Диагностическая питательная среда для выявления энтеробактерий "авм"

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии, и может быть использовано в медицине, ветеринарии, прикладной биотехнологии, пищевой промышленности и смежных отраслях промышленности. Питательная среда содержит лактозу, пептон, дрожжевой экстракт, маннит, агар-агар, NaCl, Na₂SO₃, K₂SO₄, MgSO₄×7Н₂О, Na₂HPO₄×12H₂O, (NH₄)₂SO₄, Na₂СО₃, нейтральный красный, метиловый красный, бромтимоловый синий и дистиллированную воду. Изобретение позволяет сократить сроки выявления и увеличить спектр выявляемых микроорганизмов. 9 табл.

 

Изобретение относится к области прикладной микробиологии, точнее к диагностическим средам для выявления энтеробактерий, и может быть использовано в медицине, ветеринарии, прикладной биотехнологии, пищевой промышленности и смежных отраслях промышленности, в частности для бактериологического контроля состояния продуктов питания, кормов и питьевой воды, а также помещений, приборов и оборудования.

Использование диагностических сред является одним из наиболее простых и широко распространенных методов диагностики патогенной микрофлоры. Как правило, ее идентификация основана на изменении цвета среды в зависимости от вида и особенностей микроорганизмов, что дает полную информативную картину микробного фона в данной пробе. Однако подбор оптимального состава диагностической среды представляет определенную проблему, т.к. сахаролитические и протеолитические ферменты микроорганизмов весьма многообразны и универсальны и часто встречаются у представителей разных видов бактерий, что делает используемую среду применимой только для диагностики ограниченного круга микроорганизмов.

В частности, желчный бульон, среды Раппопорта, Мюллера, Штерна и т.д. применяют для диагностики Е.coli и сальмонелл, среду Эндо (мясопептонный агар с лактозой, фуксином и сульфитом натрия) для определения кишечной палочки, сальмонелл ишигелл; среда Левина - для протей и кишечной палочки (агар с эозиноном и метиленовым синим), среда с солями резурина и т.д. (Каталог питательных сред, выпускаемых в СССР, Махачкала, 1992; В.Г.Иванов, Ю.Н.Шихалеев. Ветеринария, 1979, N 11, с.74; Коровин и др., Лабораторная диагностика болезней птиц., М.: Агропромиздат, 1989, с.71-83).

Недостатком указанных сред является узкий спектр микроорганизмов, которые могут быть диагностированы.

Более широкий круг микроорганизмов позволяет определить среда Левина, в состав которой входят агар, красители - метиленовый синий и эозин, углеводы (лактоза и сахароза), а также и соли (K₂НРО₄) (Каталог сухих питательных сред, выпускаемых в СССР для медицинской бактериологии. Выпуск 1. М., 1980, с.8; пат. РФ №2103367, 1998).

Наиболее близкой к заявляемому изобретению по составу и достигаемому эффекту являлась разработанная авторами среда ВБВ (пат. РФ №2103367, 1998), в состав которой входят минеральные соли - 7.5-9.5 г/л; лактоза - 8-12 г/л; манит - 0.3-0.7 г/л; агар - 5-10 г/л; красители - нейтральный красный - 0.03-0.05 г/л и бромтимоловый синий - 0.01-0.03 г/л, вода - остальное. В качестве минеральных солей используют смесь, содержащую NaCl, K₂SO₄, MgSO₄, Na₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄ и NaCO₃. В присутствии микроорганизмов наблюдается появление следующих цветов: при наличии Е.coli - малиново-красный; при наличии Citrobacter - оранжево-красный, при наличии Klebsiella - цвет не изменяется или среда приобретает легкий красный оттенок, при наличии Hafhia - красный, при наличии Proteus - грязно-зеленый (характерная форма колоний), при наличии Salmonella - лимонно-зеленый.

Среду получают смешиванием агара с красителями и минеральными солями, растворением компонентов в воде, кипячением, фильтрованием, доведением рН до 7.0-7.2, стерилизацией с последующим добавлением раствора лактозы и маннита при рН 7.0-7.2. Недостатками среды ВБВ является невозможность ее хранения в готовом сухом виде, продолжительное время определения (около 2 суток).

