Рекомбинантная плазмидная днк pas-2, кодирующая полипептид проинсулина aspart человека, и штамм бактерий escherichia coli bas2 - продуцент рекомбинантного проинсулина aspart

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в фармацевтической промышленности при создании лекарственных препаратов для лечения инсулинозависимого сахарного диабета. Плазмида pAS-2 образована HindIII/BamHI-фрагментом плазмиды pPINS07, содержащим часть искусственного гена, кодирующего IgG-связывающий домен белка А из S. aureus и пептид His₆GlySerArg, и HindIII/BamHI-фрагментом, кодирующим проинсулин Aspart. Плазмида pAS-2 обеспечивает в клетках Е. coli биосинтез гибридного белка, в котором последовательность домена В стафилококкового белка A Staphylococcus aureus соединена через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина Aspart человека. Штамм бактерий Escherichia coli BAS2 человека, полученный путем трансформирования клеток штамма бактерий Escherichia coli BL21 плазмидой pAS-2, продуцирует указанный гибридный белок. Применение изобретения позволяет получать инсулин Aspart человека по упрощенной технологии и с высоким выходом. 2 н.п. ф-лы, 4 ил.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, конкретно к получению проинсулина Aspart, и может быть использовано для создания лекарственных препаратов нового поколения для лечения инсулинозависимого сахарного диабета.

К инсулинозависимому сахарному диабету (сахарному диабету первого типа, СД1) относят нарушения углеводного обмена, развитие которых обусловлено полной деструкцией или уменьшением числа β-клеток поджелудочной железы (до ˜10% от нормы). Обычно это приводит к абсолютной инсулиновой недостаточности. При этом инсулин, гормон поджелудочной железы, до сих пор остается основным лекарственным средством для лечения СД1.

Цель инсулиновой терапии - восстановление обмена глюкозы, предотвращение гипергликемии и глюкозурии после приема пищи, оптимизация диеты и поддержание нормальной массы тела, нормализация жирового обмена, повышение качества жизни больного [Vajo Z., Fawcett J., Duckworth W.C. Endocrine Reviews, 2001, v.22, p.706-717]. Инсулиновая терапия с использованием немодифицированного инсулина человека имеет ряд недостатков:

1. При подкожном введении препарата инсулина максимальная концентрация устанавливается только через ˜1-2 часа, поэтому больным сахарным диабетом необходимо вводить препарат за 30-60 минут перед приемом пищи, чтобы избежать развития различных осложнений.

2. При подкожном введении препарата действие инсулина сохраняется в течение нескольких часов после приема пищи, что может приводить к развитию гипогликемии.

3. В местах постоянного введения инсулина, как правило, развивается липодистрофия.

4. Однократное введение препарата инсулина является недостаточным для поддержания нормального уровня глюкозы в крови в течение суток [Vajo Z., Fawcett J., Duckworth W.C. Endocrine Reviews, 2001, v.22, p.706-717].

Преодоление недостатков природного инсулина стало возможным после получения его генно-инженерных аналогов [Walsh G. Appl. Microbiol. Biotechnol, 2005, v.67, p.151-159].

Инсулин Lyspro, первый внедренный в широкую клиническую практику быстродействующий аналог инсулина человека, у которого в аминокислотной последовательности В-цепи (фиг.1) инвертированы остатки пролина В28 (РrоВ28) и лизина В29 (LysB29). Эта модификация привела к конформационным изменениям в С-концевой последовательности В-цепи, которые сделали неэффективной димеризацию молекул белка, характерную для нативного инсулина [Wood A.J.J. N. Engl. J. Med., 1997, v.337, p.176-183]. Снижение способности к образованию агрегатов позволило увеличить скорость абсорбции инсулина Lyspro после инъекции, увеличить уровень содержания препарата в плазме и уменьшить продолжительность его действия [Howey D.C., Bowsher R.R., Brunelle R.L., Woodworth J.R. Diabetes, 1994, v.43, p.396-402]. Действие инсулина Lyspro начинается через 15 мин после подкожной инъекции, достигает максимальных значений через ˜1 ч и прекращается спустя 2-4 ч [Torlone E., Fanelli С., Rambotti A.M., Kassi G., Modarelli F., Di Vincenzo A., Epifano L., Ciofetta M., Pampanelli S., Brunetti P. Diabetologia, 1994, v.37, p.713-720].

