Противомикробные полипептиды из pseudoplectania nigrella
Изобретение относится к полипептидам с установленной аминокислотной последовательностью, обладающим противомикробной активностью. Аминокислотная последовательность полипептида имеет 65-99% идентичности с аминокислотной последовательностью полипептида, происходящего, в частности, из штамма Pseudoplectania nigrella CBS 444.97. Изобретение касается также полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность, которая кодирует указанный полипептид, конструкции нуклеиновой кислоты, рекомбинантного экспрессирующего вектора, содержащего указанную конструкцию, и рекомбинантной клетки-хозяина, предназначенной для получения указанного полипептида. В изобретении описаны способы получения полипептида и ингибирования роста микробных клеток с использованием указанного полипептида. Полипептиды по изобретению могут быть использованы для приготовления ветеринарного или терапевтического средства для лечения или профилактики микробной инфекции у человека и животных. Полипептид с антимикробными свойствами по изобретению обеспечивает стабильность антимикробной активности при его использовании в различных формах антимикробных средств. 11 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 табл.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к полипептидам, обладающим противомикробной активностью, и полинуклеотидам, имеющим нуклеотидную последовательность, которая кодирует данные полипептиды. Изобретение также относится к конструкциям нуклеиновых кислот, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим конструкции нуклеиновых кислот, а также к способам получения и применения полипептидов.
ПРЕДПОСЫЛКИ
Объектом данного изобретения являются полипептиды, обладающие противомикробной активностью, и полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте данное изобретение относится к полипептиду, обладающему противомикробной активностью, выбранному из группы, состоящей из:
(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 65% идентичностью с аминокислотами 1-40 SEQ ID NO:2;
(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 65% идентичностью с полипептидом, кодируемым частью нуклеотидной последовательности, кодирующей противомикробный полипептид, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97;
(c) полипептида, который кодируется нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется в условиях низкой жесткости с полинуклеотидным зондом, выбранным из группы, состоящей из:
(i) комплементарной нити нуклеотидов 166-285 SEQ ID NO:1,
(ii) комплементарной нити нуклеотидов 70-285 SEQ ID NO:1,
(iii) комплементарной нити нуклеотидов 1-285 SEQ ID NO:1;
(d) фрагмента (a), (b) или (c), который обладает противомикробной активностью.
Во втором аспекте данное изобретение относится к полинуклеотидам, имеющим нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид согласно изобретению.
В третьем аспекте данное изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид согласно изобретению, оперативно связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют продукцией полипептида в подходящем хозяине.
В четвертом аспекте данное изобретение относится к рекомбинантному экспрессирующему вектору, содержащему конструкцию нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
В пятом аспекте данное изобретение относится к рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
В шестом аспекте данное изобретение относится к способу получения полипептида согласно изобретению, указанный способ включает в себя:
(a) культивирование штамма, который в своей форме дикого типа способен продуцировать полипептид, чтобы получить полипептид; и
(b) выделение полипептида.
В седьмом аспекте данное изобретение относится к способу получения полипептида согласно изобретению, причем способ включает в себя:
(a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина согласно изобретению в условиях, способствующих продукции полипептида; и
(b) выделение полипептида.
Другие аспекты данного изобретения будут понятны из следующего далее описания и прилагаемой формулы изобретения.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Перед обсуждением данного изобретения более подробно сначала будут даны определения следующих терминов и условных обозначений.
Существенно чистый полипептид: В данном контексте термин «существенно чистый полипептид» означает препарат полипептида, который содержит самое большое 10 мас.% другого полипептидного вещества, с которым он совместно встречается в природе (предпочтительно более низкое процентное содержание другого полипептидного вещества, например, самое большее 8 мас.%, самое большее 6 мас.%, самое большее 5 мас.%, самое большее 4 мас.%, самое большее 3 мас.%, самое большее 2 мас.%, самое большее 1 мас.% и самое большее 1/2 мас.%). Таким образом, предпочтительно, чтобы существенно чистый полипептид был чистым по меньшей мере на 92%, т.е. чтобы полипептид составлял по меньшей мере 92мас.% от суммарного полипептидного вещества, присутствующего в препарате, и предпочтительно более высокое процентное содержание, такое как в случае по меньшей мере 94% чистоты, по меньшей мере 95% чистоты, по меньшей мере 96% чистоты, по меньшей мере 97% чистоты, по меньшей мере 98% чистоты, по меньшей мере 99% и наиболее предпочтительно 99,5% чистоты. Полипептиды, описанные в данной заявке, предпочтительно находятся в по существу чистой форме. В частности предпочтительно, чтобы приведенные в данном описании полипептиды были «в по существу чистой форме», т.е. чтобы препарат полипептида по существу не содержал другого полипептидного вещества, вместе с которым он встречается в природе. Это можно осуществить, например, получая полипептид с использованием хорошо известных рекомбинантных способов. В данном описании термин «существенно чистый полипептид» является синонимом терминов «изолированный полипептид» и «полипептид в изолированной форме».
Противомикробная активность: Термин «противомикробная активность» в данном описании определяется как активность, которая способна убивать или ингибировать рост микробных клеток. В контексте данного изобретения подразумевается, что термин «противомикробный» означает, что имеет место бактерицидное, и/или бактериостатическое, и/или фунгицидное, и/или фунгистатическое действие и/или вирицидное действие, при этом термин «бактерицидное» следует понимать как способное убивать бактериальные клетки. Термин «бактериостатическое» следует понимать как способное ингибировать бактериальный рост, т.е. ингибировать рост бактериальных клеток. Термин «фунгицидное» следует понимать как способное убивать клетки грибов. Термин «фунгистатическое» следует понимать как способное ингибировать рост грибов, т.е. ингибировать рост клеток грибов. Термин «вирицидное» следует понимать как способное инактивировать вирус. Термин «микробные клетки» означает бактериальные клетки или клетки грибов (включая дрожжи).
В контексте данного изобретения подразумевается, что термин «ингибирование роста микробных клеток» означает, что клетки находятся в нерастущем состоянии, т.е. они не способны размножаться.
Для целей данного изобретения противомикробную активность можно определить согласно способу, описанному Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2), pp. 167-174 (1991).
Полипептиды, обладающие противомикробной активностью, могут быть способны уменьшать количество живых клеток Escherichia coli (DSM 1576) до 1/100 после 30 мин инкубирования при 20°C в водном растворе 25% (мас./мас.); предпочтительно в водном растворе 10% (мас./мас.); более предпочтительно в водном растворе 5% (мас./мас.); еще более предпочтительно в водном растворе 1% (мас./мас.); наиболее предпочтительно в водном растворе 0,5% (мас./мас.); и особенно в водном растворе 0,1% (мас./мас.) полипептидов, обладающих противомикробной активностью.
Полипептиды, обладающие противомикробной активностью, также могут обладать способностью ингибировать рост Escherichia coli (DSM 1576) в течение 24 часов при 25°C в субстрате для роста микроорганизмов при добавлении в концентрации 1000 ч./млн; предпочтительно при добавлении в концентрации 500 ч./млн; более предпочтительно при добавлении в концентрации 250 ч./млн; еще более предпочтительно при добавлении в концентрации 100 ч./млн; наиболее предпочтительно при добавлении в концентрации 50 ч./млн; и особенно при добавлении в концентрации 25 ч./млн.
Полипептиды, обладающие противомикробной активностью, могут обладать способностью уменьшать количество живых клеток Bacillus subtilis (ATCC 6633) до 1/100 после 30 мин инкубирования при 20°C в водном растворе 25% (мас./мас.); предпочтительно в водном растворе 10% (мас./мас.); более предпочтительно в водном растворе 5% (мас./мас.); еще более предпочтительно в водном растворе 1% (мас./мас.); наиболее предпочтительно в водном растворе 0,5% (мас./мас.); и особенно в водном растворе 0,1% (мас./мас.) полипептидов, обладающих противомикробной активностью.
Полипептиды, обладающие противомикробной активностью, также могут обладать способностью ингибировать рост Bacillus subtilis (ATCC 6633) в течение 24 часов при 25°C в субстрате для роста микроорганизмов при добавлении в концентрации 1000 ч./млн; предпочтительно при добавлении в концентрации 500 ч./млн; более предпочтительно при добавлении в концентрации 250 ч./млн; еще более предпочтительно при добавлении в концентрации 100 ч./млн; наиболее предпочтительно при добавлении в концентрации 50 ч./млн; и особенно при добавлении в концентрации 25 ч./млн.
Полипептиды согласно данному изобретению предпочтительно должны обладать по меньшей мере 20% противомикробной активности полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, показанной в виде аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2. В особенно предпочтительном варианте полипептиды должны обладать по меньшей мере 40%, а именно по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, а именно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, а именно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, а именно примерно или по меньшей мере 100% противомикробной активности полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, показанной в виде аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2.
Идентичность: В данном контексте гомология между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром «идентичность».
В целях данного изобретения степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием программы FASTA, включенной в версию 2.0x пакета программ FASTA (см. W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), «Improved Tools for Biological Sequence Analysis», PNAS 85: 2444-2448; и W. R. Pearson (1990) «Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA», Methods in Enzymology 183: 63-98). Используемой для подсчета очков матрицей была BLOSUM50, штраф за пропуск составлял -12, и штраф за удлинение пропуска составлял -2.
Степень идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием такого же алгоритма и пакета компьютерных программ, как описанные выше. В качестве матрицы для подсчета очков использовали матрицу идентичности, штраф за пропуск составлял -16, и штраф за удлинение пропуска составлял -4.
Фрагмент: При использовании в данном описании «фрагмент» SEQ ID NO:2 представляет собой полипептид, в котором одна или несколько аминокислот делетированы из амино- и/или карбоксильного конца данной аминокислотной последовательности.
Аллельный вариант: В данном контексте термин «аллельный вариант» означает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один и тот же локус в хромосоме. Аллельные варианты возникают в природе в результате мутации и могут приводить к полиморфизму в популяциях. Мутации генов могут быть молчащими (без изменения в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененные аминокислотные последовательности. Аллельным вариантом полипептида является полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.
Существенно чистый полинуклеотид: Термин «существенно чистый полинуклеотид» в использовании в данном описании относится к препарату полинуклеотида, в котором полинуклеотид был извлечен из его природной генетической среды и, следовательно, не содержит других посторонних или нежелательных кодирующих последовательностей и находится в форме, подходящей для применения в системах продуцирования генетически сконструированного белка. Таким образом, существенно чистый полинуклеотид содержит самое большее 10 мас.% другого полинуклеотидного вещества, с которым он вместе встречается в природе (предпочтительно более низкое процентное содержание другого полинуклеотидного вещества, например, самое большее 8 мас.%, самое большее 6 мас.%, самое большее 5 мас.%, самое большее 4 мас.%, самое большее 3 мас.%, самое большее 2 мас.%, самое большее 1 мас.% и самое большее 1/2 мас.%). Однако существенно чистый полинуклеотид может содержать 5'- и 3'-нетранслируемые области природного происхождения, такие как промоторы и терминаторы. Предпочтительно, чтобы существенно чистый полинуклеотид был чистым по меньшей мере на 92%, т.е. чтобы полинуклеотид составлял по меньшей мере 92 мас.% от суммарного полинуклеотидного вещества, присутствующего в препарате, и предпочтительно более высокое процентное содержание, такое как в случае по меньшей мере 94% чистоты, по меньшей мере 95% чистоты, по меньшей мере 96% чистоты, по меньшей мере 97% чистоты, по меньшей мере 98% чистоты, по меньшей мере 99% и наиболее предпочтительно 99,5% чистоты. Полинуклеотиды, описанные в данной заявке, предпочтительно находятся в по существу чистой форме. В частности, предпочтительно, чтобы приведенные в данном описании полинуклеотиды были «в по существу чистой форме», т.е. чтобы препарат полинуклеотида по существу не содержал другого полинуклеотидного вещества, вместе с которым он встречается в природе. В данном описании термин «существенно чистый полинуклеотид» является синонимом терминов «изолированный полинуклеотид» и «полинуклеотид в изолированной форме».
Модификация(ции): В контексте данного изобретения термин «модификация(ции)» предназначен для обозначения любой химической модификации полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, показанной в виде аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2, а также генетической обработки ДНК, кодирующей данный полипептид. Модификацией(ями) может быть замена боковой цепи(пей) аминокислоты, замена(ны), делеция(ции) и/или инсерция(ции) в положении или рядом с представляющей интерес аминокислотой(ами).
Искусственный вариант: При использовании в данном описании термин «искусственный вариант» означает полипептид, обладающий противомикробной активностью, который был продуцирован организмом, который экспрессирует ген, модифицированный по сравнению с SEQ ID NO:1. Модифицированный ген, с которого продуцируется указанный вариант при экспрессии в подходящем хозяине, получают в результате вмешательства человека посредством модификации нуклеотидной последовательности, описанной SEQ ID NO:1.
кДНК: Подразумевается, что термин «кДНК» при использовании в данном контексте, означает молекулу ДНК, которую можно получить обратной транскрипцией со зрелой, сплайсированной молекулы мРНК, полученной из эукариотической клетки. В кДНК отсутствуют интронные последовательности, которые обычно присутствуют в соответствующей геномной ДНК. Исходный первичный РНК-транскрипт является предшественником мРНК, и он претерпевает серию событий процессинга перед появлением в виде зрелой сплайсированной мРНК. Указанные события включают удаление интронных последовательностей в ходе процесса, называемого сплайсингом. Поэтому когда кДНК получают из мРНК, она не содержит интронных последовательностей.
Конструкция нуклеиновой кислоты: При использовании в данном описании термин «конструкция нуклеиновой кислоты» означает молекулу нуклеиновой кислоты, либо однонитевую, либо двунитевую, которая выделена из встречающегося в природе гена или которая была модифицирована так, чтобы она содержала участки нуклеиновых кислот таким образом, который в иных обстоятельствах не существует в природе. Термин «конструкция нуклеиновой кислоты» является синонимом термина «экспрессирующая кассета» в том случае, когда конструкция нуклеиновой кислоты содержит регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности согласно данному изобретению.
Регуляторная последовательность: Термин «регуляторные последовательности» в данном описании включает все компоненты, которые необходимы или полезны для экспрессии полипептида согласно данному изобретению. Каждая регуляторная последовательность может быть нативной или чужеродной по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. Такие регуляторные последовательности включают, но не ограничены указанным, лидер, последовательность полиаденилирования, последовательность пропептида, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Минимально регуляторные последовательности включают в себя промотор и стоп-сигналы транскрипции и трансляции. Регуляторные последовательности могут быть снабжены линкерами в целях введения специфичных сайтов рестрикции, облегчающих лигирование регуляторных последовательностей с кодирующей областью нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид.
Оперативно связанный: Термин «оперативно связанный» в данном описании определяют как конфигурацию, в которой регуляторная последовательность соответствующим образом помещена в определенное положение относительно кодирующей последовательности ДНК-последовательности так, чтобы регуляторная последовательность управляла экспрессией полипептида.
Кодирующая последовательность: При использовании в данном описании подразумевается, что термин «кодирующая последовательность» относится к нуклеотидной последовательности, которая непосредственно определяет аминокислотную последовательность ее белкового продукта. Границы кодирующей последовательности, как правило, определяются открытой рамкой считывания, которая обычно начинается со стартового кодона ATG. Обычно кодирующая последовательность включает ДНК, кДНК и рекомбинантные нуклеотидные последовательности.
Экспрессия: В данном контексте термин «экспрессия» включает в себя любую стадию, вовлеченную в продукцию полипептида, включая, но не ограничивая указанным, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.
Экспрессирующий вектор: В данном контексте термин «экспрессирующий вектор» относится к молекуле ДНК, линейной или кольцевой, которая содержит участок, кодирующий полипептид согласно изобретению, и который оперативно связан с дополнительными участками, которые обеспечивают его транскрипцию.
Клетка-хозяин: Термин «клетка-хозяин» в используемом в данном описании смысле включает в себя любой тип клеток, который поддается трансформации конструкцией нуклеиновой кислоты.
Термины «полинуклеотидный зонд», «гибридизация», а также различные условия жесткости определены в разделе, озаглавленном «Полипептиды, обладающие противомикробной активностью».
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Полипептиды, обладающие противомикробной активностью
В первом варианте данное изобретение относится к полипептидам, обладающим противомикробной активностью, и при этом полипептиды содержат, предпочтительно состоят из аминокислотной последовательности, степень идентичности которой с аминокислотами 1-40 SEQ ID NO:2 (т.е. зрелым полипептидом) составляет по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70%, например, по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, например, по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 96%, например, по меньшей мере 97%, и еще более предпочтительно по меньшей мере 98%, например, по меньшей мере 99% (в дальнейшем «гомологичные полипептиды»). В представляющем интерес варианте аминокислотная последовательность отличается самое большее по десяти аминокислотам (например, десятью аминокислотами), особенно самое большее по пяти аминокислотам (например, пятью аминокислотами), например, самое большее по четырем аминокислотам (например, четырьмя аминокислотами), например, самое большее по трем аминокислотам (например, тремя аминокислотами) от аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2. В представляющем особый интерес варианте аминокислотная последовательность отличается самое большее по двум аминокислотам (например, двумя аминокислотами), например, по одной аминокислоте от аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2.
Предпочтительно полипептиды согласно данному изобретению содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2; ее аллельный вариант или ее фрагмент, который обладает противомикробной активностью. В другом предпочтительном варианте полипептид согласно данному изобретению содержит аминокислоты 1-40 SEQ ID NO:2. В следующем предпочтительном варианте полипептид состоит из аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2.
