Способ выделения полигидроксибутирата из сухой биомассы микроорганизма

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделению полигидроксибутирата (ПГБ) из сухой биомассы микроорганизма, полученной ферментативным синтезом. Способ состоит в том, что сухую биомассу микроорганизма рода Azotobacter с содержанием ПГБ от 50 до 75%, азота от 1,2 до 3,5% и золы от 10 до 25% экстрагируют хлороформом при температуре 30-40°С и концентрации ПГБ в хлороформе от 0,3 до 0,55 г/л, подавая раствор ПГБ в хлороформе в изопропиловый спирт равномерно со скоростью от 1 до 3 л/час с последующим отделением и сушкой целевого продукта. Изобретение позволяет выделить ПГБ медицинского назначения с заранее заданной молекулярной массой, выходом 95-98,5% и чистотой 99,5-99,95% при продолжительности процесса 8-10,5 часов. 1 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности выделению полигидроксибутирата (далее - ПГБ) из биомассы, полученной ферментативным синтезом.

Под биомассой подразумевают совокупность всех органических веществ, которые продуцируются при определенных условиях клетками животных, растений или микроорганизмов, включая генетически модифицированные формы. ПГБ представляет собой пластичный, биодеградабельный и биосовместимый полимер, который может найти применение прежде всего в медицине, а также в сельском хозяйстве и промышленности.

Отделение ПГБ от клеточного материала представляет весьма сложную задачу.

Использование традиционных способов выделения, широко применяемых в экстракции растительных масел из масличных семян, например механическое прессование, седиментация, не дают желаемого результата.

Методы выделения различных веществ, применяемые в химической технологии и описанные в литературе, сводятся в основном к экстракции целевого продукта, в данном случае ПГБ, из сухой или из сырой биомассы.

Если экстракция проводится из сухой биомассы, то ей предшествует обработка сырой биомассы, содержащей целевой продукт - ПГБ, органическим растворителем, нерастворяющим ПГБ (далее - нерастворитель), с целью освобождения от воды, липидов, неорганических солей и других примесей; отделение осадка - клеточной массы, содержащей ПГБ, известными способами - фильтрацией или центрифугированием и ее сушка (ЕР №0015123, С12Р 7/62, опубл. 22.12.1982 г.; пат. США №3036959, НКИ 435-146, МПК С12Р 7/62, опубл. 29.05.1962 г.; пат. США №3044942, НКИ 195-47, класс по МПК - не указан, опубл. 17.07.1962 г.). В частности, в ЕР №0015123 предлагается для осушки сначала через сырую биомассу пропустить поток газа при температуре не менее 100°С для испарения воды, а затем обработать ее ацетоном или метанолом. Ацетон используется также и в способах выделения ПГБ, защищенных патентами США №3036959 и №3044942.

Непосредственно сама экстракция ПГБ из сухой биомассы осуществляется растворителем ПГБ, отделяется клеточная масса известными способами - фильтрацией или центрифугированием, затем проводится осаждение целевого продукта - ПГБ нерастворителем, его отделение и сушка.

В случае прямой экстракции ПГБ из сырой биомассы последняя обрабатывается растворителем ПГБ, отделяется органическая фаза, содержащая ПГБ, фильтрацией или центрифугированием; затем проводится осаждение ПГБ нерастворителем, отделение осадка ПГБ центрифугированием, фильтрацией или в обогреваемом сепараторе и сушка целевого продукта.

Необходимо отметить, что в последнее время в большинстве случаев при прямой экстракции проводится подсушивание сырой биомассы, например, центрифугированием в дисковом сепараторе (заявка ФРГ №4036067, С12Р 7/62, опубл. 14.05.1992 г.), пропусканием газа с температурой 100-500°С (пат. США №4324907, НКИ 560-185, МПК С07С 67/56, опубл. 13.04.1982 г.).

В качестве экстрагирующего растворителя используются частично галогенированные углеводороды, такие как 1,2-дихлорэтан, хлороформ (ЕР №0015123, ЕР №0015669, С12Р 7/62, опубл. 17.09.1980 г.; пат. США №4324907); 1,1,2-трихлорэтан, 1,1,2,2-тетрахлорэтан (пат. США №4310684, НКИ 560-185, МПК С07С 69/675, опубл. 12.01.1982 г.), метиленхлорид (заявка ФРГ №4036067). Как правило, процесс осуществляется при температуре более 40°С. Причем среди них есть такие как, например, хлороформ, с которыми получается сравнительно хороший выход, и такие как, например, 1,2-дихлорэтан, с которыми получается чистый ПГБ.