Инсулин Aspart - еще один используемый в клинической практике генно-инженерный аналог инсулина быстрого действия. В молекуле инсулина Aspart остаток пролина в положении В28 В-цепи заменен остатком аспарагиновой кислоты (фиг.1). Эта замена снизила тенденцию мономерных молекул инсулина к агрегации из-за нарушения взаимодействия между остатками РrоВ28 и GlyB23 [Setter S.M., Corbett C.F., Campbell P.K., White J.R. Ann. Pharmacother., 2000; v.34, p.1423-1431].

Сродство инсулинов Aspart и Lyspro к рецептору инсулина человека и их влияние на клеточный метаболизм практически одинаковы, однако инсулин Aspart проявляет меньшее, чем инсулин Lyspro, сродство к IGF-1 рецептору. При этом оба аналога обладают меньшей митогенной активностью в сравнении с немодифицированным инсулином человека [Chapman T.M., Noble S., Goa K.L. Drugs, 2002, v.62, p.1945-1981].

Инсулин Aspart абсорбируется из места инъекции быстрее природного инсулина. При подкожном введении инсулина Aspart максимально достигаемая концентрация препарата в крови выше, чем у природного гормона (138-518 пмоль/л и 59-288 пмоль/л соответственно), и этот уровень достигается за более короткий промежуток времени (31-71 мин по сравнению с 61-145 мин). Восстановление исходного уровня инсулина Aspart в плазме также происходит быстрее [Home P.D., Barriocanal L., Lindholm A. Eur. J. Clin. Pharmacol., 1999; v.55, p.199-203].

Известен способ получения инсулина Aspart, в котором ген модифицированного проинсулина человека общей структуры B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) собирают из 10 предварительно синтезированных олигонуклеотидов и генно-инженерным способом вводят в челночный экспрессирующий вектор под контроль сильного промотора гена триозофосфатизомеразы Saccharomyces cerevisiae вслед за последовательностью нуклеотидов, кодирующей лидерный пептид, обеспечивающий секрецию рекомбинантного белка из дрожжевых клеток. Требуемую мутацию, приводящую к замене аминокислотного остатка РroВ28→AspB28 в молекуле проинсулина, вводили в рекомбинантный ген направленным мутагенезом с использованием соответствующего праймера. Рекомбинантный белок-предшественник, секретируемый клетками дрожжей, содержащими данную плазмиду, подвергали грубой очистке с использованием катионообменной хроматографии с последующей кристаллизацией. Инсулин Aspart получали реакцией транспептидации белка-предшественника с Thr-OMe в присутствии трипсина и последующим гидролизом образовавшегося эфира [US № 5618913, МКИ С07К 014/62, опубл. 1997].

Способ имеет ряд недостатков, в частности многоэтапность и связанную с этим высокую трудоемкость получения конечного продукта, необходимость использования стадий химического синтеза пептидов, а также низкий выход требуемого аналога инсулина, что затрудняет использование данного способа в технологических целях.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является штамм-продуцент рекомбинантного проинсулина Lyspro человека Escherichia coli pLP-3-1/TG-1, в котором рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный полипептид с последовательностью проинсулина Lyspro человека, соединенный через пептидный линкер с аминокислотной последовательностью домена В стафилококкового белка А, введена в клетки Escherichia coli TG-1 дикого типа. Индукция экспрессии рекомбинантного гена в этом штамме осуществляется с помощью изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) [патент РФ №2235776, МКИ C12N 15/00, опубл. 2004]. Несмотря на то, что для данного штамма-продуцента характерен высокий уровень биосинтеза рекомбинантного белка, последний в процессе синтеза и последующей очистки подвергается быстрой деградации из-за наличия в бактериальных клетках дикого типа ряда протеолитических ферментов. Это затрудняет очистку рекомбинантного проинсулина и уменьшает выход конечного продукта, что повышает стоимость препаратов рекомбинантного белка.

Задачей изобретения является конструирование плазмиды, экспрессирующей ген проинсулина Aspart, и создание высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента аналога проинсулина, позволяющего получать инсулин Aspart с высоким выходом и по упрощенной технологии.

Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pAS-2, кодирующей гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность проинсулина Aspart человека, в котором последовательность домена В белка A S. aureus соединена через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина Aspart человека с молекулярной массой 3,3 МДа (5051 п.о.), содержащей HindIII/BamHI-фрагмент плазмиды pPINS07, включающий гибридный tac-промотор, ген β-лактамазы (bla), область начала репликации (ori), терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli, последовательность нуклеотидов, кодирующую аминокислотную последовательность домена В белка А S. aureus, соединенную с последовательностью нуклеотидов, кодирующей пептид His₆GlySerArg, и HindIII/BamHI-фрагмент (271 п.о.), кодирующий проинсулин Aspart человека; уникальные сайты рестрикции со следующими координатами: EcoRI - 1, NcoI - 217, BamHI - 221, PstI - 342 и 417, HindIII - 492, SalGI - 4513, ClaI - 4792, а также за счет штамма Escherichia coli BAS2 - продуцента рекомбинантного белка, содержащего аминокислотную последовательность проинсулина Aspart.

Исходной плазмидой для конструирования является плазмида pPINS07, кодирующая:

- гибридный полипептид, состоящий из одного IgG-связывающего домена белка А Staphylococcus aureus, пептидного линкера His₆GlySerArg и проинсулина человека,

- гибридный tac-промотор и

- терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli.

[Патент РФ №2144957, МКИ C12N 15/00, опубл. 2000].

Как уже отмечалось выше, последовательность инсулина Aspart отличается от природного инсулина структурой аминокислотных остатков в положении В28. Для введения соответствующей мутации в ген проинсулина человека используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с перекрывающимися праймерами. Для этого вначале на матрице исходной плазмиды синтезируют продукты А и В (ПЦР 1, фиг.2) с помощью пар праймеров 1-4 и 2-3. Праймеры 3 и 4 содержат некомплементарные матрице нуклеотиды, соответствующие последовательностям гена проинсулина Aspart человека (обозначены звездочками). Полученные ПЦР-продукты очищают на ДЭАЭ-мембране и используют в качестве матрицы во второй полимеразной реакции (ПЦР 2) в присутствии праймеров 1 и 2 (фиг.3). Синтезированный фрагмент С очищают на ДЭАЭ-мембране. Полученный в итоге фрагмент С содержат требуемую мутацию, а также уникальные сайты рестрикции BamHI и HindIII на своих концах. Далее этот фрагмент инкубируют с рестриктазами BamHI и HindIII и клонируют в предварительно подготовленном векторе, который представляет собой исходную плазмиду, содержащую рекомбинантный ген гибридного полипептида без последовательности проинсулина человека, удаленной с помощью тех же рестриктаз (фиг.2). Отбор рекомбинантных клонов проводят по элиминации сайта рестрикции Mbo II в продукте ПЦР, полученном в результате амплификации предполагаемой рекомбинантной плазмиды pAS-2 с помощью праймеров 1 и 2 (фиг.2 и 3). Удаление сайта рестрикции является следствием изменения с помощью проведенного направленного мутагенеза последовательности нуклеотидов гена проинсулина исходной плазмиды, приводящего к появлению в В-цепи инсулина измененного аминокислотного остатка AspB28 (фиг.1). Плазмиды отобранных клонов, которые обладают требуемыми свойствами, очищают щелочным методом [Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press], и последовательности нуклеотидов клонированного фрагмента ДНК определяют методом Сэнгера с использованием дидезоксирибонуклеотидных производных в качестве терминаторов синтеза ДНК термосеквеназой на автоматическом секвенаторе. Полученную последовательность сравнивают с последовательностью исходной плазмиды, определенную тем же методом. Итогом работы является получение рекомбинантной плазмиды, обладающей требуемыми свойствами.