Аминокислоты, составляющие полипептид согласно изобретению, могут быть независимо выбраны из D- или L-форм.
Полипептид согласно изобретению может быть полипептидом дикого типа, обладающим противомикробной активностью, идентифицированным и выделенным из природного источника. Специфичный скрининг таких полипептидов дикого типа можно осуществить стандартными способами, известными в данной области. Кроме того, полипептид согласно изобретению можно получить способом перестановки ДНК так, как описано в J. E. Ness et al. Nature Biotechnology 17, 893-896 (1999). Кроме того, полипептид согласно изобретению может являться искусственным вариантом, который содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере одну замену, делецию и/или инсерцию аминокислоты по сравнению с аминокислотами 1-40 SEQ ID NO:2. Такие искусственные варианты можно сконструировать стандартными способами, известными в данной области, такими как сайт-специфичный/случайный мутагенез полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в виде аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2. В одном варианте изобретения изменения аминокислот (в искусственном варианте, а также в полипептидах дикого типа) минимальны, то есть представляют собой консервативные аминокислотные замены, которые существенно не влияют на укладку и/или активность белка; небольшие делеции, обычно от одной до примерно 30 аминокислот; небольшие удлинения аминоконца или карбоксильного конца, такие как аминоконцевой остаток метионина; небольшой линкерный пептид примерно до 20-25 остатков; или небольшое удлинение, которое облегчает очистку за счет изменения результирующего заряда или другой функции, такое как полигистидиновый участок, антигенный эпитоп или связывающий домен.
Примеры консервативных замен имеются в группе основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глютаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глютамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин, валин и метионин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и небольших аминокислот (глицин, аланин, серин и треонин). Замены аминокислот, которые в общем не изменяют специфичную активность, известны в данной области и описаны, например, H. Neurath and R. L. Hill, 1979, In The Proteins, Academic Press, New York. Наиболее часто встречающимися заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly, а также обратные замены указанных аминокислот.
В представляющем интерес варианте изобретения аминокислотными заменами являются замены такой природы, при которой изменяются физико-химические свойства полипептидов. Например, могут быть осуществлены замены аминокислот, которые повышают термостабильность полипептида, которые изменяют субстратную специфичность, которые изменяют оптимум pH и тому подобные.
Предпочтительно количество таких замен, делеций и/или инсерций по сравнению с аминокислотами 1-40 SEQ ID NO:2 составляет самое большее 10, например, самое большее 9, например, самое большее 8, более предпочтительно самое большее 7, например, самое большее 6, например, самое большее 5, наиболее предпочтительно самое большее 4, например, самое большее 3, например, самое большее 2, особенно самое большее 1.
Авторы данного изобретения выделили ген, кодирующий полипептид, обладающий противомикробной активностью, из Pseudoplectania nigrella. Штамм Pseudoplectania nigrella, несущий ген, депонировали в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры 28 января 1997 г. в The Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands (альтернативно P.O.Box 85167, 3508 AD Utrecht, The Netherlands), и присвоили номер доступа No. CBS 444.97.
Таким образом, во втором варианте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим, предпочтительно состоящим из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 65% идентична кодирующей противомикробный полипептид части нуклеотидной последовательности, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97. В представляющем интерес варианте изобретения полипептид содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, которая обладает по меньшей мере 70%, например, по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, например, по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 96%, например по меньшей мере 97% и еще более предпочтительно по меньшей мере 98%, например, по меньшей мере 99% идентичностью с кодирующей противомикробный полипептид частью нуклеотидной последовательности, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97 (в дальнейшем «гомологичные полипептиды»). В представляющем интерес варианте аминокислотная последовательность отличается самое большее по десяти аминокислотам (например, десятью аминокислотами), особенно самое большее по пяти аминокислотам (например, пятью аминокислотами), например, самое большее по четырем аминокислотам (например, четырьмя аминокислотами), например, самое большее по трем аминокислотам (например, тремя аминокислотами) от кодирующей противомикробный полипептид части нуклеотидной последовательности, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97. В представляющем особый интерес варианте аминокислотная последовательность отличается самое большее по двум аминокислотам (например, двумя аминокислотами), например, по одной аминокислоте от кодирующей противомикробный полипептид части нуклеотидной последовательности, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97.
Предпочтительно полипептиды согласно данному изобретению содержат аминокислотную последовательность кодирующей противомикробный полипептид части нуклеотидной последовательности, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97. В другом предпочтительном варианте полипептид согласно изобретению состоит из аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого кодирующей противомикробный полипептид частью нуклеотидной последовательности, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97.
Подобно тому, как описано выше, полипептид согласно изобретению может представлять собой искусственный вариант, который содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере одну замену, делецию и/или инсерцию аминокислоты по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой частью нуклеотидной последовательности, кодирующей противомикробный полипептид, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97.
В третьем варианте данное изобретение относится к полипептидам, обладающим противомикробной активностью, которые кодируются нуклеотидными последовательностями, которые гибридизуются в условиях очень низкой жесткости, предпочтительно в условиях низкой жесткости, более предпочтительно в условиях средней жесткости, более предпочтительно в условиях умеренно высокой жесткости, еще более предпочтительно в условиях высокой жесткости и наиболее предпочтительно в условиях очень высокой жесткости с полинуклеотидным зондом, выбранным из группы, состоящей из (i) нити, комплементарной нуклеотидам 166-285 SEQ ID NO:1, (ii) нити, комплементарной последовательности кДНК, заключенной в нуклеотидах 70-285 SEQ ID NO:1, и (iii) нити, комплементарной нуклеотидам 1-285 SEQ ID NO:1 (J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).
Нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или ее подпоследовательность, а также аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или ее фрагмент можно использовать для того, чтобы сконструировать полинуклеотидный зонд для идентификации и клонирования ДНК, кодирующей полипептиды, обладающие противомикробной активностью, из штаммов различных родов или видов согласно способам, хорошо известным в данной области. В частности, такие зонды можно использовать для гибридизации с геномной или кДНК представляющего интерес рода или вида с последующими стандартными процедурами Саузерн-блоттинга, чтобы идентифицировать и выделить соответствующий ген. Такие зонды могут быть значительно короче, чем полная последовательность, но должны иметь длину по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 нуклеотидов в длину, например, по меньшей мере 70 нуклеотидов в длину. Однако предпочтительно, чтобы полинуклеотидный зонд имел длину по меньшей мере 100 нуклеотидов. Например, полинуклеотидный зонд может составлять по меньшей мере 200 нуклеотидов в длину, по меньшей мере 300 нуклеотидов в длину, по меньшей мере 400 нуклеотидов в длину или по меньшей мере 500 нуклеотидов в длину. Можно использовать еще более длинные зонды, например, полинуклеотидные зонды, которые составляют по меньшей мере 600 нуклеотидов в длину, по меньшей мере 700 нуклеотидов в длину, по меньшей мере 800 нуклеотидов в длину или по меньшей мере 900 нуклеотидов в длину. Можно использовать как ДНК-зонды, так и РНК-зонды. Зонды обычно метят для выявления соответствующего гена (например, 32P, 3H, 35S, биотином или авидином).
Таким образом, можно проводить скрининг библиотеки геномной ДНК или кДНК, полученной из других подобных организмов, в отношении ДНК, которая гибридизуется с зондами, описанными выше, и которая кодирует полипептид, обладающий противомикробной активностью. Геномную или другую ДНК из других подобных организмов можно разделить с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле или другими способами разделения. ДНК из библиотек или разделенную ДНК можно перенести и иммобилизовать на нитроцеллюлозе или других подходящих материалах носителей. Чтобы идентифицировать клон или ДНК, которая гомологична SEQ ID NO:1, материал носителя с иммобилизованной ДНК используют для Саузерн-блота.
В целях данного изобретения гибридизация свидетельствует о том, что нуклеотидная последовательность гибридизуется с меченым полинуклеотидным зондом, который гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1, в условиях жесткости от очень низкой до очень высокой. Молекулы, с которыми полинуклеотидный зонд гибридизуется в данных условиях, можно зарегистрировать с использованием рентгеновской пленки или любым другим способом, известным в данной области. Всякий раз, когда термин «полинуклеотидный зонд» используется в данном контексте, следует понимать, что такой зонд содержит по меньшей мере 15 нуклеотидов.
В представляющем интерес варианте полинуклеотидный зонд является комплементарной нитью нуклеотидов 166-285, нуклеотидов 70-285 или нуклеотидов 1-285 SEQ ID NO:1.
В другом представляющем интерес варианте полинуклеотидный зонд является комплементарной нитью нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:2. В другом представляющем интерес варианте полинуклеотидный зонд является комплементарной нитью SEQ ID NO:1. В еще одном представляющем интерес варианте полинуклеотидный зонд является комплементарной нитью кодирующей зрелый полипептид области SEQ ID NO:1. В другом представляющем интерес варианте полинуклеотидный зонд является комплементарной нитью кодирующей противомикробный полипептид области, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97. В еще одном представляющем интерес варианте полинуклеотидный зонд является комплементарной нитью области, кодирующей зрелый противомикробный полипептид, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97.
В случает длинных зондов, имеющих длину по меньшей мере 100 нуклеотидов, условия от очень низкой до очень высокой жесткости характеризуют как предгибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5× SSPE, 1,0% SDS, 5× растворе Денхардта, 100 мкг/мл расщепленной и денатурированной ДНК спермы лосося, с последующими стандартными процедурами Саузерн-блоттинга. Предпочтительно длинные пробы по меньшей мере из 100 нуклеотидов не содержат более 1000 нуклеотидов. В случае длинных проб по меньшей мере из 100 нуклеотидов в длину материал носителя в конце три раза промывают, каждый раз по 15 минут, используя 2× SSC, 0,1% SDS при 42°C (очень низкая жесткость), предпочтительно три раза промывают, каждый раз по 15 минут, используя 0,5× SSC, 0,1% SDS при 42°C (низкая жесткость), более предпочтительно три раза промывают, каждый раз по 15 минут, используя 0,2× SSC, 0,1% SDS при 42°C (средняя жесткость), еще более предпочтительно три раза промывают, каждый раз по 15 минут, используя 0,2× SSC, 0,1% SDS при 55°C (умеренно высокая жесткость), наиболее предпочтительно три раза промывают, каждый раз по 15 минут, используя 0,1× SSC, 0,1% SDS при 60°C (высокая жесткость), в частности, три раза промывают, каждый раз по 15 минут, используя 0,1× SSC, 0,1% SDS при 68°C (очень высокая жесткость).
Хотя не особенно предпочтительно, но предполагается, что также можно использовать более короткие зонды, например, зонды длиной примерно от 15 до 99 нуклеотидов, такие как примерно от 15 до 70 нуклеотидов в длину. В случае таких коротких зондов условия жесткости характеризуют как предгибридизацию, гибридизацию и промывку после гибридизации при температуре на 5-10°C ниже рассчитанной Tm с использованием расчета согласно Bolton and McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390) в 0,9 М NaCl, 0,09 M трис-HCl pH 7,6, 6 мМ EDTA, 0,5% NP-40, 1× растворе Денхардта, 1 мМ пирофосфате натрия, 1 мМ однозамещенном фосфате натрия, 0,1 мМ ATP и 0,2 мг дрожжевой РНК на мл, с последующими стандартными процедурами Саузерн-блоттинга.
В случае коротких зондов, которые имеют длину примерно от 15 до 99 нуклеотидов, материал носителя промывают один раз в 6× SCC плюс 0,1% SDS в течение 15 минут и два раза, каждый раз по 15 минут, используя 6× SSC при температуре на 5-10°C ниже рассчитанной Tm.
N-концевое удлинение
N-концевое удлинение соответственно может состоять из 1-50 аминокислот, предпочтительно 2-20 аминокислот, особенно 3-15 аминокислот. В одном варианте N-концевое удлинение пептида не содержит Arg (R). В другом варианте N-концевое удлинение содержит kex2 или kex2-подобный сайт расщепления, определение которого будет дано ниже. В предпочтительном варианте N-концевое удлинение представляет собой пептид, содержащий по меньшей мере два аминокислотных остатка Glu (E) и/или Asp (D), такое как N-концевое удлинение, содержащее одну из следующих последовательностей:
EAE, EE, DE, DD.
Сайты kex2
Сайты kex2 (см., например, Methods in Enzymology Vol. 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology") и kex2-подобные сайты являются состоящими из двух оснований сайтами узнавания (т.е. сайтами расщепления), обнаруженными между областью, кодирующей пропептид, и областью зрелого пептида некоторых белков.
В некоторых случаях показано, что инсерция сайта kex2 или kex2-подобного сайта усиливает точный эндопептидазный процессинг в сайте отщепления пропептида, приводя к повышенным уровням секреции белка.
В контексте изобретения инсерция сайта kex2 или kex2-подобного сайта в результате дает возможность получить расщепление в определенном положении в N-концевом удлинении, приводя к тому, что противомикробный полипептид становится удлиненным по сравнению со зрелым полипептидом, показанным в виде аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2.
Источники полипептидов, обладающих противомикробной активностью
Полипептид согласно данному изобретению можно получить из микроорганизмов любого рода. В целях данного изобретения термин «полученный из» в используемом в данном описании смысле будет означать, что полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, продуцируется клеткой, в которой нуклеотидная последовательность присутствует в природе или в которую нуклеотидная последовательность была встроена. В предпочтительном варианте полипептид секретируется из клетки.
Полипептид согласно данному изобретению может быть бактериальным полипептидом. Например, полипептид может быть полипептидом грамположительной бактерии, таким как полипептид Bacillus, например полипептид Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis или Bacillus thuringiensis; или полипептид Streptomyces, например, полипептид Streptomyces lividans или Streptomyces murinus; или полипептид грамотрицательной бактерии, например полипептид E. coli или Pseudomonas sp.
Полипептид согласно данному изобретению может быть полипептидом гриба и более предпочтительно полипептидом дрожжей, таким как полипептид Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia; или более предпочтительно полипептидом нитчатого гриба, таким как полипептид Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium или Trichoderma.
В представляющем интерес варианте полипептид является полипептидом Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis или Saccharomyces oviformis.
В другом представляющем интерес варианте полипептид является полипептидом Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei или Trichoderma viride.
В предпочтительном варианте полипептид является полипептидом Pseudoplectania nigrella и более предпочтительно полипептидом Pseudoplectania nigrella CBS 444.97, например полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности 1-40 SEQ ID NO:2.
Будет понятно, что в случае вышеуказанного вида изобретение охватывает как совершенные, так и несовершенные состояния и другие таксономические эквиваленты, например анаморфы, независимо от названия вида, под которым он известен. Специалисты в данной области легко смогут идентифицировать соответствующие эквиваленты.
Штаммы указанных видов легко и общедоступны из ряда коллекций культур, таких как Американская коллекция типов культур (ATCC), Немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) и Коллекция патентуемых культур службы сельскохозяйственных исследований, Northern Regional Research Center (NRRL).
Кроме того, такие полипептиды можно идентифицировать и получить из других источников, включая микроорганизмы, выделенные из природной среды (например, почвы, компостов, воды и т.д.), используя указанные выше зонды. Способы выделения микроорганизмов из природной среды хорошо известны в данной области. Затем можно получить нуклеотидную последовательность, сходным образом проводя скрининг библиотеки геномной или кДНК другого микроорганизма. После того как нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, выявлена с помощью зонда(дов), последовательность можно выделить или клонировать, используя способы, которые известны специалистам в данной области (см., например, Sambrook et al., 1989, выше).
Полипептиды, кодируемые нуклеотидными последовательностями согласно данному изобретению, также включают слитые полипептиды или расщепляемые слитые полипептиды, в которых другой полипептид слит с N-концом или C-концом полипептида или его фрагмента. Слитый полипептид получают слиянием нуклеотидной последовательности (или ее части), кодирующей другой полипептид, с нуклеотидной последовательностью (или ее частью) согласно данному изобретению. Способы получения слитых полипептидов известны в данной области и включают лигирование кодирующих последовательностей, кодирующих полипептиды, так чтобы они были в рамке и чтобы экспрессия слитого полипептида была под контролем того же самого промотора(ров) и терминатора.
Полинуклеотиды и нуклеотидные последовательности
Данное изобретение также относится к полинуклеотидам, имеющим нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид согласно изобретению. В частности, данное изобретение относится к полинуклеотидам, состоящим из нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид согласно изобретению. В предпочтительном варианте нуклеотидная последовательность указана в SEQ ID NO:1. В более предпочтительном варианте нуклеотидная последовательность представляет собой область SEQ ID NO:1, кодирующую зрелый полипептид. В другом более предпочтительном варианте нуклеотидная последовательность представляет собой область, кодирующую зрелый противомикробный полипептид, имеющейся у Pseudoplectania nigrella CBS 444.97. Данное изобретение также охватывает полинуклеотиды, имеющие, предпочтительно состоящие из нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или ее зрелого пептида, которые отличаются от SEQ ID NO:1 в силу вырожденности генетического кода.
Данное изобретение также относится к полинуклеотидам, имеющим, предпочтительно состоящим из последовательности SEQ ID NO:1, которая кодирует фрагменты SEQ ID NO:2, которые обладают противомикробной активностью. Подпоследовательность SEQ ID NO:1 является нуклеотидной последовательностью, входящей в SEQ ID NO:1, за исключением того, что были делетированы один или несколько нуклеотидов из 5'- и/или 3'-конца.