В патенте ФРГ №19533459 (С08G 63/89, опубл. 28.11.1996 г.) и заявке ФРГ №19623778 (С08G 63/90, опубл. 14.06.1996 г.) используются метил- и этиллактаты, но при этом температуры экстракции высоки (например, для этиллактата - 154°С). В заявке ФРГ №19712702 (С08G 63/06, опубл. 01.10.1998 г.) описано применение уксусной кислоты, а в заявке ГДР №229428 (С12Р 7/62, опубл. 06.11.1985 г.) - уксусный ангидрид. Но в этих растворителях уже вблизи 70°С происходит гелеобразование и смешение с побочными компонентами биомассы. При этом часть растворителя сохраняется в ПГБ, придавая продукту специфический запах. Не исключается также возможный гидролиз ПГБ с уменьшением молекулярной массы. В патенте ФРГ №19955381 (С12Р 7/62, опубл. 22.02.2001 г.) описывается экстракция 1-метил-2-пирролидоном при 80-120°С, причем при экстракции прибавляется связывающее воду вещество, предпочтительно уксусный ангидрид. По патенту США №3036959 экстракция осуществляется с использованием пиридина при температуре более 40°С.

Для осаждения ПГБ из органической фазы используют воду, метанол или их смесь, ацетон, петролейный эфир, неполярные растворители.

Сушка целевого ПГБ, предложенная в различных патентах, осуществляется при температуре от 50 до 80°С.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ выделения ПГБ из биомассы, описанный в заявке ФРГ №4036067 (С12Р 7/62, опубл. 14.05.1992 г.). В соответствии с этим источником сухая биомасса обрабатывается с целью экстракции ПГБ хлоруглеводородом - метиленхлоридом (несмешивающимся с водой растворителем и имеющим температуру кипения ниже 100°С) - при нагревании в течение 30 минут. Затем отделяется клеточный материал центрифугированием со скоростью 2200 об/мин в течение 30 минут. Далее оставшаяся органическая фаза, содержащая ПГБ, впрыскивается в воду, нагретую выше температуры кипения растворителя (˜80°С). Впрыскивание проводится со скоростью 300 л/час действием водяного пара с давлением 3 бар с помощью двойного сопла с диаметром 4 мм для раствора ПГБ и кольцевого зазора около 2 мм для пара. ПГБ выпадает в виде хлопьев, часть воды испаряется. Суспензия перемешивается в течение 30 минут при температуре 80°С. Затем целевой продукт отделяется центрифугированием и сушится при 80°С в течение 24 часов.

Выход продукта - 85%, чистота - 99%.

Следует отметить, что предварительно при приготовлении сухой биомассы часть воды из сырой биомассы удаляется центрифугированием в дисковом сепараторе.

К недостаткам данного способа можно отнести следующие: хотя вода является дешевым и нетоксичным реагентом, однако использование больших ее количеств, в частности, на стадии удаления метиленхлорида приводит, с одной стороны, к необходимости ведения процесса при повышенной температуре (80°С) и, с другой - к протеканию процесса гидролиза полимера, что влечет за собой существенное снижение его молекулярной массы и препятствует получению полимера с заранее заданной молекулярной массой. Снижению молекулярной массы полимера способствует также и необходимость длительной сушки (до 24 час) выделенного из раствора ПГБ от воды при повышенной температуре (80°С). Небольшой выход готового продукта 85% является также результатом применения для его очистки больших количеств воды, а наличие даже малой примеси метиленхлорида делает невозможным применение такого ПГБ в медицинских целях.

Техническая задача предлагаемого изобретения состоит в получении ПГБ медицинского назначения с заранее заданной молекулярной массой и повышенной чистотой полимера, а также ускорении технологического процесса выделения целевого продукта.

Технический результат, состоящий в получении ПГБ с молекулярной массой 300-1200 кДа, выходом не менее 90% и чистотой не менее 99,2% при сокращении времени процесса, достигается тем, что в способе выделения ПГБ из сухой биомассы микроорганизма, включающем экстракцию ПГБ хлоруглеводородом и отделение клеточного материала с последующим осаждением ПГБ из хлоруглеводорода при перемешивании, отделением и сушкой целевого продукта, в качестве сухой биомассы микроорганизма используют биомассу микроорганизма рода Azotobacter с содержанием ПГБ от 50 до 75%, азота от 1,2 до 3,5% и золы от 10 до 25%, в качестве хлоруглеводорода применяют хлороформ, экстракцию осуществляют при температуре 30-40°С и концентрации ПГБ в хлороформе от 0,3 до 0,55 г/л, а осаждение проводят путем равномерной подачи раствора ПГБ в хлороформе в изопропиловый спирт, причем скорость подачи составляет от 1 до 3 л/час.

Сырую биомассу с содержанием сухого остатка 24-32%, полученную ферментативным способом с использованием микроорганизма рода Azotobacter, подготавливают любыми известными способами: путем промывки ее изопропиловым спиртом, вакуумной фильтрации изопропилового спирта с растворенными в нем липидными соединениями, подсушки и дробления отмытой биомассы до порошкообразного состояния.

