Способ оценки качества вакцин

Предлагаемое изобретение относится к области биологии и медицины. Для оценки качества живых вирусных вакцин используют раствор вакцины с вирусами и фрагментами их разрушения. При нанесении раствора вакцины на поверхность подложки проводят кратковременную инкубацию и сорбцию с сохранением нативной структуры компонентов вакцины. Осуществляют сканирование зоны измерения зондом в режиме сканирующего зондового микроскопа. Для анализа полученного изображения разделяют изображения компонентов вакцины на две группы, где первая группа содержит вирусы, а вторая - фрагменты их разрушения. Подсчитывают количество компонентов в каждой группе и определяют качество вакцины по соотношению площади (в %), занятой частицами второй группы, к общей площади сканирования. При этом оптимальной является площадь не более 45±5%. Использование способа позволяет повысить точность и достоверность определения эффективности вакцины. 9 з.п. ф-лы.

 

Предлагаемое изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано в качестве дополнительной процедуры при проведении стандартных мероприятий по надзору за качеством производства живых вирусных вакцин.

Способ основан на измерении размеров биологических объектов с помощью сканирующей зондовой микроскопии.

Вакцинация - самое эффективное и экономически выгодное средство предупреждения инфекционных болезней в современной медицине. Основной принцип вакцинации заключается в том, что пациенту дается ослабленный или убитый болезнетворный агент для стимуляции иммунного ответа против истинного возбудителя заболевания. Вакцины отличаются от других иммунобиологических препаратов сложностью состава, наличием патогенного материала, технологией изготовления, разнообразием механизмов действия на организм и необходимостью особого контроля за их безопасностью. Качество вакцины во многом определяется количеством специфического антигенного материала, способного активировать иммунную систему вакцинируемого [1, 2].

В целом производство вакцины состоит из следующих стадий: 1) промышленное производство партии вакцинного препарата; 2) проверка биологической активности новой партии; 3) лиофильная сушка и расфасовка по ампулам; 4) доставка в медицинские учреждения.

В ходе промышленного получения вакцин может происходить деградация «живых» (то есть полностью сформированных и готовых к воспроизведению) вирусных частиц. Именно они, при введении в организм вакцинируемого, ответственны за размножение вирусов и, в конечном итоге, активацию иммунного ответа. Поэтому перед использованием в медицинских учреждениях все партии вакцины проходят обязательную комплексную проверку на биологическую активность [3].

Известен и широко применяется способ оценки качества вакцины на основе определения титра цитопатогенного действия ТЦД50 вирусов культуральным методом [4]. Принцип метода пробы вакцины готовят в виде 10-кратных разведении на поддерживающей питательной среде и вносят в лунки содержащие чувствительные к данному вирусу клетки. Адсорбцию на клетках проводят в течение 1 часа при комнатной температуре или 30 минут при +37°С, после чего в пробирки вносят поддерживающую среду. После инкубации при комнатной температуре в течение 20 минут инфицированные культуры помещали в термостат для последующего культивирования при 37°С в атмосфере с 5% CO2. Результаты титрования учитывали в период между начиная с 3-его дня после инфицирования, когда появлялись отчетливые цитопатические изменения в монослое клеток инфицированных культур при отсутствии цитопатических явлений в контрольных неинфицированных культурах. Для подсчета титра вируса используют формулу Рида и Менча [4]. За титр вируса принимают вычисленное по статистической формуле Рида и Менча наибольшее его разведение, которое вызывает дегенерацию 50% зараженных этим разведением вируса культур клеток. Значение титра вируса выражается в условных единицах (ЦПД50/мл).

Определение специфической активности производимой вакцины с помощью титрования цитопатогенного действия вируса является достаточно трудоемким и продолжительным процессом. Этот метод занимает более 1 недели и не позволяет проводить дифференцировку серий вакцины с недопустимо низкими ТЦД50 до проведения дорогостоящих заключительных этапов производства - лиофильной сушки и упаковки вакцины в ампулы. При этом после обнаружения низкой биологической активности выбраковывается огромное количество вакцинного препарата. Экономические потери составляют миллионы рублей. В связи с этим разработка экспресс метода для оценки - состояния вирусных частиц в вакцине весьма актуальна.

