно получать с помощью известных методов, включая, например, пронуклеарную инъекцию рекомбинантных генов в пронуклеус одноклеточных эмбрионов, включение искусственной хромосомы дрожжей в стволовые клетки эмбрионов, методы направленного переноса генов, методологию, основой которой является применение стволовых клеток (см., например, патенты US 4736866, 4873191, 4873316, 5082779, 504489, 5174986, 5175384, 5175385, 5221778; Gordon и др., Proc. Natl. Acad. Sci. 77:7380-7384, 1980; Palmiter и др., Cell, 41: 343-345, 1985; Palmiter и др., Ann. Rev. Genet., 20: 465-499, 1986; Askew и др., Mol. Cell. Bio., 13: 4115-4124, 1993, Games и др., Nature, 373:527, 1995; Valancius и Smithies, Mol. Cell. Bio., 11: 1402-1408, 1991; Stacey и др., Mol. Sci. Bio., 14: 1009-1016, 1994; Hasty и др., Nature, 350: 243-246, 1995; Rubinstein и др., Nucl. Acid Res. 21: 2613-2617, 1993. Нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению можно интродуцировать в млекопитающее, кроме человека, включая мышь (Hogan и др., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, New York, 1986), свинью (Hammer и др., Nature, 315: 343-345, 1985), овцу (Hammer и др., Nature, 315: 343-345, 1985), корову, крысу или примата (см., также Church, Trend in Biotech., 5: 13-19, 1987; Clark и др., Trend in Biotech. 5: 20-24, 1987); и DePamphilis и др., BioTechniques, 6:662-680, 1988).

Кроме того, например, в продажу поступают специально созданные трансгенные крысы и мыши. Эти трансгенные животные могут применяться в качестве модельных животных для тестирования функции гена, в качестве корма для змей, в качестве генетического маркера для выявления происхождения штамма (т.е. штамма, в который встроен FGF-21, 23 или их фрагмент) и т.д. Такие трансгенные животные могут также включать другие трансгены. Трансгенных животных можно получать и использовать согласно любому пригодному методу.

В отношение других аспектов, касающихся нуклеиновых кислот, в качестве ссылок можно использовать стандартные руководства по молекулярной биологии (см., например, Davis и др., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing Inc., New York, 1986; Hames и др., Nucleic Acid Hybridization, IL Press, 1985; Sambrook и др., Molecular Cloning, CSH Press, 1989; Howe, Gene Cloning and Manipulation, Cambridge University Press, 1995.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - нуклеотидная и аминокислотная последовательность FGF-20 (SEQ ID NO: 1 и 2),

на фиг.2 - нуклеотидная и аминокислотная последовательность FGF-23 (SEQ ID NO: 3 и 4),

на фиг.3 - сравнительный анализ аминокислотной последовательности протеина FGF-20 и известных представителей семейства FGF. xfgf-20 получен из Xenopus laevis,

на фиг- 4 - пролиферация олигодендроцитов. На фиг.4А показана пролиферация олигодендроцитов. На фиг.4Б показано, что активность уничтожается после кипячения протеина,

на фиг.5 - воздействие FGF-20 на пролиферацию олигодендроцитов линии N20.1,

на фиг.6 - воздействие FGF на пролиферацию первичных олигодендроцитов крыс (ПОК). На фиг.6А показаны клетки, обработанные FGF-2. На фиг.6Б - клетки, обработанные FGF-20,

на фиг.7 - воздействие FGF на выживание/пролиферацию клеточной линии нейронного происхождения. На фиг.7А показано воздействие FGF-20. На фиг.7Б показано воздействие FGF-2, FGF-9 и FGF-20,

на фиг.8 - рост неврита. Культуру клеток линии PC 12 обрабатывают в течение 6 дней рекомбинантным FGF-20 и гепарином (левая панель) или только гепарином (правая панель). Клетки фиксируют и окрашивают βIII-тубулином, нуклеиновую кислоту визуализируют с помощью 7-AAD. Рост неврита не обнаружен в клетках, обработанных только гепарином,

на фиг.9 - демонстрация того, что FGF - 20 является эффективным фактором выживания кортикальных нейронов.

