Фармацевтическая композиция, обладающая панкреатотропной активностью, и способ получения фармацевтической композиции
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается новой фармацевтической композиции и способа ее получения. Композиция содержит в качестве активных ингредиентов октреотид и даларгин в терапевтически эффективных количествах. Способ получения композиции включает растворение ингредиентов в очищенной воде, с дальнейшей лиофилизацией раствора. Изобретение обеспечивает высокую панкреатропную активностью и может найти применение при лечении заболеваний, связанных с патологией поджелудочной железы. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 табл.
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармацевтической композиции, обладающей панкреатотропной активностью и выраженным лечебным действием.
Одной из актуальных проблем современной гастроэнтерологии является лечение больных с острой и хронической формами панкреатита и их обострениями [1].
В последнее время отмечено значение эндогенных опиоидных пептидов в формировании стрессорных реакций при воспалительных заболеваниях органов брюшной полости, в том числе при поражениях паренхимы поджелудочной железы.
Известен препарат октреотид, который широко применяют для профилактики осложнений после операций на поджелудочной железе и лечения острого панкреатита. Октреотид обладает выраженной способностью угнетать экзокринную функцию поджелудочной железы, активирует процессы заживления ее паренхимы [2].
Известен препарат даларгин, созданный на основе эндогенных опиоидных пептидов, который также обладает панкреатотропной активностью и находит применение в консервативном лечении больных с острой и хронической формами панкреатита [3]. Кроме того, даларгин обладает выраженной стресспротективной и анальгетической активностью [4].
Задачей данного изобретения является создание нового
комбинированного препарата, обладающего выраженной панкреатотропной активностью и лечебным действием.
Поставленная задача достигается описываемой фармацевтической композицией, которая содержит в качестве активных компонентов даларгин и октреотид в эффективных количествах.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
В реактор, снабженный якорной мешалкой, наливают 8 л воды для инъекций. Затем открывают вентиль для подачи в реактор стерильного азота и барботируют воду в течение 5 минут. После этого в реактор последовательно загружают 10 г субстанции даларгина и 1 г субстанции октреотида при постоянном перемешивании и барботаже раствора азотом. Перемешивание ведут до полного растворения. Затем доводят рН раствора до значения 4,5-5,5 добавлением 1 М раствора уксусной кислоты. Полученный раствор доводят до объема 10 л водой для инъекций и пропускают через стерилизующий фильтр. В асептических условиях осуществляют розлив в ампулы емкостью 2 мл по 1 мл в ампулу. Кассеты с ампулами помещают в сублимационную камеру, где замораживают до температуры минус 40°С со скоростью замораживания 10°С/ч, а затем подвергают высушиванию путем вакуумирования. Ампулы с полученной сухой лиофилизированной формой препарата запаивают под азотом.
Пример 2.
1 г субстанции даларгина и 0,1 г субстанции октреотида растворяют при перемешивании и барботаже азотом в 900 мл воды для инъекций, в которой предварительно растворено 0,71 г ацетата аммония, рН полученного раствора доводят до значения 4,5-5,0 с помощью 1 М раствора уксусной кислоты и добавляют воду для инъекций до общего объема 1,0 л. Проводят стерилизующую фильтрацию полученного раствора и в асептических условиях осуществляют под азотом его розлив в ампулы емкостью 2 мл по 1 мл в ампулу. Заполненные ампулы запаивают под азотом.
Пример 3. Изучение панкреатотропной активности описываемой фармкомпозиции. Исследование проводилось в опытах на крысах. В качестве препаратов сравнения использовали даларгин и октреотид. Моделирование экспериментального острого панкреатита (ЭОП) проводилось по известной методике путем орошения поджелудочной железы (ПЖ) хлорэтилом (холодовая модель ЭОП) [5].
В эксперименте была использована фармкомпозиция по примеру 1.