Известен также способ оценки качества вакцины на основе метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленный на детекцию генетического материала вируса в образцах вакцины до проведения дорогостоящих процедур производства [5]. Этот метод занимает относительно небольшое время для анализа - сутки, обладает высокой чувствительностью и селективностью, а также имеет возможность проведения полуколичественного анализа.

Однако к основным недостаткам данного метода относится невозможность оценить состояние вирусных частиц и деградацию вирусного материала в вакцине, поскольку оценивается только наличие генетического материала вируса. Как уже отмечалось выше, одним из показателей наличия иммунологического активного материала в вакцине является наличие сформированных вирусных частиц, способных к размножению в организме вакцинируемого и в которых сохранены в неизменном виде антигенные детерминанты вируса.

Возможно также применение электронной микроскопии (ЭМ), позволяющей непосредственно визуализировать вирусные частицы в биологических препаратах [6, 7]. Однако метод ЭМ дорогостоящ, требует длительное время на приготовление и анализ образцов. Кроме того, при подготовке образцы подвергаются специальной обработке, фиксации, что вносит ряд ошибок в исследуемые структуры.

Известен способ детекции растворов с биологическими объектами, в частности токсичных белков [8], на основе сканирующей зондовой микроскопии, включающий взаимодействие антитоксичного моноклонального антитела с токсичным белком, образование и анализ размеров кластеров, а также выявление токсинных белков при превышении размеров кластеров над размерами токсичных белков, при этом как минимум на одной подложке иммобилизируют молекулы, по меньшей мере, одного антитоксичного моноклонального или поликлонального антитела с расстоянием между молекулами, превышающими их размеры, образуя при этом четыре тестовых поля, после этого первое тестовое поле оставляют в качестве эталонного, на второе тестовое поле наносят нейтральный раствор, на третье тестовое поле наносят раствор с молекулами, по меньшей мере, одного токсичного белка, а на четвертое тестовое поле наносят исследуемый раствор, инкубируют, после чего устанавливают, как минимум, одну подложку в сканирующий зондовый микроскоп и проводят последовательный анализ четырех тестовых полей, сканируя их и определяя размеры образовавшихся кластеров. При этом анализ четырех тестовых полей можно проводить в жидкой фазе, после удаления жидкости, в замороженном состоянии или после нанесения на них металлического покрытия. Существует также вариант, в котором поверхность подложек обрабатывают веществами, обеспечивающими ковалентную связь, повышающими адсорбцию или создающими поверхностный заряд. Возможно также воздействие ультразвука на подложки как перед иммобилизацией молекул, так и перед их анализом.

Недостаток указанного способа детекции растворов с биологическими компонентами заключается в недостаточной достоверности измерений, связанной с ограниченным набором приемов подготовки полей исследуемых объектов и ограниченных режимах исследований.

Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является создание эффективного способа оценки качества вакцин. Технический результат предложенного изобретения заключается в повышении достоверности определения эффективности вакцины за счет повышения достоверности детекции вирусных частиц.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе оценки качества вакцины, включающем подготовку поверхности подложки, нанесение раствора с биологическими объектами на поверхность подложки, фиксацию биологических объектов на поверхности подложки, сканирование зондом в режиме сканирующего зондового микроскопа зоны измерения с биологическими объектами на поверхности подложки и анализ полученного изображения, при этом в качестве раствора с биологическими объектами используют раствор вакцины с вирусами и фрагментами их деления, при нанесении раствора вакцины на поверхность подложки проводят кратковременную инкубацию и сорбцию с сохранением нативной структуры компонентов вакцины, анализ полученного изображения происходит следующим образом: разделяют изображения компонентов вакцины на две группы, содержащие в первой вирусы, а во второй - фрагменты их разрушения, подсчитывают количество компонентов в каждой группе и по отношению их количества в группах определяют качество вакцины.

Существуют варианты, в которых инкубацию проводят при повышенной температуре или при воздействии ультразвука. Возможен вариант, где сканирование зондом осуществляют в режиме атомно-силового микроскопа с переменными полями сканирования. Существуют также варианты, в которых после фиксации компонентов вакцины на поверхности подложки производят ее сушку, покрытие по меньшей мере одним тонким слоем проводящего материала и сканирование в режиме туннельного микроскопа или покрытие люминесцентным материалом и сканирование в режиме близкопольного оптического микроскопа. Кроме того, возможно осуществление сканирования в режиме измерения твердости, в режиме измерения модуля Юнга, в режиме измерения трения или в режиме измерения усилия сдвига компонентов вакцины на поверхности подложки.

