Способ получения сибиреязвенного протективного антигена

Авторы патента:

Меновщиков Виктор Алексеевич (RU)

Боровской Денис Витальевич (RU)

Хапаев Николай Геннадьевич (RU)

Лобастов Владимир Сергеевич (RU)

Шевцов Александр Николаевич (RU)

A61K39/07 - бациллы

Владельцы патента RU 2340356:

Федеральное государственное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает культивирование вакцинного штамма на стерильной питательной среде с бикарбонатом натрия. При этом бикарбонат натрия вводят в питательную среду на протяжении экспоненциальной фазы роста на 6-8 ч культивирования вакцинного штамма. После окончания процесса культивирования выделение, концентрирование и стерилизацию протективного антигена осуществляют на одной установке ультра- и микрофильтрации. Способ обеспечивает стабильное получение нативного сибиреязвенного протективного антигена с активностью в РДП более 100 ЕА·мл^-1, а также сокращение времени и стадий получения стерильного концентрированного протективного антигена с активностью в РДП не менее 200 ЕА·мл^-1. 3 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к технологии получения сибиреязвенного протективного антигена (ПА), в частности к сибиреязвенным вакцинам, и может быть использовано в медицине и ветеринарии для специфической профилактики сибирской язвы.

Изобретение позволяет воспроизводимо получать нативный ПА с активностью в реакции диффузионной преципитации (РДП) в геле более 100 ЕА·мл^-1, сократить время и количество технологических стадий получения стерильного концентрированного ПА.

Сибиреязвенный ПА используется для получения двух видов вакцин: сибиреязвенной очищенной адсорбированной химической и комбинированной жидкой и сухой (одним из компонентов которых он является), по иммунологическим и физико-химическим показателям, удовлетворяющим требования, предъявляемые национальным органом контроля медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) к этим вакцинам.

Известен способ получения сибиреязвенного ПА при глубинном анаэробном культивировании штамма B.antracis на питательной среде, содержащей бикарбонат натрия при аэрировании культуральной жидкости инертным газом(патент RU 2223114 C2, 10.02.2004). Данный способ используется при приготовлении вакцины сибиреязвенной очищенной адсорбированной химической жидкой, включающем в себя следующие стадии:

приготовление маточной посевной культуры производственного штамма СТИ-1;

приготовление производственной питательной среды;

получение нативной культуры штамма СТИ-1;

получение нативного ПА;

получение стерильного ПА, включающее сепарирование нативного ПА на сепараторе SA-1-02-575, концентрирование на установке УФУ-4,0, грубую, тонкую и стерилизующую фильтрацию через бумажный фильтр «синяя лента», фильтрующие мембраны МФА №2 и МФА №1;

сорбцию стерильного концентрированного ПА на геле гидроокиси алюминия;

стабилизацию раствором формалина и отмывку сорбированного ПА;

разведение сорбированного концентрированного ПА, розлив;

контроль качества полученного сорбированного концентрированного ПА.

Недостатком вышеуказанного способа является низкая воспроизводимость при получении нативного ПА в ферментерах с требуемой активностью ПА в реакции диффузионной преципитации 100 ЕА·мл^-1 и более. Кроме того, при выделении ПА из культуральной жидкости используется метод сепарирования, который по времени более длителен и имеет следующие недостатки (Отчет о НИР. Совершенствование технологии производства химической сибиреязвенной вакцины - Арх. Вч 23527 - инв. №30353, 1997. - С.28):

сложность эксплуатации (вибрация, шум, необходимость разборки и мойки) аппарата;

воздействие на микробную культуру центробежной силы, перепада давления и гидродинамического удара;

отсутствие герметизации и обеспечения асептических условий ведения процесса.

Кроме того, известно, что при выращивании микробной популяции вакцинного сибиреязвенного штамма СТИ-1 в присутствии бикарбонат-иона, добавляемого в момент начала культивирования, нарастает доля клеток со структурными поломками гена pag в условиях несбалансированного роста (Sirard J.C., Mocr М., Fonet A. Tne three Bacillus anthracis taxin genesare coordinately regulated by bicarbonate and temperature. / J. Bacterid / - 1962/ - vol.52, p.632-645), что отрицательно сказывается на продукции антигена.

Задачей изобретения является стабильное получение нативного сибиреязвенного ПА с высокой активностью, сокращением времени получения стерильного концентрированного ПА с высокой активностью.