Задачей, решаемой в рамках заявляемого изобретения, является создание новой питательной среды, компоненты которой до разбавления их водой способны длительное время храниться в виде готовой сухой смеси, на базе которой среда легко может быть получена в полевых условиях, которая обладает повышенными дифференцирующими свойствами, в частности, позволяющей проводить экспресс-определение видового и количественного состава энтеробактерий.

Технический результат достигался в результате использования при диагностике среды АВМ следующего состава: лактоза - 15-25 г/л; маннит - 0.8-1.2 г/л; пептон - 12-18 г/л; дрожжевой экстракт - 0.8-1.2 г/л; агар (порошок) - 8-15 г/л; красители - нейтральный красный - 0.03-0.05 г/л, бромтимоловый синий - 0.01-0.04 г/л, метиловый красный - 0.01-0.02, NaCl - 3.5-4,7 г/л, K₂SO₄ - 1.7-2.2 г/л; Na₂HPO₄×12H₂O - 1.2-1.5 г/л; (NH₄)₂SO₄ - 0,9-1.2 г/л; MgSO₄×7H₂O - 0.3-0.8 г/л; Na₂СО₃ 0.3-0.8 г/л; Na₂SO₃ - 0.1-0.3 г/л; вода - остальное.

До разбавления водой среда представляет собой сухую смесь, содержащую растворяемые ингредиенты в следующем соотношении (мас.%): лактоза - 20-40; маннит - 1.5-2.0; пептон - 20-30; дрожжевой экстракт - 1.5-2.0; агар (порошок) - 15-25; красители - нейтральный красный - 0.05-0.08, бромтимоловый синий - 0.02-0.07, метиловый красный - 0.02-0.04, NaCl - 6.0-8.0, K₂SO₄ - 3.0-4.0; Na₂HPO₄×12H₂O - 2.0-2.5; (NH₄)₂SO₄ - 1.5-2.0; MgSO₄×7H₂O - 0.5-1.5; Na₂СО₃ 0.5-1.5; Na₂SO₃ - 0.2-0.5.

Отличиями заявляемой среды, получившей условное наименование АВМ, является существенное увеличение концентрации в готовой смеси источников азота и углерода и расширение их ассортимента за счет введения в исходную смесь дополнительно пептона, дрожжевого экстракта, а также в качестве красителя - метилового красного и в состав минеральных солей - сульфита натрия. Изменение состава питательных веществ в среде ведет к более высокой интенсивности развития бактерий и большей дифференциации их метаболитов, что позволяет лучше фиксировать относительно небольшие изменения состава и свойств выделяемых ими метаболитов.

В присутствии микроорганизмов наблюдается появление следующих цветов: при наличии E.coli - малиново-красный; при наличии Citrobacter - оранжевый, при наличии Klebsiella - серо-розовый, при наличии Hafhia - красный, при наличии Proteus - грязно-зеленый (характерная форма колоний), при наличии Salmonella - лимонно-зеленый.

Диагностическая среда «АВМ» может быть использована для проведения таких бактериологических исследований, как выделение бактерий из патологического материала, определение бактериологической обсемененности, видового состава и количественного состава микрофлоры сыпучих материалов, жидкостей и воздуха.

Указанные граничные интервалы компонентов являются оптимальными. Их изменение либо снижает эффективность роста микроорганизмов, либо ухудшает эксплуатационные характеристики среды, например плотность геля, прозрачность и т.п.

Среду получают смешением ингредиентов в заданном соотношении и их измельчении. Перед использованием полученный порошок растворяют водой при нагревании, доводят рН до 7,4±0,02, стерилизуют, после чего разливают в чашки Петри по общепринятой методике. Чашки оставляют до застывания среды.

Эффективность и возможность практического применения среды иллюстрируется примерами.

Пример 1. Приготовление питательных сред «АВМ». Навески ингредиентов по таблице 1 из расчета на 1 кг среды смешивали и измельчали в роторном смесителе до получения гомогенного порошка.