Реализация предложенного способа осуществляется следующим образом. На свежеочищенную слюдяную подложку (определенного размера, например, 7×7 мм²) непосредственно наносят препарат вакцины в объеме примерно 10 мкл и проводят кратковременную инкубацию в течение 5 минут при комнатной температуре. В исследованиях был использован препарат живой коревой вакцины (ЖКВ), которая используется для профилактики кори в России. ЖКВ готовится методом культивирования аттенуированного штамма вируса кори Ленинград-16 (Л-16) на первичной культуре фибробластов эмбрионов японских перепелов [9]. ЖКВ готовится в соответствии с Фармакопейной статьей - ФС42-3092-94. При кратковременной инкубации происходит самопроизвольная сорбция вирусных частиц и вирусных фрагментов на подложку за счет ряда взаимодействий между белковым материалом вируса и гидрофильной, слабозаряженной поверхностью слюды. Для удаления несвязавшихся компонентов вакцины и остатков солей, затрудняющих последующий анализ, используют двухкратную отмывку деоионизованной водой. Наиболее общий случай исследований заключается в удалении жидкости с помощью очищенного сжатого воздуха или жидкого азота и последующего анализа поверхности подложки с помощью наиболее широко распространенного воздушного сканирующего зондового микроскопа (СЗМ) [10, 11]. Возможно проведение анализа в жидкой фазе с помощью жидкостных ячеек [12, 13].

Для анализа свойств компонентов вакцины для каждой серии вакцины подбирается концентрация таким образом, чтобы компоненты вакцины, а именно вирусные частицы и их фрагменты, располагались изолировано. Для этого используют несколько разведении в интервале от 1:1000 до 1:10 000 вакцинного материала.

После этого устанавливают подложку (подложки) с биологическими объектами в сканирующий зондовый микроскоп и, проводят последовательно сканирование площадей по известной методике [14]. Для сканирования выбирают центральную область подложки, чтобы избежать краевых эффектов при инкубации раствора вакцины на подложке.

Для определения размера выборки частиц, необходимых для проведения анализа, использовали вероятностный подход, который предполагает, что каждая частица имеет ненулевую вероятность включения в выборку [15]. В целом, для получения достоверных результатов по выборке необходимо провести измерения не менее 350 частиц. Для проведения измерений размеров частиц используют площади, порядка 1000×1000 нм². Такой размер площади позволяет оценивать размеры исследуемых частиц, находящихся в интервале от 15 до 200 нм с высокой степенью достоверности. Количество площадей, необходимых для анализа, определяется в каждом случае экспериментально на основе подсчета севших на слюду частиц. Площади для анализа выбираются случайным образом при исключении рядом расположенных площадей. Последнее проводится для того, чтобы исключить двойной обсчет одних и тех же частиц. При анализе размеров частиц первой группы (соответствующих размерам цельных вирусов) учитываются следующие факторы: 1) не подлежат обсчету частицы, слившиеся друг с другом; 2) не подлежат обсчету частицы, находящиеся на границе сканируемой площади. Трудности, вызванные наличием слившихся частиц, можно преодолеть, используя различные варианты инкубации вакцины на подложке, как-то: ковалентную модификацию, обработку ультразвуком, использованием гидрофобных агентов (см. ниже). Для того чтобы учесть частицы, находящиеся на границе сканируемой площади, предлагается использовать для повторного сканирования площадь большого размера, например, 1200×1200 нм².