Предложенное техническое решение иллюстрируется следующими примерами (1-19). Следует отметить, что в примерах 1-13 и 17-19 используется сухая биомасса, полученная ферментативным способом с использованием штамма микроорганизма Azotobacter chroococcum 7Б; в примере 14 - с использованием штамма микроорганизма Azotobacter chroococcum 12A; в примере 15 - с использованием штамма микроорганизма Azotobacter chroococcum 35 и в примере 16 - с использованием штамма микроорганизма Azotobacter vinelandii 21.

Пример 1.

В трехгорлую колбу емкостью 3 литра, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником и термометром, загружают 16 г сухой биомассы с содержанием ПГБ 70%, азота 1,66%, золы 13% и 1500 мл хлороформа. Включают мешалку и содержимое колбы интенсивно перемешивают в течение 2 часов при температуре 38°С, поместив колбу в нагреваемую водяную баню. В колбе получают суспензию сухой биомассы в хлороформе.

Полученную суспензию отфильтровывают на воронке Бюхнера через два слоя фильтрующего материала (бельтинг и капрон) при вакууме 15 мм рт.ст. ост. и комнатной температуре. На фильтре образуется осадок, который представляет собой побочный продукт очистки сухой биомассы - клеточный материал.

Содержание ПГБ, находящегося в растворе хлороформа, равно 11,2 г, что соответствует 0,5% концентрации его в растворе.

Далее в трехгорлую колбу емкостью 8 л, снабженную механической мешалкой, термометром, обратным холодильником, капельной воронкой, загружают 4500 мл изопропилового спирта. Включают мешалку и при интенсивном перемешивании содержимого колбы подают из капельной воронки 1500 мл 0,5% раствора ПГБ в хлороформе со скоростью 1,3 л/час. При этом ПГБ выделяется из раствора в виде белых хлопьев. По окончании введения раствора ПГБ в хлороформе в изопропиловый спирт мешалку выключают и оставляют образовавшийся гель для созревания на 1 час при комнатной температуре. Затем гель отфильтровывают на воронке Бюхнера через два слоя фильтровального материала (бельтинг и капрон) при вакууме 15 мм рт.ст. ост. Гель счищают с фильтрующего материала и снова помещают в трехгорлую колбу емкостью 1 л, снабженную механической мешалкой, термометром и обратным холодильником, куда загружают 350 мл изопропилового спирта, включают мешалку и проводят дополнительную промывку изопропиловым спиртом в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем мешалку выключают, а осадок отфильтровывают от изопропилового спирта на воронке Бюхнера через два слоя фильтрующего материала (бельтинг и капрон) при вакууме 15 мм рт.ст. ост. и комнатной температуре. Осадок высушивают в сушильном шкафу при температуре 58-60°С в течение 2 часов. Получают 11,03 г (98,5%) ПГБ с содержанием основного вещества 99,95%, азота 0,1%, молекулярной массой 300 кДа.

Сырую биомассу с содержанием сухого остатка 24-32% предварительно подготавливают путем промывки ее изопропиловым спиртом, вакуумной фильтрации изопропилового спирта с растворенными в нем липидными соединениями, подсушки и дробления отмытой биомассы до порошкообразного состояния.

Сведения по примерам 2-16 (в соответствии с изобретением), 17-18 (сравнительные - при параметрах, выходящих за заявленные пределы) осуществляются по методике, описанной в примере 1, пример 19 - воспроизведение прототипа, приведены в таблице.

Сопоставление предложенного способа со способом по прототипу затруднено тем, что способ по прототипу осуществлен не в лабораторных условиях, а на камеральной установке. В связи с этим способ по прототипу воспроизведен нами в лабораторных условиях.

Пример 19 (по прототипу).

В трехгорлую колбу емкостью 2 л, снабженную водяной баней, механической мешалкой, обратным холодильником и термометром, загружают 39 г сухой биомассы. К ней прибавляют 156 мл метиленхлорида и нагревают с обратной конденсацией 30 минут. Полученную смесь центрифугируют для отделения органического раствора ПГБ от водной фазы клеточного материала микроорганизмов.

Органическую фазу впрыскивают при 80°С в пятигорлую колбу емкостью 2 л, снабженную термометром, механической мешалкой, обратным холодильником, двойным соплом, и содержащую 320 мл воды. Впрыскивание органической фазы со скоростью 50 л/час производят действием водяного пара давлением 0,5 бар с помощью двойного сопла с диаметром 1 мм для раствора и кольцевого зазора около 0,5 мм - для пара. Постоянство температуры поддерживают с помощью водяной бани. При этом выпадают хлопья ПГБ и испаряется часть воды. По окончании впрыскивания перемешивают суспензию 30 минут при 80°С. Наконец, снова центрифугируют массу в той же центрифуге и высушивают хлопья ПГБ в полочной сушилке при 80°С в течение 12 часов. При этом получают 9,5 г ПГБ (выход 85%) с чистотой 99,0% и содержанием метиленхлорида менее 1 млн.д. Продолжительность процесса составляет 14 часов.