Холодовую модель экспериментального ЭОП воспроизводили у животных следующим образом. У крыс под наркозом в асептических условиях вскрывали брюшную полость, в рану выводили желудок, двенадцатиперстную кишку (ДПК) и селезенку с находящейся под ними ПЖ. Если расположить желудок и ДПК справа, а селезенку слева от операционного разреза, в ране окажется основная часть ПЖ. В течение 1 минуты обе поверхности ПЖ охлаждали струей хлорэтила до появления налета инея. Температура этого сегмента железы понижалась до -30°С. Измерение температуры проводили в предварительных опытах с помощью специального термометра, который вводили в толщу ПЖ до замораживания. После последующего быстрого оттаивания ПЖ вместе с желудком, ДПК и селезенкой погружали в брюшную полость и рану брюшной стенки зашивали через все слои отдельными узловыми капроновыми швами наглухо. Асептической повязки не накладывали. Моделировали ЭОП средней тяжести.
Максимальная выраженность заболевания развивается через 24 часа от начала опытов. Поэтому вещества вводили через 1 сутки (сут) после воспроизведения ЭОП, т.е. на высоте патологического процесса.
Для оценки лечебного эффекта выбранных веществ было поставлено 4 серии экспериментов на белых беспородных крысах-самцах массой 250-300 г: I группа контрольная (ЭОП без лечения), II группа - ЭОП (лечение даларгином), III группа - ЭОП (лечение октреотидом), IV группа - ЭОП (лечение фармкомпозицией). Фармакологические вещества вводили внутрибрюшинно (в/б). Объем вводимого в/б раствора веществ составлял 1 мл, доза - 50 мкг/кг для каждого. Препараты вводили 2 раза/сут в течение 3 сут.
Критериями оценки эффективности лечения служили: макроскопические изменения в брюшной полости, морфологические изменения ткани ПЖ, биохимические показатели (активность ферментов ПЖ и содержание продуктов перекисного окисления липидов /ПОЛ/ в крови). Перечисленные исследования на подопытных животных проводили после декапитации спустя 1, 5, 10 и 15 суток после начала эксперимента.
Материалы для морфологического исследования забирали из трех зон ПЖ: I - зоны поражения (охлаждения); II - зоны, непосредственно граничащей с очагом поражения (перифокальная); III - зоны, отдаленной от очага поражения (интактная). Для светооптического исследования кусочки ПЖ фиксировали 10% нейтральным формалином по Лилли и заливали в парафин. Препараты окрашивали гематоксилином-эозином, по Ван Гизону, по Романовскому-Гимзе; фибрин и зимогеновые гранулы выявляли по Грамм-Вейгерту. В каждом наблюдении с электронных блоков были изготовлены полутонкие срезы толщиной в 1 мкм, которые окрашивали смесью азур-П и метиленовый синий и изучали в световом микроскопе.
В гепаринизированной плазме крови крыс стандартными коммерческими наборами производства фирмы "DiaSys" (Германия) определяли активность панкреатической амилазы (субстрат EPS-G7) и панкреатической липазы колориметрическим методом. Как известно, они являются высокоспецифичными маркерами повреждения ПЖ [6].
При ЭОП происходит некомпенсированное усиление ПОЛ, приводящее к нарушению мембранных структур как наиболее чувствительных к действию активных форм кислорода, а нарастание концентрации продуктов ПОЛ находится в прямой зависимости от тяжести воспалительных изменений в ткани ПЖ. Исследование содержания продуктов ПОЛ (концентрацию малонового диальдегида /МДА/) определяли по Yagi К. [7].
Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики.
Морфологическое исследование
Интактные животные
Гистологически ткань ПЖ интактных животных представлена разномасштабными дольками, разобщенными рыхлой малоклеточной тканью. Внутридольковые протоки содержат секрет. Отмечается умеренное полнокровие меж- и внутридольковых вен. Ацинусы в дольках имеют обычное строение с четкими границами клеточных мембран ацинарных клеток (АК). Зрелые секреторные гранулы локализуются вокруг центра ацинозных протоков. Отмечается асинхронность накопления секреторных гранул от малочисленного до значительного в периостровковой зоне. Просветы центроацинозных протоков заполнены секретом. ПЖ интактных животных сохраняет обычное дольчатое строение железы, четкую структуру ацинусов и асинхронный тип накопления секрета.