Плазмиду pAS-2 вводят в компетентные клетки Е. coli BL21 [патент РФ №2267534, МКИ C12N 15/17, опубл. 2006], что приводит к созданию рекомбинантного штамма-продуцента инсулина Aspart (Е. coli BL21/pAS-2). Исследование уровней экспрессии гибридного белка, содержащего последовательность аналога проинсулина Aspart в полученном рекомбинантном штамме, показывает, что содержание рекомбинантного полипептида в бактериальных клетках после завершения индукции с помощью ИПТГ составляет не менее 25% от суммарного клеточного белка.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pAS-2, кодирующая гибридный полипептид с последовательностью аналога проинсулина Aspart, характеризуется следующими свойствами:

- имеет молекулярную массу 3,3 МДа (5051 п.о.);

- кодирует гибридный белок, в котором последовательность домена В стафилококкового белка А с С-концевым гексагистидиновым линкером соединена через трипептид GlySerArg с последовательностью проинсулина Aspart (плазмида pAS-2);

- состоит из HindIII/BamHI-фрагмента плазмиды pPNIS07, содержащего синтетический tac-промотор транскрипции, ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость клеток бактерий к ампициллину, область инициации репликации плазмидной ДНК (ori), терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli, а также включающего часть искусственного гена, кодирующую IgG-связывающий домен белка А из S. aureus и гексагистидиновый домен, соединенный с трипептидом GlySerArg, а также HindIII/BamHI-фрагмента, кодирующего проинсулин Aspart (плазмида pAS-2) человека, содержащий в аминокислотной последовательности остаток AspB28; уникальные сайты рестрикции имеют следующие координаты: EcoRI - 1, NcoI - 217, BamHI - 221, PstI - 342 и 417, HindIII - 492, SalGI - 4513, ClaI - 4792.

Преимуществом полученной плазмиды перед известными плазмидами является то, что она кодирует полипептид проинсулина Aspart под контролем синтетического tac-промотора, индуцируемого изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом. Это позволяет индуцировать и осуществлять синтез проинсулина при обычной для Е. coli температуре 37°С, что значительно повышает выход рекомбинантного белка и облегчает его дальнейшую очистку. Кроме того, в отличие от известных плазмид, сконструированная плазмида содержит ген β-лактамазы в качестве селектируемого маркера.

Для получения штамма-продуцента гибридного полипептида, содержащего последовательность проинсулина Aspart человека, рекомбинантную плазмиду pAS-2 вводят с помощью электропорации в компетентные клетки Е. coli BL21.

Полученный штамм Е. coli BL21/pAS-2, названный Е. coli BAS2, характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки: клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, 1×3,5 мкм, подвижные. Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон, LB-агар, минимальная среда с глюкозой). При росте на агаризованной среде LB колонии округлые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.

Физиолого-биохимические признаки: клетки растут при 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Генетические признаки: F^- ompT hsdS_B(r_B ^- m_B ^-) gal dcm. Проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием генов устойчивости к антибиотику в ДНК рекомбинантной плазмиды pAS-2.

Условия хранения: штамм бактерий Е. coli BAS2 хранят на чашках и косяках при 4°С. Пересевы на свежие среды проводят один раз в месяц. Может храниться не менее одного года в среде LB, содержащей 30% глицерина, при -20-70°С.

Устойчивость к антибиотикам: клетки штаммов-продуцентов проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием генов устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pAS-2.

Преимуществом полученного бактериального штамма является обеспечение им высокой внутриклеточной стабильности гибридного полипептида проинсулина Aspart человека как следствие неактивного состояния в этих клетках бактериальных генов lon и ompT, кодирующих соответственно АТР-зависимую протеиназу и протеиназу внешней мембраны. В результате в клетках этого штамма отсутствуют продукты деградации рекомбинантных предшественников инсулина, затрудняющих их очистку, что сопровождается повышением выхода очищенного рекомбинантного белка, содержащего последовательность аналога проинсулина человека.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1. Получение фрагментов ДНК, кодирующих аминокислотную последовательность проинсулина Aspart человека.