Для приготовления сухой биомассы предварительно часть воды удаляют из сырой биомассы центрифугированием в дисковом сепараторе.

Представленные примеры подтверждают достижение следующего технического результата:

- полученный ПГБ обладает свойствами, позволяющими использовать его в медицине в виде пленок и нитей, например, как шовный биоразлагаемый материал, который не требует удаления с течением времени;

- получен ПГБ с заранее заданной молекулярной массой 300-1200 кДа;

- выход ПГБ составляет 95,0-98,5% против 85% по прототипу;

- чистота ПГБ 99,5-99,95% против 99,0% по прототипу;

- продолжительность процесса сократилась с 14 часов до 8-10,5 часов по сравнению с прототипом.

Кроме того, предлагаемая технология выделения ПГБ малоотходна, т.к. большая часть растворителей возвращается в процесс и находится в цикле.

Таблица
Характеристика исходного сырья, параметров процесса и технического результата в сравнении с прототипом
№ примера	Содержание веществ и результаты анализа сухой биомассы, мас.%	Температура экстракции, °С	Концентр. ПГБ в хлороформе, %	Скорость подачи раствора ПГБ, л/ч	Продолжит. процесса, ч	Выход целевого ПГБ, %	Содержание ПГБ в конечном продукте, %	Молек. масса ПГБ, кДа
ПГБ	азот	зола
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
В соответствии с изобретением
1	70	1,66	13	38	0,5	1,3	8,0	98,5	99,95	300
2	50	3,4	24	38	0,37	1,1	9,0	96,0	99,5	370
3	75	1,3	11	38	0,53	1,2	10,0	97,0	99,6	680
4	70	1,2	15	35	0,45	1,5	9,5	98,0	99,85	500
5	56	3,5	20	37	0,42	1,8	9,0	96,8	99,7	700
6	72	1,48	10	35	0,52	2,0	9,0	97,0	99,5	430
7	54	3,1	25	40	0,38	1,1	10,0	97,5	99,7	450
8	52	3,3	23	30	0,35	1,1	10,5	96,0	99,6	560
9	65	2,12	16	40	0,47	2,0	8,5	96,5	99,9	380
10	50	3,5	25	38	0,3	3,0	8,0	95,0	99,7	1100
11	75	1,2	10,0	38	0,55	1,1	10,0	97,0	99,5	600
12	67	2,0	14,8	40	0,48	1,0	10,5	95,5	99,65	1000
13	60	2,6	19	38	0,43	3,0	8,5	97,0	99,8	1200
14	71	3,2	19	37	0,46	1,1	9,5	97,5	99,6	500
15	55	2,5	20	40	0,4	2,1	9,9	96,0	99,8	1000
16	68	1,5	12	36	0,5	1,5	10,0	97,8	99,9	350
Для сравнения
17	49	3,6	25,6	29	0,28	0,9	11,0	90,0	99,2	1200
18	76	1,1	9,4	41	0,57	3,1	12,0	93,0	99,5	1000
Прототип
19	72	1,3	10	80	-	50	14	85	99,0	600

При этом полученный технический результат не является очевидным. Казалось бы, логичнее при осаждении ПГБ из раствора, поскольку в реакторе находится раствор ПГБ в хлороформе, подавать туда осадитель - изопропиловый спирт. Однако обнаружилось, что при таком порядке ведения процесса увеличивается время осаждения полимера из раствора, снижается чистота продукта; при обратном же порядке введения реагентов, т.е. при равномерном добавлении раствора ПГБ в хлороформе в изопропиловый спирт с определенной скоростью, удается получить продукт улучшенного качества при ускорении процесса.

Способ выделения полигидроксибутирата из сухой биомассы микроорганизма, включающий экстракцию полигидроксибутирата хлоруглеводородом и отделение клеточного материала с последующим осаждением полигидроксибутирата из хлоруглеводорода при перемешивании, отделением и сушкой целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве сухой биомассы микроорганизма используют биомассу микроорганизма рода Azotobacter с содержанием полигидроксибутирата от 50 до 75%, азота от 1,2 до 3,5% и золы от 10 до 25%, в качестве хлоруглеводорода применяют хлороформ, экстракцию осуществляют при температуре 30-40°С и концентрации полигидроксибутирата в хлороформе от 0,3 до 0,55 г/л, а осаждение проводят путем равномерной подачи раствора полигидроксибутирата в хлороформе в изопропиловый спирт, причем скорость подачи составляет от 1 до 3 л/ч.