Экспериментальный острый панкреатит
Гистологически ткань ПЖ через 1 сут после воспроизведения экспериментального ОП представлена разобщенными разной величины дольками за счет выраженного междолькового отека. Отдельные дольки или часть их с признаками некроза и нарушения обычного строения ацинусов. АК с неразличимыми границами, диффузной эозинофиллией цитоплазмы. В отдельных АК различимы ядра центроацинозных протоковых клеток и пикнотичные ядра АК.
На полутонких срезах в очагах ацинарных повреждений видны контуры некротизированных ацинусов с неразличимыми границами АК и отсутствием секреторных гранул в них, но диффузной микровезикулярной трансформацией цитоплазмы. Среди некротизированных ацинусов видны сохраненные вставочные протоки с кистозными расширениями их просветов. В пограничных с некрозом зонах в цитоплазме АК прослеживаются дистрофические изменения в виде вакуолизации цитоплазмы и диссоциации секреторных гранул до базальных мембран с возможным выбросом ферментов в интерстиций. В межацинарных пространствах имеется воспалительная лейкоцитарная инфильтрация с миграцией сегментоядерных лейкоцитов в цитоплазму поврежденных клеток и очаговые кровоизлияния. В отдельных дольках полностью стираются контуры некротизированных ацинусов, а сегментоядерные лейкоциты диффузно инфильтрируют поврежденную ткань долек. Междольковая воспалительная инфильтрация распространена преимущественно вокруг долек с некротизированными ацинусами.
В сохраненной ацинарной паренхиме в междольковой жировой и соединительной ткани имеются признаки отека и минимальная воспалительная инфильтрация. Междольковые артерии и вены дилатированы и полнокровны. Междольковые протоки с расширенным просветом и без содержимого Ацинусы вне очагов повреждения отличаются высокой степенью накопления секреторных гранул.
Через 5 сут после воспроизведения ЭОП ткань ПЖ представлена крупными дольками, большая часть которых имеет обычное строение ацинусов. В сохраненной ацинарной паренхиме встречаются мелкие и более крупные дольки ПЖ, где наряду с сохраненными ацинусами имеются трубчатые протоковые регенераты, а межацинарные пространства выполнены рыхлой многоклеточной соединительной тканью с наличием в ней клеток воспалительного инфильтрата в виде лимфоцитов и сегментоядерных лейкоцитов. Имеющиеся дольки или фрагменты их полностью представлены трубчатыми протоковыми регенератами с кистозным расширением их просвета. На полутонких срезах более четко видно скопление мелких протоков, разобщенных прослойкой соединительной ткани. Эпителиальные клетки протоков не содержат секреторных гранул. Часть новообразованных протоков включается в систему выводных протоков ацинусов, а другие существуют изолированно.
В дольках с трубчатыми регенератами более выражены признаки междолькового и внутридолькового склероза местами с полным замещением соединительной тканью протоковых регенератов с воспалительной инфильтрацией преимущественно из лимфоцитов.
Вне поврежденной ткани ПЖ в АК отмечается высокая степень накопления секреторных гранул с типичной апикальной ориентацией, в отдельных АК видна их диссоциация до базальных мембран.
Гистологически через 10 сут большая часть паренхимы ПЖ представлена крупными дольками, разобщенными узкими прослойками малоклеточной соединительной ткани. Наряду с этим в краевых отделах отдельных долек и субкапсулярно видны мелкие и более крупные атрофичные дольки, представленные кистозно измененными трубчатыми образованиями, разобщенными прослойками соединительной ткани, или полностью замещенные соединительной тканью с едва различимыми единичными протоками и островками Лангенгарса.
На полутонких срезах неповрежденная ацинарная паренхима представлена крупными ацинусами с высокой степенью накопления секреторных гранул в апикальных отделах цитоплазмы АК.
