Биологически активный гетерогликозид для коррекции патологических состояний центральной нервной системы
Владельцы патента RU 2335289:
Общество с ограниченной ответственностью "Группа "Новые Технологии" (RU)
Изобретение относится к медицине и биологии и может найти применение в качестве средства фармакологической коррекции патологических состояний центральной нервной системы. Гетерогликозид, выделенный из делящихся растительных клеток, содержит следующие компоненты, мас.%: рамноза 2-10, арабиноза 3-15, галактоза 2,5-27, ксилоза 0.1-3, манноза 0,1-5, уроновые кислоты 2-5, агликон фенольной природы 5-10 и глюкоза - остальное. Техническим результатом является выявление нейрофизиологической активности, которая проявляется в способности гликозида изменять фоновую активность и/или реакцию нервных клеток на тактильную стимуляцию. 6 табл.
Изобретение относится к медицине и биологии и может найти применение в качестве средства фармакологической коррекции патологических состояний центральной нервной системы (ЦНС).
Известно лекарственное средство для коррекции патологии ЦНС, включающее активную часть, содержащую низкомолекулярный гепарин, состоящий из олигосахаридов, имеющий на одном из своих концов 2-0-сульфо-4-енопиранозоуроновую кислоту, со средней молекулярной массой 1500-6000 D, получаемый деполимеризацией сложного эфира гепарина гидроксидом натрия и применяемый для профилактики и лечения травм ЦНС (RU 2195287, опуб. 27.12.2002). Гепарин - кислый аминополисахарид, с сульфатированной аминогруппой, выделен из тканей печени. Лекарственное средство может вводиться в организм внутривенно, подкожно, перорально, ректально. В тесте на животных (крысах) предложенный препарат уменьшает размер церебральной травмы на 30%. Рекомендуемая доза лекарственного средства составляет 14-280 мг в сутки для взрослого человека.
Техническим результатом предложенного изобретения является повышение терапевтической эффективности и безопасности препарата.
Поставленная задача решается новым средством для коррекции патологических состояний центральной нервной системы, представляющим собой гетерогликозид, выделенный из делящихся клеток картофельных ростков, включающий полисахаридную цепь, содержащую рамнозу, арабинозу, глюкозу, галактозу, ксилозу, манозу и уроновые кислоты, дополнительно содержащим биологически активный агликон фенольной природы, связанный с остатком полисахарида через атом кислорода, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Рамноза | 2-10 |
| Арабиноза | 3-15 |
| Галактоза | 2,5-27 |
| Ксилоза | 0.1-3 |
| Манноза | 0,1-5 |
| Уроновые кислоты | 2-5 |
| Агликон фенольной природы | 5-10 |
| Глюкоза | Остальное |
Известно, что многие группы химических веществ в период интенсивного роста и развития растения находятся в виде гликозидов. В процессе экстрагирования активных составляющих из растительного сырья и последующего их фракционирования обычно отбрасывается вся их не углеводная (не сахарная) часть. В то же время биологическое значение гликозидов в большинстве случаев обеспечивается структурой их агликонов. Наиболее востребованы в медицине и биологии вещества, обладающие полифункциональной антиоксидантной активностью. Высокую антиоксидантную активность в различных модельных системах in vivo и in vitro показывают природные полифенольные соединения. Полифенолы исключительно легко пересекают барьер между кровью и мозгом и быстро оказывают помощь нервным клеткам, особенно чувствительным к воздействию свободных радикалов, что предполагает их широчайшее использование при лечении заболеваний центральной нервной системы.
Известен полисахарид класса гексозных гликозидов (см. RU 2000126604, опуб. 10.03.2004), обладающий широким спектром противоинфекционной активности и содержащий полисахаридную цепь, включающую следующие сахара, мас.%: рамноза 2-10; арабиноза 3-15; глюкоза 10-67; галактоза 2,5-27; ксилоза 0.1-3; манноза 0,1-5; уроновые кислоты 2-5, нейтральный сахара - остальное. Однако данный гетерогликозид не обладает нейрофизиологической активностью.
Предложенное изобретение представляет собой новое вещество, обладающее как широким спектром противоинфекционной активности, так и способное к коррекции патологических состояний нервной системы и не имеющее побочных эффектов.
В отличие от известных моногликозидов растительного происхождения, представляющих из себя полисахариды (высоко- и низкомолекулярные гепарины, декстран и др.), и содержащие только углеводные остатки, предложенный гетерогликозид имеет в остатке агликон, состоящий из фенолосодержащих соединений, обладающий высокой антиоксидантной активностью, который обуславливает нейрофизиологическую активность.
