Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью
Владельцы патента RU 2337700:
Государственное учреждение Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (RU)
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" ГОУВПО СибГМУ (RU)
ООО "Инновационные коммуникации" (RU)
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству, обладающему иммуностимулирующей активностью. Применение водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, в качестве средства, обладающего иммуномодулирующей активностью, стимулирующего Th1-зависимый тип иммунного ответа. Водорастворимые полисахариды, полученные из листьев мать-и-мачехи, обладают иммуномодулирующей активностью, эффективно стимулируют Th1-зависимый тип иммунного ответа. 2 табл.
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и может быть использовано для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).
В настоящее время в терапии заболеваний, обусловленных дисфункцией иммунной системы, используются [Энциклопедия лекарств, 2004а]: препараты на основе цитокинов, интерфероны и интерфероногены (например, неовир, тилорон, криданимод), синтетические вещества с иммуностимулирующими свойствами (например, декарис, циклоферон, тимоген, ликопид), препараты растительного происхождения, препараты на основе нуклеиновых кислот (натрия дезоксирибонуклеат, натрия нуклеинат, оксиметилурацил), препараты, содержащие микроорганизмы или их производные (имудон, ИРС 19, рибомунил) и препараты на основе ферментов (вобэ-мугос Е, вобэнзим).
Препараты растительного происхождения представлены в основном лекарственными средствами на основе растения эхинацеи - иммунал, иммунорм, доктор Тайсс экстракт эхинацеи. Препараты иммунал и иммунорм содержат сок, полученный из свежесобранной травы цветущей эхинацеи пурпурной [Энциклопедия лекарств, 2004б; Энциклопедия лекарств, 2004в], а доктор Тайсс экстракт эхинацеи - экстракт листьев эхинацеи [Энциклопедия лекарств, 2004 г]. У этих препаратов имеется общее побочное действие: аллергические реакции на эхинацею. Некоторые авторы полагают, что у препаратов растительного происхождения, таких как вышеуказанные лекарственные средства на основе эхинацеи, отсутствует избирательность в отношении иммунной системы [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2003а]. Вероятно, это связано с наличием в них различных по своим фармакологическим эффектам веществ.
Наиболее близким (базовым) препаратом является ликопид, поскольку в основе механизма его иммуномодулирующего действия лежит активация антиген-презентирующих клеток и фагоцитов (макрофаги, нейтрофилы) [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2003б]. Известно, что основным цитокином, активирующим Т-хелперы 1 типа (Th1), является интерлейкин-12, который вырабатывается антиген-презентирующими клетками в раннюю фазу инфекции. Благодаря этому цитокину макрофаги могут направлять дифференцировку Т-хелперов, создавая условия для предпочтительного развития Th1 in vitro и in vivo. Ликопид активирует клетки моноцитарно-макрофагального звена, стимулируя продукцию ими воспалительных цитокинов.
Для стимулирования активности макрофагов мы предлагаем использовать водорастворимые полисахариды, полученные из листьев мать-и-мачехи, поскольку известно, что полисахариды могут связываться практически со всеми рецепторами антиген-презентирующих клеток [Schepetkin I.A., et al., 2006]. Кроме того, в ряде работ показано, что полисахариды растительного или микробного происхождения могут оказывать влияние на поляризацию лимфоцитов через соответствующую активацию антиген-презентирующих клеток, при этом полисахариды могут способствовать как развитию Th1-, так и Th2-зависимого иммунного ответа.
Задачей данного изобретения является расширение арсенала иммуномодулирующих средств растительного происхождения, повышение их эффективности путем избирательной стимуляции Th1-зависимого типа иммунного ответа.
Поставленная цель решается путем применения водорастворимых полисахаридов, выделенных из листьев мать-и-мачехи, в качестве стимулятора Th1-зависимого типа иммунного ответа.
Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение в качестве иммуномодулирующего средства водорастворимых полисахаридов, выделенных из листьев мать-и-мачехи.
Новое свойство водорастворимых полисахаридов, выделенных из листьев мать-и-мачехи, было обнаружено в результате экспериментальных исследований.
Новое свойство полисахаридов явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники и описание его не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе. В качестве иммуномодулирующего средства водорастворимые полисахариды, выделенные из листьев мать-и-мачехи, можно использовать для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью TH1-зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).
Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Полисахариды получены по стандартной методике [Методы исследования углеводов, 1975]. Сырье листья мать-и-мачехи измельчали и просеивали через сита с размером пор 1 и 3 мм, экстрагировали водой при перемешивании в течение 30-180 мин при нагревании на водяной бане (температура 80-100°С), при соотношении сырье:экстрагент от 1:10 до 1:50. После этого сырье с экстрагентом оставляли на время от 6 до 36 часов в прохладном месте для настаивания. Затем экстрагент отделяли от сырья фильтрованием, экстракцию повторяли вновь в тех же условиях. После фильтрации полученные извлечения объединяли и упаривали до 1/5 объема. Полисахариды осаждали добавлением к полученному раствору двукратного количества 96%-ного этанола. Выпавший осадок центрифугировали, отделяли от раствора, промывали 96% этиловым спиртом и высушивали. Выход водорастворимых полисахаридов составлял 0,7 г (7%). Сумма водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, представляла собой порошок молочно-белого цвета с кремовым оттенком, а полисахариды, полученные из листьев календулы, имели вид мелкозернистых тяжелых гранул темно-коричневого цвета с диаметром частиц до 1,5 мм.
Эксперименты проведены на 90 линейных мышах BAlb/с массой 20 г, возраст 8 недель. В предварительных экспериментах было выявлено, что оптимальной суточной дозой полисахаридов, полученных из мать-и-мачехи, для иммуномодуляции является 10 мг/кг массы тела.
Для индукции Th1-зависимого типа иммунного ответа животных иммунизировали эритроцитами барана, которые, как известно, вызывают развитие именно этого типа иммунного ответа. Для изучения влияния водорастворимых полисахаридов на гуморальный и клеточный иммунный ответ мышам вводили раствор полисахаридов по 10 мг/кг массы тела ежедневно внутрибрюшинно в течение 10 дней. Через 5 дней от начала введения животных иммунизировали эритроцитами барана (по 5×106 внутрибрюшинно при определении числа АОК и титра антител, по 1×108 при проведении реакции гиперчувствительности замедленного типа).
Влияние полисахаридов на гуморальное звено иммунитета оценивали по изменению числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунизированных мышей [Хаитов P.M. с соавт., 1999] и по титру антител в сыворотке крови. Для этого животных забивали через 5 дней после иммунизации, лимфоциты получали гомогенизацией селезенок в стеклянном гомогенизаторе, после чего клеточную взвесь фильтровали через 4-слойный капрон, трижды промывали холодным изотоническим раствором хлорида натрия, ресуспендировали в 4 мл среды 199 и подсчитывали количество жизнеспособных клеток. В пробирки, предварительно нагретые до 49-53°С, вносили 0,9 мл среды культивирования (среда 199, 0,7% агар «Difco»), 0,2 мл 20%-ной взвеси эритроцитов барана, 0,2 мл взвеси спленоцитов и 0,1 мл комплемента. После ресуспендирования данной смесью заполняли камеры Горяева, помещали их во влажную камеру, инкубировали 2 ч при 37°С, затем подсчитывали зоны гемолиза при помощи светового микроскопа. Титр антител в сыворотке крови определяли в реакции агглютинации [Хаитов P.M. с соавт., 1999]. Для этого животных забивали цервикальной дислокацией, вскрывали грудную полость и забирали кровь из сердца, после чего клеточные элементы осаждали центрифугированием. Полученную сыворотку раститровывали в 96-луночном планшете с шагом 1/2, добавляли эритроциты барана, инкубировали при 37°С 2 часа и учитывали реакцию. За титр принимали то последнее разведение исследуемой сыворотки, при котором еще наблюдается агглютинация.
Для оценки действия исследуемого вещества на клеточное звено иммунитета использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа [Хаитов P.M. с соавт., 1999]. Для этого на 5-е сутки после иммунизации животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (108 эритроцитов барана в 0,02 мл изотонического раствора хлорида натрия). В контрлатеральную лапу вводили 0,02 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия («контрольная лапа»). Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 часа по разнице массы опытной (Мо) и контрольной (Мк) лап. Животных забивали, обе лапки отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава. Индекс реакции (ИР) вычисляли для каждой мыши по формуле:
Статистическую обработку проводили при помощи t-критерия Стьюдента. Различия показателей считали достоверными при p<0,05.
Пример 1.