Данное изобретение также относится к полинуклеотидам, имеющим, предпочтительно состоящим из модифицированной нуклеотидной последовательности, которая содержит по меньшей мере одну модификацию в кодирующей зрелый полипептид последовательности SEQ ID NO:1, и где модифицированная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, который состоит из аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2.
Способы, используемые для выделения или клонирования нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, известны в данной области и включают выделение из геномной ДНК, получение из кДНК или их комбинацию. Клонирование нуклеотидных последовательностей согласно данному изобретению из такой геномной ДНК можно осуществить, например, с использованием хорошо известной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или скринингом с использованием антител экспрессирующих библиотек, чтобы выявить клонированные фрагменты ДНК с общими структурными признаками. См., например, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Можно использовать другие способы амплификации, такие как лигазная цепная реакция (ЛЦР), активируемая лигированием транскрипция (LAT) и основанная на нуклеотидной последовательности амплификация (NASBA). Нуклеотидная последовательность может быть клонирована на основе разновидности нуклеотидной последовательности, кодирующей противомикробный полипептид, присутствующей в Pseudoplectania или другом или родственном организме, и, следовательно, может быть аллельным или видовым вариантом кодирующей полипептид области нуклеотидной последовательности.
Нуклеотидную последовательность можно получить стандартными способами клонирования, используемыми в генетической инженерии для перенесения нуклеотидной последовательности из ее природного положения в другое место, где она будет копироваться. Способы клонирования могут включать в себя эксцизию и выделение требуемого фрагмента, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, инсерцию фрагмента в молекулу вектора и внедрение рекомбинантного вектора в клетку-хозяина, где будут реплицироваться множественные копии или клоны нуклеотидной последовательности. Нуклеотидная последовательность может быть геномной, кДНК, РНК, полусинтетической, синтетической природы или любой их комбинацией.
Данное изобретение также относится к полинуклеотиду, имеющему, предпочтительно состоящему из нуклеотидной последовательности, которая обладает по меньшей мере 65% идентичностью с нуклеотидами 166-285 SEQ ID NO:1. Предпочтительно нуклеотидная последовательность обладает по меньшей мере 70% идентичностью, например, по меньшей мере 80% идентичностью, такой как по меньшей мере 90% идентичность, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью, такой как по меньшей мере 96% идентичность, например, по меньшей мере 97% идентичность, еще более предпочтительно по меньшей мере 98% идентичностью, такой как по меньшей мере 99% идентичность с нуклеотидами 166-285 SEQ ID NO:1. Предпочтительно нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, обладающий противомикробной активностью. Степень идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют, как описано ранее (см. раздел, озаглавленный «Определения»). Предпочтительно нуклеотидная последовательность содержит нуклеотиды 166-285 SEQ ID NO:1. В еще более предпочтительном варианте нуклеотидная последовательность состоит из нуклеотидов 166-285 SEQ ID NO:1.
В другом представляющем интерес аспекте данное изобретение относится к полинуклеотиду, имеющему, предпочтительно состоящему из нуклеотидной последовательности, которая обладает по меньшей мере 65% идентичностью с кодирующей противомикробный полипептид частью нуклеотидной последовательности, присутствующей в кодирующей противомикробный полипептид нуклеотидной последовательности, имеющейся в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97. В предпочтительном варианте степень идентичности с кодирующей противомикробный полипептид частью нуклеотидной последовательности, присутствующей в кодирующей противомикробный полипептид нуклеотидной последовательности, имеющейся в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97, составляет по меньшей мере 70%, например, по меньшей мере 80%, а именно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, а именно по меньшей мере 96%, например, по меньшей мере 97%, еще более предпочтительно по меньшей мере 98%, а именно по меньшей мере 99%. Предпочтительно нуклеотидная последовательность содержит кодирующую противомикробный полипептид часть нуклеотидной последовательности, присутствующей в кодирующей противомикробный полипептид нуклеотидной последовательности, имеющейся в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97. В еще более предпочтительном варианте нуклеотидная последовательность состоит из кодирующей противомикробный полипептид части нуклеотидной последовательности, присутствующей в кодирующей противомикробный полипептид нуклеотидной последовательности, имеющейся в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97.
Модификация нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид согласно данному изобретению, может быть необходима для синтеза полипептида, который содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере одну замену, делецию и/или инсерцию по сравнению с аминокислотами 1-40 SEQ ID NO:2. Указанные искусственные варианты могут отличаться определенным специальным образом от полипептида, выделенного из его нативного источника, например, варианты, которые отличаются по удельной активности, термостабильности, оптимуму pH и тому подобному.
Специалистам в данной области будет понятно, что такие модификации можно осуществить вне областей, важных для функционирования молекулы, и все еще получить активный полипептид. Аминокислотные остатки, важные для активности полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью согласно изобретению, и поэтому предпочтительно не подвергаемые модификации, такой как замена, можно идентифицировать согласно способам, известным в данной области, таким как сайт-направленный мутагенез или мутагенез на основе сканирования аланином (см., например, Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). В последнем способе мутации вводят в каждый положительно заряженный остаток в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы тестируют в отношении противомикробной активности, чтобы идентифицировать аминокислотные остатки, которые являются критическими для активности молекулы. Сайты взаимодействия субстрат-фермент также можно определить анализом трехмерной структуры, которую определяют такими способами, как анализ ядерно-магнитного резонанса, кристаллография или фотоаффинное мечение (см., например, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).
Кроме того, нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид согласно данному изобретению, можно модифицировать введением нуклеотидных замен, которые не дают другой аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью, но которые соответствуют использованию кодонов организма хозяина, предназначенного для продуцирования фермента.
Введение мутации в нуклеотидную последовательность, чтобы заменить один нуклеотид на другой нуклеотид, можно осуществить сайт-направленным мутагенезом с использованием любого из способов, известных в данной области. Особенно применим способ, в котором используют суперспирализованный двунитевой ДНК-вектор с представляющей интерес инсерцией и двумя синтетическими праймерами, содержащими требуемую мутацию. Олигонуклеотидные праймеры, каждый из которых комплементарен противоположным нитям вектора, удлиняют в ходе температурного цикла с помощью ДНК-полимеразы Pfu. После включения праймеров образуется мутантная плазмида, содержащая ступенчато расположенные нити. После осуществления температурного циклирования продукт обрабатывают DpnI, которая специфична по отношению к метилированной и полуметилированной ДНК, чтобы расщепить родительскую ДНК-матрицу и отобрать содержащую мутацию синтезированную ДНК. Также можно использовать другие способы, известные в данной области. Общее описание нуклеотидной замены см., например, в Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
Данное изобретение также относится к полинуклеотиду, содержащему, предпочтительно состоящему из нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, обладающий противомикробной активностью и которая гибридизуется в условиях очень низкой жесткости, предпочтительно в условиях низкой жесткости, более предпочтительно в условиях средней жесткости, более предпочтительно в условиях умеренно высокой жесткости, еще более предпочтительно в условиях высокой жесткости и наиболее предпочтительно в условиях очень высокой жесткости с полинуклеотидным зондом, выбранным из группы, состоящей из (i) нити, комплементарной нуклеотидам 166-285 SEQ ID NO:1, (ii) нити, комплементарной последовательности кДНК, содержащейся в нуклеотидах 70-285 SEQ ID NO:1, и (iii) нити, комплементарной нуклеотидам 1-285 SEQ ID NO:1.
Как будет понятно, подробности и частности, касающиеся гибридизации нуклеотидных последовательностей, будут такими же или аналогичными аспектам гибридизации, обсуждаемым в разделе данного описания, озаглавленном «Полипептиды, обладающие противомикробной активностью».
Конструкции нуклеиновых кислот
Данное изобретение также относится к конструкциям нуклеиновых кислот, содержащим нуклеотидную последовательность согласно данному изобретению, оперативно связанную с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют экспрессией кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине в условиях, совместимых с регуляторными последовательностями.
Обработку нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид согласно данному изобретению, можно осуществлять различными способами, чтобы обеспечить экспрессию полипептида. Обработка нуклеотидной последовательности перед ее встраиванием в вектор может быть желательна или необходима в зависимости от экспрессирующего вектора. Методики модифицирования нуклеотидных последовательностей с использованием способов на основе рекомбинантной ДНК хорошо известны в данной области.
Регуляторной последовательностью может быть соответствующая промоторная последовательность, нуклеотидная последовательность, которая распознается клеткой-хозяином для экспрессии нуклеотидной последовательности. Последовательность промотора содержит регуляторные последовательности транскрипции, которые опосредуют экспрессию полипептида. Промотор может быть любой нуклеотидной последовательностью, которая проявляет транскрипционную активность в выбранной клетке-хозяине, включая мутантные, укороченные и гибридные промоторы, и может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды либо гомологичные, либо гетерологичные по отношению к клетке-хозяину.
Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией конструкций нуклеиновых кислот согласно данному изобретению, особенно в бактериальной клетке-хозяине, являются промоторы, полученные из lac-оперона E. coli, гена агаразы (dagA) Streptomyces coelicolor, гена левансукразы (sacB) Bacillus subtilis, гена альфа-амилазы (amyL) Bacillus licheniformis, гена мальтогенной амилазы (amyM) Bacillus stearothermophilus, гена альфа-амилазы (amyQ) Bacillus amyloliquefaciens, гена пенициллиназы (penP) Bacillus licheniformis, генов xylA и xylBBacillus subtilis и гена бета-лактамазы прокариот (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), а также промотор tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Другие промоторы описаны в «Useful proteins from recombinant bacteria» в Scientific American, 1980, 242: 74-94; и в Sambrook et al., 1989, выше.
Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией конструкций нуклеотидных последовательностей согласно данному изобретению в клетке-хозяине нитчатого гриба являются промоторы, полученные из генов амилазы Aspergillus oryzae TAKA, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger, устойчивой к кислотам альфа-амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы (glaA) Aspergillus niger или Aspergillus awamori, липазы Rhizomucor miehei, щелочной протезы Aspergillus oryzae, триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae, ацетамидазы Aspergillus nidulans и трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum (WO 96/00787), а также промотор NA2-tpi (гибрид промоторов генов нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger и триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae) и их мутантные, укороченные и гибридные промоторы.
Промоторы, применимые в дрожжевом хозяине, получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), галактокиназы Saccharomyces cerevisiae (GAL1), алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) и 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae. Другие применимые промоторы для дрожжевых клеток-хозяев описаны Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
Регуляторной последовательностью также может быть подходящая последовательность терминатора транскрипции, последовательность, узнаваемая клеткой-хозяином, чтобы остановить транскрипцию. Последовательность терминатора оперативно связана с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. В данном изобретении можно использовать любой терминатор, который является функциональным в выбранной клетке-хозяине.
Предпочтительные терминаторы в случае клеток-хозяев нитчатых грибов получают из генов амилазы TAKA Aspergillus oryzae, глюкоамилазы Aspergillus niger, антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, альфа-глюкозидазы Aspergillus niger и трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum.
Предпочтительные терминаторы в случае дрожжевых клеток-хозяев получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae, цитохрома C Saccharomyces cerevisiae (CYC1) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae. Другие применимые терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев описаны Romanos et al., 1992, выше.
Регуляторной последовательностью также может быть подходящая лидерная последовательность, нетранслируемая область мРНК, которая имеет важное значение для трансляции клеткой-хозяином. Лидерная последовательность оперативно связана с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. Любая лидерная последовательность, которая функциональна в выбранной клетке-хозяине, может быть использована в данном изобретении.
Предпочтительные лидеры для клеток-хозяев нитчатых грибов получают из генов амилазы TAKA Aspergillus oryzae и триозофосфатизомеразы Aspergillus nidulans.
Подходящие лидеры для дрожжевых клеток получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae, альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).
Регуляторной последовательностью также может быть последовательность полиаденилирования, последовательность, оперативно связанная с 3'-концом нуклеотидной последовательности и которая при транскрипции узнается клеткой-хозяином в виде сигнала к добавлению остатков полиаденозина к транскрибируемой мРНК. Любая последовательность полиаденилирования, которая является функциональной в выбранной клетке-хозяине, может быть использована в данном изобретении.
Предпочтительные последовательности полиаденилирования для клеток-хозяев нитчатых грибов получают из генов амилазы TAKA Aspergillus oryzae, глюкоамилазы Aspergillus niger, антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum и альфа-глюкозидазы Aspergillus niger.
Последовательности полиаденилирования, применимые в случае дрожжевых клеток, описаны Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.
Регуляторной последовательностью также может быть область, кодирующая сигнальный пептид, которая кодирует аминокислотную последовательность, связанную с аминоконцом полипептида, и направляет кодируемый полипептид в секреторный путь клетки. 5'-конец кодирующей последовательности нуклеотидной последовательности может природно содержать область, кодирующую сигнальный пептид, которая в естественных условиях связана в открытой рамке трансляции с участком кодирующей области, которая кодирует секретируемый полипептид. Альтернативно 5'-конец кодирующей последовательности может содержать область, кодирующую сигнальный пептид, которая является чужеродной по отношению к кодирующей последовательности. Область, кодирующая чужеродный сигнальный пептид, может быть необходима в тех случаях, когда кодирующая последовательность природно не содержит область, кодирующую сигнальный пептид. Альтернативно область, кодирующая сигнальный пептид, может просто заменять область, кодирующую природный сигнальный пептид, чтобы усилить секрецию полипептида. Однако в данном изобретении можно использовать любую область, кодирующую сигнальный пептид, которая направляет экспрессированный полипептид в секреторный путь выбранной клетки-хозяина.
Область, кодирующая сигнальный пептид, состоит из нуклеотидов 1-69 SEQ ID NO:1, которые кодируют аминокислоты от -55 до -33 SEQ ID NO:2 (или аминокислоты 1-23 SEQ ID NO:3).
Эффективными областями, кодирующими сигнальный пептид, в случае бактериальных клеток-хозяев являются области, кодирующие сигнальный пептид, полученные из генов мальтогенной амилазы Bacillus NCIB 11837, альфа-амилазы Bacillus stearothermophilus, субтилизина Bacillus licheniformis, бета-лактамазы Bacillus licheniformis, нейтральных протеаз (nprT, nprS, nprM) Bacillus stearothermophilus и prsA Bacillus subtilis. Другие сигнальные пептиды описаны Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
Эффективными областями, кодирующими сигнальный пептид в случае клеток-хозяев нитчатых грибов, являются области, кодирующие сигнальный пептид, полученные из генов амилазы TAKA Aspergillus oryzae, нейтральной амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, целлюлазы Humicola insolens и липазы Humicola lanuginosa.
Применимые сигнальные пептиды в случае дрожжевых клеток-хозяев получают из генов альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и инвертазы Saccharomyces cerevisiae. Другие применимые области, кодирующие сигнальные пептиды, описаны Romanos et al., 1992, выше.
Регуляторной последовательностью также может быть кодирующая пропептид область, которая кодирует аминокислотную последовательность, расположенную на аминоконце полипептида. Полученный в результате полипептид называют проферментом или прополипептидом (или в некоторых случаях зимогеном). Прополипепид, как правило, является неактивным и может быть превращен в зрелый активный полипептид в результате каталитического или аутокаталитического отщепления пропептида от прополипептида. Кодирующую пропептид область можно получить из генов щелочной протеазы Bacillus subtilis (aprE), нейтральной протеазы Bacillus subtilis (nprT), альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei и лакказы Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).
Кодирующая пропептид область представлена нуклеотидами 70-165 SEQ ID NO:1, которые кодируют аминокислоты от -32 до -1 SEQ ID NO:2 (или аминокислоты 24-55 SEQ ID NO:3).
В том случае, когда и область сигнального пептида, и область пропептида присутствуют на аминоконце полипептида, область пропептида расположена рядом с аминоконцом полипептида, а область сигнального пептида расположена рядом с аминоконцом области пропептида.
Также может быть желательным добавление регуляторных последовательностей, которые позволяют регулировать экспрессию полипептида в связи с ростом клетки-хозяина. Примерами регуляторных систем являются системы, которые вызывают включение или отключение экспрессии гена в ответ на химический или физический стимул, включая присутствие регуляторного соединения. Регуляторные системы в прокариотических системах включают системы операторов lac, tac и trp. В дрожжах можно использовать систему ADH2 или систему GAL1. У нитчатых грибов в качестве регуляторных последовательностей можно использовать промотор альфа-амилазы TAKA, промотор глюкоамилазы Aspergillus niger и промотор глюкоамилазы Aspergillus oryzae. Другими примерами регуляторных последовательностей являются последовательности, которые обеспечивают амплификацию генов. В эукариотических системах такие последовательности включают ген дигидрофолатредуктазы, который амплифицируется в присутствии метотрексата, и гены металлотионеина, которые амплифицируются в присутствии тяжелых металлов. В указанных случаях нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, обычно оперативно связана с регуляторной последовательностью.
Экспрессирующие векторы
Данное изобретение также относится к рекомбинантным экспрессирующим векторам, содержащим конструкцию нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Различные нуклеотидные и регуляторные последовательности, описанные выше, можно связать вместе, чтобы получить рекомбинантный экспрессирующий вектор, который может содержать один или несколько подходящих сайтов рестрикции, обеспечивающих инсерцию или замену нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, в таких сайтах. Альтернативно нуклеотидная последовательность согласно данному изобретению может быть экспрессирована посредством встраивания нуклеотидной последовательности или конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, в соответствующий вектор для экспрессии. При создании экспрессирующего вектора кодирующую последовательность располагают в векторе так, чтобы кодирующая последовательность была оперативно связана с соответствующими регуляторными последовательностями для экспрессии.