Поставленная задача решается изменением момента введения раствора бикарбоната натрия в процессе культивирования и получением стерильного концентрированного ПА методом ультра- и микрофильтрации.

Возможность практического использования заявляемого изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Изменение времени введения индуктора синтеза ПА-раствора бикарбоната натрия (NaHCO₃).

Известно, что при выращивании микробной популяции вакцинного сибиреязвенного штамма СТИ-1 в присутствии бикарбонат-иона, добавляемого в момент начала культивирования, нарастает доля клеток со структурными поломками гена pag в условиях несбалансированного роста (Sirard J.C., Mocr M., Fonet A. Tne three Bacillus anthracis taxin genesare coordinately regulated by bicarbonate and temperature. / J. Bacterid / - 1962 / - vol.52, p.632-645).

Для уменьшения отрицательного влияния на развитие микробной культуры в начальной фазе роста, вызываемого присутствием в ПС бикарбоната натрия, целесообразно введение индуктора (NaHCO₃) синтеза ПА в динамике культивирования на 6...8 час роста, что контролируется содержанием глюкозы в среде и значением рН культуральной жидкости. Бикарбонат натрия активирует экспрессию гена рад, детерминирующего синтез ПА, на поздней лаг-фазе и протяжении экспоненциальной фазы роста.

Динамика развития микробной популяции вакцинного сибиреязвенного штамма и накопления ПА по существующему способу (на основании пяти циклов ферментации) технологии представлены в таблице 1, по заявляемому способу в таблице 2 (на основании 10 циклов ферментации).

Как видно из результатов, представленных в таблицах 1 и 2, введение бикарбоната натрия на 6 часов культивирования по заявляемому способу технологии в отличие от существующего способа благоприятно сказывается на продукции ПА, антигенная активность которого к 12 часам культивирования выходит на регламентируемый показатель 100 ЕА·мл^-1, а к 19 часам роста антигенная активность возрастает до 200 ЕА·мл^-1 и сохраняется на этом уровне до окончания процесса культивирования.

Пример 2. Выбор эффективного оборудования в процессе получения стерильного концентрированного ПА.

Использование ультра- и микрофильтрационной установки «Сартокон» в технологическом процессе выделения, стерилизации и концентрирования ПА дает возможность:

проводить технологический процесс в асептических условиях;

осуществлять стерилизацию оборудования химическим и термическим способами и их сочетанием, что соответствует требованиям GMP;

быстро заменять фильтрующие элементы в случае их выхода из строя во время проведения технологического процесса благодаря модульной системе фильтров установки «Сартокон».

Заявляемый способ получения стерильного концентрированного ПА с использованием установки «Сартокон» при проведении процесса микро- и ультрафильтрации уменьшает количество стадий с 6 до 2, сокращает время выделения ПА из культуральной жидкости и всего цикла в целом по сравнению с существующим способом и включает в себя:

выделение ПА из культуральной жидкости и одновременную его стерилизацию;

концентрирование стерильного ПА.

Технологические характеристики проведения процесса концентрирования ПА по существующему и заявленному способам технологии представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, применение микро- и ультрафильтрационной установки «Сартокон» по заявленному способу в значительной степени уменьшает время выделения ПА из культуральной жидкости и всего технологического процесса в целом по сравнению с существующим способом технологии.

Таблица 1
Динамика развития микробной культуры по существующему способу, n=5
Определяемый показатель	Время выращивания, ч
0	9	12	15	18	20
рН, ед. рН	8,4	8,1	7,7	7,6	7,4	7,0
Биомасса, ед. экс.	60	250	280	350	560	1300
Утилизация глюкозы, %	0	5	18	28	43	68
Антигенная активность в РДП, ЕА. мл^-1	0	25	25	25...50	25...50	25...100

Таблица 2
Динамика развития микробной культуры по заявляемому способу, п=10
Определяемый показатель	Время выращивания, ч
0	6	12	19
рН, ед. рН	7,7	7,2/7,9*	7,6	7,4
Биомасса, ед. экс.	75	650	1480	1860
Утилизация глюкозы, %	0	16	79	100
Антигенная активность в РДП, ЕА. мл^-1	0	0	50...100	100...200
Примечание: * - значение рН культуры до и после внесения бикарбоната натрия.