80 нг плазмидной ДНК плазмиды pPINS07, содержащей ген природного проинсулина человека, используют в качестве матрицы для синтеза фрагмента А (фиг.3) в полимеразной цепной реакции (ПЦР), добавляя к 50 мкл реакционной смеси следующего состава: 20 мМ Трис-HCl рН 8,8, 67 мМ (NH₄)₂SO₄, 1,5 мМ MgCl₂, по 0,2 мМ dATP, dCTP, TTP и dGTP каждого, 0,5 ед. смеси Taq- и Pfu-ДНК-полимераз (в отношении 50/1 по активности), и для синтеза фрагмента ДНК, кодирующего последовательность проинсулина Aspart, по 1 мкМ каждого из праймеров CAGGATCATCACCATGGATCCCG и CACGACGGGTCTTGTCGGTGTAGAAG (праймеры 1 и 4 соответственно на фиг.3, в последовательностях праймеров подчеркнуты измененные нуклеотиды). В работе используют модифицированную моноклональными антителами (для имитации «горячего старта») термостабильную Taq-ДНК-полимеразу. Амплификацию соответствующего участка плазмиды осуществляют, проводя 20 циклов ПЦР (94°С, 20 с; 59°С, 20 с; 72°С, 20 с) на амплификаторе «Терцик» фирмы «ДНК-технология», Россия. Синтез фрагмента В (фиг.3) проводят в тех же условиях и в той же реакционной смеси, но в присутствии праймеров CCGCCAAGCTTACTAGTTGCAGTAG и ACACCGACAAGACCCGTCGTGAAGC (праймеры 2 и 3, фиг.3). Синтезированные фрагменты А и В очищают электрофоретически в 3% агарозном геле, перенося на кусочки ДЭАЭ-мембраны NA-45 (Schleicher&Schuhle), и элюируют в центрифужных микропробирках на 1,5 мл 200 мкл буфера, содержащего 1,5 М Nad, 10 мМ ЭДТА в течение 40 мин при 65°С. К буферу добавляют тРНК Е. coli до конечной концентрации 100 мкг/мл и синтезированные фрагменты осаждают 2,5 объемами 96% этилового спирта. Осадок собирают центрифугированием на микроцентрифуге «Эппендорф» при максимальных оборотах в течение 15 мин, супернатант отбрасывают, осадки промывают 1 мл холодного 70% этилового спирта, подсушивают при комнатной температуре и растворяют в 50 мкл деионизованной воды. Сборку необходимого фрагмента С (фиг.3) осуществляют с помощью ПЦР 2 в 25 мкл вышеописанной реакционной смеси, однако в отличие от нее содержащей по 1 мкл очищенных перекрывающихся фрагментов А и В в качестве матрицы, а также праймеры 1 и 2 (фиг.3, последовательности см. выше).

Пример 2. Подготовка экспрессирующего вектора для клонирования синтезированного фрагмента С.

3 мкг плазмиды pPINS07 инкубируют с эндонуклеазами рестрикции HindIII и BamHI, как описано выше, и образовавшийся большой фрагмент векторной ДНК, взятый для получения экспрессирующей плазмиды, электрофоретически отделяют от малого фрагмента с использованием легкоплавкой агарозы (1,5%) после чего электрофоретически его переносят в лунку, заполненную легкоплавкой агарозой, откуда выделяют фенольным методом [Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Перемещение фрагмента в агарозном геле контролируют в УФ-свете при 366 нм. После перехода требуемого фрагмента ДНК в легкоплавкую агарозу ее переносят в пробирку «Эппендорф» на 1,5 мл, содержащую равный объем ТЕ-буфера (10 mM Трис-HCl (рН 8,0), 1 mM ЭДТА), плавят в течение 5-10 мин при температуре 65°С, добавляют равный объем нейтрализованного фенола, перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 7 мин при 14000g. Супернатант переносят в чистую пробирку, содержащую 0,1 объема (от вносимого объема супернатанта) 4М LiCl, выдерживают 2 мин во льду, после чего центрифугируют в течение 3 мин. Векторную ДНК осаждают из верхней фазы 96% этанолом с тРНК в качестве носителя, промывают 70% спиртом и растворяют в 20 мкл деионизованной воды.

Пример 3. Получение плазмиды pAS-2, экспрессирующей гены гибридного проинсулина Aspart, и штамма-продуцента гибридного белка, содержащего последовательность проинсулина Aspart.

