Мутант вируса инфекционной бурсальной болезни (ibdv), экспрессирующий вирус-нейтрализующие эпитопы, специфичные для классического и вариантного штаммов ibdv

Изобретение относится к области вирусологии. Штамм экспрессирует белок VP2, который связывается с моноклональным антителом moab B69 и moab 67, секретируемыми гибридомными клеточными линиями НВ-9437 и НВ-11122. Содержит мутацию кодирующей области классического VP2 в положении 222, кодирующий серин или треонин, и нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID No. 1-5 в положении 318-323. Предложены также способ получения такого штамма, вакцины его содержащей и способ ее получения. Изобретение может быть использовано для вакцинации против инфекционной бурсальной болезни (IBDV). 6 н. и 18 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл.

 

Настоящее изобретение относится к мутанту классического вируса инфекционной бурсальной болезни (IBDV) и вакцине, включающей в себя мутант классического IBDV.

Вирус инфекционной бурсальной болезни (IBDV) является членом семейства Birnaviridae. Вирусы этого семейства имеют достаточно простую геномную организацию и сходный цикл репликации. Геномы этих вирусов содержат два сегмента (A и B) двунитевой (ds) РНК. Больший сегмент A кодирует полипротеин, расщепляемый посредством автопротеолиза с образованием зрелых вирусных белков VP2, VP3 и VP4. VP2 и VP3 являются главными структурными белками вириона. VP2 представляет собой главный иммуноген бирнавирусов, защищающий от хозяина и содержащий иммуногенные области, ответственные за индукцию вирус-нейтрализующих антител.

У IBDV известны два серотипа, обозначенные 1 и 2. Эти серотипы различают с помощью вирус-нейтрализующих (VN) тестов. Установлено, что вирусы серотипа 1 являются патогенными для кур, тогда, как IBDV серотипа 2 вызывает лишь подострое заболевание индеек. Инфекционная бурсальная болезнь (IBD), также известная как болезнь Гамборо, является острым, высококонтагиозным вирусным заболеванием кур. Первичной мишенью инфекции является лимфоидная ткань с селективным тропизом для клеток фабрициевой сумки. Скорость распространения болезни в восприимчивых стаях птиц является высокой, сопровождается быстрой потерей массы тела и повышением коэффициента смертности от среднего значения до высокого. Выздоровевшие после этой болезни птицы характеризуются иммунодефицитом, вызванным разрушением фабрициевой сумки, которая играет важную защитную роль у кур. IBD-вирус вызывает тяжелую иммунносупрессию у молодняка кур в возрасте менее 3 нед и индуцирует повреждение фабрициевой сумки у кур в возрасте до 3 мес.

В течение многих лет заболевание предотвращали путем индукции высокого уровня антител у птиц-производителей посредством введения инактивированной вакцины курам, примированным аттенуированной живой IBDV-вакциной, что сводило экономические потери, вызванные IBD, к минимуму. Материнские антитела у кур, происходящих от вакцинированных особей-производителей, предотвращали раннее инфицирование IBDV и противодействовали развитию иммуносупрессии. Кроме того, аттенуированные живые вакцины успешно применяли при промышленном разведении птицы после снижения уровня активности материнских антител.

Исторически IBD-вирусы относят исключительно к одному типу, известному как «классический» IBD-вирус. Однако в США в середине 1980-х гг. зарегистрировали острую вспышку заболевания в стаях птиц, вакцинированных вакцинами на основе классического IBDV. Установлено, что заболевание вызвано IBD-вирусами, имеющими отличающийся от классического иммуногенный состав. Эти новые вирусы появились, возможно, в результате генетического дрейфа. Возникновение так называемых «вариантных» штаммов IBDV привело к необходимости создания новых программ IBD-вакцинации, так как классические вакцинные штаммы на основе IBDV не индуцировали адекватную перекрестную защиту. Наиболее важными вариантными подтипами серотипа 1 IBDV, идентифицированными ранее, были варианты Delaware-E, GLS, RS/593 и DS326. Идентификация этих вариантных штаммов и выявление их отличий от классических штаммов проведено с помощью вирус-нейтрализующего теста, панели с моноклональными антителами или полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Вариант Delaware-E обнаружен Rosenberger с сотр. (Proc. 20^th Natl. Meet. on Poultry Health and Condemnations; Ocean City, MD, USA, 94-101, 1985) и Snyder с сотр. (Avian Diseases 32, 535-539, 1985). Вирус GLS выделен в США в 1987 г., DS326 (GLS-подобный вирус) - в США в 1988 г. (Snyder с сотр., Arch. Virol. 127, 89-101, 1992, van Loon с сотр., Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia, Rauischholzhausen, Germany, 179-187, 1994). Штамм RS/593 (подобный варианту-E) также выделен в США в 1993 г. (Snyder с сотр.,Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia, Rauischholzhausen, Germany, 65-70, 1994).

Панель с вирус-нейтрализующими моноклональными антителами (moab) обычно используют в иммуноферментном анализе (AC-ELISA), основанном на захвате антигена, с целью идентификации различных типов IBDV. Паттерн иммунореактивности moab с существующими штаммами IBDV суммирован в таблице 1.

Таблица 1 Различные варианты штаммов IBDV, идентифицированные с помощью паттерна панели moab
Штамм↓/moab→	8	В69	R63	10	BK9	67	57	44A1	179
Классический	+	+	+	+	-	-	-	+	+
Вариант Delaware-E	+	-	+	-	+	+	-	+	+
RS/593	+	-	-	-	-	+	-	-	+
GLS	+	-	-	+	-	-	+	+	+
DS326	+	-	-	+	-	-	+	+	-

VN moab R63 и B69 нейтрализуют классические штаммы IBDV в высоких титрах, а moab B69 специфически связывается с классическими штаммами. moab BK9 связывается исключительно со штаммами варианта Delaware-E. Позитивную реакцию с moab 57 используют для разделения штаммов GLS и DS326 от классического штамма и вариантного штамма Delaware. Эти и другие moab обычно используют для различения вариантных штаммов IBDV путем определения паттерна реакции для панели с имеющимися moab. Гибридомы, секретирующие moab, доступны в ATCC (Rockville, США) под следующими инвентарными номерами: R63 (HB-9490), 8 (HB-10174), B29 (HB-9746), BK-9 (HB-10157), 67 (HB-11122), 57 (HB-10156), B69 (HB-9437) и 179 (HB-10158). Вариантные штаммы и гибридомы также имеются в Национальной Коллекции культур микроорганизмов института Пастера, Париж, Франция, под инвентарными номерами: DS 326 (I-910), GLS (I-792 и I-793), moab 10 (I-2812).