Рекомбинантным экспрессирующим вектором может быть любой вектор (например, плазмида или вирус), который можно легко подвергнуть процедурам получения рекомбинантной ДНК и который может осуществлять экспрессию нуклеотидной последовательности. Выбор вектора, как правило, будет зависеть от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую вектор необходимо ввести. Векторы могут быть линейными или замкнутыми кольцевыми плазмидами.
Вектор может быть автономно реплицирующимся вектором, т.е. вектором, который существует в виде внехромосомной единицы, репликация которой не зависит от репликации хромосомы, например плазмида, внехромосомный элемент, минихромосома или искусственная хромосома.
Вектор может содержать любые средства для обеспечения саморепликации. Альтернативно вектор может представлять собой вектор, который при введении в клетку-хозяин интегрируется в геном и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую он был интегрирован. Кроме того, можно использовать единичный вектор или плазмиду или два или более векторов или плазмид, которые вместе содержат суммарную ДНК, которую требуется ввести в геном клетки-хозяина, или можно использовать транспозон.
Векторы согласно данному изобретению предпочтительно содержат один или несколько селектируемых маркеров, которые позволяют легко проводить отбор трансформированных клеток. Селектируемым маркером является ген, продукт которого придает биоцидную или вирусную резистентность, резистентность к тяжелым металлам, прототрофность ауксотрофам и тому подобное.
Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются гены dal Bacillus subtilis или Bacillus licheniformis или маркеры, которые придают резистентность к антибиотикам, такую как резистентность к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Подходящими маркерами в случае дрожжевых клеток-хозяев являются ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 и URA3. Подходящие маркеры для применения в клетках-хозяевах нитчатых грибов включают, но не ограничены указанным, amdS (ацетамидазу), argB (орнитинкарбамоилтрансферазу), bar (фосфинотрицинацетилтрансферазу), hygB (гигромицинфосфотрансферазу), niaD (нитратредуктазу), pyrG (оротидин-5'-фосфатдекарбоксилазу), sC (сульфатаденилтрансферазу), trpC (антранилатсинтазу), а также их эквиваленты.
Предпочтительными для применения в клетке Aspergillus являются гены amdS и pyrG Aspergillus nidulans или Aspergillus oryzae и ген bar Streptomyces hygroscopicus.
Векторы согласно данному изобретению предпочтительно содержат элемент(ы), который обеспечивает стабильную интеграцию вектора в геном клетки-хозяина или автономную репликацию вектора в клетке независимо от генома.
В случае интеграции в геном клетки-хозяина вектор может зависеть от нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, или от любого другого элемента вектора для стабильной интеграции вектора в геном путем гомологичной или негомологичной рекомбинации. Альтернативно вектор может содержать дополнительные нуклеотидные последовательности для управления интеграцией посредством гомологичной рекомбинации в геном клетки-хозяина. Дополнительные нуклеотидные последовательности делают возможной интеграцию вектора в геном клетки-хозяина в точном положении(ях) хромосомы (хромосом). Чтобы повысить вероятность интеграции в точном положении интегрируемые элементы предпочтительно должны содержать достаточное количество нуклеотидов, а именно от 100 до 1500 пар оснований, предпочтительно от 400 до 1500 пар оснований и наиболее предпочтительно от 800 до 1500 пар оснований, которые высоко гомологичны соответствующей последовательности-мишени, чтобы повысить вероятность гомологичной рекомбинации. Интегрируемым элементом может быть любая последовательность, которая гомологична последовательности-мишени в геноме клетки-хозяина. Кроме того, интегрируемые элементы могут представлять собой некодирующие или кодирующие последовательности. С другой стороны, вектор может быть интегрирован в геном клетки-хозяина путем негомологичной рекомбинации.
В случае автономной репликации вектор может дополнительно содержать начало репликации, дающее возможность вектору автономно реплицироваться в данной клетке-хозяине. Примерами бактериальных начал репликации являются начала репликации плазмид pBR322, pUC19, pACYC177 и pACYC184, обеспечивающее репликацию в E. coli, и pUB110, pE194, pTA1060 и pAMβ1, обеспечивающее репликацию в Bacillus. Примерами начала репликации для применения в дрожжевых клетках-хозяевах являются начало репликации 2-микронной плазмиды, ARS1, ARS4, комбинация ARS1 и CEN3 и комбинация ARS4 и CEN6. Началом репликации может быть начало репликации, имеющее мутацию, которая делает его функционирование чувствительным к температуре в клетке-хозяине (см., например, Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).
В клетку-хозяин может быть встроено более одной копии нуклеотидной последовательности согласно данному изобретению, чтобы увеличить продуцирование генного продукта. Увеличение числа копий нуклеотидной последовательности можно получить путем интеграции по меньшей мере одной дополнительной копии последовательности в геном клетки-хозяина или путем введения амплифицируемого гена селектируемого маркера с нуклеотидной последовательностью, при этом клетки, содержащие амплифицированные копии гена селектируемого маркера и, следовательно, дополнительные копии нуклеотидной последовательности, могут быть отобраны в результате культивирования клеток в присутствии соответствующего селектирующего агента.
Способы, используемые для лигирования описанных выше элементов, чтобы сконструировать рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно данному изобретению, хорошо известны специалисту в данной области (см., например, Sambrook et al., 1989, выше).
Клетки-хозяева
Данное изобретение также относится к рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которую преимущественно используют при рекомбинантной продукции полипептидов. Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность согласно данному изобретению, вводят в клетку-хозяин так, чтобы вектор сохранялся в виде интегрированной в хромосому единицы или в виде самореплицирующегося внехромосомного вектора, как описано ранее.
Клеткой-хозяином может быть одноклеточный микроорганизм, например прокариот, или неодноклеточный организм, например, эукариот.
Применимыми одноклеточными являются бактериальные клетки, такие как грамположительные бактерии, включая, но не ограничивая указанным, клетку Bacillus, например Bacillus alkalophilus, Bacillusamyloliquefaciens, Bacillusbrevis, Bacilluscirculans, Bacillusclausii, Bacilluscoagulans, Bacilluslautus, Bacilluslentus, Bacilluslicheniformis, Bacillusmegaterium, Bacillusstearothermophilus, Bacillus subtilis и Bacillusthuringiensis; или клетку Streptomyces, наприме, Streptomyces lividans или Streptomyces murinus, или грамотрицательные бактерии, такие как E. coli и Pseudomonas sp. В предпочтительном варианте бактериальной клеткой-хозяином является клетка Bacilluslentus, Bacilluslicheniformis, Bacillusstearothermophilus или Bacillus subtilis. В другом предпочтительном варианте клеткой Bacillus является щелочелюбивая Bacillus.
Введение вектора в бактериальную клетку-хозяин, например, можно осуществить трансформацией протопластов (см., например, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), используя компетентные клетки (см., например, Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 или Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), электропорацией (см., например, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) или конъюгацией (см., например, Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).
Клеткой-хозяином может быть эукариотическая клетка, такая как клетка млекопитающего, насекомого, растения или гриба.
В предпочтительном варианте клеткой-хозяином является клетка гриба. «Грибы» в используемом в данном описании смысле включают филюмы Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota и Zygomycota (которые определены Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK), а также Oomycota (которые приведены в Hawksworth et al., 1995, выше, стр. 171) и все митоспоровые грибы (Hawksworth et al., 1995, выше).
В более предпочтительном варианте клеткой-хозяином гриба является дрожжевая клетка. Термин «дрожжи» в используемом в данном описании смысле включает аскоспорогенные дрожжи (Endomycetales), базидиоспорогенные дрожжи и дрожжи, относящиеся к несовершенным грибам (Blastomycetes). Так как классификация дрожжей в будущем может измениться, в целях данного изобретения дрожжи следует определять, как описано в Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A., Passmore, S. M. and Davenport, R. R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).
В еще более предпочтительном варианте дрожжевой клеткой-хозяином является клетка Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia.
В наиболее предпочтительном варианте дрожжевой клеткой-хозяином является клетка Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis или Saccharomyces oviformis. В другом наиболее предпочтительном варианте дрожжевой клеткой-хозяином является клетка Kluyveromyces lactis. В другом наиболее предпочтительном варианте дрожжевой клеткой-хозяином является клетка Yarrowia lipolytica.
В другом более предпочтительном варианте клеткой-хозяином гриба является клетка нитчатого гриба. Термин «нитчатые грибы» включает в себя все нитчатые формы подтипа Eumycota и Oomycota (по определению Hawksworth et al., 1995, выше). Нитчатые грибы характеризуются стенкой мицелия, состоящей из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и других сложных полисахаридов. Вегетативный рост происходит в результате удлинения гиф, и катаболизм углерода является облигатно аэробным. В отличие от этого вегетативный рост дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae, осуществляется почкованием одноклеточного таллома, и катаболизм углерода может быть ферментативным.
В еще более предпочтительном варианте клеткой-хозяином нитчатого гриба без ограничения является клетка вида Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium или Trichoderma.
В наиболее предпочтительном варианте клеткой-хозяином нитчатого гриба является клетка Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger или Aspergillus oryzae. В другом наиболее предпочтительном варианте клеткой-хозяином нитчатого гриба является клетка Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides или Fusarium venenatum. В еще более предпочтительном варианте родительской клеткой нитчатого гриба является клетка Fusarium venenatum (Nirenberg sp. nov.). В другом наиболее предпочтительном варианте клеткой-хозяином нитчатого гриба является клетка Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei или Trichoderma viride.
Клетки грибов можно трансформировать способом, который заключается в образовании протопластов, трансформации протопластов и регенерации клеточной стенки по существу известным способом. Подходящие способы трансформации клеток-хозяев Aspergillus описаны в EP 238023 и Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470- 1474. Подходящие способы трансформации вида Fusarium описаны Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 и WO 96/00787. Дрожжи можно трансформировать с использованием способов, описанных Becker and Guarente, в Abelson, J. N. and Simon, M. I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; и Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.
Способы получения
Данное изобретение также относится к способам получения полипептида согласно данному изобретению, включающему в себя (a) культивирование штамма, который в своей форме дикого типа способен продуцировать полипептид; и (b) выделение полипептида. Предпочтительно штамм относится к роду Pseudoplectania и более предпочтительно является Pseudoplectania nigrella.
Данное изобретение также относится к способам получения полипептида согласно данному изобретению, включающему в себя (a) культивирование клетки-хозяина в условиях, в которых проходит продуцирование полипептида; и (b) выделение полипептида.
В способах получения согласно данному изобретению клетки культивируют в питательной среде, подходящей для продуцирования полипептида, с использованием способов, известных в данной области. Например, клетку можно культивировать посредством культивирования во встряхиваемых флаконах, ферментацией в небольшом масштабе или в крупном масштабе (включая непрерывную, периодическую, с подпиткой или твердофазную ферментацию) в лабораторных или промышленных ферментерах, проводимой в подходящей среде и в условиях, обеспечивающих экспрессию и/или выделение полипептида. Культивирование осуществляют в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, используя способы, известные в данной области. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или могут быть приготовлены согласно опубликованным составам (например, в каталоге Американской коллекции типов культур). Если полипептид секретируется в питательную среду, то полипептид можно выделить непосредственно из среды. Если полипептид не секретируется, то его можно выделить из клеточных лизатов.
Полипептиды можно регистрировать с использованием способов, известных в данной области, которые являются специфичными для полипептидов. Указанные способы регистрации могут включать применение специфичных антител, образование ферментного продукта или исчезновение субстрата фермента. Например, можно использовать ферментативный анализ для определения активности полипептида, как описано в данной заявке.
Полученный в результате полипептид можно выделить способами, известными в данной области. Например, полипептид можно выделить из питательной среды обычными способами, включая, но не ограничивая указанным, центрифугирование, фильтрацию, экстракцию, распылительную сушку, выпаривание или осаждение.
Полипептиды согласно данному изобретению можно очищать множеством способов, известных в данной области, включая, но не ограничивая указанным, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, гидрофобную, хроматофокусирование и эксклюзионную по размеру), электрофоретические способы (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония), SDS-ПААГ или экстракцию (см., например, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).
Растения
Данное изобретение также относится к трансгенному растению, части растения или растительной клетке, которые были трансформированы нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид, обладающий противомикробной активностью согласно данному изобретению, для того чтобы экспрессировать и продуцировать полипептид в количествах, которые можно выделить. Полипептид можно выделить из растения или части растения. Альтернативно растение или часть растения, содержащие рекомбинантный полипептид, можно использовать как таковые для улучшения качества пищи или корма, например для повышения питательной ценности, аппетитности и реологических свойств или для разрушения антипитательного фактора. Выделенный полипептид, растение или часть растения также можно использовать для улучшения или изменения пищеварительной флоры у животных и домашнего скота.
Трансгенное растение может быть двусемядольным (двудольным) или односемядольным (однодольным). Примерами однодольных растений являются травы, такие как луговая трава (мятлик, Poa), фуражная трава, такая как Festuca, Lolium, трава умеренного климата, такая как Agrostis и злаковые, например, пшеница, овес, рожь, ячмень, рис, сорго и кукуруза.
Примерами двудольных растений являются табак, картофель, сахарная свекла, бобовые, такие как люпин, горох, бобы и соя, и крестоцветные растения (семейство Brassicaceae), такие как цветная капуста, рапс и близкородственный модельных организм Arabidopsis thaliana.
Примерами частей растений являются стебель, каллус, листья, корень, плоды, семена и клубни. Также частью растения считаются специфичные растительные ткани, такие как хлоропласт, апопласт, митохондрия, вакуоль, пероксисомы и цитоплазма. Кроме того, любая растительная клетка независимо от тканевого происхождения считается частью растения.
Также в объем изобретения включено потомство таких растений, частей растений и растительных клеток.
Трансгенное растение или растительную клетку, экспрессирующую полипептид согласно данному изобретению, можно конструировать согласно способам, известным в данной области. Коротко, растение или растительную клетку конструируют путем введения одной или нескольких экспрессирующих конструкций, кодирующих полипептид согласно данному изобретению, в геном растения-хозяина и размножения полученного в результате модифицированного растения или растительной клетки с получением трансгенного растения или растительной клетки.
В подходящем случае экспрессирующая конструкция является конструкцией нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид согласно данному изобретению, оперативно связанную с соответствующими регуляторными последовательностями, необходимыми для экспрессии нуклеотидной последовательности в выбранном растении или части растения. Кроме того, экспрессирующая конструкция может содержать селектируемый маркер, применимый для идентификации клеток-хозяев, в которые была интегрирована экспрессирующая конструкция, и ДНК-последовательности, необходимые для введения конструкции в данное растение (последние зависят от используемого способа введения ДНК).
Выбор регуляторных последовательностей, таких как последовательности промотора и терминатора и необязательно сигнальные или транспортные последовательности, определяют, например, на основе того, когда, где и как нужно экспрессировать полипептид. Например, экспрессия гена, кодирующего полипептид согласно данному изобретению, может быть конститутивной или индуцируемой или может быть специфичной для стадии развития или тканеспецифичной, и продукт гена может быть направлен к мишени, к конкретной ткани или части растения, такой как семена или листья. Регуляторные последовательности описаны, например, Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.
Для конститутивной экспрессии можно использовать промотор 35S-CaMV (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294). Органоспецифичным промотором может быть, например, промотор из запасающих тканей, таких как семена, клубни картофеля и плоды (Edwards and Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), или из тканей потребителей метаболических веществ, таких как меристемы (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), специфичный для семян промотор, такой как промотор глютелина, проламина, глобулина или альбумина из риса (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), промотор Vicia faba легумина B4 и гена неизвестного белка семян Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), промотор белка масляных телец семян (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), промотор запасного белка napA из Brassica napus или любой другой специфичный для семян промотор, известный в данной области, например, который описан в WO 91/14772. Кроме того, промотором может быть специфичный для листьев промотор, такой как промотор rbcs из риса или томата (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000), промотор гена аденинметилтрансферазы вируса хлореллы (Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93) или промотор гена aldP риса (Kagaya et al., 1995, Molecular and General genetics 248: 668-674) или индуцируемый ранением промотор, такой как промотор pin2 картофеля (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588).
Также можно использовать энхансерный элемент промотора, чтобы добиться более высокой экспрессии фермента в растении. Например, энхансерным элементом промотора может быть интрон, который помещен между промотором и нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид согласно данному изобретению. Например, Xu et al., 1993, ссылка приведена выше, заявил о применении первого интрона гена актина 1 риса, чтобы усилить экспрессию.
Ген селектируемого маркера и любые другие части экспрессирующей конструкции могут быть выбраны из доступных в данной области вариантов.
Конструкцию нуклеиновой кислоты включают в геном растения согласно обычным способам, известным в данной области, включая опосредованную Agrobacterium трансформацию, трансформацию, опосредованную вирусом, микроинъекцию, бомбардировку частицами, биолистическую трансформацию и электропорацию (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).
В настоящее время опосредованный Agrobacterium tumefaciens перенос генов является предпочтительным способом для создания трансгенных двудольных растений (для обора см. Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38). Однако его также можно использовать для трансформации однодольных, хотя для этих растений обычно предпочтительны другие способы трансформации. В настоящее время предпочтительным способом для создания трансгенных однодольных растений является бомбардировка частицами (микроскопическими частицами золота или вольфрама, покрытыми трансформирующей ДНК) эмбриональных каллусов или развивающихся зародышей (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Альтернативный способ трансформации однодольных растений основан на трансформации протопластов, как описано Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.