Затем проводят анализ полученных данных. На основе геометрических размеров частицы разделяют на две группы. Первая соответствует популяции зрелых полностью сформированных вирусных частиц. Во вторую группу объединяют все остальные изображения, которые соответствуют различным фрагментарным обломкам вирусных частиц. Подсчитывают количество компонентов в первой группе с помощью программы "Grain analysis", проводящий количественный анализ изображений [13]. Именно данная группа в первую очередь является иммунологически активной и определяет качество вакцины. Было проведено сравнение нескольких серий вакцин. Все исследованные вакцины имели по данным ПЦР высокий титр 10^-4-10^-5, ЦТД50 находилось в пределах 4,37-5,04lg0,5 [5]. По результатам анализа с помощью СЗМ было показано, что количество цельных вирусных частиц в вакцинных препаратах должно составлять не менее 42±7 частиц на площади сканирования размером 1000×1000 нм². Количество частиц во второй группе является показателем повреждений или разборки вирусных частиц, а также наличия примесных белков. Поскольку эта группа представляет собой гетерогенную смесь частиц, отличающихся по размерам и формам, и, кроме того, нередко агрегированных друг с другом, обсчет этой группы частиц проводили другим образом: С помощью программы "Grain analysis" исключали из обсчета популяцию целых вирусных частиц и подсчитывали процентное соотношение площади, которую занимала популяция вторых частиц к общей площади сканирования. Оптимальной считалось площадь, которую занимают разрушенные фрагменты вируса, не более 45±5%. По отношению компонентов каждой группы проводили предварительную оценку качества вакцины.

Данный способ оценки качества вакцин применим также и для других живых вирусных вакцин, например паротитной, краснушной, полиомиелитной и др. Зная параметры вирусных частиц, можно путем измерений СЗМ оценить наличие сформированных цельных частиц вирусов и разрушенных фрагментов вирусов. Далее, сопоставив информацию о биологической активности данной вакцины, полученную другими методами (определение ЦТД 50, ПЦР анализ и др.), можно выработать критерий оценки вакцины с помощью СЗМ.

Существуют также варианты, в которых анализ качества вакцины осуществляют, как и в прототипе, с предварительной модификацией поверхности с созданием возможности ковалентной пришивки компонентов вакцины. Для этого используют вещества, которые создают на подложке слой вещества с активными группами. При внесении вакцины активные группы белков вирусных частиц связываются с активными группами на подложке и образуют прочные связи. Широко используемая методика химической модификации для стабилизации молекул на поверхности - это силанизация подложек [16]. Процесс силанизации существенно не изменяет топографических особенностей поверхности - она остается достаточно гладкой, в то же время улучшается связь макромолекулы с модифицированной подложкой. Процедура осуществляется следующим образом: образцы свежеочищенной слюды помещают в эксикатор в присутствии APTES (3-aminopropyl-triethoxysilane, FLUKA,) и DIPEA (N,N-Disopropylethylamine ACROS) и инкубируют в атмосфере аргона в течение 2 часов при комнатной температуре. При необходимости (если обнаружено значительная шероховатость, перепад высот) выравнивают слой APTES путем нагревания образцов при 120°С в течение часа. Для индукции активных связей обрабатывают силанизированные положки 1% глутаровым альдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре и затем отмывают 3 раза деионизованной водой. Затем вносят исследуемый раствор в фосфатно-солевом буфере на 15 минут, при этом аминогруппы белковых молекул связываются с активными группами подложки, образуя ковалентные связи. Для ковалентной модификации можно использовать методы тиол-дисульфидного обмена, введения спейсерных остатков, более подробно описанных в работах [17].

Возможна также модификация поверхности подложки, аналогично прототипу, поверхностно-активными гидрофобными веществами (ПАВ). В качестве ПАВ широко используют октодецил - аминофенилазобензосульфамид, который наслаивают на подложку методом формирования ленгмюровских пленок. Определенную дозу ПАВ растворяют в легколетучем растворителе (например, бензолгексане), впрыскивают смесь на водную поверхность, образуя разряженный мономолекулярный слой. Перенос пленки осуществляют обычно вертикальным способом (метод Ленгмюра-Блоджетт), пропуская подложку сквозь монослой, причем давление в пленке поддерживают постоянным путем сокращения площади пленки на водной поверхности подвижным барьером в процессе переноса монослоя. Более подробно указанный процесс описан в [18].

Возможен вариант инкубации вакцины на подложке при повышенной температуре -37°С. Это достигается подогревом предметного столика СЗМ, на котором размещены подложки с биологическими объектами.

Существует также вариант, в котором инкубация вакцины на подложке проводится при воздействии ультразвука путем возбуждения ультразвуковых колебаний пьезокерамическим элементом, сопряженным с измеряемым объектом [13].

