Человеческие моноклональные антитела к рецептору эпидермального фактора роста (egfr), способ их получения и их использование, гибридома, трансфектома, трансгенное животное, экспрессионный вектор

Описаны выделенные человеческие моноклональные антитела, которые специфически связывают рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) человека, а также соответствующие композиции на основе антител и биоспецифической молекулы. Человеческие антитела могут быть получены с использованием трансгенной мыши, способной к образованию множества изотипов человеческих моноклональных антител путем рекомбинации V-D-J и переключения изотипов. Представлены также фармацевтические композиции, содержащие человеческие антитела для лечения или предотвращения заболеваний, опосредованных экспрессией EGFR, трансгенные животные, отличные от человека, экспрессирующие указанные антитела, гибридомы и трансфектомы, которые продуцируют человеческие антитела. Описаны способы терапии и диагностики заболеваний, опосредованных экспрессией EGFR, с использованием человеческих антител или их антиген-связывающих фрагментов, а также способы подавления роста клеток, экспрессирующих EGFR, и индукции цитолиза указанных клеток. Изобретение позволяет получать терапевтические и диагностические препараты антител с улучшенными свойствами. 17 н. и 36 з.п. ф-лы, 22 ил., 4 табл.

 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

1. Выделенное человеческое моноклональное антитело, которое связывается с человеческим рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), выбранное из группы, включающей антитела IgGI, IgA, IgE, IgM, IgG4 и IgD, и при этом антитело содержит: каркасные сегменты человеческой тяжелой цепи, CDR1 участок человеческой тяжелой цепи, CDR2 участок человеческой тяжелой цепи и CDR3 участок человеческой тяжелой цепи, который представляет собой CDR3 участок человеческой тяжелой цепи моноклонального антитела 2F8, представленный на фиг.21 и 22; и каркасные сегменты человеческой легкой цепи, CDR1 участок человеческой легкой цепи, CDR2 участок человеческой легкой цепи и CDR3 участок человеческой легкой цепи, который представляет собой CDR3 участок человеческой легкой цепи моноклонального антитела 2F8, представленный на фиг.21 и 22.

2. Выделенное человеческое моноклональное антитело по п.1, отличающееся тем, что оно представлено антителом IgGI.

3. Человеческое антитело по п.1, отличающееся тем, что оно ингибирует связывание лиганда EGFR с человеческим EGFR.

4. Человеческое антитело по п.3, отличающееся тем, что лиганд EGFR представлен EGF или TGF-α.

5. Человеческое антитело по п.1, отличающееся тем, что оно связывается с человеческим EGFR с константой равновесия ассоциации (К_А) по меньшей мере приблизительно 10⁸ М^-1.

6. Человеческое антитело по п.1, отличающееся тем, что оно связывается с человеческим EGFR с константой равновесия ассоциации (К_А) по меньшей мере приблизительно 10⁹ М^-1.

7. Человеческое антитело по п.3, отличающееся тем, что оно блокирует связывание лиганда EGFR с человеческим EGFR по меньшей мере приблизительно на 50%.

8. Человеческое антитело по п.2, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную область из тяжелой цепи IgGl и вариабельную область из каппа-легкой цепи.

9. Человеческое антитело по п.1, отличающееся тем, что оно кодируется нуклеиновыми кислотами человеческой тяжелой цепи и человеческой каппа-легкой цепи, содержащими в своих вариабельных областях нуклеотидные последовательности, представленные в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3, соответственно, и консервативные модификации данных последовательностей.

10. Человеческое антитело по п.1, отличающееся тем, что оно имеет вариабельные области тяжелой цепи и каппа-легкой цепи, которые содержат аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, соответственно, и консервативные модификации данных последовательностей.

11. Человеческое антитело по п.1, отличающееся тем, что оно имеет вариабельные области тяжелой цепи и каппа-легкой цепи, которые содержат аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4 соответственно.