После трансформации трансформанты, содержащие внедренные в них экспрессирующие конструкции, отбирают и регенерируют в целые растения согласно способам, хорошо известным в данной области.
Данное изобретение также относится к способам получения полипептида согласно данному изобретению, включающему в себя (a) культивирование трансгенного растения или растительной клетки, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий противомикробной активностью, согласно данному изобретению в условиях, в которых проходит продуцирование полипептида; и (b) выделение полипептида.
Композиции
В еще одном аспекте данное изобретение относится к композициям, таким как фармацевтические композиции, содержащим противомикробный полипептид согласно изобретению.
Композиция может содержать полипептид согласно изобретению в виде основного полипептидного компонента, например однокомпонентная композиция. Альтернативно композиция может содержать множество ферментативных активностей, таких как аминопептидаза, амилаза, карбогидраза, карбоксипептидаза, каталаза, целлюлаза, хитиназа, кутиназа, циклодекстрингликозилтрансфераза, дезоксирибонуклеаза, эстераза, альфа-галактозидаза, бета-галактозидаза, глюкоамилаза, альфа-глюкозидаза, бета-глюкозидаза, галопероксидаза, инвертаза, лакказа, липаза, маннозидаза, оксидаза, пектинолитический фермент, пептидоглютаминаза, пероксидаза, фитаза, полифенолоксидаза, протеолитический фермент, рибонуклеаза, трансглютаминаза или ксиланаза.
Композиции, кроме того, могут содержать другой фармацевтически активный агент, такой как дополнительный биоцидный агент, такой как другой противомикробный полипептид, проявляющий противомикробную активность, который определен выше. Биоцидным агентом может быть антибиотик, который известен в данной области. Классы антибиотиков включают пенициллины, например пенициллин G, пенициллин V, метициллин, оксациллин, карбенициллин, нафциллин, ампициллин и т.д.; пенициллины в комбинации с ингибиторами бета-лактамазы, цефалоспоринами, например цефаклор, цефазолин, цефуроксим, моксалактам и т.д.; карбапенемы; монобактамы; аминогликозиды; тетрациклины; макролиды; линкомицины; полимиксины; сульфонамиды; хинолоны; хлорамфеникал; метронидазол; спектиномицин; триметоприм; ванкомицин и т.д. Биоцидный агент также может быть противомикотическим агентом, включая полиены, например, амфотерицин B, нистатин; 5-флюкозин; и азолы, например, миконазол, кетоконазол, интраконазол и флюконазол.
В одном варианте биоцидным агентом является неферментативный химический агент. В другом варианте биоцидным агентом является неполипептидный химический агент.
Биоцидный агент может обладать способностью снижать количество живых клеток Escherichia coli (DSM 1576) до 1/100 после 30 мин инкубирования при 20°C в водном растворе 25% (мас./мас.); предпочтительно в водном растворе 10% (мас./мас.); более предпочтительно в водном растворе 5% (мас./мас.); еще более предпочтительно в водном растворе 1% (мас./мас.); наиболее предпочтительно в водном растворе 0,5% (мас./мас.); и в частности, в водном растворе 0,1% (мас./мас.) биоцидного агента.
Биоцидный агент также может обладать способностью ингибировать рост Escherichia coli (DSM 1576) в течение 24 часов при 25°C в субстрате для роста микроорганизмов при добавлении в концентрации 1000 ч./млн; предпочтительно при добавлении в концентрации 500 ч./млн; более предпочтительно при добавлении в концентрации 250 ч./млн; еще более предпочтительно при добавлении в концентрации 100 ч./млн; наиболее предпочтительно при добавлении в концентрации 50 ч./млн; и в частности при добавлении в концентрации 25 ч./млн.
Биоцидный агент также может обладать способностью снижать количество живых клеток Bacillus subtilis (ATCC 6633) до 1/100 после 30 мин инкубирования при 20°C в водном растворе 25% (мас./мас.); предпочтительно в водном растворе 10% (мас./мас.); более предпочтительно в водном растворе 5% (мас./мас.); еще более предпочтительно в водном растворе 1% (мас./мас.); наиболее предпочтительно в водном растворе 0,5% (мас./мас.); и в частности, в водном растворе 0,1% (мас./мас.) биоцидного агента.
Биоцидный агент также может область способностью ингибировать рост Bacillus subtilis (ATCC 6633) в течение 24 часов при 25°C в субстрате для роста микроорганизмов при добавлении в концентрации 1000 ч./млн; предпочтительно при добавлении в концентрации 500 ч./млн; более предпочтительно при концентрации 250 ч./млн; еще более предпочтительно при добавлении в концентрации 100 ч./млн; наиболее предпочтительно при добавлении в концентрации 50 ч./млн; и в частности, при добавлении в концентрации 25 ч./млн.
Противомикробный полипептид согласно изобретению и биоцидный агент композиции могут быть выбраны так, чтобы получить синергетическое противомикробное действие.
Противомикробный полипептид и биоцидный агент композиции могут быть выбраны так, чтобы количество живых клеток E. coli (DSM 1576) при инкубирования 10 мин при 20°C в водном растворе, содержащем 50 мас.%/мас. (предпочтительно 25 мас.%/мас., более предпочтительно 10 мас.%/мас., наиболее предпочтительно 5мас.%/мас.) биоцидного агента и 0,5 ч./млн (предпочтительно 0,1 ч./млн) противомикробного полипептида, снижалось более чем по меньшей мере на 5% (предпочтительно по меньшей мере на 10%) по сравнению со снижением, полученным при суммировании результатов отдельных инкубаций с биоцидным агентом и противомикробным полипептидом отдельно, т.е. по сравнению с простым аддитивным действием.
Ферментный компонент и биоцидный агент композиции также можно подобрать так, чтобы рост E. coli (DSM 1576) при 25°C в субстрате для роста микроорганизмов, содержащем 500 ч./млн (предпочтительно 250 ч./млн, более предпочтительно 100 ч./млн, наиболее предпочтительно 50 ч./млн) биоцидного агента и 0,5 ч./млн (предпочтительно 0,1 ч./млн) противомикробного полипептида ингибировался в течение более длительного периода времени по меньшей мере на 5% (предпочтительно по меньшей мере на 10%) по сравнению с периодом времени, полученным суммированием результатов отдельных инкубаций с биоцидным агентом и противомикробным полипептидом отдельно, т.е. по сравнению с простым аддитивным действием.
Противомикробный полипептид и биоцидный агент композиции также могут быть выбраны так, чтобы количество живых клеток Bacillus subtilis (ATCC 6633) при инкубирования 10 мин при 20°C в водном растворе, содержащем 50 мас.%/мас. (предпочтительно 25 мас.%/мас., более предпочтительно 10 мас.%/мас., наиболее предпочтительно 5 мас.%/мас.) биоцидного агента и 0,5 ч./млн (предпочтительно 0,1 ч./млн) противомикробного полипептида, снижалось более чем по меньшей мере на 5% (предпочтительно по меньшей мере на 10%) по сравнению со снижением, полученным при суммировании результатов отдельных инкубаций с биоцидным агентом и противомикробным полипептидом отдельно, т.е. по сравнению с простым аддитивным действием.
Ферментный компонент и биоцидный агент композиции также можно подобрать так, чтобы рост Bacillus subtilis (ATCC 6633) при 25°C в субстрате для роста микроорганизмов, содержащем 500 ч./млн (предпочтительно 250 ч./млн, более предпочтительно 100 ч./млн, наиболее предпочтительно 50 ч./млн) биоцидного агента и 0,5 ч./млн (предпочтительно 0,1 ч./млн) противомикробного полипептида ингибировался в течение более длительного периода времени по меньшей мере на 5% (предпочтительно по меньшей мере на 10%) по сравнению с периодом времени, полученным суммированием результатов отдельных инкубаций с биоцидным агентом и противомикробным полипептидом отдельно, т.е. по сравнению с простым аддитивным действием.
Композиции могут содержать подходящее вещество носителя. Композиции также могут содержать подходящий наполнитель для доставки, способный доставлять противомикробные полипептиды согласно изобретению в требуемое место в том случае, когда композиции используют в качестве лекарственного средства.
Композиции могут быть приготовлены согласно способам, известным в данной области, и могут быть в форме жидкой или сухой композиции. Например, полипептидная композиция может быть в форме гранулята или микрогранулята. Полипептид, включаемый в композицию, можно стабилизировать согласно способам, известным в данной области.
Ниже приведены примеры предпочтительных применений полипептидных композиций согласно изобретению. Дозу полипептидной композиции согласно изобретению и другие условия, при которых композицию используют, можно определить на основе способов, известных в данной области.
Способы и применения
Данное изобретение также охватывает различные применения противомикробных полипептидов. Противомикробные полипептиды обычно применимы в любом месте, подвергаемом заражению бактериями, грибами, дрожжами или водорослями. Обычно места являются водными системами, такими как водные системы охлаждения, смывочная вода из прачечных, масляными системами, такими как смазочно-охлаждающие эмульсии, смазочные материалы, нефтяные месторождения и тому подобное, где необходимо уничтожить микроорганизмы или где необходимо контролировать их рост. Однако данное изобретение также можно использовать при всех применениях, когда известно, что применимы противомикробные композиции, таких как защита древесины, латекса, адгезивного вещества, клея, бумаги, картона, текстиля, кожи, пластика, уплотняющего материала и корма.
Другие применения включают сохранение пищевых продуктов, напитков, косметических средств, таких как лосьоны, кремы, гели, мази, мыло, шампуни, кондиционеры, антиперспиранты, дезодоранты, раствора для полоскания рта, продуктов контактных линз, ферментных препаратов или пищевых ингредиентов.
Таким образом, противомикробные полипептиды согласно изобретению могут быть применимы в качестве дезинфицирующего средства, например, при лечении акне, инфекций глаза или рта, кожных инфекций; в антиперспирантах или дезодорантах; в солях для ножных ванн; для очистки и дезинфекции контактных линз, твердых поверхностей, зубов (уход за полостью рта), ран, ушибов и тому подобного.
В общем предполагается, что противомикробные полипептиды согласно данному изобретению применимы для очистки, дезинфекции или ингибирования роста микроорганизмов на любой твердой поверхности. Примерами поверхностей, которые преимущественно могут контактировать с противомикробными полипептидами согласно изобретению, являются поверхности технологического оборудования, используемого, например, в технологических установках для производства молочных продуктов, химических или фармацевтических технологических установках, системах санитарного контроля воды, установках нефтеобработки, целлюлозно-обрабатывающих установках, установках для обработки воды и башенных охладителях. Противомикробные полипептиды согласно изобретению следует применять в количестве, которое является эффективным для очистки, дезинфекции или ингибирования роста микроорганизмов на данной поверхности.
Кроме того, предполагается, что противомикробные полипептиды согласно изобретению можно преимущественно использовать в системе очистки на месте (C.I.P.) для очистки технологического оборудования любого вида.
Противомикробные полипептиды согласно изобретению, кроме того, можно использовать для очистки поверхностей и посуды для приготовления на предприятиях по обработке пищевых продуктов и в любой области, в которой готовят пищу или обслуживают, таких как больницы, дома для престарелых, рестораны, особенно рестораны быстрого питания, гастрономические магазины и тому подобное. Их также можно использовать в качестве противомикробных средств в пищевых продуктах, и они могут быть особенно применимы в качестве поверхностных противомикробных средств для сыров, фруктов и овощей и продуктов питания в салатных барах.
Их также можно использовать в качестве консерванта или дезинфицирующего средства в красках на водной основе.
Противомикробные полипептиды согласно данному изобретению также применимы для микробиологического контроля водоводов и для дезинфекции воды, в частности, для дезинфекции промышленной воды.
Изобретение также относится к применению противомикробного полипептида или композиции согласно изобретению в качестве лекарственного средства. Кроме того, противомикробный полипептид или композицию согласно изобретению также можно использовать для производства лекарственного средства для контроля или борьбы против микроорганизмов, таких как организмы грибов или бактерии, предпочтительно грамположительные бактерии.
Композицию и противомикробный полипептид согласно изобретению можно использовать в качестве противомикробного ветеринарного средства или терапевтического или профилактического средства для человека. Таким образом, композиция и противомикробный полипептид согласно изобретению можно использовать для приготовления ветеринарных средств или терапевтических средств или профилактических средств для человека для лечения микробных инфекций, таких как бактериальные или грибковые инфекции, предпочтительно грамположительные бактериальные инфекции. В частности, микробные инфекции могут быть связаны с заболеваниями легких, включая, но не ограничивая указанным, туберкулез и кистозный фиброз; и заболеваниями, передающимися половым путем, включая, но не ограничивая указанным, гонорею и хламидии.
Композиция согласно изобретению содержит эффективное количество противомикробного полипептида согласно изобретению.
Термин «эффективное количество» при использовании в данном описании предназначен для обозначения количества противомикробного полипептида, содержащего аминокислотную последовательностью, показанную в виде аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2, или его фрагмента или варианта, которое достаточно для ингибирования роста данных микроорганизмов.
Изобретение также относится к композициям для заживления ран или таким продуктам, как бинты, медицинские устройства, такие как, например, катетеры, и, кроме того, к продуктам против перхоти волос, таким как шампуни.
Синтез in vitro
Противомикробные пептиды согласно изобретению можно получить с помощью синтеза in vitro, используя обычные способы, которые известны в данной области. Имеются различные коммерческие приборы для синтеза, например автоматические синтезаторы Applied Biosystems Inc., Beckman, и т.д. При использовании синтезаторов аминокислоты природного происхождения можно заменить неприродными аминокислотами, в частности D-изомерами (или D-формами), например D-аланином и D-изолейцином, диастереоизомерами, боковыми цепями, имеющими разные длины или функциональные группы, и тому подобное. Конкретная последовательность и способ получения будут определяться удобством, экономическими соображениями, требуемой чистотой и тому подобным.
Может быть осуществлено химическое связывание с различными пептидами или белками, содержащими подходящие функциональные группы для связывания, такие как аминогруппы для образования амида или замещенного амина, например восстановительного аминирования, тиольных групп для образования тиоэфира или дисульфида, карбоксильных групп для образования амида и тому подобного.
При желании во время синтеза или в ходе экспрессии в пептид можно ввести различные группы, которые обеспечивают связывание с другими молекулами или поверхностью. Соответственно цистеины можно использовать для получения тиоэфиров, гистидины для связывания с комплексом иона металла, карбоксильные группы для образования амидов или сложных эфиров, аминогруппы для образования амидов и тому подобное.
Полипептиды также можно выделить и очистить согласно обычным способам синтеза рекомбинантов. Можно получить лизат экспрессирующего хозяина и лизат, очищенный с использованием ВЭЖХ, эксклюзионной хроматографии, гель-электрофореза, аффинной хроматографии или другого способа очистки. Главным образом композиции, которые используют, будут содержать по меньшей мере 20 мас.% требуемого продукта, более обычно по меньшей мере примерно 75 мас.%, предпочтительно по меньшей мере примерно 95 мас.% и для терапевтических целей обычно по меньшей мере примерно 99,5 мас.% по отношению к примесям, связанным со способом получения продукта и его очисткой. Обычно процентное содержание будет основано на общем белке.
Корм для животных
Данное изобретение также относится к способам применения полипептидов, обладающих противомикробной активностью, в кормах для животных, а также к кормовым композициям и кормовым добавкам, содержащим противомикробные полипептиды согласно изобретению.
Термин «животное» включает в себя всех животных, включая человека. Примерами животных являются нежвачные и жвачные, такие как коровы, овцы и лошади. В конкретном варианте животное является нежвачным животным. Нежвачные животные включают животных с одним желудком, например поросят или свиней (включая, но не ограничивая указанным, поросят, подрастающих свиней и свиноматок); домашнюю птицу, а именно индюков и кур (включая, но не ограничивая указанным, бройлерных кур, кур-несушек); молодых телят; и рыбу (включая, но не ограничивая указанным, лосося).
Термин «корм» или «кормовая композиция» означает любое соединение, препарат, смесь или композицию, подходящую или предназначенную для потребления животным.
В применении согласно изобретению противомикробный полипептид можно скармливать животному до, после или одновременно с приемом пищи. Последнее предпочтительно.
В конкретном варианте противомикробный полипептид в форме, в которой его добавляют в корм, или когда он включен в кормовую добавку, является вполне определенным. «Вполне определенный» означает, что препарат противомикробного полипептида по меньшей мере на 50% является чистым на основании определения эксклюзионной хроматографией по размеру (см. пример 12 WO 01/58275). В других конкретных вариантах препарат противомикробного полипептида по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 или по меньшей мере на 95% является чистым согласно определению указанным способом.
Вполне определенный препарат противомикробного полипептида является предпочтительным. Например, намного легче точно дозировать в корме противомикробный полипептид, который по существу не содержит других мешающих или загрязняющих противомикробных полипептидов. Термин «точно дозировать» относится, в частности, к цели получения непротиворечивых и неизменных результатов, и возможности оптимизации дозы, основанной на требуемом эффекте.
Однако для применения в корме для животных не требуется, чтобы противомикробный полипептид был таким чистым; например, он может содержать другие ферменты, и в этом случае его можно назвать препаратом противомикробного полипептида.