Для проведения измерений можно использовать несколько режимов сканирующей зондовой микроскопии. Сканирование можно осуществлять в режиме атомно-силовой микроскопии с переменными полями сканирования, позволяющими более достоверно оценить количество компонентов второй группы. Осуществляется анализ следующим образом, при номинальном поле сканирования 1000×1000 нм², проводят предварительное сканирование поля 5000×5000 нм². С помощью программы "Grain analysis" определяют количество цельных вирусных частиц на поле 5000×5000 нм², затем выделяют поля 1000×1000 нм², содержащие минимальное количество вирусных частиц, и переходят к их сканированию. После сканирования подсчитывают по описанному выше алгоритму количество компонентов второй группы, а за количество компонентов первой группы принимают среднее количество частиц первой группы, подсчитанное на 5000×5000 нм² и разделенное на 25 (число площадей 1000×1000 нм² на площади 5000×5000 нм²).

Туннельный режим сканирования может отличаться от прототипа тем, что после фиксации компонентов вакцины на поверхности подложки производят ее сушку, покрытие несколькими слоями проводящего материала и последовательное сканирование в режиме туннельной микроскопии. Оптимальным режимом подготовки нанесенных на подложку вируссодержащих препаратов для наблюдения является покрытие препаратов пленкой электропроводящего материала (например, вольфрама, углерода или золота), придающей поверхности препаратов жесткость и электропроводность. Данная процедура позволяет скрыть мелкие фрагменты (привнесенную примесь) при покрытии первой пленкой и фрагменты вирусов при покрытии второй пленкой. После первого покрытия можно считать вирусы и фрагменты их деления, а после второго только вирусы.

Возможно, также после фиксации компонентов вакцины на поверхности подложки покрыть ее фотоактивным материалом и сканировать в режиме близкопольной оптической, микроскопии (БОМ). В качестве фотоактивных агентов можно использовать ряд флуоресцентных красителей: флуоресцеин 5 изотиоцианат (ФИТЦ), фикоэритрин, техасский красный, цианин 5.1. Они возбуждаются аргоновым лазером с длинной волны 488 нм, а излучают флуоресценцию в разных диапазонах волн: ФИТЦ - в зеленом, фикоэритрин - желто-оранжевом, техасский красный - красном, цианин 5.1-фиолетовом. Концентрацию веществ для обработки вакцины необходимо подбирать экспериментально по отношению полезного сигнала (связывания вирусного материала с красителем) к фоновому сигналу (неспецифическая окраска поверхности подложки). Селективность измерений в режиме БОМ можно существенно повысить, используя фотоактивные красители, аффинно взаимодействующие с компонентами вакцины. В качестве аффинных маркеров можно использовать конъюгаты антител с флуоресцентными красителями. Целесообразно использовать антитела к поверхностным белкам вируса кори: F-белку, Н-белку. В качестве маркеров, селективно связывающих с генетическим материалом вируса, можно использовать бромистый этидий.

Все вышеописанные методы оценки качества вакцин основывались на морфологических критериях, а именно на разнице в размерах, которые меняются в зависимости от степени «деградированности» вирусного материала в пробе вакцины. Преимущество использования зондовой сканирующей микроскопии в том, что помимо топографии образца, имеется возможность проводить измерения механических свойств образца за счет воздействия сканирующей иглой на образец. В зависимости от плотности упаковки вирусных частиц механические свойства частиц могут изменяться. Вирусная частица, как правило, представляет собой генетический материал, заключенный в защитный нуклеокапсид, окруженный в свою очередь внешней оболочкой. Наиболее плотными являются полностью сформированные «зрелые» вирусные частицы. В результате производства вирусных вакцин возможно нарушение целостности частиц и соответственно изменение их механических свойств. Таким образом, определяя механические свойства компонентов вакцины, можно проводить оценку качества вакцины. Режимы измерения твердости, измерения модуля Юнга, режимы трения и усилия сдвига компонентов вакцины на поверхности подложки проводят с использованием стандартных режимов зондовой микроскопии [19-22].

Предлагаемый патентом способ оценки позволяет быстро и эффективно определять наличие сформированных вирусных частиц в вакцинных препаратах и может быть рекомендован для использования в качестве дополнительной процедуры при прохождении стандартных мероприятий по оценке качестве живых вакцин. Целесообразно использовать для проверки методом СЗМ вакцинный препарат на стадии, предшествующей проверке биологической активности. Это будет способствовать значительной экономии, поскольку позволяет избежать дорогостоящих этапов производства вакцины. Дополнительными аспектами применения данного патента могут быть проверки качества вакцины не только во время производства, но и при длительном хранении. Отличительной особенностью живых вакцин является то, что они легкочувствительны к действию высоких температур и требуют неукоснительного соблюдения холодовой цепи. При неправильном хранении может происходить деградация иммунологического активного материала.