Примеры

Пример 1

Пролиферация и выживание олигодендроцитов:

Олигодендроциты, которые применяют для оценки воздействия факторов роста (ФР) на пролиферацию клеток, представляют собой либо созданные линии клеток, такие как N20, либо первичные олигодендроциты грызунов. Первичные олигодендроциты грызунов (крыс) и прародители олигодендроцитов выделяют и очищают с помощью дифференциальной адгезии (Mitrovic и др., 1994), центрифугирования в градиенте Перкола (Mattera и др., Neurochem. Int., 6(1): 41-50, 1984 и Kim и др., J. Neurol. Sci., декабрь: 62(1-3): 295-301, 1983). Анализы пролиферации олигодендроцитов осуществляют, высевая 2,5×10⁴ клеток/мл в 96-луночные планшеты. Клетки стимулируют факторами роста в течение 3, 5 и 7 дней. В качестве позитивных контролей служат представители семейства FGF, такие как FGF-2 или FGF-9. Пролиферацию клеток оценивают с помощью МТТ и анализа включения ³Н-тимидина.

На фиг.4, 5 и 6 показано, что FGF-20 стимулирует пролиферацию олигодендроцитов клеточной линии олигодендроцитов N20.1 в зависимости от продолжительности обработки и дозы. Клетки линии N20.1 обрабатывают образцами FGF -20, частично очищенными с помощью гепарин-агарозной хроматографии. Пролиферацию определяют с помощью окрашивания МТТ. Установлено, что FGF-20 индуцирует пролиферацию олигодендроцитов (фиг.4А) и активность исчезает после кипячения протеина (фиг.4Б).

Указанные выше данные были подтверждены при использовании препаратов частично очищенного продукта, полученного из гипариновых и S-колонок (фиг.5). Клетки линии N20.1 обрабатывают FGF-20, полученным из гепариновых или S-колонок. Клетки инкубируют с FGF-20 в течение 5 дней и повышение уровня пролиферации по сравнению с необработанным контролем оценивают путем окрашивания МТТ. В качестве позитивного контроля используют FGF-9, а в качестве отрицательного контроля используют приемлемые соответствующие буферы (Н и S). Активность частично очищенного продукта сравнивают с активностью FGF-9.

Кроме того, FGF-20 индуцирует пролиферацию первичных крысиных олигодендроцитов (фиг.6Б). Олигодендроциты обрабатывают FGF-2 (фиг.6А) и FGF-20 (фиг.6Б). Клетки инкубируют с ФР в течение 3 дней и определяют повышения уровня пролиферации по сравнению с необработанным контролем путем окрашивания МТТ. Активность частично очищенного продукта сравнивают с активностью FGF-2. Установлено, что FGF-20 является эффективным индуктором пролиферации олигодендроцитов и его активность сопоставима с активностью других представителей семейства FGP, таких как FGF-2 и FGF-9.

Пример 2

Индукция выживания нейронов:

Анализ выживания нейронов осуществляют, высевая 2,5×10⁴ клеток/мл в 96-луночные планшеты в среды с низким содержанием сыворотки. В этих условиях нейроны подвергаются апоптозу из-за отсутствия фактора роста. Клетки стимулируют факторами роста в различные периоды времени в диапазоне от 3 до 12 дней. В качестве позитивных контролей служат другие представители семейства FGF, такие как FGF-2 или FGF-9. Выживание нейронов оценивают с помощью МТТ.

Из фиг.7 и 9 видно, что FGF-20 является эффективным нейротрофическим фактором, который может стимулировать выживание клеток нейронного происхождения.

Клетки линии PC 12 высевают в 96-луночные планшеты в присутствии среды с низким содержанием сыворотки (1% Nu-сыворотки). Различные факторы роста, включая FGF-20, добавляют в концентрациях 0,0025-2500 нг/мл. Через 7-10 дней относительный уровень выживания оценивают с помощью МТТ и сравнивают с необработанным контролем. Данные для FGF-20 приведены на фиг.7А, для FGF-2, FGF-9 и FGP-20 - на фиг.7Б.

Пример 3

Индукция роста неврита

FGF-20 обладает активностью в отношении роста клеток линии PC 12. Эта активность не зависит от предварительной обработки ФРН (см. таблицы 1 и 2 и фиг.9).