Курсовое введение полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, привело к увеличению в 2,1 раза числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенках мышей (табл.1).
| Таблица 1 | ||
| Влияние курсового введения полисахаридов (ПС), выделенных из листьев мать-и-мачехи, на количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенках мышей и продукцию ими антител (Х±m) | ||
| Группа животных | Число АОК, 103/селезенку | Титр антител, log2 |
| Контроль | 36,7±6,0 | 5,5±0,5 |
| Ликопид (10 мг/кг) | 66,9±9,3* | 6,0±0,8 |
| Ликопид (2 мг/кг) | 72,9±9,7* | 8,5±0,5* |
| ПС мать-и-мачехи | 77,1±8,2* | 7,50±0,67* |
| Примечание: * - различия с контролем достоверны, р<0,05. |
У животных, не получавших исследуемого вещества, количество АОК составило 36,7 тыс. из расчета на 1 селезенку, в то время как у мышей после курсового введения полисахаридов их число составило 77,1 тыс. на 1 селезенку. Количество антител, вырабатываемых В-лимфоцитами в ответ на введенный антиген (эритроциты барана), под влиянием курсового введения полисахаридов повышалось на 36% (табл.1). Ликопид также повышал количество АОК и уровень антител, однако это стимулирующее действие было выражено в той же степени, что и у полисахаридов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что изучаемое вещество обладает способностью стимулировать гуморальный иммунный ответ, повышая количество антителообразующих клеток и их функциональную активность. Следует отметить, что по стимулирующей активности полисахариды не уступают ликопиду.
Пример 2.
Курсовое введение полисахаридов, выделенных из листьев мать-и-мачехи, усиливало эффекторную фазу реакции клеточного ответа на эритроциты барана (табл.2). У мышей, которым вводили только растворитель (изотонический раствор хлорида натрия), индекс реакции составил 9,85%. У животных в результате курсового введения полисахаридов, выделенных из листьев мать-и-мачехи, индекс реакции был увеличен в 2 раза и составил 20,4%. Водорастворимые полисахариды, выделенные таким же способом, но из другого растительного сырья - листьев календулы, стимулирующей активности в данной иммунологической реакции не проявили.
| Таблица 2 | |
| Влияние полисахаридов, выделенных из листьев мать-и-мачехи, на реакцию ГЗТ на 5-е сутки после иммунизации эритроцитами барана (Х±m) | |
| Группа животных | ИР (%) |
| Контроль | 9,85±1,73 |
| ПС календулы | 11,46±2,71 |
| ПС мать-и-мачехи | 20,40±2,81* |
| Примечание: * - различия с контролем достоверны, р<0,05. |
Таким образом, экспериментально установлено, что полисахариды, полученные из листьев мать-и-мачехи, стимулируют протекание иммунного ответа, вызванного эритроцитами барана, а следовательно, являются активаторами Th1 типа иммунного ответа.
Водорастворимые полисахариды, полученные из листьев мать-и-мачехи, являются активаторами Th1-зависимого типа иммунного ответа и могут расширить арсенал средств растительного происхождения, способных стимулировать иммунный ответ при хронических, вялотекущих и рецидивирующих инфекционно-воспалительных процессах любой локализации.
Литература
1. Методы исследования углеводов (пер. с английского В.А.Несмеянова, под. ред. проф. Харлина). М.: Мир, 1975. С.274.
2. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения // Клиническая медицина. 1996. №8. С.7-12.
3. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В., Зебрев А.И. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов (методические рекомендации) // Ведомости Фармакологического Комитета. 1999. №1. С.31-36.
4. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение // Иммунология. 2003а. №3. С.198.
5. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение // Иммунология. 2003б. №3. С.199.
6. Энциклопедия лекарств. 2004а. №11. Изд-во ООО «РЛС-2004». С.1081-1082.
7. Энциклопедия лекарств. 2004б. №11. Изд-во ООО «РЛС-2004». С.360.
8. Энциклопедия лекарств. 2004в. №11. Изд-во ООО «РЛС-2004». С.362.
9. Энциклопедия лекарств. 2004г. №11. Изд-во ООО «РЛС-2004». С.320.
10. Schepetkin I.A., Quinn M.T. Botanical polysaccharides: macrophage immunomodulation and therapeutic potential // Int. Immunopharmacol. 2006. Vol.6, №3. P.317-733.
Применение водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, в качестве средства, обладающего иммуномодулирующей активностью, стимулирующего Th1-зависимый тип иммунного ответа.