Хотя важное значение некоторых областей и различных аминокислот белка VP2 для антигенной вариабельности штаммов IBDV предполагали Vakharia с сотр. (Virus Research 31, 265-273, 1994) и Snyder с сотр. (Avian Diseases 38, 701-707, 1994), необходимость присутствия всех аминокислот для формирования нейтрализующих эпитопов IBDV пока не установлена. Vakharia с сотр. (Virus Research 49, 131-137, 1997) сообщили об аминокислоте пролине, присутствующей в варианте E IBDV. В международной патентной заявке WO 95/26196 Vakharia с сотр. показали участие аминокислот 286 (Ile), 318 (Asp) и 323 (Glu) в связывании белка VP2 варианта E с moab 67. Кроме того, выявлены множественные различия аминокислотных последовательностей белков VP2 в классическом и вариантных штаммах IBDV. Считается, что аминокислоты в положении 222 (Pro), 249 (Gln) и 254 (Gly) участвуют в формировании эпитопа B69 белка VP2 GLS.

В EP 1170302 (Akzo Nobel N.V.) разработан способ приготовления мутанта варианта E IBDV с улучшенной иммуногенностью по отношению к классическим штаммам IBDV. Этот мутант IBDV получили путем введения мутаций в кодирующую область VP2 варианта E, в частности, в кодоны аминокислот в положении 253 (замена Gln на His), 284 (замена Ala на Thr), 254 (замена Ser на Gly) и 270 (замена Ala на Thr). Ни один из этих мутантов варианта E IBDV не экспрессирует белок VP2, связывающийся с moab B69.

Следует отметить, что информация о создании мутанта классического IBDV, экспрессирующего вирус-нейтрализующий эпитоп варианта E, отсутствует. Такой мутант можно использовать в вакцинах для индукции защитного ответа против заболевания, вызванного как классическим, так и вариантным штаммами IBDV в полевых условиях.

В настоящем изобретении на основе классического IBDV сконструирован новый мутант IBDV путем введения мутаций в кодирующую область белка VP2, характеризующийся тем, что белок VP2, экспрессируемый вирусом, содержит вирус-нейтрализующий эпитоп 67, типичный для вариантных штаммов IBDV. Авторы изобретения установили, что в контексте классического белка VP2 иммунореактивность с moab 67 изменяется под влиянием аминокислотных последовательностей, локализованных в области, содержащей около 100 аминокислот. Кроме того, предположение Vakharia с сотр. о том, что аминокислоты 286 (Ile), 318 (Asp) и 323 (Glu) влияют на присутствие эпитопа 67, не подтвердилось. В действительности авторы обнаружили, что появление эпитопа 67 в составе белка VP2 классического IBDV зависит от замены пролина в положении 222 на серин или треонин и от присутствия определенных аминокислотных последовательностей в положениях 318-323. Замена пролина на серин или треонин в положении 222 в присутствии аминокислотных последовательностей, естественных для белка VP2 классического IBDV в положениях 318-323 (Gly-Gly-Gln-Ala-Gly-Asp), вызывает появление эпитопа 67 в белке VP2 классического IBDV.

Вследствие этого в настоящем изобретении предлагается мутант классического вируса инфекционной бурсальной болезни, который экспрессирует белок VP2, связывающийся с моноклональным антителом (moab) B69 и отличающийся тем, что белок VP2 также связывается с moab 67, секретируемым клеточными линиями HB-9437 и HB-11122 гибридомы, депонированными в ATCC, Rockville, США.

Белок VP2 IBDV состоит из 512 аминокислот и локализован в полипротеине в аминокислотном положении 1-512. Определены нуклеотидные последовательности (включающие в себя полноразмерный сегмент A) кодирующей области VP2 и соответствующие аминокислотные последовательности белка VP2 многих штаммов классического IBDV (US 5871744, EP 887412 для D78; NCBI GeneBank).

Все изученные moab проявляют вирус-нейтрализующие свойства, в том числе, moab B69, который специфичен для штаммов классического IBDV и способен узнавать конформационно-зависимые эпитопы. Vakharia с сотр. (1994, см. выше) и Heine с сотр. (J. Gen. Virol. 72, 1835-1843, 1991) провели сравнение многих аминокислотных последовательностей классического и вариантного VP2, в частности, варианта E и GLS. Хотя в вирусных штаммах существуют биологические вариации, в штаммах IBDV классического типа аминокислотная последовательность белка VP2 строго консервативна. Гомология аминокислот среди последовательностей классического VP2 варьирует для полноразмерного белка между 98-99,4% (данные получены на основе сравнения аминокислотной последовательности VP2 штамма D78 IBDV). Идентифицирована центральная область белка VP2, содержащая наиболее вариабельную часть VP2. Эта область локализована в аминокислотном положении 206-350 (Bayliss с сотр., J. Gen. Virol. 71, 1303-1312, 1987). Гомология аминокислотных последовательностей этой области классического VP2 варьирует между 95,9-97,9% (данные получены на основе сравнения аминокислотной последовательности VP2 штамма D78). По данным Vakharia с сотр. (1994, см. выше) в этой центральной области в положении 212-224 и 314-326 идентифицированы два гипервариабельных района, в которых выявлено большинство изменений аминокислот при сравнении различных типов существующих штаммов IBDV. Несмотря на это, большинство штаммов классического IBDV содержат аминокислотные последовательности в области 200-230, идентичные таковым VP2 штамма D78 IBDV: Ser-Asp-Arg-Pro-Arg-Val-Tyr-Thr-Ile-Thr-Ala-Ala-Asp-Asp-Tyr-Gln-Phe-Ser-Ser-Gln-Tyr-Gln-Pro-Gly-Gly-Val-Thr-Ile-Thr-Leu-Phe (SEQ ID No. 19). Анализ последовательностей проведен с помощью версии 8 пакета программ Wisconsin (Компьютерная группа по генетике, Мэдисон, Висконсин).