Препарат противомикробного полипептида можно (a) добавлять непосредственно в корм (или использовать непосредственно в процессе обработки растительных белков), или (b) его можно использовать для получения одной или нескольких промежуточных композиций, таких как кормовые добавки или премиксы, которые затем добавляют в корм (или используют в процессе обработки). Степень чистоты, описанная выше, относится к чистоте исходного препарата противомикробного полипептида, используемого либо согласно (a), либо согласно (b), как описано выше.
Препараты противомикробного полипептида с чистотой указанного порядка значений, в частности, можно получить с использованием рекомбинантных способов получения, поскольку их не так легко получить, и они также подвергаются гораздо более сильным вариациям от партии к партии, когда противомикробный полипептид получают традиционными способами ферментации.
Такой препарат противомикробного полипептида, конечно, может быть смешан с другими ферментами.
Термин «растительные белки» в используемом в данном описании смысле относится к любому соединению, композиции, препарату или смеси, которые содержат по меньшей мере один белок, полученный из растения или имеющий растительное происхождение, включая модифицированные белки и производные белков. В конкретных вариантах содержание белка в растительных белках составляет по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50 или 60% (мас./мас.).
Растительные белки можно получить из источников растительных белков, таких как бобовые и злаковые растения, например, сырья из растений семейств Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae и Poaceae, такого как соевая мука, мука из люпина и рапсовая мука.
В конкретном варианте источником растительного белка является сырье из одного или нескольких растений семейства Fabaceae, например сои, люпина, гороха или бобов.
В другом конкретном варианте источником растительного белка является сырье из одного или нескольких растений семейства Chenopodiaceae, например свеклы, сахарной свеклы, шпината или киноа.
Другими примерами источников растительных белков являются семена рапса и капуста.
Соя является предпочтительным источником растительного белка.
Другими примерами источников растительных белков являются злаковые, такие как ячмень, пшеница, рожь, овес, кукуруза, рис и сорго.
Противомикробный полипептид можно добавлять в корм в любой форме, либо в виде относительно чистого противомикробного полипептида, либо в смеси с другими компонентами, предназначенными для добавления в корм для животных, например в форме кормовых добавок для животных, таких как так называемые премиксы для кормов для животных.
В следующем аспекте данное изобретение относится к композициям для применения в кормах для животных, а именно в кормах для животных и кормовых добавках для животных, например премиксах.
Кроме противомикробного полипептида согласно изобретению кормовые добавки для животных согласно изобретению содержат по меньшей мере один жирорастворимый витамин, и/или по меньшей мере один водорастворимый витамин, и/или по меньшей мере один микроэлемент, и/или по меньшей мере один макроэлемент.
Кроме того, необязательными добавляемыми в корм ингредиентами являются красители, ароматизаторы, стабилизаторы и/или по меньшей мере один другой фермент, выбранный из числа фитаз EC 3.1.3.8 или 3.1.3.26; ксиланаз EC 3.2.1.8; галактаназ EC 3.2.1.89; и/или бета-глюканаз EC 3.2.1.4.
В конкретном варианте указанные другие ферменты являются вполне определенными (как определено выше для препаратов противомикробного полипептида).
Примерами других противомикробных пептидов (AMP) являются CAP18, лейкоцин A, тритрптицин, протегрин-1, танатин, дефенсин, овиспирин, такой как новиспирин (Robert Lehrer, 2000) и их варианты или фрагменты, которые сохраняют противомикробную активность.
Примерами других противогрибковых полипептидов (AFP) являются пептиды Aspergillus giganteus и Aspergillus niger, а также их варианты и фрагменты, которые сохраняют противогрибковую активность, которые описаны в WO 94/01459 и PCT/DK02/00289.
Обычно жиро- и водорастворимые витамины, а также микроэлементы образуют часть так называемого премикса, предназначенного для добавления в корм, тогда как макроэлементы обычно добавляют в корм отдельно. Любой из указанных типов композиции при обогащении противомикробным полипептидом согласно изобретению является кормовой добавкой для животных согласно изобретению.
В конкретном варианте кормовая добавка для животных согласно изобретению предназначена для включения (или предписывается как необходимая для включения) в рационы животных или в корма на уровне от 0,01 до 10,0%; более конкретно от 0,05 до 5,0%; или от 0,2 до 1,0% (% означает г добавки на 100 г корма). Это относится, в частности, к премиксам.
Далее следует не являющийся исключительным список примеров указанных компонентов:
Примерами жирорастворимых витаминов являются витамин A, витамин D3, витамин E и витамин K, например, витамин K3.
Примерами водорастворимых витаминов являются витамин B12, биотин и холин, витамин B1, витамин B2, витамин B6, ниацин, фолиевая кислота и пантотенат, например Ca-D-пантотенат.
Примерами микроэлементов являются марганец, цинк, железо, медь, йод, селен и кобальт.
Примерами макроэлементов являются кальций, фосфор и натрий.
Пищевые потребности в указанных компонентах (на примере домашней птицы и поросят/свиней) перечислены в таблице A в WO 01/58275. Пищевая потребность означает, что указанные компоненты необходимо вводить в рацион в указанных концентрациях.
Альтернативно кормовая добавка для животных согласно изобретению содержит по меньшей мере один из отдельных компонентов, перечисленных в таблице A в WO 01/58275. По меньшей мере один означает либо один, либо несколько, один либо два, либо три, либо четыре и так далее вплоть до всех тринадцати или до всех пятнадцати отдельных компонентов. Более конкретно данный по меньшей мере один отдельный компонент включают в добавку согласно изобретению в таком количестве, чтобы обеспечить концентрацию в корме в пределах, указанных в колонке четыре или колонке пять, или колонке шесть таблицы A.
Данное изобретение также относится к композициям кормов для животных. Композиции кормов для животных или рационы имеют относительно высокое содержание белка. Рационы домашних птиц и свиней можно охарактеризовать, как указано в таблице B в WO 01/58275, колонки 2-3. Рационы для рыб можно охарактеризовать, как указано в колонке 4 данной таблицы B. Кроме того, такие рационы для рыб обычно имеют содержание общего жира 200-310 г/кг.
Композиция корма для животных согласно изобретению имеет содержание общего белка 50-800 г/кг и, кроме того, содержит по меньшей мере один противомикробный полипептид, который заявлен в данном описании.
Кроме того, или альтернативно (содержанию общего белка, указанному выше), композиция корма для животных согласно изобретению имеет содержание метаболизируемой энергии 10-30 МДж/кг; и/или содержание кальция 0,1-200 г/кг; и/или содержание доступного фосфора 0,1-200 г/кг; и/или содержание метионина 0,1-100 г/кг; и/или содержание метионина плюс цистеина 0,1-150 г/кг; и/или содержание лизина 0,5-50 г/кг.
В конкретных вариантах содержание метаболизируемой энергии, общего белка, кальция, фосфора, метионина, метионина плюс цистеина и/или лизина составляет одно из значений в пределах 2, 3, 4 или 5 в таблице B в WO 01/58275 (R. 2-5).
Общий белок рассчитывают в виде азота (N), умноженного на коэффициент 6,25, т.е. общий белок (г/кг) = N (г/кг) × 6,25. Содержание азота определяют способом Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).
Метаболизируемую энергию можно рассчитать на основе публикации NRC пищевых потребностей свиней, девятого исправленного издания 1988, подкомитета питания свиней, комитета животного питания, Министерства сельского хозяйства, Национального совета исследований, National Academy Press, Washington, D. C., pp. 2-6, и Европейской таблицы значений энергии для корма для домашних птиц, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.
Содержание в рационе кальция, доступного фосфора и аминокислот в полном рационе животных рассчитывают на основе таблиц кормов, таких как Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6,8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.
В конкретном варианте композиция корма для животных согласно изобретению содержит по меньшей мере один растительный белок или источник белка, которые определены выше.
В следующих конкретных вариантах композиция корма для животных содержит 0-80% кукурузной; и/или 0-80% сорго; и/или 0-70% пшеничной; и/или 0-70% ячменной; и/или 0-30% овсяной; и/или 0-40% соевой муки; и/или 0-10% рыбной муки; и/или 0-20% сыворотки. Корма для животных, например, можно производить в виде кормовой смеси (негранулированной) или гранулированного корма. Обычно измельченные кормовые вещества смешивают и добавляют достаточное количество необходимых витаминов и минеральных веществ в соответствии с инструкциями для данного вида. Ферменты можно добавлять в виде твердых или жидких ферментных препаратов. Например, твердый ферментный препарат обычно добавляют до или во время стадии смешивания; а жидкий ферментный препарат обычно добавляют после стадии гранулирования. Фермент также можно вводить в кормовую добавку или премикс.
Конечная концентрация фермента в корме находится в пределах 0,01-200 мг белка фермента на кг корма, например в пределах 5-30 мг белка фермента на кг кора для животных.
Противомикробный полипептид можно вводить в одном или нескольких из следующих количеств (пределы дозы): 0,01-200; или 0,01-100; или 0,05-100; или 0,05-50; или 0,10-10 - все указанные пределы указаны в мг белка противомикробного полипептида на кг корма (ч./млн).
Для определения мг белка противомикробного полипептида на кг корма противомикробный полипептид очищают из композиции корма и определяют удельную активность очищенного противомикробного полипептида, используя соответствующий анализ (см. в разделе «Противомикробная активность, субстраты и анализы»). Противомикробную активность композиции корма как таковую также определяют с использованием такого же анализа, и на основе указанных двух определений рассчитывают дозу в мг белка противомикробного полипептида на кг корма.
Такие принципы применимы для определения мг белка противомикробного полипептида в кормовых добавках. Конечно, если можно получить образец противомикробного полипептида, используемого для получения кормовой добавки или корма, то удельную активность определяют в данном образце (без необходимости в очистке противомикробного полипептида из композиции корма или добавки).
Детергентная композиция
Противомикробные полипептиды согласно изобретению можно добавлять в детергентную композицию, и таким образом, они становятся ее компонентом.
Детергентную композицию согласно изобретению можно, например, приготовить в виде детергентной композиции для ручной или машинной стирки, включая композицию стиральной добавки, подходящую для предварительной обработки окрашенных тканей, и добавляемую при полоскании композицию мягчителя ткани, или приготовить в виде детергентной композиции для применения в домашнем хозяйстве при общей очистке твердых поверхностей, или приготовить для ручного или машинного мытья посуды.
В конкретном аспекте в изобретении предлагается добавка к детергенту, содержащая противомикробные полипептиды согласно изобретению и поверхностно-активное вещество. Детергентная добавка, а также детергентная композиция могут содержать один или несколько других ферментов, таких как протеаза, липаза, кутиназа, амилаза, карбогидраза, целлюлаза, пектиназа, маннаназа, арабиназа, галактаназа, ксиланаза, оксидаза (такая как лакказа) и/или пероксидаза (такая как галопероксидаза).
В общем свойства выбранного фермента(тов) должны быть совместимы с выбранным детергентом (например, оптимум pH, совместимость с другими ферментными и неферментными ингредиентами, и т.д.), и фермент(ы) должны присутствовать в эффективных количествах.
Протеазы: Подходящие протеазы включают протеазы животного, растительного или микробного происхождения. Микробное происхождение предпочтительно. Включены химически модифицированные или полученные в результате конструирования белков мутанты. Протеаза может представлять собой сериновую протеазу или металлопротеазу, предпочтительно щелочную протеазу микроорганизма или трипсиноподобную протеазу. Примерами щелочных протеаз являются субтилизины, особенно субтилизины, полученные из Bacillus, например, субтилизин Novo, субтилизин Carlsberg, субтилизин 309, субтилизин 147 и субтилизин 168 (описанные в WO 89/06279). Примерами трипсиноподобных протеаз являются трипсин (например, полученный от свиньи или быка) и протеаза Fusarium, описанная в WO 89/06270 и WO 94/25583.
Примерами применимых протеаз являются варианты, описанные в WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 и WO 98/34946, особенно варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 и 274.
Липазы: Подходящие липазы включают липазы бактериального или грибкового происхождения. Включены химически модифицированные или полученные в результате конструирования белков мутанты. Примеры применимых липаз включают липазы из Humicola (синоним Thermomyces), например, из H. lanuginosa (T. lanuginosus), которые описаны в EP 258068 и EP 305216, или из H. insolens, которые описаны в WO 96/13580, липазу Pseudomonas, например, из P. alcaligenes или P. pseudoalcaligenes (EP 218272), P. cepacia (EP 331376), P. stutzeri (GB 1372034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. штамма SD 705 (WO 95/06720 и WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), липазу Bacillus, например, из B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) или B. pumilus (WO 91/16422).
Другими примерами являются варианты липазы, такие как варианты, описанные в WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 и WO 97/07202.
Амилазы: Подходящие амилазы (альфа и/или бета) включают амилазы бактериального или грибкового происхождения. Включены химически модифицированные или полученные в результате конструирования белков мутанты. Амилазы включают, например, альфа-амилазы, полученные из Bacillus, например из конкретного штамма B. licheniformis, описанного более подробно в GB 1296839.
Примерами применимых амилаз являются варианты, описанные в WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 и WO 97/43424, особенно варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 и 444.
Целлюлазы: Подходящие целлюлазы включают целлюлазы бактериального или грибкового происхождения. Включены химически модифицированные или полученные в результате конструирования белков мутанты. Подходящие целлюлазы включают целлюлазы из родов Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, например целлюлазы грибов, полученные из Humicola insolens, Myceliophthora thermophila и Fusarium oxysporum, описанные в US 4435307, US 5648263, US 5691178, US 5776757 и WO 89/09259.
Особенно подходящими целлюлазами являются щелочные или нейтральные целлюлазы, имеющие преимущества, связанные с уходом за цветными тканями. Примерами таких целлюлаз являются целлюлазы, описанные в EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Другими примерами являются варианты целлюлаз, такие как варианты, описанные в WO 94/07998, EP 0531315, US 5457046, US 5686593, US 5763254, WO 95/24471, WO 98/12307 и PCT/DK98/00299.
Пероксидазы/оксидазы: Подходящие пероксидазы/оксидазы включают пероксидазы/оксидазы растительного, бактериального и грибкового происхождения. Включены химически модифицированные или полученные в результате конструирования белков мутанты. Примеры применимых пероксидаз включают пероксидазы из Coprinus, например из C. cinereus, и их варианты, как те, которые описаны в WO 93/24618, WO 95/10602 и WO 98/15257.
Детергентный фермент(ы) может быть включен в детергентную композицию посредством добавления отдельных добавок, содержащих один или несколько ферментов, или посредством добавления комбинированной добавки, содержащей все указанные ферменты. Детергентную добавку согласно изобретению, т.е. отдельную добавку или комбинированную добавку можно приготовить, например, в виде гранулята, жидкости, суспензии и т.д. Предпочтительными препаратами детергентных добавок являются грануляты, в частности не образующие пыли грануляты, жидкости, в частности стабилизированные жидкости или суспензии.
Не образующие пыли грануляты можно получить, например, как описано в US 4106991 и 4661452, и можно необязательно покрыть способами, известными в данной области. Примерами восковидных покрывающих материалов являются продукты поли(этиленоксида) (полиэтиленгликоль, ПЭГ) со средними молекулярными массами от 1000 до 20000; этоксилированные нонилфенолы, содержащие от 16 до 50 единиц этиленоксида; этоксилированные жирные спирты, где спирт содержит от 12 до 20 атомов углерода и в которых имеется от 15 до 80 единиц этиленоксида; жирные спирты; жирные кислоты; и моно-, ди- и триглицериды жирных кислот. Примеры покрывающих веществ, образующих пленку, подходящих для применения в способе на основе псевдоожиженного слоя, приведены в GB 1483591. Жидкие ферментные препараты можно, например, стабилизировать добавлением полиола, такого как пропиленгликоль, сахара или сахарного спирта, молочной кислоты или борной кислоты согласно принятым способам. Защищенные ферменты можно приготовить согласно способу, описанному в EP 238216.
Детергентная композиция согласно изобретению может иметь любую подходящую форму, например форму пластинки, таблетки, порошка, гранулы, пасты или жидкости. Жидкий детергент может быть водным, обычно содержащим до 70% воды и 0-30% органического растворителя, или неводным.
Детергентная композиция содержит одно или несколько поверхностно-активных веществ, которые могут быть неионогенными, включая полуполярные, и/или анионогенными, и/или катионогенными, и/или цвиттерионными. Поверхностно-активные вещества обычно присутствуют на уровне от 0,1 до 60 мас.%.
Включенный в данное изобретение детергент, как правило, будет содержать примерно от 1% до 40% анионогенного поверхностно-активного вещества, такого как неразветвленный алкилбензолсульфонат, альфа-олефинсульфонат, алкилсульфат (сульфат жирного спирта), этоксисульфат спирта, вторичный алкансульфонат, сложный метиловый эфир жирной альфа-сульфокислоты, алкил- или алкенилянтарная кислота или мыло.
Включенный в данное изобретение детергент, как правило, будет содержать примерно от 0,2% до 40% неионогенного поверхностно-активного вещества, такого как этоксилат спирта, этоксилат нонилфенола, алкилполигликозид, алкилдиметиламиноксид, этоксилированный моноэтаноламид жирной кислоты, моноэтаноламид жирной кислоты, полигидроксиалкиламид жирной кислоты или N-ацил-, N-алкил-производные глюкозамина («глюкамиды»).
Детергент может содержать 0-65% структурообразующего компонента детергента или комплексообразующего агента, такого как цеолит, дифосфат, трифосфат, фосфонат, карбонат, цитрат, нитрилотриуксусная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота, диэтилентриаминпентауксусная кислота, алкил- или алкенилянтарная кислота, растворимые силикаты или слоистые силикаты (например, SKS-6 производства Hoechst).