Кратковременная инкубация и сорбция с сохранением нативной структуры компонентов вакцины за счет повышенного сохранения компонентов вакцины повышает достоверность оценки качества вакцины.

Инкубация вакцины при повышенной температуре повышает скорость движения компонентов вакцины в инкубационной смеси, способствует сокращению времени инкубации вирусных частиц на подложку, повышает вероятность инкубации и достоверность измерений.

Обработка ультразвуком вакцины позволяет избавляться от агрегатов вирусных частиц, которые могут образовываться при приготовлении вакцины. Такие агрегаты, содержащие вирусные частицы и их фрагменты, на подложке выглядят как слившиеся частицы большого размера и это делает невозможным визуализацию отдельных частиц. Таким образом, обработка ультразвуком при инкубации вакцины на подложке в значительной степени влияет на качество получаемого препарата для анализа частиц, пригодного для анализа, и повышает достоверность полученных данных.

Использование режима АСМ будет отличаться от прототипа использованием различных полей, что позволяет проводить измерения мелких фрагментов на полях с минимальным количеством крупных частиц (вирусов). Это также повышает достоверность полученных данных.

Использование проводящих покрытий позволяет исследовать в туннельном режиме крупные структуры, исключая мелкие структуры и привнесенную примесь. Это достигается за счет сравнивания мелких объектов под слоем проводящего материала, что невозможно в прототипе, в котором размеры исследуемых частиц на порядок ниже и соответственно более толстое покрытие будет скрывать мелкие фрагменты. Кроме того, покрытие слоем проводящего материала придает дополнительную жесткость и позволяет избежать возможной деформации биомолекул, которая может проходить в результате взаимодействия образца с острием.

Использование режима БОМ за счет возможности исследования плоских объектов повышает достоверность и чувствительность измерений. Более того, с использованием селективных флуоресцентных красителей можно проводить количественные измерения определенных вирусных белков, генетического материала вирусов.

Режимы измерения твердости, измерения модуля Юнга, силы трения и усилия сдвига позволяют распознавать среди частиц с размерами вирусов привнесенную примесь, повышая при этом достоверность измерений.

ЛИТЕРАТУРА

1. Н.В.Медуницын, "Вакцинология". - М.: Триада, 1998.

2. Роит «Иммунология». - Мир, 2000.

3. Постановление от 18 апреля 2003 г. №60 Министерства Здравоохранения Российской Федерации // О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 3.3.2.1288-03

4. Пшеничнов В.А., Б.Ф.Семенов, Е.Г.Зезеров. В кн.: Стандартизация методов вирусологических исследований. - М.: Медицина, 1974, 123-128

5. Зайцев И.З, Колышкин В.М., Юминова Н.В., Ведяков А.М., Потехин О.Е., Сидоренко Е.С., Тоневицкий А.Г. // Детекция РНК вируса кори в образцах коревой вакцины методом полимеразной цепной реакции. // Биотехнология, 2001, 1, С.76-82.

6. Chiu W., Baker M.L., Jiang W., Dougherty M., Schmid M.F. // Electron cryomicroscopy of biological machines at subnanometer resolution. // Structure (Camb). 2005 Mar; 13(3): 363-72. Review.

7. Chiu W., Rixon FJ. // High resolution structural studies of complex icosahedral viruses: a brief overview. // Virus Res. 2002, Jan, 30; 82(1-2): 9-17.

8. Положительное решение по заявке №2003121587 от 16.07.03 на патент «Способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии»

9. http://www.bio.ru/vcor.htm.

10. В.А. Быков и др. // Зондовая сканирующая микроскопия для биологии и медицины // Сенсорные системы, 1998 т.12, стр.99-121.

11. А.И.Данилов // Сканирующая туннельная и атомно-силовая микроскопия в электрохимии поверхности. // Успехи химии, 1995, т.64, стр.818-833

12. патент RU 2210818 от 20.08.03.

13. http://www.ntmdt.ru.