Вследствие этого классический IBDV определен здесь как изолированный IBDV, содержащий кодирующую область VP2, экспрессирующую белок VP2, который способен связываться с moab B69.

Более конкретно классический IBDV определен как изолированный IBDV, содержащий аминокислотную последовательность VP2 в положении 200-230, идентичную таковой штамма D78 (SEQ ID No. 19).

Реакцию moab с IBDV проводили с помощью метода AC-ELISA, обычно применяемого для этой цели, как описано Snyder с сотр. (1992, см. выше) и van der Marel с сотр. (Dtsch. Tierartzl. Wschr. 97, 81-83, 1990).

В качестве альтернативы реакцию IBDV с moab также можно выполнить с помощью иммунофлуоресцентного анализа, как описано в примере 1.

Представленный мутант классического IBDV, в соответствии с изобретением, экспрессирует белок VP2, который кроме moab B69 и moab 67 связывается с moab R63, секретируемым клеточной линией HB-9490 гибридомы, депонированной в ATCC, Rockvill, США. moab R63 способен нейтрализовать как классический штамм, так и вариант E IBDV.

В настоящем изобретении впервые определено, какие аминокислотные остатки в составе классического белка VP2 необходимы и достаточны для:

i) формирования нейтрализующего эпитопа, связывающегося с moab R63 (классический и вариант E);

ii) дополнительного формирования нейтрализующего эпитопа, связывающегося с moab 67 (вариант E);

iii) дополнительного формирования нейтрализующего эпитопа, связывающегося с moab 57 (GLS).

Как определено выше, путем введения мутаций в кодирующую область VP2 классического штамма IBDV авторы изобретения выделили ряд мутантов IBDV (пример 1). Полученные данные указывают на то, что идентичные эпитопы могут сворачиваться с помощью различных аминокислотных последовательностей, тогда как другие аминокислотные последовательности не способны генерировать вариантные эпитопы. Поэтому для специфического эпитопа имеется специфичная кодирующая емкость. Сводка важных аминокислотных последовательностей, необходимых для надлежащей укладки эпитопов 67, 57 и R63, представлена в таблице 2 (SEQ ID No. 1-5, 6-9, 10-18 соответственно). Информация, представленная в таблице 2, позволяет квалифицированному исследователю создавать мутанты классического IBDV, способные экспрессировать белок VP2, который кроме вирус-нейтрализующего эпитопа B69 содержит также вирус-нейтрализующий эпитоп 67, специфичный для штаммов варианта E IBDV.

Таблица 2 Аминокислоты, необходимые для укладки эпитопов
Эпитоп	аа 222	aa 318	aa 319	aa 320	aa 321	aa 322	aa 323	aa 330	SEQ ID no. (318-323)
67	S или T	G	G	Q	A	G	D	R или S	1
67	S или T	G	G	Q	A	G	E	R или S	2
67	S или T	D	G	Q	A	G	D	R или S	3
67	S или T	D	G	Q	A	G	E	R или S	4
67	S или T	N	G	Q	A	G	E	R или S	5
57	P, S или T	G	G	Q	E	G	D	R или S	6
57	P, S или T	D	G	Q	E	G	D	R	7
57	P, S или T	N	G	Q	E	G	D	R	8
57	P, S или T	N	G	Q	E	G	E	R	9
R63	P, S или T	G	G	Q	A	G	D	R или S	10
R63	P, S или T	G	G	Q	A	G	E	R или S	11
R63	P, S или T	D	G	Q	A	G	D	R или S	12
R63	P, S или T	D	G	Q	A	G	E	R или S	13
R63	Р, S или T	D	G	Q	E	G	D	S	14
R63	P, S или T	N	G	Q	A	G	D	R или S	15
R63	Р, S или T	N	G	Q	A	G	E	R или S	16
R63	P, S или T	N	G	Q	E	G	D	S	17
R63	P, S или T	N	G	Q	E	G	E	S	18

Вследствие этого предлагаемый мутант классического IBDV представляет собой мутант, связывающийся с moab B69 и moab 67 и содержащий одну или большее число мутаций в кодирующей области классического VP2, где кодирующая область включает в себя:

i) кодон аминокислоты в положении 222, кодирующий серин или треонин;

ii) нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в любом SEQ ID No. 1-5 в положении 318-323.

Установлено, что аминокислотная последовательность в положении 318-323, как показано в таблице 2, приводит к правильному сворачиванию эпитопа 67 только в случае замены аминокислоты в положении 222 (пролин) на серин или треонин, с учетом того, что правильная укладка эпитопа определяется влиянием аминокислот, локализованных на расстоянии 100 положений.

Хотя аминокислота в положении 330 не играет критическую роль, улучшенный мутант IBDV включает в себя кодон, кодирующий аминокислоту аргинин или серин в этом положении.

Дальнейшее улучшение свойств мутанта классического IBDV, как определено выше, состоит в том, что мутант, также экспрессирующий белок VP2, содержит аминокислотную последовательность, необходимую для правильной укладки вирус-нейтрализующего эпитопа R63. Как показано в таблице 2 и примере 1, IBDV, который экспрессирует белок VP2, содержащий аминокислотную последовательность в положении 318-323, представленную в любой SEQ ID No. 14-15 и 7-18 (дополнительно к серину или треонину в положении 222), проявляет эпитоп R63, но не проявляет эпитоп 67.