Агликон и сахар соединены между собой связью, подобной сложноэфирной, поэтому молекула гликозида легко расщепляется в присутствии воды под влиянием энзимов (ферментов), содержащихся в этих растениях.
Связь сахара с агликоном фенольной структуры характеризуется следующей структурной формулой (на примере глюкозы):
где R1 алифатический боковой радикал.
Предлагаемый гетерогликозид получали следующим образом.
Пример 1.
Свежесобранные картофельные ростки длиной до 30 см и толщиной до 1 см измельчали до кашицеобразного состояния, заливали кипящей водой в соотношении 1:1 и выстаивали при комнатной температуре 18-20 часов. Экстракт сепарировали, добавляли азид натрия до концентрации 0,012% и выстаивали не менее 50 дней, затем концентрировали с помощью диализного патрона типа HF 89(S). Концентрат высушивали с помощью лиофильной сушки. Затем лиофилизат экстрагировали этилацетатом. Полученный экстракт концентрировали под вакуумом и растворяли в воде. Сухую субстанцию получали путем лиофилизации из предварительно замороженного водного раствора.
Пример 2.
Свежесобранные картофельные ростки длиной до 30 см и толщиной до 1 см измельчали до кашицеобразного состояния, заливали кипящей водой в соотношении 1: 1,5 и выстаивали при комнатной температуре 18-20 часов. Экстракт сепарировали, добавляли азид натрия до концентрации 0,012% и выстаивали не менее 50 дней, затем концентрировали с помощью диализного патрона типа HF 89(S). Концентрат высушивали с помощью лиофильной сушки. Затем лиофилизат экстрагировали бензолом. Сухой остаток повторно экстрагировали этилацетатом. Полученный экстракт концентрировали под вакуумом и растворяли в воде. Сухую субстанцию получали путем лиофилизации из предварительно замороженного водного раствора.
Полученное вещество представляет собой аморфный порошок от светло-серого до светло-коричневого оттенка, не имеющее запаха, легко растворимое в воде (рН 5,0-7,0) и водных растворах и практически не растворимое в этиловом и метиловом спиртах, хлороформе, эфире и ацетоне. Вещество имеет молекулярную массу 1-15-105 D, элементарный состав (в мас.%): азот 1,5-2; водород 5,3-6,4; углерод 42-43. Вещество содержит полисахаридную цепь, состоящую из мас.%: глюкоза 25-85,3; рамноза 2-10; рарбиноза 3-15; галактоза 2,5-27; ксилоза 0,1-3; манноза 0,1-5; урановые кислоты 2-5; агликон 5-10. Вещество характеризуется максимумами ИК-спектра: 3350, 1620, 1720, 1560, 1610, 1560, 1635, 2000 см-1, а при газовой хроматографии - временем удерживания моносахаридов (мин): рамноза, арабиноза, ксилоза 7,18÷7,49; манноза, глюкоза, галактоза 9,39÷9,72.
Исследование химического состава
Схема разделения, входящих в состав субстанции соединений основана на их физических и химических свойствах. Для разделения фенольных соединений и полисахаридов использовали осаждение последних 80% этанолом. Агликоны флавоноидов выделяли диэтиловым эфиром, а гликозиды диэтилацетатом.
ИК-спектры выделенных веществ снимали на спектрографе в таблетках КВг высотой 1 мм при соотношении вещества и наполнителя 1:400 и в пленке. УФ-спектры снимали на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм, растворитель - абсолютный этанол при концентрации вещества 2·10-4 и 2·10-5.
На основании физико-химических констант, УФ-, ИК-спектров и данных хроматографии на бумаге были выделены следующие известные вещества, являющиеся агликонами:
C16H12O6, идентифицированное, как изорамнетин λmax=282,287,311 нм
С21Н20О11, идентифицированное, как астрагалин λmax=267.5,297,351 нм
С21Н24О10, идентифицированное, как трифолизирин λmax=280,286,312 нм
С25Н28О6, идентифицированное, как вексибинол λmax=293,340 пл. нм
С27Н30О14, идентифицированное, как леспедин λmax=266,320,347 нм
С27Н30О16, идентифицированное, как кверцетин (рутин) λmax=262,280,366 нм
Нейрофизиологическая активность определялась на выбранных трех рецептурах содержания ингредиентов полученного гетерогликозида при воздействии на препарат улитки Helix lucorum. Препарат позволяет исследовать активность нервных клеток. При получении препарата Helix lucorum (виноградной улитки) не нарушается связь между центральной нервной системой подглоточного комплекса ганглиев и эффекторными органами улитки - висцеральным мешком.