Детергент может содержать один или несколько полимеров. Примерами являются карбоксиметилцеллюлоза, поли(винилпирролидон), поли(этиленгликоль), поли(виниловый спирт), поли(винилпиридин-N-оксид), поли(винилимидазол), поликарбоксилаты, такие как полиакрилаты, сополимеры малеиновой/акриловой кислоты и сополимеры лаурилметакрилат/акриловая кислота.
Детергент может содержать систему отбеливания, которая может содержать источник H2O2, такой как перборат или перкарбонат, которые можно комбинировать с образующим перкислоту активатором отбеливателя, таким как тетраацетилэтилендиамин или нонаноилоксибензолсульфонат. Альтернативно система отбеливания может содержать пероксикислоты, например, типа амида, имида или сульфона.
Фермент(ы) детергентной композиции согласно изобретению можно стабилизировать, используя обычные стабилизирующие агенты, например полиол, такой как пропиленгликоль или глицерин, сахар или сахарный спирт, молочную кислоту, борную кислоту или производное борной кислоты, например сложный ароматический боратный эфир или производное фенилбороновой кислоты, такое как 4-формилфенилбороновая кислота, и композицию можно приготовить как описано, например, в WO 92/19709 и WO 92/19708.
Детергент также может содержать другие обычные ингредиенты детергента, такие как кондиционеры для ткани, включая глины, усилители пенообразования, пеногасители, антикоррозийные агенты, суспендирующие грязь агенты, агенты, препятствующие повторному осаждению грязи, красители, бактерицидные агенты, флуоресцентные осветлители, гидротропные вещества, ингибиторы потускнения или отдушки.
В настоящее время предполагается, что в детергентные композиции любой фермент и противомикробный полипептид согласно изобретению можно добавлять в количестве, соответствующем 0,01-100 мг ферментного белка на литр моющего раствора, предпочтительно 0,05-10 мг ферментного белка на литр моющего раствора, более предпочтительно 0,1-5 мг ферментного белка на литр моющего раствора и наиболее предпочтительно 0,1-1 мг ферментного белка на литр моющего раствора.
Противомикробные полипептиды согласно изобретению можно дополнительно включать в детерегентные препараты, заявленные в WO 97/07202, которая включена в данное описание в виде ссылки.
Далее данное изобретение описано с помощью следующих примеров, которые не следует толковать как ограничивающие объем изобретения.
ПРИМЕРЫ
Химические реактивы, используемые в качестве буферов и субстратов, представляли собой коммерческие продукты, по меньшей мере, чистые для анализа.
ПРИМЕР 1
Идентификация противомикробного полипептида из Pseudoplectania nigrella
Вещества и способы
Библиотеку кДНК получали из P. nigrella, индуцированной средой в течение 5 дней на среде Mex-1 (протокол можно найти в примерах международной заявки на выдачу патента WO 98/38288). Очищали поли-A-обогащенную РНК, синтезировали кДНК и получали библиотеку согласно стандартным способам молекулярной биологии. Подробный протокол общего способа можно найти в примерах международной заявки на выдачу патента WO 01/12794. Вектор, используемый для клонирования, представлял собой pMhas5, который показан в SEQ ID NO:4, и имел следующие признаки:
| Таблица 1 Признаки вектора pMhas5 | ||
| Признак | Положение | Описание |
| Кодирующая последовательность | 365-1156 | Резистентность к канамицину |
| Кодирующая последовательность | 2232-2387 | Альфа-пептид бета-галактозидазы |
| Сигнал -10 | 2189-2192 | Шайне-Далгарно |
| Промотор | 2101-2189 | Промотор Lac |
| Отличительный признак | 626-650 | Праймер KanP1 для системы ВАСЕ |
Особыми признаками данной плазмиды являются сайты рестрикции EcoRI-NotI, расположенные проксимально по отношению к области Шайне-Далгарно промотора Lac. Это позволяет клонировать в векторе EcoRI-NotI-адаптированные кДНК и активно транскрибировать и транслировать полученные в результате конструкции в клетке-хозяине E. coli.
Конструирование библиотеки Pseudoplectania nigrella и улавливание сигнала полученного в результате плазмидного пула кДНК
Плазмидный пул кДНК получали всего из 20000 трансформантов исходного лигирования кДНК-вектор pMHas5. Плазмидную ДНК получали непосредственно из пула колоний, извлекаемых из твердой селективной среды LB согласно протоколу Qiagen для выделения плазмидной ДНК (Qiagen Inc.). Плазмидный пул обрабатывали транспозоном SigA2 и транспозазой MuA согласно инструкциям производителя транспозазы (Finnizyme, Finland). Общую информацию об улавливании сигнала, полученного с помощью транспозона, можно найти в международной заявке на выдачу патента WO 01/77315. Полученную в результате смесь осаждали этанолом, чтобы удалить избыток соли, и 1,5 микролитра путем электропорации вводили в 20 микролитров сверхкомпетентных клеток DH10B согласно стандартному протоколу, прилагаемому к клеткам (Gibco-BRL). Подвергнутые электропорации клетки инкубировали в среде SOC при встряхивании (28 градусов Цельсия, 2 часа, 250 об/мин) перед посевом на селективную среду. Использовали три агаризованные среды:
LB + 50 микрограммов на мл канамицина,
LB + канамицин + 15 микрограммов на мл хлорамфеникола или
LB + канамицин + хлорамфеникол + 12,5 микрограмма на мл ампициллина.
На основании посева электропорированных клеток с разведением на среде LB+канамицин+хлорамфеникол определили, что присутствовало примерно 119000 колоний, содержащих плазмиду библиотеки кДНК с транспозицией SigA2. Всего 363 колонии получили в ходе эксперимента по тройной селекции. Получали реплики всех 363 колоний на тройной селективной среде с использованием 50 микрограммов на мл ампициллина, чтобы отобрать настоящие улавливаемые источники сигнала. Всего 336 колонии обладали способностью расти при повышенной концентрации ампициллина, и из указанных колоний выделяли ДНК, используя наборы Miniprep согласно протоколу Qiagen Qiaturbo96 (Qiagen Inc.). Плазмиды секвенировали с использованием прямого и обратного праймеров транспозона (праймеры A и B) согласно способу, описанному в примерах международной заявки на выдачу патента WO 01/77315.
| Праймер А: | agcgt ttgcg gccgc gatcc | (SEQ ID NO:16) |
| Праймер В: | ttatt cggtc gaaaa ggatc c | (SEQ ID NO:17) |
Получали последовательность ДНК для реакций на капиллярном секвенаторе AB3700. Последовательности урезали, чтобы удалить последовательность вектора и транспозона и считывания праймера A и B для каждой сборки плазмиды. В результате получили 225 встроенных последовательностей, которые сгруппировали на основании гомологии последовательностей в 145 контигов. Все 145 контигов независимо подвергали обработке с использованием программы BLAST и результаты анализировали. Одна плазмида (Plectasin_6_B12) проявляла некоторую гомологию аминокислот с известными противомикробными полипептидами (полипептиды, подобные дефенсину).
В следующих примерах противомикробный полипептид согласно изобретению назван «плектазин».
ПРИМЕР 2
Конструирование экспрессирующего вектора Aspergillus для плектазина
Последовательность, кодирующую плектазин, амплифицировали из описанной выше библиотеки кДНК (см. пример 1 выше) следующим образом: 1 микролитр кДНК (примерно 10 нанограммов ДНК) использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР с двумя праймерами 178 и 179.
| Праймер 178: | tctgg atcca ccatg caatt tacca ccatc ctctc | (SEQ ID NO:7) |
| Праймер 179: | tctct cgagc tagta acact tgcaa acaaa gc | (SEQ ID NO:8) |
10 пмоль каждого праймера использовали в объеме реакции, равном 100 микролитрам. Температура отжига составляла 55 градусов Цельсия и удлинение при 72 градусах Цельсия в течение 1 минуты. Всего проводили 35 циклов. Использовали систему ПЦР повышенной точности (Roche).
Аликвоты реакционной смеси ПЦР разделяли в 4% агарозном геле. Наблюдали две отдельные полосы: наиболее заметная полоса в области размера примерно 300 п.о. и несколько более слабая полоса примерно в области 350 п.о.
Оба фрагмента расщепляли BamHI и XhoI, которые разрезают в области перекрываний, введенных благодаря праймерам ПЦР. Расщепленные фрагменты выделяли и клонировали в pMT2188, экспрессирующей плазмиде Aspergillus, основанной на плазмиде pCaHj527 (см. примеры международной заявки на выдачу патента WO 00/70064), сконструированной, как описано в примере 7 заявки на выдачу патента Дании PA 2001 00088. Обнаружено, что более короткий фрагмент содержит последовательность, кодирующую плектазин, которую определяли на основании эксперимента по улавливанию сигнала (см. пример 1 выше). Последовательность данного более короткого ПЦР-фрагмента показана в виде SEQ ID NO:5.
Подобным образом определили, что последовательность более длинного ПЦР-фрагмента содержит последовательность, кодирующую плектазин, и дополнительную вставку длиной 58 п.о. Отмечено, что вставка длиной 58 п.о. содержит элементы консенсуса интрона грибов и амплификация указанного продукта считается доказательством неполного удаления интрона в пуле мРНК и полученной библиотеке кДНК. Последовательность данного более длинного ПЦР-фрагмента показана в виде SEQ ID NO:6. Экспрессирующая плазмида Aspergillus для более короткого ПЦР-продукта (SEQ ID NO:5) названа pMT2548.
ПРИМЕР 3
Экспрессия плектазина в Aspergillus
PMT2548 трансформировали Aspergillus oryzae, штамм BECh2 (описанный в международной заявке на выдачу патента WO 00/39322) и Aspergillus niger MBin118. 30 трансформантов каждого штамма снова дважды выделяли в селективных и неиндуцирующих условиях на чашках с минимальной средой Cove с сахарозой и ацетамидом. Чтобы тестировать экспрессию плектазина, трансформанты выращивали в течение 6 дней при 30 градусах Цельсия в пробирках с 10 мл YPM (2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% мальтозы). Надосадки разделяли в 10% бис-трис-SDS-гелях NuPage (Invitrogen), следуя рекомендациям производителя, используя рабочий буфер MES, чтобы обеспечить разделение в диапазоне низких М.м. Оба штамма Aspergillus хорошо росли даже при индукции экспрессии плектазина. У большинства трансформантов наблюдали отдельную полосу в области размера, ожидаемого для плектазина, тогда как указанную полосу не наблюдали в случае нетрансформированных штаммов-хозяев A. oryzae BECh2 и A. niger MBin118. Было видно, что полоса плектазина была более интенсивной у трансформантов BECh2, чем у трансформантов MBin118. Определили очень грубо и только на основании интенсивности окраски, что выход в указанных условиях роста был порядка 10-50 мг на литр культуральной среды.
ПРИМЕР 4
Клонирование плектазина в суицидной экспрессирующей системе (SES)
Фрагмент плектазина амплифицировали с помощью ПЦР, используя кДНК плектазина полной длины в качестве матрицы (Plectasin_6_B12) и праймеры линкеров, содержащих NcoI- и XbaI-сайты рестрикции, DR34F и DR34R.
| DR34F: | ccggccatgg gatttggatg caatggtcct tggg | (SEQ ID NO:9) |
| DR34R: | gccgtctaga gccatctagt aacacttgca aacaaagccc cccttagc | (SEQ ID NO:10) |
ПЦР-амплификацию осуществляли с использованием ДНК-полимеразы PWO согласно инструкциям производителя (Roche Bioscience, CA). ПЦР-продукт расщепляли NcoI и XbaI и направленно встраивали в плазмиды pHHA и pHH (описанные в примерах международной заявки на выдачу патента WO 00/73433). Полученные в результате плазмиды назвали pDR-18-plectasin для цитоплазматической экспрессии пептида и pDRS-18-plectasin для периплазматической экспрессии.
Обе плазмиды содержали следующую аминокислотную последовательность фрагмента плектазина:
| mGFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY | (SEQ ID NO:11) |
где m (метионин) не присутствует в нативном плектазине, но был включен в результате методики клонирования.
Ингибирование роста E. coli при экспрессии плектазина
Чтобы оценить, ингибируется ли рост E. coli в жидкой среде при индукции эндогенной экспрессии плектазина, проводили следующий эксперимент, который описан в примерах международной заявки на выдачу патента WO 00/73433. Коротко, свежие ночные культуры клеток, содержащих плазмиды либо pDRS-18-plectasin, pDR-18-plectasin, pHH или pHHA, разбавляли в 300 раз в 150 микролитрах LB или LB, содержащей 0,1% арабинозы, в планшете для микротитрования и инкубировали при 37 градусах Цельсия и энергичном встряхивании. Кривую роста контролировали путем измерения OD450 через регулярные интервалы, используя считывающее устройство для ELISA. Результаты показали, что плектазин ингибировал рост клеток на 41% в том случае, если направлялся в периплазму, однако он не влиял на рост клеток при экспрессии в цитоплазме (см. таблицу ниже).
| Таблица 2 Ингибирование клеточного роста | |
| Конструкция | % ингибирования |
| рНН | 16% |
| рНН-plectasin (pDRS-18-plectasin) | 41% |
| рННА | 12% |
| рННА-plectasin (pDR-18-plectasin) | 13% |
ПРИМЕР 5
Клонирование, экспрессия и оценка активности плектазина P. nigrella в E. coli
Клонирование плектазина из P. nigrella в pET31b+
Чтобы получить плектазин для анализов противомикробной активности кДНК, кодирующую плектазин, встраивали в экспрессирующий вектор pET31b+ (Novagen Inc., WI). С помощью специально сконструированных олигонуклеотидов (праймер 1 и праймер 2) ген плектазина амплифицировали в полимеразной цепной реакции, используя ДНК-полимеразу PWO согласно инструкциям производителя (Roche Bioscience, CA).
| Праймер 1: | ||
| attattcagatgctggatcc gaaaaacctgcgtcgcatta tccgcaaaggcatccatatc | (SEQ ID NO:12) | |
| Праймер 2: | ||
| aataatctcgagttattagc catattttttaatgatatgg atgcctttgcggataatgcg ac | (SEQ ID NO:13) |
Ферментативное расщепление фланкирующих сайтов рестрикции эндонуклеазой (AlwNI/AvaI) позволило авторам клонировать указанный ген в виде слитой конструкции в pET31b+ (стандартные способы, которые описаны производителем (New England Biolabs Inc., MA). Все стандартные протоколы описаны в другой публикации (Sambrook, Fritsch, and Maniatis, 1989).
Трансформация и экспрессия плектазина P. nigrella в E. Coli
Рекомбинантной pET31b+ трансформировали E. coli Novablue, как описано производителем (Novagen). Плазмиду готовили с помощью миниколонок QIAprep (QIAGEN Inc., CA) и секвенировали автоматическим секвенированием, используя специфичные для плазмиды праймеры (праймер 3 и праймер 4).
| Праймер 3: | tgctagttat tgctcagcgg | (SEQ ID NO:14) |
| Праймер 4: | accgtagttg cgcccatcg | (SEQ ID NO:15) |
Плазмидами трансформировали E. coli BLR-DE3 согласно инструкциям производителя (Novagen). Бактерии культивировали в среде LB до OD600˜0,8 и инициировали синтез рекомбинантного белка с помощью 1 мМ IPTG (изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид). После индукции в течение 3 часов бактерии собирали, ресуспендировали в 1/10 объема буфера A (50 мМ трис-HCl, 1 мМ EDTA, 100 мМ NaCl, pH 8) и лизировали разрушением под давлением (1500 мбар). Полученный в результате осадок дважды промывали в буфере B (50 мМ трис-HCl, 10 мМ EDTA, 0,5% тритон X-100, 100 мМ NaCl, pH 8). Все стандартные протоколы описаны в другой публикации (Sambrook, Fritsch, and Maniatis, 1989).
Очистка плектазина P. nigrella из телец включения E. coli
Осадок, полученный в результате описанной выше очистки, содержал очищенные тельца включения. Чтобы освободить пептид от партнера в слиянии KSI, осуществляли кислотный гидролиз в сконструированном сайте Asp-Pro, введенном с N-конца по отношению к гену, кодирующему плектазин.
Тельца включения ресуспендировали в 100 мМ фосфате натрия (pH 2,3) и инкубировали в течение ночи при 85 градусах Цельсия. Полученный в результате надосадок содержал пролин-плектазин, и образец нейтрализовали 100 мМ фосфатом натрия (pH 12,3). Идентичность пролин-плектазина подтверждали масс-спектрометрией. Все стандартные протоколы описаны в другой публикации (Sambrook, Fritsch, and Maniatis, 1989).
Противомикробная активность при анализе радиальной диффузии
Модифицированную версию ранее опубликованного протокола применили для определения противомикробной активности (Lehrer et al., (1991). Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides. J. Immunol. Methods 137: 167-173). Бактерии-мишени (106 колониеобразующих единиц (КОЕ)) добавляли к 10 мл подстилающей агарозы (1% агароза с низким электроэндосмосом, 0,03% триптиказо-соевый бульон, 10 мМ фосфат натрия, pH 7,4, 37 радусов Цельсия). Суспензию отверждали на чашках Петри INTEGRID (Becton Dickinson Labware, NJ). 3-мм перфоратор геля использовали, чтобы сделать отверстия в подстилающей агарозе (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden). Образцы добавляли в отверстия и инкубировали при 37 градусах Цельсия 3 часа. Верхний слой вливали сверху и чашку инкубировали в течение ночи (среда LB, 7,5% агар). Противомикробную активность наблюдали в виде зон, чистых от бактерий вокруг лунок. Живые клетки контрастно красили добавлением 10 мл 0,2 мМ MTT (бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия, тиазолил синий). Все стандартные протоколы описаны в другой публикации (Sambrook, Fritsch, and Maniatis, 1989).