Кроме того, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что замена аминокислоты в кодирующей области VP2 в положении 318-323 штамма классического IBDV приводит к подавлению способности к росту у этих мутантов. Такие мутанты проявляют аттенуированный фенотип у кур и могут быть полезны в качестве вакцин-кандидатов, обладающих повышенной безопасностью, в частности, вакцин, применяемых in ovo. Поэтому в настоящем изобретении также предлагается мутант классического IBDV, содержащий одну или большее число мутаций кодирующей области классического VP2, где кодирующая область содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность в положении 318-323, которая отличается от нативной аминокислотной последовательности Gly-Gly-Gln-Ala-Gly-Asp (SEQ ID No. 1). Предпочтительно, чтобы эти мутанты классического IBDV содержали аминокислотную последовательность в этих положениях, как показано в любой SEQ ID No. 2-9 или 11-18, факультативно, вместе с аминокислотой в положении 222 и/или 330, как определено выше.

В соответствии с настоящим изобретением мутант классического IBDV может быть получен путем введения необходимых мутаций в кодирующую область белка VP2, происходящего от любого штамма классического IBDV, выделенного в полевых условиях или применяемого в вакцинах. К подходящим штаммам IBDV относятся хорошо изученные штаммы IBDV, присутствующие в коммерчески применяемых вакцинах, такие, как D78, PBG98, 228E и 89-03 (Intervet Interntional B.V.). Штамм D78 IBDV (патент США No. 4530831) также депонирован в ATCC под No. VR-2041. Нуклеотидная последовательность полноразмерного сегмента A штамма D78, содержащего кодирующую область VP2, и аминокислотная последовательность соответствующего (поли)протеина представлена в патенте США No. 5871744 и в заявке EP 887412.

В частности предлагается мутант классического IBDV, несущий одну или большее число мутаций в кодирующей области VP2 штамма D78 IBDV.

Далее в соответствии с настоящим изобретением представленный мутант классического IBDV включает в себя полную генетическую последовательность сегмента A штамма классического IBDV, в том числе, мутантную кодирующую область классического VP2, как описано выше. Более конкретно, мутант классического IBDV, как определено выше, происходит от штамма D78 IBDV.

Однако в соответствии с изобретением мутант классического IBDV может быть получен на основе генетической последовательности вариантного штамма IBDV, такого, как вариант E или штамм GLS. В таком «химерном» мутанте классического IBDV кодирующие последовательности VP2 в генетической последовательности сегмента A вариантного штамма IBDV замещены на соответствующие необходимые кодирующие последовательности классического VP2, которые дополнительно содержат желательные мутации, ответственные за новые вариантные эпитопы мутанта классического IBDV.

В соответствии с изобретением генерация мутанта классического IBDV может быть получена с использованием недавно разработанной системы на основе инфекционной кРНК для IBDV (Mundt и Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131-11136, 1996). Система на основе обратной генетики обеспечивает возможность введения мутаций в РНК-содержащий геном IBDV. Наиболее важным этапом этой системы обратной генетики является получение полноразмерных клонов кДНК сегментов A и B IBDV, в том числе, нуклеотидов 5'- и 3'-концов обоих сегментов. После процедуры клонирования полноразмерные последовательности сегментов A и B сшивали с промотором, который способен связываться с ДНК-зависимой РНК-полимеразой, такой, как полимераза T7, SP6 или T3. Предпочтителен промотор фага T7. ДНК-зависимая полимераза синтезирует вирусную кРНК с полноразмерных клонов кДНК сегментов A и B, соответственно. Эта кРНК индуцирует репликацию вируса и способствует выделению жизнеспособного вируса. Такую процедуру можно проводить с каждым природным штаммом IBDV.

Системы обратной генетики описаны для различных штаммов IBDV, таких, как D78 (Yao с сотр., J. Virol. 72, 2647-2657, 1998), штамм HK46 (Lim с сотр., J. Virol. 73, 2854-2862, 1999), CEF 94 (Boot с сотр.,Virology 265, 330-341, 1999) и UK661 (van Loon с сотр., J. Gen. Virol. 83, 121-129, 2002).

Желательные мутации можно вводить в геном IBDV с помощью общеизвестных методов, в частности, посредством сайт-направленного мутагенеза. Методы введения мутации в геном IBDV описаны здесь, но можно использовать и общепринятые методы (Mundt and Vakharia, 1996, supra; Yao et al., J. Virology 72, 2647-2654; 1998; Mundt et al., 1999, supra; EP patent application no. 1170302; Current Protocols in Molecular Biology, eds.: F.M. Ausubel et al., Wiley N.Y., 1995 edition, pages 8.5.1.-8.5.9. and Kunkel et al. in Methods in Enzymology vol. 154, 376-382, 1987).

Номера, используемые здесь для указания положения аминокислот, относятся к нумерации аминокислот полипротеина IBDV. Номера, указывающие положение нуклеотидов, основаны на полной нуклеотидной последовательности сегмента A генома IBDV, как описано Mundt и Muller (J. Gen. Virol. 77, 437-443, 1995; NCBI регистрационный No. X 84034).

В соответствии с изобретением сегмент B мутанта классического IBDV может быть получен от любого штамма IBDV, предпочтительно, от штамма классического IBDV, более предпочтительно, от штамма D78 или P2 (патент США 5871744 и патент EP No. заявки 887412).

Как показано в примерах, в соответствии с изобретением мутант классического IBDV проявляет иммуногенность, не характерную для штаммов классического IBDV. На основе нового мутанта классического IBDV можно создать IBDV-вакцину нового типа, эффективно защищающую домашнюю птицу от патологического состояния, вызванного заражением как классическим, так и вариантным штаммом IBDV. Вследствие этого другим аспектом изобретения является вакцина, применяемая для защиты домашней птицы от заболевания, вызванного инфекцией IBDV. Вакцина включает в себя мутант классического IBDV, как определено выше, и фармацевтически допустимый носитель или растворитель.