Таблица 3
Временные характеристики технологического процесса по существующему и заявляемому способу, n=3
Стадии технологического процесса по существующему способу	Время проведения процесса по существующему способу, мин	Стадии технологического процесса по заявляемому способу	Время проведения процесса по заявляемому способу, мин
Выделение ПА из культуральной жидкости методом сепарирования на «Westfalia» SA-02-575	90±10	Выделение ПА из нативной культуры и одновременная его стерилизация методом микрофильтрации на установке «Сартакон-2»	40±10
Концентрирование нативного ПА на установке УФС -0,4	90±20	Концентрирование стерильного ПА методом ультрафильтрации на установке «Сартакон-2».	40±10
Грубая фильтрация (колба Бунзена)	120±10	отсутствует	отсутствует
Тонкая фильтрация, фильтр МФА-А №2	60±10	отсутствует	отсутствует
Стерилизующая фильтрация, фильтр МФА-А №1	60±10	отсутствует	отсутствует
Общее время проведения по существующему способу составляет 420±20 минут	Общее время проведения заявляемого способа составляет 80±10 минут

Способ получения сибиреязвенного протективного антигена, включающий культивирование вакцинного штамма на стерильной питательной среде с бикарбонатом натрия, отличающийся тем, что бикарбонат натрия вводят в питательную среду на протяжении экспоненциальной фазы роста на 6-8 ч культивирования вакцинного штамма, а после окончания процесса культивирования выделение, концентрирование и стерилизацию протективного антигена осуществляют на одной установке ультра- и микрофильтрации.

Белки, вызывающие измененную иммуногенную реакцию, и способы их получения и использования // 2311458

Изобретение относится к биотехнологии и касается варианта белка субтилизина Bacillus amyloliguefaciens с заменой Y217L, содержащий Т-клеточный эпитоп, при этом указанный Т-клеточный эпитоп указанного варианта включает одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из остатков, соответствующих положениям 76, 79 и 122, где указанный вариант субтилизина необязательно имеет замену в одном или нескольких из положений 3, 31, 40, 41, 46, 47, 48, 50, 76, 101, 104, 107, 111, 128, 147, 154, 181, 182, 183, 185, 206, 215, 216, 218, 238, 247, 248, 250, 254, 258, 262.

Способ получения нетоксичной противосибиреязвенной вакцины // 2287581

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности производству вакцин. .

Ассоциированная вакцина против сибирской язвы и чумы крупного рогатого скота // 2286173

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Иммуногенный полипептид, вызывающий защитный иммунный ответ против bacillus anthracis (варианты), способ его получения, нуклеиновая кислота, кодирующая его, вектор для экспрессии (варианты), способ и вакцина для предупреждения инфекции, вызванной bacillus anthracis // 2270865

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии. .

Способ получения иммунной сыворотки к антигенам вирулентного штамма bacillus anthracis // 2252031

Изобретение относится к медицинской микробиологии. .

Способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена // 2230570

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для изучения антигенной структуры сибиреязвенного микроба и идентификации различных генотипов В.anthracis.

Комбинированная вакцина против сибирской язвы животных // 2220742

Изобретение относится к ветеринарной биологии и иммунологии, в частности к производству и применению биологических препаратов для вакцинации животных. .

Способ комплексной профилактики сибирской язвы // 2216349

Изобретение относится к медицине, к инфекционным болезням и может быть использовано для комплексной профилактики сибирской язвы. .

Глобулин противосибиреязвенный лошадиный сухой // 2214836

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для стабилизации физико-химических и иммунобиологических свойств глобулина противосибиреязвенного.

Способ иммунопрофилактики экспериментального мелиоидоза инкапсулированными антигенами burkholderia pseudomallei // 2373955

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии и иммунологии, и может быть использовано для иммунопрофилактики мелиоидоза

Способ повышения протективности мелиоидозных антигенов цитокинами // 2376031

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии и иммунологии, и может быть использовано при разработке вакцины против мелиоидоза

Способ получения диагностического сибиреязвенного аллергена // 2415941

Изобретение относится к технологии производства диагностического препарата, необходимого для здравоохранения и ветеринарии при оценке напряженности противосибиреязвенного иммунитета и диагностики инфекции у лиц, привлекаемых к работам с возбудителем сибирской язвы

Ассоциированная вакцина для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных // 2480237

Изобретение относится к области ветеринарии и биотехнологии и касается получения ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных

Вакцина для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных и способ получения ее // 2524430

