Новые флуоресцирующие белки aequorea coerulscens и способы их применения

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано для мечения белков, клеток и организмов. Путем введения замен в нуклеиновую кислоту Aequorea coerulescens, кодирующую бесцветный GFP-подобный белок acGFP, получена нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный белок. Кассета экспрессии, содержащая данную нуклеиновую кислоту под контролем регуляторных элементов, обеспечивает биосинтез флуоресцентного белка в клетке. С помощью данной генетической конструкции получены трансгенный организм и клетка, продуцирующие флуоресцентный белок, кодируемый указанной нуклеиновой кислотой. Данный флуоресцентный белок используют в способах мечения клетки, внутриклеточной структуры и белка, а также для регистрации транскрипционной активности промотора. Применение изобретения позволяет расширить арсенал маркировочных средств, используемых в биохимии, молекулярной биологии и медицинской диагностике. 10 н. и 1 з.п. ф-лы, 25 ил.

 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

1. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный полипептид, имеющая нуклеотидную последовательность, по существу, соответствующую открытой рамке считывания аминокислотной последовательности кодируемого флуоресцентного полипептида, где указанная выделенная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из:

(a) нуклеиновой кислоты, полученной из нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок Aequorea coerulescens acGFP, характеризующийся аминокислотной последовательностью, показанной на фиг. 1, путем введения замен в положения нуклеиновой кислоты Aequorea coerulescens, приводящих к по меньшей мере одной из замен E222G, Y220L, Н148Т или H148S и необязательно к одной или более заменам, выбранным из группы, состоящей из V111, N19D, Т62А, F64L, К101Е, Е115К, N121S, F165L, Е172К, Е172А, Т206А, F221L, Y237I, K238Q в указанной аминокислотной последовательности кодируемого полипептида, и к возникновению у кодируемого полипептида способности к флуоресценции;

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, выбранную из группы аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 3, 5, 6, 7, 9, 12, 15, 17, 19 и 21.

2. Выделенная нуклеиновая кислота по п.1, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы нуклеотидных последовательностей, показанных на фиг. 3, 5, 6, 7, 9, 12, 15, 17, 19, 21 и 23, или нуклеотидную последовательность, отличающуюся от указанной вследствие вырожденности генетического кода.

3. Кассета экспрессии, содержащая нуклеиновую кислоту по п.1 под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, которая будучи интегрированной в геном клетки или при введении в клетку в виде внехромосомного элемента, способна обеспечить экспрессию флуоресцентного полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.1.

4. Клетка, продуцирующая флуоресцентный полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.3, содержащая кассету экспрессии по п.3 в виде внехромосомного элемента или элемента, интегрированного в геном этой клетки.

5. Выделенный полипептид, способный к флуоресценции и кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1.

6. Слитый полипептид, способный к флуоресценции, состоящий из полипептида по п.5 и партнера слияния, представляющего собой направляющий к мишени пептид или сигнальный пептид.

7. Трансгенный организм, содержащий кассету экспрессии по п.3 в виде внехромосомного элемента или интегрированную в геном и способный экспрессировать флуоресцентный полипептид по п.5.

8. Способ мечения белка, включающий связывание указанного белка с полипептидом по п.5 путем создания нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид по п.5, оперативно связанной с нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный белок, и получение флуоресцентного слитого белка по п.6.

9. Способ мечения клетки, включающей трансфекцию клетки кассетой по п.3 и продуцирование клеткой флуоресцентного пептида по п.5.

10. Способ мечения внутриклеточной структуры, включающий (а) трансфекцию клетки экспрессионной кассетой, содержащей нуклеиновую кислоту по п.1, слитую с нуклеиновой кислотой, кодирующей сигнал клеточной локализации, специфичный в отношении клеточной структуры, подлежащей мечению, под контролем регуляторных элементов, обеспечивающих продуцирование флуоресцентного полипептида по п.5, слитого с сигналом клеточной локализации, и (b) экспрессию флуоресцентного слитого пептида в клетке.

11. Способ регистрации транскрипционной активности промотора, включающий (а) продуцирование пептида по п.5 в клетке путем ее трансфекции экспрессирующей кассетой по п.3, содержащей промотор, ответственный в природе за экспрессию изучаемого гена; (b) регистрацию клеточной флуоресценции.