Мутант классического IBDV может вводиться в состав вакцины в виде живого аттенуированного вируса или в виде инактивированного вируса.

В соответствии с изобретением вакцину можно готовить с использованием соответствующих методов, таких, которые применяли, например, при приготовлении коммерчески пригодных вакцин на основе живого или инактивированного вируса IBDV. В соответствии с изобретением чувствительный субстрат засевали мутантом классического IBDV. На субстрате происходила репликация вируса и его размножение до желательного инфекционного титра. После этого IBDV-содержащий материал выделяли, факультативно инактивировали и смешивали с фармацевтически приемлемым носителем или растворителем.

В соответствии с изобретением для приготовления вакцины использовали любой субстрат, способный поддерживать репликацию IBDV, в том числе, первичные клеточные культуры (птиц), такие, как клетки эмбриональных фибробластов кур (CEF), клетки эмбриональной печени кур (CEL), клеточные линии млекопитающих, такие, как клеточная линия VERO или BGM-70, клеточные линии птиц, такие, как QT-35, QM-7 или LMH. Обычно после инокуляции клеток вирус размножался в течение 3-14 дней, после чего выделяли супернатант клеточной культуры и, если необходимо, фильтровали или центрифугировали супернатант для удаления клеточного дебриса.

Мутант классического IBDV также можно размножать в эмбрионах куриных яиц.

При необходимости аттенуацию классического IBDV проводили с помощью стандартного серийного пассирования вируса в клеточных культурах, например, в первичных клеточных культурах или в клеточных линиях, указанных выше (Bayyari с сотр., Avian Diseases 40, 516-532, 1996; Tsai с сотр., Avian diseases 36, 415-422, 1992).

В качестве альтернативы, классический IBDV размножали in vivo в инфицированных курах с последующим выделением фабрициевой сумки из инфицированных птиц, смешиванием ее с растворителем и гомогенизацией смеси. IBDV, размноженный этим методом, обычно использовали в качестве основы для инактивированной вакцины.

В соответствии с изобретением вакцину, содержащую живой вирус, готовили и реализовали в форме суспензии или в лиофилизированной форме. Дополнительно вакцина содержала фармацевтически приемлемые носитель или растворитель, обычно применяемые в таких составах. К носителям относятся стабилизаторы, консерванты и буферы. К подходящим стабилизаторам относятся, например, SPGA, углеводы (такие, как сорбитол, маннитол, крахмал, сахароза, декстран, глутамат или глюкоза), белки (такие, как сухая молочная сыворотка, альбумин или казеин) или продукты их расщепления. Подходящими буферами являются фосфаты щелочных металлов. К консервантам относятся тимеросал, мертиолят и гентамицин. Растворителями могут быть вода, водный раствор буфера (забуференный физраствор), спирт и полиолы (например, глицерин).

В соответствии с изобретением живые вакцины при необходимости могут содержать адъювант. Примеры соответствующих соединений и композиций с адъювантной активностью приведены ниже.

Хотя в соответствии с настоящим изобретением возможно применение живой вакцины путем инъекции, например, внутримышечно, подкожно или in ovo, предпочтителен недорогой способ массовой IBDV-вакцинации. IBDV-вакцинацию применяют путем введения вакцины в питьевую воду, распыления или аэрозольной вакцинацией.

В качестве альтернативы в настоящем изобретении предлагается вакцина, содержащая вариант IBDV в инактивированной (убитой) форме. Преимуществом инактивированной IBDV-вакцины является возможность получения высокого уровня защитных антител длительного действия.

Целью инактивации вирусов, собранных после этапа размножения, является устранение репродукции вирусов, что достигается с помощью хорошо известных химических или физических средств.

Вакцина, содержащая инактивированный вариант IBDV, может, например, включать в себя один или большее число вышеупомянутых фармацевтически приемлемых носителей или растворителей, пригодных для этой цели.

В соответствии с изобретением желательно, чтобы инактивированная вакцина содержала одно или большее число соединений с адъювантной активностью. Приемлемые соединения или композиции для этих целей включают гидроокись, фосфат или окись алюминия, эмульсию масла в воде или воды в масле, полученную на основе, например, минерального масла, такого, как Bayol F® или Marcol 52®, или растительного масла, такого, как ацетат витамина E и сапонины.

Вакцина в соответствии с изобретением содержит в качестве активного компонента эффективную дозу мутанта классического IBDV, например, определенное количество иммунизированного IBDV материала, который способен индуцировать иммунитет у вакцинированных птиц против заражения вирулентным вирусом. Иммунитет определяется здесь как индукция достоверно высокого уровня защиты в популяции птиц после вакцинации по сравнению с невакцинированной группой птиц.

В соответствии с изобретением живую вакцину, как правило, применяют в дозе 10⁰-10⁹ ТЦПД₅₀/особь (50%-ная тканевая цитопатическая доза), предпочтительно, в дозе 10³-10⁶ ТЦПД₅₀/особь. Инактивированные вакцины могут содержать антигенный эквивалент 10⁶-10¹⁰ ТЦПД₅₀/особь.

Инактивированные вакцины обычно применяют парентерально, например, внутримышечно или подкожно.

Хотя в соответствии с настоящим изобретением, IBDV-вакцина может эффективно использоваться для вакцинации кур, ее можно применять для других птиц, таких, как индейки, цесарки, куропатки. К курам относятся бройлеры, молодки, репродуктивное стадо и яйценосное стадо.

В соответствии с изобретением возраст птиц, получающих живую или инактивированную вакцину, совпадает с таковым птиц, получающих стандартную живую или инактивированную IBDV-вакцину. Например, бройлеров (свободных от происходящих от матери антител - MDA) можно вакцинировать в возрасте 1 день или in ovo, тогда, как бройлеров с высоким уровнем MDA предпочтительно вакцинировать в возрасте 2-3 нед. Яйценосное или репродуктивное стадо с низким уровнем MDA можно вакцинировать в возрасте 1-10 дней с последующей активной иммунизацией инактивированной вакциной в возрасте 6-12 и 16-20 нед.

