Способ изготовления вирусвакцины против классической чумы свиней

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Способ предусматривает выращивание вируса КЧС штамма «ЛК-ВНИИВВиМ» в культуре клеток, титрование и лиофилизацию. При этом используют перевиваемую культуру клеток почки эмбриона свиньи (РК-15), питательной среды Игла и сыворотки КРС. При лиофилизации в качестве защитной среды используют пептон и лактозу - по 5%, желатинозу - 2% и сыворотку КРС - 5%. Способ повышает технологические возможности производства вакцины. Изобретение может быть использовано на предприятиях биологической промышленности и в ветеринарии. 1 табл.

 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано на предприятиях биологической промышленности и в ветеринарии.

Для профилактики классической чумы свиней (КЧС) используют как живые, так и инактивированные вакцины [1-6]. Однако инактивированные вакцины не нашли широкого применения в практике из-за большой себестоимости, повышенного расхода вирусного антигена, невысокой иммуногенности, частотой прививок. Наибольшее распространение для вакцинопрофилактики КЧС в настоящее время нашли вирусные препараты, полученные на основе аттенуированных штаммов.

Известные способы получения вирусного сырья для изготовления вирусвакцин против КЧС из штаммов «К» [4], «ЛК-ВНИИВВиМ» [5] и «ЛКК» [3] основаны на использовании первичных клеточных культур почки поросят (ПП) или тестикулов ягнят (ТЯ), что технологически и экономически весьма трудоемко, или перевиваемых клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК). Независимо от чувствительности указанных клеток к вирусу КЧС использовать их для титрования получаемого вирусного сырья не представляется возможным из-за разницы титров, полученных на животных и в культуре клеток.

Наиболее близким аналогом является способ получения вирусвакцины ЛК-ВНИИВВиМ против КЧС, при котором выращивание вируса проводят в первично трипсинизированной культуре клеток тестикулярной ткани ягненка с использованием донорской (гомологичной) сыворотки ягнят [5].

Однако существующий способ получения вирусного сырья технологически трудоемок и экономически не эффективен. Для получения тестикулярной ткани и сыворотки крови ягнят требуется убой молодых животных (1,5-2,0 месячного возраста) и это возможно только в весенний период (март-май), что затрудняет плановое изготовление вакцины. Экстренное использование полученных в результате убоя животных тканей и сывороток крови чревато возможной неконтролируемой контаминацией продукта производства вирусными или бактериальными агентами. Точное определение титра получаемого вируса возможно только на свиньях по иммунизирующей активности (ИмД₅₀/мл), что вновь приводит к удорожанию коммерческого продукта. При попытках определения инфекционной активности этого материала в культуре клеток титр вируса по БОЕ₅₀ на 1,0-1,5 lg ниже, чем при титровании на свиньях по ИмД₅₀.

Целью настоящего изобретения является разработка более технологичного способа изготовления вирусвакцины против КЧС без снижения иммунобиологических характеристик препарата и экономичного метода определения инфекционной активности вируса.

Поставленная цель достигается тем, что способ изготовления вирусвакцины против классической чумы свиней включает выращивание вируса КЧС штамм «ЛК-ВНИИВВиМ» в культуре клеток, титрование, лиофилизацию, при этом в качестве культур клеток используют перевиваемую культуру клеток РК-15 в питательной среде Игла с сывороткой КРС, перед лиофилизацией к инфицированной суспензии добавляют защитную среду в составе: пептон - 5%, лактоза - 5%, желатиноза - 2% и сыворотка КРС - 5%, затем вируссодержащий материал и готовую вакцину титруют в той же культуре РК-15 (по БОЕ₅₀) или на свиньях (по ИмД₅₀).

Преимущество использования перевиваемых клеток РК-15 в том, что они проходит постоянный контроль на отсутствие контаминантов, обладают возможностью неограниченного пассирования и длительного хранения при минус 65-75°С, что позволяет сохранить ритмичность производства вакцины. Клетки и вирус выращивают с использованием питательной среды Игла и стандартной коммерческой сыворотки крупного рогатого скота (КРС).

Использование данного способа изготовления вакцины позволяет проводить титрование вирусного материала и готовой вакцины двумя методами - как на свиньях по иммуногенной активности (ИмД₅₀), так и в той же культуре клеток РК-15 по инфекционной активности (БОЕ₅₀). Титры вируса, полученные любым из выбранных методов титрования, совпадают, что позволяет контролировать качество получаемого вируссодержащего материала более экономичным и современным методом (МФА).

При изготовлении вакцины к полученному вируссодержащему материалу с активностью 5,0-6,0 lg БОЕ (ИмД)₅₀/мл добавляют 5% сыворотки КРС, затем добавляют защитную среду, содержащую в конечной концентрации следующие компоненты: пептон и лактоза - по 5%, желатиноза - 2% в соотношении 1:1, и лиофилизируют.

Пример конкретного выполнения.