Таблица 1
Реагент	На 1 литр (г)	На 1 набор (г)	На 50 наборов (г)
NaCl	чда	3,64	1,1	55
Na2HPO4×12H2O	хч	1,36 (0,54 б/в)	0,41 (0,16 б/в)	20,4 (7,84 б/в)
(NH4)2SO4	чда	1	0,3	15
K2SO4	чда	2	0,6	30
MgSO4×7H2O	чда	0,5	0,15	7,5
Na2CO3 б/в	хч	0,45	0,135	6,75
Na2SO3 б/в	чда	0,2	0,06	3
Лактоза	чда	20	6	300
Манит	чда	1	0,3	15
Пептон	форм	15	4,5	225
Дрожжевой экстракт	ICN	1	0,3	15
Метиловый красный	чда	0,017	0,0051	0,255
Нейтральный красный	чда	0,036	0,011 (0,022)	0,54 (1,1)
Бромтимоловый синий	чда	0,027	0,0081 (0,0162)	0,405 (0,81)
Агар-агар (порошок)	Difco	10	3	150
ИТОГО:		56,23 (55,41)	16,87(16,623)	843,5 (831,15)

Затем полученный порошок расфасовывали в полиэтиленовые пакеты или пластиковую тару по 16,87 г. На каждую упаковку помещали этикетку с названием препарата, датой изготовления и инструкцией по применению.

Приготовление формы питательной среды, готовой к употреблению, осуществляли следующим образом. Полиэтиленовый пакет со средой АВМ стерильно вскрывают. Порошок концентрата среды помещают в коническую колбу, содержащую 300 мл дистиллированной воды, и при нагревании растворяют. Затем проверяют рН среды при помощи рН-метра и доводят его до 7,4±0,02. Среду стерилизуют в конических колбах, укупоренных ватно-марлевыми пробками и обернутых пергаментными колпачками при 110 С° и давлении 0,5 кг/см² в течение 30 минут. Затем среду разливают в чашки Петри по общепринятой методике. Чашки оставляют до застывания среды. В результате проведенных манипуляций получается среда со следующими свойствами (табл. 2).

Таблица 2
Свойства среды АВМ после автоклавирования и застывания агара (геля)
№	Показатели	Свойства
1.	Внешний вид	При 20°С - гелеобразная масса без посторонних включений
2.	Цвет (%, не менее)	Бурый (40)
3.	Концентрация водородных ионов (рН)	7,2 - 7,4
4.	Стерильность	Должна быть стерильная

Контроль ростовых свойств среды АВМ производили путем посева методом истощающего штриха агаровых культур тест-штаммов (Е.coli, Proteus, Citrobacter, Klebsiella, Salmonella). Культуры наносили бактериальной петлей зигзагообразно по поверхности чашки Петри со средой. Чашки закрывали и выдерживали в термостате при 37°С в течение 24 ч. Полученные результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3
Определение видового состава энтеробактерий на среде
Среда	Цвет среды до посева	Индикатор	Цвет колоний и среды в зависимости от ферментации лактозы
бактерии	+	-
АВМ	Коричневая с зеленоватым оттенком (бурая)	метиловый красный, бромтимоловый	E.coli	Красно-розовый	розовый
			цвет среды красный
Salmonella sp.,	Лимонно-зеленый	Грязно-зеленый
		синий, нейтральный красный		Цвет среды не изменяется
			Klebsiella sp,	Серо-розовый	Серо-розовый
			Цвет среды не изменяется
			Citro bacter sp	Оранжевый	Оранжевый
цвет среды оранжевый

Пример 2. В условиях примера 1 готовят минимальные и максимальные по составу среды. Состав полученных сред приведен в табл.4.

Таблица 4
Состав сред «АВМ»
Реагент		На 1 литр (г)
оптимальная	минимальная	максимальная
NaCl	чда	3,64	3,3	4,7
Na2HPO4×12H2O	хч	1,36	1,2	1,5
(NH4)2SO4	чда	1	0,9	1,2
К2SO4	чда	2	1,7	2,2
MgSO4×7H2O	чда	0,5	0,3	0,8
Na2CO3 б/в	хч	0,45	0,3	0,8
Na2SO3 б/в	чда	0,2	0,3	0,1
Лактоза	чда	20	15	25
Манит	чда	1	0,8	1,2
Пептон из мяса фермент.	фарм	15	12	18
Дрожжевой экстракт	ICN	1	0,8	1,2
Метиловый красный	чда	0,017	0,02	0,01
Нейтральный красный	чда	0,036	0,05	0,03
Бромтимоловый синий	чда	0,027	0,01	0,04
Агар-агар (порошок)	Difco	10	8	15