Изобретение также включает в себя комбинированные вакцины, содержащие в дополнение к мутанту классического IBDV, описанному выше, один или большее число вакцинных компонентов других инфекционных патогенов домашней птицы.

Предпочтительно, чтобы комбинированная вакцина дополнительно содержала один или большее число вакцинных штаммов вируса болезни Марека (MDV), вируса инфекционного бронхита (IBV), вируса Ньюкасльской болезни (NDV), вируса синдрома снижения яйценоскости (EDS), вируса ринотрахеита индеек (TRTV) или реовируса.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Приготовление мутантов классического IBDV и определение иммунореактивности моноклональных антител

Материалы и методы

Получение мутантного сегмента A

Проведены эксперименты по сайт-направленному мутагенезу pD78A (Mundt и Vakharia, см. выше, 1996; EP заявка 887412). Для этого конец pD78A расщепляли с помощью EcoRI/Kpnl и фрагмент, содержащий сегмент A, лигировали с соответственно расщепленным pBlueScript KS+ с получением pSK+-D78A. После приготовления однонитевой ДНК сайт-направленные эксперименты выполняли по Kunkel с сотр. (1978, см. выше) с использованием олигонуклеотидов, перечисленных в таблице 3. Олигонуклеотиды Mut1, Mut2, Mut3, Mut4, Mut5, Mut6, Mut7, Mut8, Mut9, Mut10, Mut11 использовали для генерации мутантных плазмид pMut1, pMut2, pMut3, pMut4, pMut5, pMut6, pMut7, pMut8, pMut9, pMut10, pMut11 соответственно. С помощью этих 11 мутантных плазмид получили однонитевую ДНК, которую использовали вместе с однонитевой ДНК pSK+-D78A в экспериментах по сайт-направленному мутагенезу. Опыты проводили с одним (P222S или R339S) или с двумя олигонуклеотидами (P222S и R339S) в одном эксперименте для получения одного или большего числа перестановок триплетов оснований. Полученные мутагенизированные плазмиды (см. таблицу 4) секвенировали и использовали в дальнейших экспериментах.

Трансфекция кРНК, иммунофлуоресцентный анализ и пассирование полученного вируса

Для проведения транскрипции in vitro плазмиды, содержащие pD78A, и мутагенизированные плазмиды линеаризовали путем расщепления с помощью BsrG I. pP2B линеаризовали с помощью Pst I (Mundt & Vakharia, см. выше, 1996; EP заявка 887412). Дальнейшую обработку линеаризованной ДНК, транскрипцию и трансфекцию РНК в клетках BHK21 выполняли по Mundt (J. Gen.Virol. 80, 2067-2076, 1999). Для иммунофлуоресцентного анализа клетки BHK21, выращенные в 24-луночных планшетах для тканевой культуры, трансфицировали, через 24 ч после трансфекции фиксировали смесью ацетон/метанол (50%/50%) в течение 5 мин и высушивали. Фиксированные клетки инкубировали с моноклональными антителами 67, B69, 57, R63 и кроличьей анти-IBDV сывороткой, соответственно (Mundt с сотр. J.Gen. Virol. 76, 437-443, 1995), разводили физраствором в фосфатном буфере (PBS), оставляли на 30 мин и промывали с помощью Трис и PBS. Клетки инкубировали 30 мин с козьими антителами против IgG кролика, конъюгированным с DTAF, или с козьими антителами против IgG мыши, конъюгированным с DTAF (Dianova, Hamburg, Germany), разбавленными в PBS с последующим 3-кратным промыванием PBS и 1-кратным промыванием дистиллированной водой. После высушивания на воздухе клетки помещали в 2,5% 1.4.-диазобицикло(2.2.2.)-октан (DABCO, Sigma, Deisenhofen, Germany), содержащий PBS в 90% глицерине. Флуоресценцию регистрировали с помощью иммерсионного флуоресцентного микроскопа. Для пассирования полученного вируса клетки BHK21, выращенные в 6-луночных планшетах для тканевой культуры, трансфицировали параллельно опытам по трансфекции в 24-луночных планшетах для тканевой культуры и инкубировали 24-48 ч. После замораживания-оттаивания при -70°С в течение не менее 1 ч полученный супернатант центрифугировали при 6400 × g 10 мин и пассировали на клетках QM, выращенных во флаконе для тканевой культуры площадью 25 см² до визуализации цитопатического эффекта (CPE). Супернатант получали, как описано выше, и замораживали в виде аликвотных проб при -70°С. Для анализа жизнеспособности и реакционной способности с mmAb клетки QM, выращенные в 24-луночных планшетах для тканевой культуры, инфицировали одной аликвотой и инкубировали 24 ч. Иммунофлуоресцентный анализ проводили, как описано выше.

Анализ роста полученного вируса в клеточной культуре

Для мониторинга роста CEC, выращенные в 24-луночном планшете для тканевой культуры, инфицировали селективным IBDV при множественности заражения (MOI) 1 в течение 1 ч при 37°С. Затем инокулят удаляли, клетки промывали средой и добавляли 1 мл среды. Супернатанты собирали сразу (0 ч), через 8, 12, 16, 24 и 36 ч инкубации при 37°С и хранили при -70°С. Титры вируса получали путем определения ТЦПД₅₀ на QM-клетках (мышечные клетки перепела), выращенных в 96-луночных планшетах для тканевой культуры. Для этого супернатанты размораживали и титровали с шагом log10 (стандартного 10-кратного разведения). 100 мкл каждого соответствующего разведения вносили в 4 лунки планшета для тканевой культуры и добавляли 100 мкл суспензии клеток QM (10⁶ кл/мл). Планшеты инкубировали при 37°С. Через 5 дней лунки с CPE учитывали как позитивные, ТЦПД₅₀ рассчитывали по Spaerman (Brit. J. Psychol., 2, 227-242, 1908) и Karber (Arch. Exp. Path. Pharmak., 162, 480-487, 1931). Определяли средние значения и стандартное отклонение в 3-х независимых экспериментах.