Пример 1. Культуру клеток РК-15 выращивают в матрасах в стационарных условиях в среде Игла с 5-7% сыворотки КРС при 37°С в течение 1-3 суток до образования монослоя. Затем среду удаляют, вносят производственную расплодку вируса КЧС (штамм «ЛК-ВНИИВВиМ») в соотношении к исходному объему 1:10-1-50, после 1-часового контакта добавляют поддерживающую среду Игла с 2% сыворотки КРС обработанной ПЭГ и продолжают инкубировать в течение 3-5 суток. По окончании культивирования содержимое матрасов подвергают замораживанию-размораживанию и определяют биологическую активность вируссодержащего материала в реакции МФА («Методические указания по иммунофлюоресцентной диагностике КЧС». Вишняков И.О., 1984), выражают в БОЕ₅₀/мл, и на свиньях, выражают в ИмД₅₀/мл. Инфекционная активность материала методом МФА и на свиньях совпадают и составляет 5,0-6,0 lg БОЕ(ИмД)₅₀/мл.

Таким образом, вируссодержащий материал, полученный предлагаемым способом, не только имеет высокую биологическую активность (БОЕ), но и сохраняет иммуногенные характеристики (ИмД).

Пример 2. Перед приготовлением вирусвакцины к полученному вирусному материалу с активностью 5,0-6,0 lg БОЕ (ИмД)₅₀/мл добавляют 5% сыворотки КРС для лучшего сохранения вируса. При составлении серии вакцины инфекционный материал соединяют в равных объемах со стабилизатором. Защитная среда содержит в конечных концентрациях следующие компоненты: пептон - 5%, лактоза - 5%, желатиноза - 2% (или желатин 1%). Техническую жидкость разливают по ампулам или пенициллиновым флаконам, замораживают в течение 6-7 часов и лиофилизируют в сублимационных установках при температуре конденсатора не выше минус 60°С в течение 36-45 часов. Инфекционная и иммуногенная активность готовой вакцины составляет 4,5-5,5 lg БОЕ (ИмД)₅₀/мл, что говорит о хорошей сохранности вирусного антигена при использовании данной защитной среды.

Сравнительные характеристики способов изготовления вирусвакцины против классической чумы свиней, представлены в таблице.

Сравнительные характеристики способов изготовления вирусвакцины против классической чумы свиней
Этапы работы	Предлагаемый способ	Прототип
Штамм вируса	ЛК-ВНИИВВиМ	ЛК-ВНИИВВиМ
Культура клеток	Перевиваемая - РК-15	Первичная - ТЯ
Сыворотка крови	Круп. рогат. скота	Ягнят 1,5-2,0 мес
Титр вируса: в культуре на свиньях	5,5 БОЕ50/мл	4,5 БОЕ50/мл
5,5 ИмД50/мл	5,5 ИмД50/мл
Защитная среда	Пептон 5%	Пептон 10%
	Лактоза 5%	Сахароза 10%
	Желатиноза 2%	Желатин 1%
	Сыворотка КРС 5%
Потеря титра после сушки	0,3-0,5 lg	1,0-1.5 lg

Использование предлагаемого способа изготовления вирусвакцины против КЧС по сравнению с существующим прототипом имеет следующие преимущества:

1. Удешевляет производство вирусвакцины за счет использования высокочувствительной и лабораторно контролируемой перевиваемой культуры клеток РК-15 и коммерческой сыворотки КРС.

2. Повышает технологические возможности производства за счет использования тех же клеток РК-15 для определения титра вируса на предварительных этапах изготовления вакцины.

3. Предложенные в качестве протекторов компоненты позволяют сохранять инфекционную и иммуногенную активность вируссодержащего материла в процессе сушки и вакцины при длительном хранении.

4. Исключает использование дополнительных технологических приемов и технических средств - убой молодых ягнят с целью получения тестикулярной ткани и сыворотки крови, доставка их на производство разными транспортными средствами за короткий период времени (не более 3-4 часов), дальнейшая обработка и трипсинизация.

Литература

1. Справочник «Инфекционные болезни животных»./ Под редакцией Д.Ф.Осидзе. М.: Агропромиздат, 1987.

2. Сюрин В.Н. и др. «Вирусные болезни животных». М.: 1998.

3. Жестерев В.И. и др. Патент №2049477, 1993.

4. Мищенко Н.К. Автореферат докторской диссертации. 1980.

5. Попов В.И. «Разработка и усовершенствование средств и способов специфической профилактики КЧС». Автореферат докторской диссертации. 1981.

6. Жестерев В.И. и др. Патент №2057805, 1996.

Способ изготовления вирусвакцины против классической чумы свиней, включающий выращивание вируса КЧС штамм «ЛК-ВНИИВВиМ» в культуре клеток, титрование, лиофилизацию, отличающийся тем, что в качестве культур клеток используют перевиваемую культуру клеток РК-15 в питательной среде Игла с сывороткой КРС, перед лиофилизацией к инфицированной суспензии добавляют защитную среду в составе: пептон - 5%, лактоза - 5%, желатиноза - 2% и сыворотка КРС - 5%, затем вируссодержащий материал и готовую вакцину титруют в той же культуре РК-15 (по БОЕ₅₀) или на свиньях (по ИмД₅₀).