Противомикробная активность плектазина, направленная против Bacillus subtilis
Чтобы оценить противомикробную активность плектазина, бульоны для ферментации рекомбинантного Aspergillus oryzae применяли в 2-кратных серийных разведениях в анализе радиальной диффузии (описанном выше). Большие чистые зоны наблюдали при тестировании образца против Bacillus subtilis, следуя описанному выше протоколу. Самую большую чистую зону получали с неразведенным бульоном для ферментации (15 мм), тогда как образцы, взятые из нерекомбинантного Aspergillus oryzae, не проявляли противомикробной активности против Bacillus subtilis.
Плектазин, экспрессируемый посредством телец включения в альтернативном хозяине E. coli
Чтобы увеличить количество выделяемого плектазина с противомикробной активностью, плектазин экспрессировали в E. coli Origami-DE3 (Novagen Inc.). Указанный штамм несет мутацию в генах, кодирующих тиоредоксинредуктазу (trxB) и глутатионредуктазу (gor). Рекомбинантной плазмидой pET31b+, кодирующей плектазин, трансформировали E. coli Origami-DE3 согласно инструкциям производителя (Novagen). Культивирование, экспрессию и выделение содержащих плектазин телец включения осуществляли, как описано выше (Трансформация и экспрессия плектазина P. nigrella в E. coli). Плектазин выделяли, как описано выше (Очистка плектазина P. nigrella из телец включения E. coli). Затем использовали анализ радиальной диффузии, чтобы оценить противомикробную активность (см. выше: «Противомикробная активность при анализе радиальной диффузии»).
Результаты показывают, что продуцирование пептидов плектазина в E. coli Origami-DE3 приводит к 5-10-кратному увеличению противомикробной активности пептида. Повышенная биологическая активность плектазина, кроме того, подтверждается тем фактом, что сходные результаты получили, экспрессируя другой дефенсин, бета-дефенсин 3 человека. Авторы пришли к выводу, что штаммы E. coli, которые дают возможность образовываться дисульфидным связям в цитоплазме, в общем применимы для биосинтеза биологически активных дефенсинов и других связанных дисульфидными мостиками противомикробных пептидов.
ПРИМЕР 6
Конструирование экспрессирующего вектора Saccharomyces cerevisiae для плектазина
Чтобы оценить экспрессию плектазина в S. cerevisiae приготовили две разные плазмидные конструкции pHH3875 и pHH3876. pHH3875 кодирует альфа-лидер из S. cerevisiae, слитый со зрелым плектазином. Плектазин можно освободить от альфа-лидера и, следовательно, сделать зрелым благодаря последовательности расщепления KEX2. pHH3876 кодирует альфа-лидер, слитый с областью пропептида плектазина, за которой следует зрелый плектазин. В данной конструкции один сайт KEX2 присутствует между альфа-лидером и областью пропептида плектазина, тогда как другой сайт KEX2 разделяет область пропептида плектазина и сам плектазин.
Конструирование pHH3875-альфа-лидер/KEX2/плектазин
Ген плектазина амплифицировали в стандартной реакции ПЦР, используя праймеры pHH3875-Forw и pHH3875-Rev, описанные ниже. Плазмиду pMT2548 Aspergillus из примера 2 использовали в качестве матрицы в ПЦР-реакции. Полученный в результате фрагмент ДНК очищали, используя набор для очистки Qiaquick PCR (Qiagen), и расщепляли XbaI и ClaI, которые разрезают в перекрывающихся областях, введенных благодаря праймерам. Затем фрагмент очищали из 2% агарозного геля и лигировали в экспрессирующий вектор S. cerevisiae, также расщепленный XbaI и ClaI. Указанный основанный на 2-мкм плазмиде челночный вектор E. coli/дрожжей использует конститутивный промотор tpi, чтобы управлять экспрессией слияния альфа-лидер/плектазин, использует бета-лактамазу для фенотипической селекции в E. coli и несет ген POT для селекции плазмиды в дрожжах Δtpi (MT663; a/α, Δtpi/Δtpi, pep4-3/pep4-3).
| Праймер рНН3875-Forw: | ||
| gaagg ggtat cgatg gctaa gagag gattt ggatg caatg gtcct tggga tgagg | (SEQ ID NO:18) | |
| Праймер рНН3875-Rev: | ||
| cttag tttct agact agtaa cactt gcaaa caaag ccccc c | (SEQ ID NO:19) |
Конструирование pHH3876-альфа-лидер/KEX2/область пропептида/KEX2/плектазин
Протокол конструирования pHH3876 идентичен протоколу для pHH3875 за исключением используемых праймеров ДНК. В случае pHH3876 использовали праймеры, описанные ниже:
| Праймер рНН3876-Forw: | ||
| gaagg ggtat cgatg gctaa gagag caccc cagcc tgttc ccgag gctta cgc | (SEQ ID NO:20) | |
| Праймер рНН3876-Rev (идентичен рНН3875-Rev): | ||
| cttag tttct agact agtaa cactt gcaaa caaag ccccc c | (SEQ ID NO:21) |
Экспрессия плектазина в S. cerevisiae
Плазмидами pHH3902 (контроль), pHH3875 и pHH3876 трансформировали S. cerevisiae, штамм MT633, используя протокол на основе ацетата лития. Отбирали несколько трансформантов pHH3902, pHH3875 и pHH3876, высевали штрихом на чашки с SC-основой/агаром (содержащие SC-основу, агар, 2% D-глюкозу, 0,02% треонин) и инкубировали при 30 градусах Цельсия до развития колоний.
Чтобы тестировать экспрессию, отдельные колонии инокулировали в 10 мл жидкой SC-основы (содержащей SC-основу, 2% D-глюкозу, 0,02% треонин), инкубировали при энергичном встряхивании при 30 градусах Цельсия в течение 3 дней. Надосадки разделяли в 16% трициновых гелях (Novex), чтобы получить оптимальное разделение в области низкой молекулярной массы. Параллельно надосадки концентрировали от 500 микролитров до 20 микролитров, используя центрифужные колонки Microcon с пределом отсечения по М.м. 3 кД. На всех образцах из pHH3875 и pHH3876 наблюдали полосы пептидов ожидаемого размера. Концентрированные образы показали наиболее заметные полосы.
Чтобы получить более подробную информацию, надосадки анализировали с использованием масс-спектрометра MALDI-типа (Voyager DE-Pro из Perseptive Biosystems).
В случае pHH3875 основной пик наблюдали в области масс 4410-4411. Это очень близко к ожидаемой массе 4402 для точно продуцированного и процессированного плектазина.
В случае pHH3876 наблюдали несколько пиков. Два наиболее заметных пика обнаружили в области масс 4411-4413 и 7870-7871. Пик 4411 снова соответствует точно процессированному плектазину. Пик 7870 лучше всего соответствует полупроцессированому плектазину, в котором область пропептида не отщеплена от плектазина. Наблюдали несколько разрушенных продуктов предположительно пика 7870.
Активность плектазина из pHH3875 и pHH3876
Описанные выше надосадки анализировали в анализе радиальной диффузии, как описано в примере 5.
| Таблица 3 Приблизительная зона ингибирования (мм) | ||
| Плазмида | Нормальная | Концентрированная |
| рНН3902 | 0 | 0 |
| рНН3875 | 5 | 12 |
| рНН3876 | 8 | 14 |
Неожиданно pHH3876 давала наибольшую зону ингибирования, что свидетельствует о большем количестве продукта или продукте с более высокой активностью по сравнению с pHH3875.
HTP-скрининг вариантов плектазина
Чтобы далее оптимизировать противомикробную активность плектазина, требуется высокопроизводительный анализ (HTP) активности. Чтобы наладить такую систему, дрожжевые клетки, содержащие контрольную плазмиду, pHH3902, или две плазмиды, экспрессирующие плектазин, pHH3875 и pHH3876, выращивали в 96-луночных планшетах для микротитрования. При подходящей плотности клеток либо 5, либо 20 микролитров дрожжевой культуры извлекали из планшета для микротитрования и использовали в анализе радиальной диффузии, который описан в примере 5. И снова зоны, чистые от бактерий, на тестируемой чашке для радиальной диффузии были видны в случае надосадков, полученных от двух продуцирующих плектазин штаммов, pHH3875 и pHH3876. Как было отмечено выше, чистые зоны были больше в случае надосадков, получаемых из pHH3876. Не наблюдали чистых зон в случае контрольной плазмиды. Это свидетельствует о том, что указанный простой HTP-анализ может различать дрожжевые клетки, экспрессирующие разные уровни противомикробных активностей, и подходит для скрининга вариантов плектазина с требуемыми активностями.
ПРИМЕР 7
Конструирование индуцируемой продукции у дрожжей и системы HTP-скрининга плектазина - конструирование pYES2-3902, pHH3886 (плектазин) и pHH3887 (проплектазин)
Чтобы оценить индуцируемые системы экспрессии и возможность разработки системы HTP-скрининга для идентификации вариантов плектазина с повышенной биоактивностью, конструировали индуцируемые экспрессирующие векторы, кодирующие плектазин и проплектазин, используя pYES2.
pYES2 (Invitrogen) является вектором размером 5,9 т.п.о., сконструированным для индуцируемой экспрессии рекомбинантных белков и пептидов в Saccharomyces cerevisiae. Вектор содержит такие отличительные элементы, как дрожжевой промотор GAL1 для экспрессии на высоком уровне, индуцируемой галактозой, и репрессии глюкозой. Прототрофность по урацилу и резистентность к ампициллину используют для селекции трансформантов клеток дрожжей и E. coli, соответственно.
Конструировали три плазмиды: контрольную плазмиду, pYES-3902, и две плазмиды, кодирующие плектазин, pHH3886 и pHH3887.
Так как pYES2 является неслитым вектором, полные области альфа-лидера из pHH3902, pHH3875 и pHH3876 ПЦР-амплифицировали в стандартной реакции ПЦР. Фрагменты разделяли в 2% агарозном геле, очищали, используя набор для очистки Qiagen, и подвергали рестрикции HindIII и XbaI и лигировали в соответствующие сайты в плазмиде pYES2. При этом альфа-лидер помещали перед промотором GAL1. Смесью для лигирования трансформировали компетентные клетки E. coli. Трансформанты снова высевали штрихом и анализировали количество отдельных клонов в отношении плазмид со вставкой точного размера. Окончательное подтверждение осуществляли с помощью секвенирования ДНК, используя праймеры AOP107 и AOP446. Плазмиды названы pYES2-3902 (контроль), pHH3886 (плектазин) и pHH3887 (проплектазин).
| Праймер АОР107: | caata taaaa aagct agctt tccg | (SEQ ID NO:22) |
| Праймер АОР446: | ccggc tgaag ctgct atcgg | (SEQ ID NO:23) |
Тремя плазмидами, pYES-3902, pHH3886 и pHH3887, трансформировали дрожжевой штамм JG169 и высевали на чашки, содержащие глюкозу (0,5%)/галактозу (1,5%). Глюкоза обеспечивает образование колоний подходящего размера, а после истощения глюкозы галактоза обеспечивает дальнейший рост, индукцию транскрипции и соответствующую продукцию плектазина. После образования колоний газон (примерно 106 КОЕ) индикаторного штамма B. subtilis наслаивали на колонии и чашки далее инкубировали в течение ночи. Как видно в случае с другими дрожжевыми плазмидами, описанными выше, дрожжевой штамм, несущий контрольную плазмиду, не давал зону, очищенную от бактерий, тогда как оба, pHH3886 и pHH3887, вызывали образование чистых зон. Наибольшие чистые зоны наблюдали в случае pHH3887, кодирующей проплектазин.
ПРИМЕР 8
Конструирование индуцируемой дрожжевой продукции и системы HTP-скрининга в отношении плектазина - конструирование библиотек мутантного плектазина
Библиотеки мутантного плектазина конструировали с использованием склонной к ошибкам ПЦР. Случайно мутированные фрагменты ДНК создавали, используя праймеры pYES-mut и pHH3885-Rev и в качестве матрицы либо pHH3875 (проплектазин), либо pHH3876 (плектазин) в ПЦР-реакции, содержащей 0,5 мМ MnCl2.
| Праймер pYES-mut: | ||
| taaatactac tattgccagc attgctgcta aagaagaagg ggtatcgatg gccaagaga | (SEQ ID NO:24) | |
| Праймер рНН3885-Rev: | ||
| tgtaagcgtg acataactaa ttacatgatg cggccctcta ga | (SEQ ID NO:25) |
Фрагменты разделяли в 2% агарозном геле, очищали, используя набор для очистки Qiagen, и встраивали в плазмиду pYES2-3902. Плазмиды путем электропорации вводили в компетентные дрожжевые клетки JG169.
Две разные библиотеки высевали на большие чашки с агаром (23 см × 23 см), содержащие 0,5% глюкозы и 1,5% галактозы. После инкубирования при 30 градусах Цельсия в течение 2 дней на чашки с библиотеками наслаивали тонкий слой агарозы, содержащий примерно 107 КОЕ B. subtilis. Чашки инкубировали еще в течение 24 часов при 30 градусах Цельсия. Тестировали примерно 10000 колоний. Дрожжевые колонии, вызывающие образование значительных очищенных зон, выделяли для дальнейшей характеристики.
ДЕПОЗИТ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Следующий биологический материал депонировали по условиям Будапештского договора в Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands (альтернативно P.O.Box 85167, 3508 AD Utrecht, The Netherlands) и присвоили следующий номер доступа:
| Депозит | Номер доступа | Дата депозита |
| Pseudoplectania nigrella | CBS 444.97 | 18 января 1997 г. |
Депозит сделан Novo Nordisk A/S и позднее переуступлен Novozymes A/S.
Классификация Pseudoplectania nigrella:
Эукариоты; грибы; Ascomycota; Pezizomycotina; Pezizomycetes; Pezizales; Sarcosomataceae; Pseudoplectania.
1. Полипептид, обладающий противомикробной активностью, выбранный из группы, состоящей из:
(a) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 65% идентичностью с аминокислотными остатками 1-40 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, при этом аминокислотные остатки, составляющие аминокислотную последовательность полипептида, выбраны из D- или L-форм;
(b) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 65% идентичностью с аминокислотной последовательностью полипептида, кодируемого частью нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, обладающий противомикробной активностью, из штамма Pseudoplectania nigrella CBS 444.97;
(c) фрагмента полипептида (а) или (b), обладающего противомикробной активностью.
2. Полипептид по п.1, аминокислотная последовательность которого обладает по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 99% идентичностью с аминокислотными остатками 1-40 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
3. Полипептид по п.2, аминокислотная последовательность которого включает аминокислотные остатки 1-40 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
4. Полипептид по любому из пп.1-3, который состоит из аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2.
5. Полипептид по любому из пп.1-3, где полипептид представляет собой искусственный вариант зрелого полипептида и имеющий в аминокислотной последовательности по меньшей мере одну замену, делецию и/или инсерцию аминокислотного остатка по сравнению с аминокислотными остатками 1-40 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
6. Полипептид по п.1, включающий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 70% идентичностью, или по меньшей мере 80% идентичностью, или по меньшей мере 85% идентичностью, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 99% идентичностью с аминокислотной последовательностью полипептида, кодируемого частью нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, обладающий противомикробной активностью, из штамма Pseudoplectania nigrella CBS 444.97.
7. Полипептид по п.6, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую частью нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, обладающий противомикробной активностью, из штамма Pseudoplectania nigrella CBS 444.97.
8. Полипептид по п.6 или 7, который состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой частью нуклеотидной последовательности, кодирующей противомикробный полипептид, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97.
9. Полипептид по любому из пп.6 и 7, где полипептид представляет собой искусственный вариант зрелого полипептида и имеющий в аминокислотной последовательности по меньшей мере одну замену, делению и/или инсерцию аминокислотного остатка по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой частью нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, обладающий противомикробной активностью, из штамма Pseudoplectania nigrella CBS 444.97.
10. Полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид по любому из пп.1-9.
11. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность по п.10, оперативно связанную с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют продукцией полипептида в подходящем хозяине.
12. Рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий конструкцию нуклеиновой кислоты по п.11.
13. Рекомбинантная клетка-хозяин для получения полипептида по любому из пп.1-9, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по п.11.
14. Способ получения полипептида по любому из пп.1-9, включающий:
(a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина по п.13 в условиях, способствующих продукции полипептида, и
(b) выделение полипептида.
15. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по пп.1-9, имеющий нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 65% идентична нуклеотидам 166-285 SEQ ID NO:1.
16. Способ уничтожения или ингибирования роста микробных клеток, включающий в себя контактирование микробных клеток с противомикробным полипептидом по любому из пп.1-9.
17. Применение противомикробного полипептида по любому из пп.1-9 в качестве лекарственного средства.
18. Применение противомикробного полипептида по любому из пп.1-9 для приготовления ветеринарного или терапевтического средства для человека для лечения или профилактики микробной инфекции.
19. Применение по меньшей мере одного противомикробного полипептида по любому из пп.1-9 в корме для животных.
Приоритет по пунктам:
20.11.2001 по пп.1-18;
23.08.2002 по п.19.