Поведение в этом опыте частично очищенного FGF-21 аналогично поведению FGF-9, который имеет очень похожую последовательность. Кроме того, сравнивают активность различных представителей семейства FGF в отношении индукции роста неврита клеток линии PC 12 (FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-16, FGF-17, FGF-18 (см. таблицу 2). Наиболее эффективными FGF, которые обладают способностью индуцировать рост нервов в этой системе, являются FGF-2, FGF-9 и FGF-20/21. Обнаружено, что два FGF, а именно FGF-7 и FGF-10, не обладают активностью при использовании этого анализа, независимо от присутствия или отсутствия гепарина.

Первичные кортикальные нейроны крысиных эмбрионов выделяют из головного мозга крысиных эмбрионов (Е16). Кору головного мозга рассекают под микроскопом и шестикратно промывают раствором Хэнкса и механически измельчают без ферментативной обработки. Нейроны культивируют в среде, содержащей: среду DMEM, дополненную 10% лошадиной сыворотки, 10% ФТС, 2 мМ L-глутамином, HEPES-буфером. Через 24 ч добавляют в течение 3 дней смесь ингибиторов, содержащую 10 мкМ FdU (фтордезоксиуридин) и 1 мМ арабинозидцитозином, для того чтобы ингибировать пролиферацию всех типов клеток за исключением нейронов. После культивирования в течение 8 дней нейроны собирают и высевают в 96-луночные планшеты в присутствии среды с низким содержанием сыворотки (2% Nu-сыворотка). Добавляют различные факторы роста, включая FGF-20, в концентрации 0,0025-2500 нг/мл. Через 5 дней относительное выживание оценивают с помощью МТТ и сравнивают с необработанным контролем.

Таблица 1: FGF-20 является эффективным индуктором удлинения неврита в клетках линии PC 12:

Клетки линии PC 12 высевают и обрабатывают согласно эксперименту, представленному на фиг.7. Добавляют FGF-9 и FGF-29 в концентрациях 0,0025-2500 нг/мл. Через 7 и 12 дней после обработки определяют удлинение неврита путем окрашивания клеток красителем Райта и подвергают последующему микроскопическому обследованию. Процент роста соответствует установленному количеству клеток, у которых происходит процесс удлинения неврита.

Ниже представлены обобщенные результаты оценки индукции роста неврита под воздействием обработок FGF-9 и FGF 20/21. Наиболее высокая концентрация частично очищенного продукта токсична для клеток, что оказывает влияние как на данные о выживании (см. фиг.7Б), так и на данные о росте невритов (см. ниже).

Удлинение невритов в клетках линии PC 12

ФР	Концентрация	% роста
нг/мл	7 дней	12 дней
FGF-9	0	0	0
	0,025	<5	5
	0,25	5	10-20
	2,5	5-10	20-30
	25	60	60
	250	90	100
2500	90-100	100
FGF-21	0	0	0
	0,025	<5	5
	0,25	10	10
2,5	20-30	30
	25	50	60
	250	90	80
2500	0	0

Таблица 2. Рост невритов - сравнение эффективности различных представителей семейства FGF

Выращенные в культуре клетки линии PC 12 обрабатывают различными FGF и рост невритов оценивают визуально. FGF-20 является одним из наиболее эффективных нейротрофических ФР из изученных представителей семейства FGF.

Добавленный FGF	Реакция
FGF-1 (кислый FGF)	++
FGF-2 (основный FGF)	++++
FGF-4	+
FGF-6	+
FGF-7	-
FGF-8	++
FGF-9	+++
FGF-10	-
FGF-16	+
FGF-17	++
FGF-18	++
FGF-21	+++

1. Применение полипептида FGF-9 или его биологически активного фрагмента для получения лекарственного средства для лечения рассеянного склероза.

2. Применение по п.1, где полипептид FGF-9 представляет собой человеческий полипептид.

3. Применение по п.2, где полипептид FGF-9 обладает специфической иммуногенной активностью.

4. Применение по п.1, где полипептид содержит аминокислоты 1-208 человеческого FGF-9, представленные на фиг.3 (SEQ ID NO: 5).

5. Применение по п.1, где полипептид на 94% идентичен последовательности, простирающейся от аминокислоты 1 до аминокислоты 208 человеческого FGF-9, представленной на фиг.3 (SEQ ID NO: 5), и где полипептид обладает активностью FGF.

6. Применение по п.2, где полипептид на 95% идентичен последовательности, простирающейся от аминокислоты 1 до аминокислоты 208 человеческого FGF-9, представленной на фиг.3 (SEQ ID NO: 5), и где полипептид обладает активностью FGF.