Способ контроля качества вакцинации цыплят против болезни марека
Владельцы патента RU 2332235:
Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН) (RU)
Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к способам контроля качества вакцинации сельскохозяйственной птицы против болезни Марека (БМ). Предложенный способ контроля качества вакцинации включает отбор проб и исследование биоматериала от цыплят, привитых вакциной против болезни Марека, отбор биоматериала производят из внутренних органов, а исследование на наличие вакцинного вируса проводят в полимеразной цепной реакции, что позволяет более точно и в более ранние сроки контролировать качество вакцинации цыплят против болезни Марека и корректировать противоэпизоотические мероприятия. 4 табл.
Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к способам контроля качества вакцинации сельскохозяйственной птицы против болезни Марека (БМ).
Известен способ обнаружения ДНК вируса болезни Марека с помощью полимеразной цепной реакции (А.Г.Амниев, С.В.Полехин, В.Г.Андреев, А.А.Гусев. Обнаружение и типирование генома вируса болезни Марека методом полимеразной цепной реакции.// Прикладная молекулярная биология, 1998, том 32, №5, с.916-922). Для проведения реакции используют праймеры MU 906 (GTGGAAAGAGGTGACTGAAATG), MU 1379 (AGAAATTGGAGCATGGCGA), программа амплификации состоит из следующих этапов: 95°С - 40 с; 50°С - 40 с, 72°С - 40 с (30 циклов).
Однако данный способ предназначен для выявления вируса болезни Марека в культуре клеток, либо патологическом материале от заболевших птиц и не используется для контроля вакцинации.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому и взятым за прототип является способ, основанный на иммуноферментном анализе (ИФА). Качество вакцинации определяют по проценту цыплят, имеющих титры антител к вирусу болезни Марека (ВБМ) (Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Быкова Н.Н., Скороходова Л.А., Бобровская И.В., Тетеричев В.И. Экспресс-метод определения специфических антител и прогнозирования эффективности вакцины против БМ//Тез. докл. конф. «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе». М., 1999, с.33-34).
Недостаток данного способа в недостоверности контроля эффективности вакцинации по показателям гуморального иммунитета, т.е. титрам антител, так как иммунитет к болезни Марека преимущественно клеточный и напрямую зависит от наличия вакцинного штамма вируса болезни Марека в клетках организма. Таким образом, наличие антител к вирусу болезни Марека может свидетельствовать о контакте организма с его антигенами, но не дает гарантии что вирус сохранился в клетках птицы.
Технической задачей заявляемого решения является раннее обнаружение вакцинного штамма вируса болезни Марека в организме цыплят и повышение точности исследований.
Поставленная техническая задача решается тем, что в способе контроля качества вакцинации, включающем отбор проб и исследование биоматериала от цыплят, привитых вакциной против болезни Марека, согласно изобретению, отбор биоматериала производят из внутренних органов, а исследование на наличие вакцинного вируса проводят в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Сущность изобретения заключается также в том, что для выявления геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) вируса болезни Марека в ПЦР используют праймеры со следующими нуклеотидными последовательностями: 5'-ATCGCGATGGAAGTTTTTGGT-3' (сайт отжига 1210-1231 п.н.) и 5'-ATGCGGCTGAGGAGATTTC-3' (сайт - отжига 1567-1549 п.н. от первого ТАТА-сигнала гена гликопротеина А вируса болезни Марека).
Способ осуществляют следующим образом:
Материал: убитые с диагностической целью цыплята.
Отбор материала: пробы внутренних органов (например, печени) отбирают любым пригодным для последующей постановки ПЦР способом. Традиционным способом производят выделение ДНК.
Для постановки ПЦР реакцию проводят по следующему температурному режиму (Табл.1).
| Таблица 1 | |||
| этап | температура, °С | число циклов | время, мин |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 1 | 95 | 1 | пауза |
| 2 | 95 | 1 | 5 |
| 3 | 95 | 40 | 1 |
| 63 | 40 | 1 | |
| 72 | 40 | 1 | |
| 4 | 72 | 1 | 5 |
В реакции используют праймеры со следующими нуклеотидными последовательностями: 5'-ATCGCGATGGAAGTTTTTGGT-3' (сайт отжига 1210-1231 п.н.) и 5'-ATGCGGCTGAGGAGATTTC-3' (сайт - отжига 1567-1549 п.н. от первого ТАТА-сигнала гена гликопротеина А вируса болезни Марека).
Продукты ПЦР разделяют методом горизонтального электрофореза в 2% агарозе. Результаты ПЦР учитывают, визуализируя окрашенный бромистым этидием ПЦР-продукт (ампликон) в ультрафиолетовом свете. В случае положительной реакции в электрофорезе появляется фрагмент ДНК размером 358 п.н.