В таблице 1 приведены рецептуры состава гетерогликозида.
| Таблица 1 | ||||
| № п/п | Компоненты в гетерогликозида | Состав, мас.%: | ||
| 1 | 2 | 3 | ||
| 1 | L-Рамноза | 2,0 | 7,0 | 10,0 |
| 2 | L-Арабиноза | 3,0 | 15,0 | 7,0 |
| 3 | D-Галактоза | 27,0 | 2,5 | 15,0 |
| 4 | D-Ксилоза | 3,0 | 0,1 | 1,0 |
| 5 | D-Манноза | 0,1 | 5,0 | 2,5 |
| 6 | D-Глюкуроновые кислоты | 5,0 | 3,0 | 0,1 |
| 7 | Агликон | 5,0 | 10,0 | 7,5 |
| 8 | D-Глюкоза | остальное |
Гетерогликозид выбранных составов 1, 2, 3 добавляют в камеру, в которой содержится препарат Helix lucorum, в дозах 10-8-10-19 М/1 мл, воздействуя на различные нейроны (0, 1, 2), каждый из которых характеризуется фоном и реактивностью на раздражение. Применение препарата гетерогликозида сверх малых доз сопровождается изменением нейрофизиологического ответа нейрона.
В графе 4 таблицы 2 представлены характеристики, определяющие электрофизиологическую фоновую и/или реактивную специфичность нервных клеток виноградной улитки. Стабильность эффекта подтверждает факт изменения нейрофизиологической активности клеток полуинтактного препарата Helix lucorum после добавления гетерогликозида.
| Таблица 2 | ||||
| Исследуемый нейрон | Гетерогликозид | Характеристика нейрона | Эффект | |
| № состава | Доза (М/1 мл) | |||
| Нейрон №2 | 1 | 10-8 | Отсутствие фоновой активности, наличие спайковой активности в ответ на тактильную стимуляцию. | Появление в фоновой активности постсинаптических потенциалов, увеличение ответов на тактильную стимуляцию. |
| Нейрон №2 | 2 | 10-8 | Отсутствие фоновой активности и постсинаптических потенциалов. | Появление фоновых колебаний в течение 10 минут. |
| Нейрон №1 | 3 | 10-21 | Наличие фоновой активности. | Выключение генерации потенциала действия при сохранности фоновых колебаний нейрона. |
| Нейрон №2 | 1 | 10-21 | Наличие фоновой активности. | Замедление скорости генерации потенциала действия с появлением А-спайков в фоновой активности. |
| Нейрон №0 | 2 | 10-19 | Тормозные ответы на тактильные стимулы. | Увеличение тормозных ответов, увеличение частоты генерации потенциалов действия в фоне, через 6 минут после аппликации вещества - генерация подпороговых возбуждающих постсинаптических потенциалов. |
| Нейрон №1 | 3 | 10-19 | Возбуждающие постсинаптические потенциалы при стимуляции мантии. | Развитие фоновых спайков, появление высокочастотных колебаний мембранного потенциала, замедление привыкания. |
Как следует из таблиц 1 и 2, изучено влияние гликозида на мембранный потенциал и импульсную активность нейронов подглоточного комплекса ганглиев на полуинтактном препарате Helix lucorum при использовании метода внутриклеточной регистрации.
Установлены избирательное влияние гликозида на мембранный потенциал и импульсную активность нейронов и зависимость этого влияния от типа и функции нейрона в ганглии, что характерно для большинства нейроспецифических веществ. Гетерогликозид не обладает выраженной нейротоксичностью.
Исследование биологической активности гетерогликозида
Терапевтическая эффективность гетерогликозида оценивалась на различных моделях животных - крысах и мышах, у которых экспериментально вызывали различные патологические состояния центральной нервной системы
Пример 1. Применение препарата в качестве противопаркинсонического средства.
Эксперименты выполнены на аутбредных крысах самцах весом 380-420 г и мышах самцах инбредной линии С57 Black/6 весом 18-20 г.
Для моделирования паркинсонического синдрома (ПС) применяется внутрибрюшинное введение (в/б) нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) в дозе 40 мг/кг у крыс и в дозе 30 мг/кг у мышей.