Изобретение касается вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных и способа ее получения. Представленная вакцина содержит инактивированный формалином лейкоцидин - экзотоксин, полученный из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, 1-10% инактивированной бактериальной массы из указанного штамма с содержанием 7,0-7,7 млрд клеток в 1 см3, глицерин и смесь минерального масла «Маркол-52» и эмульгатора, взятых в весовых соотношениях 1:(0,9-1,1), а также суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ в физиологическом растворе и адъювант. Способ получения вакцины включает культивирование штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, инактивирование его формалином, отделение бактериальной массы от культуральной жидкости центрифугированием, выделение из культуральной жидкости экзотоксина - лейкоцидина, его очистку и концентрирование ультрафильтрацией на полых волокнах, добавление суспензии живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и сапонина, а также добавление 1-10% инактивированной бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, глицерина и смеси минерального масла «Маркол-52» и эмульгатора. Представленные изобретения позволяют получить вакцину, обеспечивающую устойчивый иммунитет. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 7 пр., 1 табл.

Аттенуированный штамм bacillus anthracis для разработки средств специфической профилактики сибирской язвы // 2544951

Изобретение относится к области биохимии, в частности к бескапсульному природно-ослабленному штамму Bacillus anthracis. Штамм В. anthracis 363/11 депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №363. Штамм предназначен для разработки средств специфической профилактики сибирской язвы. Изобретение позволяет расширить спектр защитного действия, увеличить иммуногенность, уменьшить иммунизирующую дозу и реактогенность вакцинного штамма против сибирской язвы. 5 табл., 5 пр.

Иммунобиологическое средство для лечения рака мочевого пузыря и способ его использования // 2555327

Группа изобретений относится к медицине и касается иммунобиологического средства для лечения рака мочевого пузыря на основе вакцины БЦЖ, включающего фрагмент пептидогликана, содержащий в своей структуре диаминопимелиновую кислоту. Группа изобретений также касается способа использования указанного иммунобиологического средства для лечения рака мочевого пузыря. Группа изобретений обеспечивает увеличенную противоопухолевую активность. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 пр., 5 ил., 4 табл.

Иммунобиологическое средство для терапии рака мочевого пузыря на основе бцж и способ его использования // 2571822

Группа изобретений относится к медицине и касается иммунобиологического средства для лечения рака мочевого пузыря на основе БЦЖ, дополнительно содержащего фермент или ферменты с обеспечением расщепления секрета слизистой оболочки мочевого пузыря и буфер, взятые в терапевтически эффективном соотношении. Группа изобретений также касается способа использования иммунобиологического средства для лечения рака мочевого пузыря, заключающегося во введении указанного иммунобиологического средства в мочевой пузырь. Группа изобретений обеспечивает увеличение эффективности проникновения БЦЖ в клетки слизистого слоя мочевого пузыря. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 9 пр., 5 ил., 7 табл.

Днк-конструкция, кодирующая модифицированный вариант протективного антигена bacillus anthracis // 2622085

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к искусственному гену, позволяющему экспрессировать в клетках бактерий изолированный домен 1 протективного антигена PAG из Bacillus anthracis 55-ВНИИВВиМ. Указанный ген предназначен для введения в хромосому бацилл в составе особой ДНК-конструкции. Изобретение позволяет усовершенствовать метод получения протективного антигена возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis – основного антигена, необходимого для создания средств вакцинопрофилактики и диагностики сибиреязвенной инфекции у человека и животных. 2 ил., 3 пр.

Штамм e.coli - продуцент полноразмерного протективного антигена bacillus anthracis в форме вирусоподобных частиц // 2633504

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма E. coli, являющегося продуцентом антигена возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis. Представленный штамм получен на основе протективного антигена Bacillus anthracis путем введения в штамм E. coli BL21 (DE3) плазмиды pGEM-TTPPAG. Плазмида pGEM-TTPPAG содержит в своем составе промотор фага Т7, который контролирует экспрессию слитого гена, представляющего собой полноразмерный ген ТТP бактериофага DT57C (кодирует белок трубки хвоста pb6), слитый через 3’-конец с геном протективного антигена B. anthracis, и экспрессирующегося в форме вирусоподобных частиц. Изобретение обеспечивает выход целевого продукта в оптимальных условиях культивирования не ниже 1 г/л культуры, а также позволяет получить основной защитный антиген возбудителя сибирской язвы B. anthracis в форме вирусоподобных частиц (ВПЧ), имеющих размер 225,4 нм, что облегчает его очистку и потенциально повышает иммуногенность. Полученные ВПЧ, свободные от растворимого клеточного белка, могут использоваться в качестве антигена для иммунизации. 5 ил., 3 табл.