Для иллюстрации способа приведены примеры:
Пример 1. С целью подтверждения специфичности используемой ПЦР, данную реакцию ставили с геномной ДНК различных микроорганизмов и вирусов, которые могут присутствовать в организме птицы (Табл. 2).
| Таблица 2 | ||
| № трека | Вид микроорганизма | Наличие ампликона специфичного для ВБМ |
| 1 | 2 | 3 |
| 1 | Pseudomonas auregenosa | - |
| 2 | S. aureus | - |
| 3 | Serratia marcescens | - |
| 4 | E. coli ATCC 25922 | - |
| 5 | Пат. материал от цыпленка положительного на сальмонеллу в ПЦР | - |
| 6 | Listeria monocitogenes | - |
| 7 | lersinia pseudotuberculosis | - |
| 8 | Serratia marcescens | - |
| 9 | E. coli (полевой изолят) | - |
| 10 | E.coliO157H7 | - |
| 11 | Пат. материал от цыпленка отрицательный на ВБМ | |
| 12 | Пат. материал от цыпленка положительный на сальмонеллу в ПЦР и отрицательный на ВБМ | |
| 13 | Пат. материал от цыпленка отрицательный на сальмонеллу и ВБМ в ПЦР | |
| 14 | ВБМ 2 и 3 серотипы | + |
| 15 | ВБМ + Salmonella | + |
| 16 | Отрицательный контроль | - |
Таким образом, в приведенном примере видна достаточная специфичность предложенной нами реакции.
Пример 2. Для оценки чувствительности метода была проведена серия десятикратных разведений вируссодержащего материала с начальной концентрацией 1000 БОЕ/мл. После этого с каждым разведением была поставлена ПЦР с использованием заявляемого способа и ПЦР, приведенного в качестве аналога (см. табл.3).
| Таблица 3 | ||
| Концентрация ВБМ в пробе, БОЕ/мл | Результаты ПЦР, заявляемой в нашем способе | Результаты ПЦР, приведенной в аналоге |
| 1 | 2 | 3 |
| 1000 | Положительно | Положительно |
| 100 | Положительно | Положительно |
| 10 | Положительно | Отрицательно |
| 1 | Отрицательно | Отрицательно |
| 0 | Отрицательно | Отрицательно |
Как следует из таблицы 3, чувствительность заявляемой в нашем способе ПЦР выше в 10 раз по сравнению с аналогичным методом. Этому способствуют 2 фактора - более короткий ампликон (синтезируемый фрагмент ДНК), что повышает эффективность протекания реакции и очень низкий уровень фона, что повышает эффективность использования компонентов реакции только для синтеза специфического ПЦР-продукта и позволяет использовать более высокие концентрации праймеров, не опасаясь появления неспецифических реакций.
Пример 3. Для оценки качества вакцинации птицы против БМ проведены следующие исследования.
Для исследований были отобраны цыплята 8-10-дневного возраста, привитые вакциной «бимарек» производства ВНИИЗЖ, из разных птицефабрик (6 групп). Цыплята были подвергнуты диагностическому убою, из проб печени выделили ДНК и тестировали на наличие вируса болезни Марека с использованием предложенной нами ПЦР. Параллельно из этих же птицефабрик были отобраны пробы крови от цыплят в возрасте 18 суток и поставлена ИФА (иммуноферментный анализ) на наличие антител к ВБМ. Разница в возрасте цыплят (8-10-ти суточные и 18-ти суточные) объясняется тем, что накопление и расселение вируса болезни Марека по организму происходит в более ранние сроки, чем последующая выработка антител к нему.
| Таблица 4 | |||
| группа | Размеры выборки | Результаты ИФА | Результаты ПЦР на ВБМ |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 1 | 10 | 100 | 100 |
| 2 | 10 | 100 | 100 |
| 3 | 10 | 100 | 100 |
| 4 | 10 | 90 | 60 |
| 5 | 10 | 100 | 100 |
| 6 | 10 | 60 | 50 |
Анализ таблицы (Табл.4) показывает различный процент инфицированности цыплят ВБМ от 100 до 50%, кроме того, мы видим, что обнаружение антител не всегда сопровождается наличием вируса в организме. В подобной ситуации часть результатов ИФА, в аспекте контроля процента иммунной птицы, можно рассматривать как ложноположительные.
Таким образом, заявляемый способ позволяет более точно и в более ранние сроки контролировать качество вакцинации цыплят против болезни Марека и корректировать противоэпизоотические мероприятия. В связи с этим, мы можем считать целесообразным использование заявленной нами ПЦР с целью оценки качества вакцинации и выявления не иммунных к вирусу болезни Марека цыплят.
Способ контроля вакцинации цыплят против болезни Марека, включающий отбор и исследование биоматериала от цыплят, привитых вакциной против болезни Марека, отличающийся тем, что отбор биоматериала производят из внутренних органов, а исследование на наличие геномной ДНК вакцинного штамма вируса проводят в полимеразной цепной реакции с использованием праймеров со следующими нуклеотидными последовательностями: 5'-ATCGCGATGGAAGTTTTTGGT-3' (сайт отжига 1210-1231 п.н.) и 5'-ATGCGGCTGAGGAGATTTC-3' (сайт отжига 1567-1549 п.н. от первого ТАТА-сигнала гена гликопротеина А вируса болезни Марека).