Гетерогликозид 0,004% физиологический раствор вводится в/б двукратно за 24 часа и 1 час до применения МФТП мышам - в дозе 0,016 мг (0,4 мл), крысам - 0,1 мг (2,5 мл).
Снижение двигательной активности оценивают через 1,5 часа после инъекции МФТП по локомоторной активности в установке Opto-Varimex (у мышей) и ориентировочно-исследовательской реакции (ОИР) животных в условиях "открытого поля" (у крыс и мышей). Сразу после введения нейротоксина регистрируют наличие или отсутствие тремора и ригидности как у мышей, так и у крыс. У крыс регистрируют вегетативные проявления ПС. Эффективность Препарата оценивают по уменьшению процента животных с вегетативными признаками ПС и уровню двигательной активности животных. «
Препарат значимо снижает долю животных, у которых регистрируют ригидность, пилоэрекцию, проявления синдрома Штраубе, замирание и каталепсию (Табл.1). Через 1,5 часа после введения МФТП у крыс в условиях "открытого поля" наблюдают снижение ОИР по сравнению с контрольной группой животных. При введении Препарата ОИР увеличивается по сравнению с группой животных, получающих за 24 и 1 час до МФТП инъекции физиологического раствора (Табл.3).
В установке "Opto-Varimex" локомоторная активность животных, получающих нейротоксин, практически полностью подавляется. Применение Препарата вызывает достоверное увеличение двигательной активности у мышей, что составляет 75% от уровня двигательной активности животных группы пассивного контроля (Табл.3). Введение МФТП вызывает достоверное уменьшение ОИР в "открытом поле" у мышей по сравнению с животными, не получающими нейротоксин. Применение Препарата вызывает увеличение ОИР у животных экспериментальной группы, что свидетельствует о защитных свойствах препарата.
Полученные результаты свидетельствуют о наличии у гетерогликозида антипаркинсонической активности в условиях модели МФТП-вызванного ПС, главным образом, в отношении степени выраженности олигокинезии как у мышей линии С57/Вlack6, так и у аутбредных крыс. У крыс проявляет антипаркинсоническое действие также в отношении ригидности и других проявлений ПС, таких как пилоэрекция, синдром Штраубе, замирание и каталепсия.
| Таблица 3. | ||||||
| ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТА (2,5 МЛ) НА ПАРКИНСОНИЧЕСКИЙ СИНДРОМ, ВЫЗВАННЫЙ МФТП (40 мг/кг, в/б), У КРЫС | ||||||
| Вещества, n животных в группе | % крыс с вегетативными проявлениями МФТП-вызванного ПС | |||||
| Тремор | Ригидность | Полоэрекция | Синдром Штраубе | Замирание | Каталепсия | |
| Контроль (физ.р-р), 1=10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Физ.р-р+МФТП, 1=27 | 94.4 | 94.4 | 96.3 | 94.4 | 66.7 | 63.0 |
| Гетерогликозид + МФТП, 1=6 | 91.7 | 58.3* | 58.3* | 41.7* | 0** | 0** |
| Примечание | ||||||
| - достоверность при P ≤0.05;** достоверность при P ≤0.01 (по методу оценки для выборочных долей вариант) |
| Таблица 4. | |
| ВЛИЯНИЕ ГЕТЕРОГЛИКОЗИДА НА НАРУШЕНИЯ ДВИГАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ, ВЫЗВАННЫЕ МФТП В ДОЗЕ 30 МГ/КГ У МЫШЕЙ И В ДОЗЕ 40 МГ/КГ У КРЫС. (Для примера 1) | |
| Группы животных, n животных в группе | Поведенческая активность (%) |
| Актометр "Opto Varimex" | |
| Интактные мыши, n=10 | 100 |
| Мыши, получившие МФТП, n=10 | 5* |
| Мыши, получившие МФТП и премедикацию гетерогликозидом (0,4 мл), n=10 | 75° |
| Тест "Открытое поле" | |
| Интактные мыши, n=30 | 100 |
| Мыши, получившие МФТП, n=10 | 12* |
| Мыши, получившие МФТП и премедикацию гетерогликозидом (0,4 мл), n=10 | 40° |
Продолжение табл.4
| Группы животных, n животных в группе | Поведенческая активность (%) |
| Тест "Открытое поле" | |
| Интактные крысы, n=10 | 100 |
| Крысы, получившие МФТП, n=6 | 45* |
| Крысы, получившие МФТП и премедикацию гетерогликозидом (2,5 мл), n=6 | 75°° |
| Примечание: | |
| * - отличие от интактных животных при р<0,01 (t-критерий Стьюдента), | |
| ° - отличие от группы животных, получавших только МФТП при р<0,01 (t-критерий Стьюдента), | |
| °° - отличие от группы животных, получавших только МФТП при р<0,05 (U-критерий Манна-Уитни). |
Пример 2. Применение препарата в качестве анксиолитического средства
Опыты выполняются на инбредных мышах самцах Balb/c весом 25-30 г. Гетерогликозид 1 мг/кг, в/б вводят однократно за 90 мин до помещения животных в «открытое поле». Мыши контрольной группы получают в/б инъекции физиологического раствора в эквивалентном объеме. Экспериментальные данные представлены в виде средних значений по группе.