10 мкг большого фрагмента плазмиды pPINS07, содержащего липкие концы HindIII/BamHI, лигируют с 50 мкг очищенного С-фрагмента ДНК (фиг.3) с теми же липкими концами [Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Продукты реакции осаждают и промывают этиловым спиртом, как описано выше, и растворяют в 10 мкл воды; 5 мкл продуктов лигирования используют для трансформации компетентных клеток Е. coli BL21 методом электропорации в стандартных условиях. Суспензию трансформированных клеток (200 мкл) высевают на LB-агар, содержащий ампициллин (100 мкг/мл) в качестве селектирующего агента. При анализе плазмиды pAS-2 среди выросших колоний бактерий с помощью ПЦР в присутствии праймеров 1 и 2 (фиг.3) (последовательности см. выше) отбирают клоны, содержащие вставку клонируемого фрагмента С. Для этого образовавшиеся продукты ПЦР инкубируют с эндонуклеазой рестрикции MboII (Fermentas, Латвия) в условиях, рекомендуемых фирмой-производителем, и образовавшиеся фрагменты ДНК разделяют электрофорезом в 6% полиакриламидном геле. При наличии в анализируемой плазмидной ДНК мутации Aspart после рестрикции образуется только три фрагмента ДНК длиной 158, 67 и 51 п.о., так как один из трех сайтов рестрикции (центральный, фиг.3) содержащихся в этой части исходной плазмиды pPINS07, элиминируется под действием введенной мутации. Из клонов, содержащих требуемую мутацию, выделяют плазмидную ДНК стандартным фенольным методом [Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. // Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press] и последовательность нуклеотидов гена проинсулина Aspart определяют методом Сэнгера с использованием набора реактивов для секвенирования ThermoSequenase Cycle Sequencing Kit фирмы Amersham BioSciences (США). Электрофоретическое разделение продуктов секвенирования проводят с помощью автоматического секвенатора ALF Express II фирмы Amersham BioSciences (США). Строение плазмиды pAS-2 представлено на фиг.4.

Пример 4. Определение продуктивности штамма-продуцента гибридного белка, содержащего аминокислотную последовательность проинсулина Aspart человека.

В 20 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, вносят индивидуальную колонию клеток Е. coli BAS2 и выращивают при 37°С на качалке при 180 об/мин в течение 4 ч до мутности 0,8. Затем добавляют индуктор ИПТГ до конечной концентрации 0,5 мМ и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 6 ч. Отбирают пробу 2 мл и центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин, после чего клетки суспендируют в 200 мкл буфера, содержащего 125 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерина, 3% додецилсульфата натрия, 3% меркаптоэтанола и 0,01% бромфенолового синего, нагревают 10 мин на кипящей водяной бане. Отбирают аликвоты объемом 2,5, 5, 7,5, 10 и 15 мкл и анализируют электрофорезом в 13%-ном полиакриламидном геле, содержащем 0,1% додецилсульфат натрия. Гель окрашивают Кумасси R250 и сканируют на лазерном денситометре Ultrascan XL. По данным сканирования содержание соответствующего гибридного белка составляет не менее 25% суммарного клеточного белка бактериальных клеток анализируемого штамма-продуцента.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pAS-2, обеспечивающая в клетках Е. coli биосинтез гибридного белка, содержащего аминокислотную последовательность проинсулина Aspart человека, в котором последовательность домена В стафилококкового белка A Staphylococcus aureus соединена через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина Aspart человека с молекулярной массой 3,3 МДа (5051 п.о.), содержащая HindIII/BamHI-фрагмент плазмиды pPINS07, включающий гибридный tac-промотор, ген β-лактамазы (bla), область начала репликации (ori), терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli, последовательность нуклеотидов, кодирующую аминокислотную последовательность домена В белка A S. aureus, соединенную с последовательностью нуклеотидов, кодирующей пептид His₆GlySerArg, и HindIII/BamHI-фрагмент (271 п.о.), кодирующий проинсулин Aspart; уникальные сайты рестрикции со следующими координатами: EcoRI - 1, NcoI - 217, BamHI - 221, Hindlll - 492, SalGI - 4513, ClaI - 4792, и сайт рестрикции PstI с координатами 342 и 417.

2. Штамм бактерий Escherichia coli BAS2 - продуцент гибридного белка, в котором последовательность домена В стафилококкового белка А соединена через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина Aspart, полученный путем трансформирования клеток штамма бактерий Escherichia coli BL21 рекомбинантной плазмидной ДНК pAS-2 по п.1.