14. Maliuchenko N.V., Agapov I.I., Tonevitskii A.G., Moisenovich M.M., Savvateev M.N., Tonevitskii E.A., Bykov V.A., Kirpichnikov M.P.. // Detection of immune complexes using atomic force microscopy. // Biofizika. 2004 Nov-Dec; 49(6): 1008-14. Russian.

15. С.Гланц // Медико-биологическая статистика. // М.: Практика, 1999.

16. Hu, М.Wang, H.-U.G.Weier, P.Frantz, W.Kolbe, D.F.Ogletree and M.Salmeron, Imaging of single extended DNA molecules on flat (aminopropyl)triethoxysilanemica by atomic force microscopy. // Langmuir, - 1996, - v.12, - No 7, - pp.1697-1700.

17. E.Pavlovic // Spatially Controlled Covalent Immobilization of Biomolecules on Silicon Surfaces. // Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Science and Technology, ISSN 1104-232X; 867.

18. Блинов Л.М. Успехи химии, 1983, 52, 1263.

19. Jandt K.D. // Atomic Force Microscopy of Biomaterials Surfaces and Interfaces // Surface Science, Volume 491, Issue 3, 1 October 2001, p 303-332

20. Caron A.; Rabe U.; Reinsädtler M.; Turner J.; Arnold W. // Imaging using lateral bending modes of atomic force microscope cantilevers. // Applied physics letters 85 (2004), Nr.26, P.6398-6400

21. Reinstaedtler M.; Rabe U.; Scherer V.; Hartmann U.; Goldade A.; Bhushan В.; Arnold, W. // On the nanoscale measurement of friction using atomic-force microscope cantilever torsional resonances // Applied physics letters 82 (2003), Nr.16, S.2604-2606.

22. Rabe U.; Amelio S.; Kopycinska M.; Hirsekom S.; Kempf M.; Güken M.; Arnold W., // Imaging and measurement of local mechanical material properties by atomic force acoustic microscopy. // Surface and Interface Analysis 33 (2002), p.65-70.

1. Способ оценки качества живых вирусных вакцин, включающий подготовку поверхности подложки, нанесение раствора с биологическими объектами на поверхность подложки, фиксацию биологических объектов на поверхности подложки, сканирование зондом в режиме сканирующего зондового микроскопа зоны измерения с биологическими объектами на поверхности подложки и анализ полученного изображения, отличающийся тем, что в качестве раствора с биологическими объектами используют раствор вакцины с вирусами и фрагментами их разрушения, при нанесении раствора вакцины на поверхность подложки проводят кратковременную инкубацию и сорбцию с сохранением нативной структуры компонентов вакцины, анализируют полученное изображение, для чего разделяют изображения компонентов вакцины на две группы, содержащие в первой группе вирусы, а во второй - фрагменты их разрушения, подсчитывают количество компонентов в каждой группе и определяют качество вакцины по соотношению площади (в %), занятой частицами второй группы, к общей площади сканирования, при этом оптимальной является площадь не более 45±5%.

2. Способ оценки качества вакцины по п.1, отличающийся тем, что инкубацию проводят при повышенной температуре.

3. Способ оценки качества вакцины по п.1, отличающийся тем, что инкубацию проводят при воздействии ультразвука.

4. Способ оценки качества вакцины по п.1, отличающийся тем, что сканирование зондом осуществляют в режиме атомно-силового микроскопа с переменными полями сканирования.

5. Способ оценки качества вакцины по п.1, отличающийся тем, что после фиксации компонентов вакцины на поверхности подложки производят ее сушку, покрытие по меньшей мере одним слоем проводящего материала и сканирование в режиме туннельного микроскопа.

6. Способ оценки качества вакцины по п.1, отличающийся тем, что после фиксации компонентов вакцины на поверхности подложки производят ее сушку, покрытие люминесцентным материалом и сканирование в режиме близкопольного оптического микроскопа.

7. Способ оценки качества вакцины по п.1, отличающийся тем, что сканирование осуществляют в режиме измерения твердости.

8. Способ оценки качества вакцины по п.1, отличающийся тем, что сканирование осуществляют в режиме измерения модуля Юнга.

9. Способ оценки качества вакцины по п.1, отличающийся тем, что сканирование осуществляют в режиме измерения трения.

10. Способ оценки качества вакцины по п.1, отличающийся тем, что при сканировании измеряют усилие сдвига компонентов вакцины по поверхности подложки.