Пример 3. Было проведено сопоставление эффективности среды «АВМ» и стандартных диагностических питательных сред. Полученные результаты приведены в таблице 5. Установлено почти полное совпадение результатов (в 98,7% случаев) по выделению и идентификации рода культур на среде АВМ и по общепринятым методикам. Использование новой питательной среды позволяет примерно в два раза сократить сроки исследования и проводить не только качественный, но и количественный анализ, используется меньший набор сред при проведении исследований, что экономически более выгодно для птицеводческих хозяйств.

Таблица 5
Сравнительная характеристика роста энтеробактерий на дифференциально-диагностических средах и на новой питательной среде
Среда	Дифференцирующие компоненты	Индикатор	Цвет колоний энтеробактерий в зависимости от ферментации углеводов
бактерии	+	-
Агар Плоски рева	лактоза	Нейтральный красный	Е.coli, Salmonella sp., Klebsiella sp, Citrobacter sp.	Розовый, красный	Бесцветный, серовато-белый
ЭМС (Среда Левина)	лактоза, сахароза	Эозин, метиленовый синий	E.coli Salmonella sp., Klebsiella sp, Citrobacter sp	Темно-фиолетового с металлическим блеском, почти черного цвета	Бесцветный, розовато-фиолетового цвета
Среда Эндо	лактоза	Основной фуксин	E.coli Salmonella sp., Klebsiella sp, Citrobacter sp	Красный с металлическим блеском или без него; розовые	Бесцветный, светло-розовые
Среда АВМ	Лактоза, маннит	нейтральный красный, бромтимоловый синий, метиловый красный	E.coli Salmonella sp., Klebsiella sp., Citrobacter sp	Красно-розовый Лимонно-зеленый Серо-розовый Оранжевый	Розовый Грязно-зеленый Серо-розовый Оранжевый

Пример 4. Проведение бактериологических исследований.

Выделение бактерий из патологического материала. Высевы проводили пастеровской пипеткой на поверхность среды чашки Петри. Для этого наносили капли физиологического раствора на поверхность агара, затем той же пипеткой делали укол в исследуемый орган трупа или другого материала и полученный изолят переносили в каплю физиологического раствора на поверхности среды, а затем стерильным шпателем каплю распределяли по всей поверхности агара. Инкубировали при 37°С 24 часа.

Определение обсемененности и видового состава микрофлоры кормов, примексов, мясокостной муки, продуктов питания и других материалов.

Для исследования брали навески образцов и делали их последовательное разведение, кратные 10. Из разведений делали посевы на среду АВМ (0,1 мл материала) в чашках Петри и инкубировали их при 27°С 20 часов.

Определение обсемененности воды и других жидкостей.

Разведение проб производили в физиологическом растворе, кратное 10. Посевы делали из разведений 0.1 мл материала на среду АВМ в чашках Петри и инкубировали при 37°С 20 часов.

Определение обсемененности воздуха в животноводческих помещениях.

Для анализа готовили среду АВМ в чашках Петри. В исследуемом помещении 5 чашек со средой открывали, разместив их на расстоянии 50-100 см от пола, и держали их открытыми в течение различного времени: 1-ую чашку - 5 минут, 2-ую - 10 мин, 3-ью - 20 мин, 4-ую - 40 мин, 5-ую - 1 час 20 мин. (При сильном бактериальном загрязнении можно инкубировать чашки в течение 5 и 10 минут.) Затем чашки закрывали и инкубировали в термостате при 37°С 22 часа. Результаты опытов приведены в таблице 6-9.