Результаты

Влияние перестановки аминокислот в вариабельной области VP2 на иммунореактивность моноклональных антител

Аминокислоты, локализованные в последовательности штамма D78 в положении 222 (пролин), 318 (глицин), 321 (аланин) и 323 (аспартат), заменили на аминокислоты серин, треонин (P222S, P222T), аспартат, аспарагин (G318D, G318N), глутамат (A321E) и глутамат (D323E), соответственно, в различных комбинациях (см. таблицу 4). Замена пролина в положении 222 на серин вызывала дополнительную иммунореактивность moab 67, если последовательность аминокислот (aa) в положении 318-323 включала в себя следующие комбинации: GGQAGD, DGQAGD, DGQAGE, GGQAGE, NGQAGE. Оказалось, что остальные комбинации aa-последовательности в положении 318-323 (DGQEGD, DGQEGE, GGQEGD, GGQEGE, NGQAGD, NGQEGD, NGQEGE), препятствуют сворачиванию эпитопа, характеризуемого с помощью moab 67, даже если пролин в положении 222 был заменен на серин. Связывание moab 57 регистрировали после замены aa 321 с аланина на глутамат вне независимости от аминокислоты 222 (пролин), 318 (глицин) и 323 (аспартат). Но замена аргинина на серин в положении 330 влияла на наличие эпитопа 57. Если замену (R330S) проводили в присутствии комбинаций DGQEGD, NGQEGD и NGQEGE, соответственно, то после экспериментов по котрансфекции не регистрировали иммунореактивность с moab 57. С другой стороны показали, что замена R330S не влияла на иммунореактивность с moab 57 в присутствии комбинации GGQEGD. В проведенных экспериментах иммунореактивность moab 57 и R63 исключалась друг для друга в случае присутствия эпитопа 57 и отсутствия эпитопа R63. Кроме того, иммунореактивность с moab R63 после экспериментов по котрансфекции регистрировали при использовании плазмид, кодирующих комбинации GGQAGD, DGQAGD, DGQAGE, GGQAGE, NGQAGD и NGQAGE для положения aa 318-323, локализованных в области VP2 независимо от замещения aa 222 (пролин) или aa 330 (аргинин). Белок, транслированный с кРНК плазмид, кодирующих аминокислотную последовательность DGQEGE или GGQEGE в положении 318-323 гена полипротеина, реагировал только с moab 69. Замена aa 222 и/или 330 также не влияла на иммунореактивность. После проведения всех экспериментов по трансфекции клетки замораживали/оттаивали, полученный супернатант пассировали. В каждом случае генерировался жизнеспособный вирус, что указывало на отсутствие влияния проведенной процедуры мутагенизации аминокислот на жизнеспособность и инфекционность клеточных культур вируса.

Анализ роста в клеточной культуре

Для изучения влияния аминокислотных замен на рост мутантного вируса анализировали нескольких мутантных IBVD (D78, Mut1, Mut2, PS-D78, PS-Mut1, PS-Mut2, Mut10 и Mut11). Для этого с помощью панели moab провели селекцию конца наработанного IBDV, содержащего определенный паттерн иммунореактивности. Как показано на чертеже, на рост вируса влияли замены аминокислот в определенных областях. Установили, что замена аминокислоты в положении 222 с пролина на серин не влияла на рост в клеточной культуре. С другой стороны замена аминокислот в области 318-323 влияла на рост изученных мутантов. Рост этих мутантов при более низких титрах во всех исследованных временных интервалах указывает на то, что область aa 318-323 имеет важное значение для роста в клеточной культуре.

Пример 2

Антигенные свойства мутантов классического IBDV

Материалы и методы

Характеристика мутантного вируса с помощью реакции нейтрализации

Для тестирования нейтрализации моноклональными антителами наработанного вируса проводили реакцию нейтрализации, как описано Schröder с сотр., (J. Gen. Virol., 81, 533-540, 2000). 100 мкл раствора вируса, содержащего 750 ТЦПД₅₀/100 мкл, вносили в каждую лунку 96-луночного планшета для тканевой культуры, за исключением первой лунки в каждом ряду. Затем 100 мкл различных moab (67, B69, 57, R63) или поликлональной кроличьей анти-IBDV сыворотки вносили в пустую первую лунку каждого ряда. В лунки, содержащие антитела, добавляли вирусную суспензию, содержащую 1500 ТЦПД₅₀/100 мкл. После перемешивания вируса и сыворотки проводили серийные разведения путем серийного переноса 100 мкл/лунку. После инкубации 1 ч при комнатной температуре в каждую лунку добавляли 100 мкл клеток QM (10⁶ клеток/мл) и инкубировали при 37°С. Через 6 дней лунки просматривали и регистрировали CPE. Конечным этапом VN-теста для образца сыворотки являлось определение обратной величины наибольшего разведения, выраженного в log2, при котором отсутствовал видимый CPE.

Результаты

Антигенные свойства в реакции нейтрализации

Для анализа нейтрализации генерированных мутантов соответствующими моноклональными антителами проводили реакцию нейтрализации. Отбирали пары вирусов, проявляющих различный паттерн mAb, основанный на одной аминокислотной замене (D78, PS-D78; Mut1, PS-Mut1; Mut2, PS-Mut2), или сходный паттерн при разных аминокислотных последовательностях (d78, Mut1, Mut2; PS-D78, PS-Mut1, PS-Mut2; Mut10, Mut11). Результаты (таблица 5) показали, что паттерн нейтрализации в большинстве случаев (D78, Mut1, Mut2, PS-D78, PS-Mut1, PS-Mut2, Mut11) сходен с таковым, полученным при флуоресцентном анализе. Исключением является Mut11, который не нейтрализовался под действием mAb 57, хотя проявлял позитивный эффект при проведении флуоресцентного анализа, что указывало на присутствие эпитопа, но утрату его нейтрализующей способности.