12. Человеческое антитело по п.1, отличающееся тем, что оно связывается с EGFR и ингибирует индуцированное EGF или TGF-α аутофосфорилирование EGFR.

13. Человеческое антитело по п.1, отличающееся тем, что оно связывается и ингибирует рост клеток, экспрессирующих EGFR.

14. Человеческое антитело по п.13, отличающееся тем, что оно связывается с клеткой, которая представляет собой опухолевую клетку, выбранную из группы, включающей клетку мочевого пузыря, клетку молочной железы, клетку толстой кишки, клетку опухоли почки, клетку яичника, клетку простаты, клетку почечно-клеточной опухоли, сквамозную клетку и немелкую клетку легкого.

15. Человеческое антитело по п.13, отличающееся тем, что оно связывается с клеткой, которая выбрана из группы, состоящей из клетки синовиального фибробласта и кератиноцита.

16. Человеческое антитело по п.1, отличающееся тем, что оно связывается с клетками, экспрессирующими EGFR, и индуцирует лизис клеток в присутствии человеческих эффекторных клеток.

17. Человеческое антитело по п.1, отличающееся тем, что оно связывается с клетками, экспрессирующими EGFR, но не индуцирует комплемент-опосредованный лизис клеток.

18. Выделенное человеческое антитело по п.1, отличающееся тем, что оно представляет собой фрагмент Fab или одноцепочечное антитело.

19. Выделенное человеческое антитело по п.1, отличающееся тем, что оно продуцируется гибридомой, которая включает В-клетку, полученную от трансгенного животного, отличного от человека, и имеющего геном, который содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой.

20. Выделенное человеческое антитело по п.1, отличающееся тем, что оно продуцируется трансфектомой, содержащей нуклеиновые кислоты, кодирующие человеческую тяжелую цепь и человеческую легкую цепь.

21. Выделенное человеческое моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом на EGFR, определенным антителом по п.11.

22. Гибридома, содержащая В-клетку, полученную от трансгенного животного, отличного от человека, и имеющего геном, который содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой, при этом гибридома продуцирует определяемое количество моноклонального антитела по п.1 или его антиген-связывающей части.

23. Трансфектома, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие человеческую тяжелую цепь и человеческую легкую цепь, при этом трансфектома продуцирует определяемое количество моноклонального антитела по п.1 или его антиген-связывающую часть.

24. Трансфектома по п.23, отличающаяся тем, что она содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие человеческую тяжелую цепь и человеческую легкую цепь, которые в своих вариабельных областях содержат нуклеотидные последовательности, представленные в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3 соответственно, или их консервативные модификации.

25. Трансгенное животное, отличное от человека, которое экспрессирует антитело по п.1, при этом трансгенное животное, отличное от человека, имеет геном, содержащий трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи.

26. Способ получения антитела по п.1, отличающийся тем, что осуществляют иммунизацию отличного от человека трансгенного животного, имеющего геном, содержащий трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, с помощью EGFR или клетки, экспрессирующей EGFR, обеспечивают таким образом продукцию антител В-клетками животного, выделяют В-клетки животного и осуществляют слияние В-клеток с клетками миеломы с образованием иммортализованных клеток гибридомы, которые секретируют антитело.

27. Биспецифическая молекула, содержащая человеческое антитело по п.1 и вторую связывающую специфичность в отношении человеческой антиген-презентирующей клетки.

28. Биспецифическая молекула, содержащая человеческое антитело по п.1 и вторую связывающую специфичность в отношении человеческого Fc-рецептора.

29. Биспецифическая молекула по п.28, отличающаяся тем, что упомянутый Fc-рецептор представляет собой человеческий рецептор FcγRI или человеческий рецептор Fcα.

30. Биспецифическая молекула по п.28, отличающаяся тем, что она связывает Fc-рецептор по центру, который отличается от центра связывания рецептора с иммуноглобулином.

31. Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения заболеваний, опосредованных экспрессией EGFR, содержащая человеческое антитело по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

32. Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения заболеваний, опосредованных экспрессией EGFR, содержащая комбинацию двух или более человеческих антител согласно п.1 или их антиген-связывающих фрагментов, где каждое из указанных антител или их антиген-связывающих фрагментов связывает отдельный эпитоп EGFR.

33. Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения заболеваний, опосредованных экспрессией EGFR, содержащая человеческое антитело по п.1 и химиотерапевтический агент.

34. Иммунотоксин, содержащий человеческое антитело по п.1, связанный с цитотоксическим агентом.

35. Способ подавления роста клетки, экспрессирующей EGFR, отличающийся тем, что осуществляют контактирование клетки с эффективным количеством антитела по п.1, ингибирующего связывание лиганда EGFR с человеческим EGFR, и подавляют таким образом рост клетки, экспрессирующей EGFR.

36. Способ по п.35, отличающийся тем, что клетку выбирают из группы, включающей клетку мочевого пузыря, клетку молочной железы, клетку толстой кишки, клетку почки, клетку яичника, клетку простаты, сквамозную клетку, немелкую клетку легкого, клетку синовиального фибробласта и кератиноцита.

37. Способ индукции цитолиза клетки, экспрессирующей EGFR, отличающийся тем, что осуществляют контактирование клетки, экспрессирующей EGFR, с антителом по п.1 в присутствии эффекторной клетки с обеспечением цитолиза клетки, экспрессирующей EGFR.

38. Способ по п.37, отличающийся тем, что клетку выбирают из группы, включающей клетку мочевого пузыря, клетку молочной железы, клетку толстой кишки, клетку почки, клетку яичника, клетку простаты, сквамозную клетку, немелкую клетку легкого, клетку синовиального фибробласта и кератиноцита.

39. Способ лечения или профилактики заболевания, опосредованного экспрессией EGFR, отличающийся тем, что субъекту вводят фармацевтическую композицию по любому из пп.31-33 в количестве, эффективном для лечения или профилактики заболевания, опосредованного экспрессией EGFR.

40. Способ по п.39, отличающийся тем, что заболевание представляет собой рак.

41. Способ по п.39, отличающийся тем, что заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание.

42. Способ по п.39, отличающийся тем, что субъекту вводят человеческое антитело, конъюгированное со связывающей специфичностью для Fc-рецептора.

43. Способ по п.39, отличающийся тем, что субъекту вводят человеческое антитело, конъюгированное с цитотоксином.

44. Способ по п.39, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют совместное введение терапевтического агента.

45. Способ по п.44, отличающийся тем, что терапевтический агент выбирают из группы, состоящей из доксорубицина (адриамицина), цисплатина, блеомицина сульфата, кармустина, хлорамбуцила и циклофосфамидгидроксимочевины.

46. Способ по п.40, отличающийся тем, что заболевание представляет собой форму рака, выбранную из группы, включающей рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак почки, рак яичника, рак простаты, почечно-клеточный рак, рак головы и рак шеи.

47. Способ по п.41, отличающийся тем, что заболевание включает гиперпролиферацию эпителия.

48. Способ по п.39, отличающийся тем, что заболевание представлено воспалительным артритом.

49. Способ детекции присутствия антигена EGFR или клетки, экспрессирующей EGFR, в образце, отличающийся тем, что осуществляют контактирование образца с антителом по п.1 в условиях, обеспечивающих образование комплекса между антителом или его частью и EGFR, и производят детекцию образования комплекса.

50. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи и/или тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела по любому из пп.1-21.

51. Экспрессионный вектор по п.50, отличающийся тем, что он дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область легкой цепи и/или тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела, которое связывает EGFR.

52. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, которые содержат аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4 соответственно, и консервативные модификации их последовательностей.

53. Трансфектома, содержащая экспрессионный вектор по п.50.