Таблица 6
Выявление специфической среды к различным бактериям
Среда	Наличие специфического роста бактерий
Е.coli	Sl. pullorum	Klebsiella	Acuterobacter	Shigella	Proteus
1	2	3	4	5	6	7
Среда Эндо	+	+	-	-	+	+
Среда Левина	+	+	-	-	+	+
Висмут-сульфит агар	-	+	-	-	+	+
МПА	-	-	-	-	-	+
Данный способ	+	+	+	+	+	+

Таблица 7
Выявление обсемененности воздуха в свинарнике
Среда по примеру2	Наличие специфического роста бактерий
Е. coli	Salmonella	Klebsiella	Acuterobacter	Proteus
1	2	3	4	5	6
№2 (миним.)	+	+	+	+	+
№1 (оптим.)	+	+	+	+	+
№3 (максим.)	+	+	+	+	+

Таблица 8
Анализ жидкой искусственной смеси бактерий на различных средах
Состав среды с 7 г/л агар-агара + 0,036 г/л нейтр. красный + 0,027 г/л брил. синий + 0,017 г/л метиловый красный	Наличие специфического роста культур бактерий
Е.coli	Salmonella	Klebsiella	Acuterobacter	Shigella	Proteus
Лактоза, г/л	Маннит, г/л	Смесь солей мин., г/л
1	2	3	4	5	6	7	8	9
1,2	0,06	1,0	-	-	-	-	-	+
2,5	0,12	2,1	-	+	-	+	-	+
5	0,25	4,3	±	+	+	+	-	+
10	0,5	8,5	+	+	+	+	+	+
15	0,75	12,5	+	+	-	+	±	+
25	1,2	17,0	+	-	-	+	-	+

Таблица 9
Эффективность использования сред для диагностики микроорганизмов
Среда	Микроорган измы	Цвет колоний	Разведение
10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
1	2	3	4	5	6	7	8	9
АВМ	Е.coli	Малиново-красный	Газон	Газон	Газон	1540	176	18
	Salmonella	Лимонно-зеленый	Газон	Газон	Газон	920	102	11
Среда Левина	Е.coli	Темно-фиолетовый	Газон	Газон	Газон	1470	168	17
	Salmonella	Бесцветный	Газон	Газон	Газон	910	101	9
Среда Плоскирева	Е.coli	Розовый	Газон	Газон	Газон	1510	171	18
	Salmonella	Бесцветный	Газон	Газон	Газон	908	102	11
Среда Эндо	Е.coli	Темно-красный	Газон	Газон	Газон	1570	178	19
	Salmonella	Бесцветный	Газон	Газон	Газон	907	106	11

Во всех опытах на среде «АВМ» наблюдалось изменение цвета в местах роста бактерий в зависимости от их вида:

Е.coli - малиново-красный; Klebsiella - серо-розовый; Hafhia - красный; Proteus - грязно-зеленый, характерная форма колоний; Salmonella - лимонно-зеленый.

Стафилококки и стрептококки, как правило, не изменяют цвета среды, поэтому для более полного анализа некоторые колонии можно исследовать микроскопически и приготовить мазки для морфологического исследования.

Проведенная экспериментальная проверка показала, что предлагаемая среда пригодна для диагностики общей бактериальной обсемененности и определения патогенной микрофлоры. При высеве на предлагаемую питательную среду удается получить результат через 18-26 часов благодаря использованию принципа изменения окраски среды и различной видовой окраски колоний микроорганизмов. При использовании общепринятых методов на эти исследования требуется не менее 48 часов, причем качественный состав микрофлоры выявляется на разных питательных средах.

Питательная среда для выявления энтеробактерий, содержащая лактозу, маннит, нейтральный красный, бромтимоловый синий, агар-агар, NaCl, Na₂СО₃, Na₂HPO₄·12H₂O, (NH₄)₂SO₄, K₂SO₄, MgSO₄·7H₂O, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит пептон, дрожжевой экстракт, метиловый красный, Na₂SO₃ при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

пептон	12-18
дрожжевой экстракт	0,8-1,2
лактоза	15-25
маннит	0,8-1,2
NaCl	3,5-4,7
Na2СО3	0,3-0,8
Na2HPO4·12H2O	1,2-1,5
(NH4)2SO4	0,9-1,2
K2SO4	1,7-2,2
MgSO4·7H2O	0,3-0,8
Na2SO3	0,1-0,3
нейтральный красный	0,03-0,05
бромтимоловый синий	0,01-0,04
метиловый красный	0,01-0,02
агар-агар	8-15
дистиллированная вода	остальное.