Таблица 5 Реакция нейтрализации мутантов IBDV с помощью поликлональной сыворотки и моноклональных антител
Вирусa	Паттерн панели в IIFAb	Антитела, использованные в реакции нейтрализацииc
	57	R63	67	B69	57	R63	67	B69	Анти-IBDV
rD78	-	+	-	+	<2d	>212	<2	212	212
PS-D78	-	+	+	+	<2	>212	210	211	212
Mut1	-	+	-	+	<2	>212	<2	210	28
Ps-Mut1	-	+	+	+	<2	>212	211	210	210
Mut2	-	+	-	+	<2	>212	<2	211	29
PS-Mut2	-	+	+	+	<2	212	212	210	27
Mut10	+	-	-	+	211	<2	<2	210	29
Mut11	+	-	-	+	<2	<2	<2	212	28
a Рекомбинантный IBDV, использованный в реакции нейтрализации b Данные паттерна панели в непрямом иммунофлуоресцентном анализе с использованием moab (57, R63, 67, B69), как показано в таблице 4 c В реакции нейтрализации использованы 4 moab (57, R63, 67, B69) и 1 поликлональная кроличья анти-IBDV сыворотка d Титр нейтрализации при Log2-разведении сыворотки

1. Мутант классического вируса инфекционной бурсальной болезни (IBDV), предназначенный для использования в вакцине, где указанный мутант вируса экспрессирует белок VP2, который связывается с моноклональным антителом (moab) B69 и moab 67, секретируемыми гибридомными клеточными линиями НВ-9437 и НВ-11122, депонированными в АТСС, Rockville, США, отличающийся тем, что мутант содержит одну или большее число мутаций кодирующей области классического VP2, при этом кодирующая область включает

i) кодон для аминокислоты в положении 222, кодирующий серин или треонин;

ii) нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID No. 1-5 в положении 318-323.

2. Мутант классического IBDV по п.1, отличающийся тем, что белок VP2 связывается с moab B69, moab 67 и moab R63, секретируемыми гибридомной клеточной линией НВ-9490, депонированными в АТСС, Rockville, США.

3. Мутант классического IBDV по п.2, отличающийся тем, что кодирующая область содержит кодон для аминокислоты в положении 330, кодирующий аргинин или серин.

4. Мутант классического IBDV по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что мутант содержит одну или большее число мутаций в кодирующей области VP2 штамма D78 IBDV.

5. Мутант классического IBDV по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что мутант содержит геномный сегмент А классического IBDV, предпочтительно штамма D78 IBDV.

6. Мутант классического IBDV по п.4, отличающийся тем, что мутант содержит геномный сегмент А классического IBDV, предпочтительно штамма D78 IBDV.

7. Вакцина, используемая для защиты домашней птицы от заболевания, вызываемого инфицированием IBDV, отличающаяся тем, что вакцина содержит мутант классического IBDV по любому из пп.1-6 вместе с фармацевтически приемлемым носителем или растворителем.

8. Вакцина по п.7, отличающаяся тем, что мутант классического IBDV находится в живой форме.

9. Вакцина по п.7, отличающаяся тем, что вакцина дополнительно включает один или большее число компонентов вакцин для других патогенных для домашней птицы инфекций.

10. Вакцина по п.8, отличающаяся тем, что вакцина дополнительно включает один или большее число компонентов вакцин для других патогенных для домашней птицы инфекций.

11. Вакцина по любому из пп.7-10, отличающаяся тем, что вакцина содержит адъювант.

12. Способ получения мутанта классического IBDV по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что мутант классического IBDV размножают в клеточной культуре и выделяют из клеточной культуры.

13. Способ получения вакцины по любому из пп.7-11, отличающийся тем, что мутант классического IBDV по любому из пп.1-6 смешивают с фармацевтически допустимым носителем или растворителем.

14. Способ получения мутанта классического вируса инфекционной бурсальной болезни (IBDV), который экспрессирует белок VP2, связывающийся с моноклональным антителом (moab) B69 и moab 67, секретируемым гибридомными клеточными линиями НВ-9437 и НВ-11122, депонированными в АТСС, Rockville, США соответственно, отличающийся тем, что одна или большее число мутаций введены в кодирующую область VP2 классического штамма IBDV так, что

i) кодон для аминокислоты в положении 222 кодирует серин или треонин;

ii) нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность в положении 318-323, кодирует аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID No. 1-5.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что мутация введена в кодон аминокислоты в положении 222 в кодирующей области VP2 классического штамма IBDV, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No. 1.

16. Способ по п.14, отличающийся тем, что белок VP2 также связывается с moab R63, секретируемым гибридомной клеточной линией НВ-9490, депонированной в АТСС, Rockville, США.

17. Способ по п.15, отличающийся тем, что белок VP2 также связывается с moab R63, секретируемым гибридомной клеточной линией НВ-9490, депонированной в АТСС, Rockville, США.

18. Способ по п.14, отличающийся тем, что кодирующая область VP2 содержит кодон аминокислоты в положении 330, кодирующий аргинин или серин.

19. Способ по п.15, отличающийся тем, что кодирующая область VP2 содержит кодон аминокислоты в положении 330, кодирующий аргинин или серин.

20. Способ по п.16, отличающийся тем, что кодирующая область VP2 содержит кодон аминокислоты в положении 330, кодирующий аргинин или серин.

21. Способ по любому из пп.14-20, отличающийся тем, что одна или большее число мутаций введены в кодирующую область VP2 штамма D78 IBDV.

22. Способ по любому из пп.14-20, отличающийся тем, что одна или большее число мутаций введены в геномный сегмент А штамма D78 классического IBDV.

23. Способ по п.21, отличающийся тем, что одна или большее число мутаций введены в геномный сегмент А штамма D78 классического IBDV.

24. Способ получения вакцины, применяемой для защиты домашней птицы от заболевания, вызванного инфекцией IBDV, отличающийся тем, что мутант классического IBDV, полученный в соответствии со способом по любому из пп.14-23, смешивают с фармацевтически приемлемым носителем или растворителем.