Применение Препарата (1 мг/кг, в/б) достоверно (р<0,01) увеличивает суммарные параметры ориентировочно-исследовательской реакции мышей линии Balb/c в тесте «открытого поля» по сравнению с животными контрольной группы (Табл. 5).
| Таблица 5. | |||
| ВЛИЯНИЕ ГЕТЕРОГЛИКОЗИДА (1 МГ/КГ, В/Б) НА ПОВЕДЕНИЕ МЫШЕЙ САМЦОВ ИНБРЕДНОЙ ЛИНИИ BALB/C В УСЛОВИЯХ ТЕСТА «ОТКРЫТОЕ ПОЛЕ». (Для примера 2). | |||
| Группы животных, n | Количество горизонтальных перемещений | Количество вертикальных движений | Суммарная ориентировочно-исследовательская активность |
| Интактные животные (физ. р-р) | 10,7±1,7 | 1,2±0,3 | 11,8±3,4 |
| Гетерогликозид (1 мг/кг) | 27,2±3,2* | 4,4±1,7* | 31,6±11,8* |
| Примечание:* - отличие от группы интактных мышей при p<0,05 (U-критерий Манна-Уитни). |
Пример 3. Применение препарата в качестве антиамнестического средства для коррекции состояния ЦНС при геморрагическом инсульте
Эксперименты проводятся на беспородных белых крысах самцах весом 200-250 г. Моделирование геморрагического инсульта (ГИ) - локального кровоизлияния в головном мозге проводится согласно методике А.Н.Макаренко и соавторов. Экспериментальным крысам осуществляют деструкцию мозговой ткани в области capsule interna с последующим введением в место повреждения крови, взятой из-под языка крысы (0,02-0,03 мл). Животных разделяют на 4 группы: интактные крысы, ложно оперированные, группа животных с ГИ, животные с ГИ, получавшие Гетерогликозид в дозе 40 мкг/кг. Регистрацию эффектов проводят через 24 часа и 14 суток после операции. Обучение и память крыс исследуют на модели условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) с электроболевым раздражением. УРПИ основан на врожденном стремлении к ограниченному затемненному пространству. С момента помещения животного в экспериментальную камеру в течение 180 с регистрируют латентный период первого захода в затемненное отделение. Когда крыса оказывается в затемненном отделении, наносят животному неизбегаемое электроболевое раздражение через пол (сила обучающего тока 0,45 мА, длительность каждого импульса составляла 1 с, интервал между последовательными импульсами - 2 с, 10 ударов). При воспроизведении УРПИ через 24 ч и 14 суток регистрируют латентный период захода животного в темное отделение и время пребывания в нем.
Применение препарата достоверно увеличивает латентное время захода животных в темную камеру и долю животных, отказывающихся от захода в "опасную" часть экспериментальной установки по сравнению с крысами группы ГИ, что свидетельствует о сохранности сформированного памятного следа и коррегирующих свойств у Препарата (Таблица 6).
Гетерогликозид для коррекции патологических состояний центральной нервной системы, выделенный из делящихся растительных клеток, включающий полисахаридную цепь, содержащую рамнозу, арабинозу, глюкозу, галактозу, ксилозу, маннозу и уроновые кислоты, отличающийся тем, что он дополнительно содержит биологически активный агликон фенольной природы, связанный с остатком полисахарида через атом кислорода при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| рамноза | 2-10 |
| арабиноза | 3-15 |
| галактоза | 2,5-27 |
| ксилоза | 0,1-3 |
| манноза | 0,1-5 |
| уроновые кислоты | 2-5 |
| агликон фенольной природы | 5-10 |
| глюкоза | остальное. |