На 15 сут ЭОП гистологически ткань ПЖ представлена мелкими и крупными дольками, разобщенными рыхлой малоклеточной соединительной тканью без признаков воспаления в ней. На полутонких срезах неповрежденные дольки ПЖ представлены разной величины ацинусами с апикальной ориентацией секреторных гранул. Только субкапсулярно и в периваскулярных и перидуктальных пространствах имеются широкие прослойки соединительной ткани с признаками воспаления в виде диффузной лимфоидной и лейкоцитарной инфильтрации. В подлежащем сальнике имеется инфильтрат, отграниченный от ткани ПЖ фиброзной капсулой. Тяжи фиброзной ткани, отходящие от капсулы, разобщают инфильтрат и микроабсцессы в нем. Особенностью фиброзной капсулы является преобладание зрелой слабоваскуляризированной соединительной ткани.
Таким образом, при ЭОП без лечения в ПЖ в ранние сроки наблюдения развивался некроз ацинарной ткани долек с реактивным внутридольковым интерстициальным воспалением и нагноением, сменяющийся в более поздние сроки неполноценной регенерацией поврежденной ткани. Особенности незавершенного коагуляционного некроза ацинарной ткани с некробиотическими и дистрофическими изменениями отдельных протоковых и АК, с одной стороны, определяют миграцию лейкоцитов с нагноением некротизированных тканей, а с другой, - неполноценную заместительную регенерацию в виде изолированных трубчатых (протоковых) структур с последующим заместительным склерозом и полным отграничением от жизнеспособной ацинарной паренхимы. Следует отметить, что во все сроки наблюдения в АК вне зон некроза сохранялась высокая степень накопления секреторных гранул с замедлением выделения секрета в систему протоков.
Сохраняющаяся высокая секреторная активность в АК с замедлением выведения секрета в систему протоков вне зон повреждения является неблагоприятным фоном для регенерации ПЖ, создавая угрозу патологической секреции в интерстиций.
Лечение экспериментального острого панкреатита даларгином
На 5 сут ткань ПЖ представлена крупными дольками, разобщенными рыхлой многоклеточной соединительной тканью. Большая часть долек ПЖ сохраняет обычное строение ацинусов, другие представлены трубчатыми регенератами, разобщенными соединительной тканью с выраженной воспалительной инфильтрацией ее макрофагами, лейкоцитами и лимфоцитами. Отдельные трубчатые образования сохраняют тенденцию к формированию выводных протоков, а другие подвергаются кистозному расширению. Наиболее выраженная воспалительная инфильтрация отмечена в участках атрофированных долек. В неизмененной ацинарной паренхиме отсутствуют признаки междолькового склероза и воспалительной инфильтрации.
На полутонких срезах сохраненной ацинарной паренхимы дольки разобщены рыхлой малоклеточной соединительной тканью с единичными фибробластами и макрофагами в ней. Ацинусы в дольках разной величины с подчеркнутыми контурами базальных мембран и с апикальной ориентацией секреторных гранул вокруг центроацинозных протоков. Более выраженная степень накопления секреторных гранул в цитоплазме АК наблюдается только вокруг островков Лангерганса.
На 10 сут гистологически ткань ПЖ представлена разными по масштабу дольками, разобщенными жировой или рыхлой соединительной тканью. Только на отдельных участках долек можно видеть прослойки соединительной ткани в виде мелких очагов или тяжей с кистозно-расширенными трубчатыми структурами, которые четко отделены от неповрежденной ацинарной паренхимы и масштабы их малы.
При изучении полутонких срезов зон атрофичных долек в них прослеживаются единичные протоки с рыхлой соединительной тканью без признаков воспаления. В жизнеспособной ацинарной паренхиме ацинусы различной величины с малой степенью накопления секреторных гранул.
На 15 сут ПЖ имеет обычное дольчатое строение из мелких и крупных по масштабу долек, разобщенных жировой тканью или малоклеточной соединительной. В краевых отделах единичных долек или в междольковых пространствах можно встретить очаговые лимфоидные инфильтраты с заключенными в них кистозно-расширенными протоками.
При изучении полутонких срезов в дольках отсутствуют признаки межацинарного отека и склероза. АК отличаются малой степенью накопления секреторных гранул и локализуются только вокруг центроацинозных протоков.
Таким образом, лечение даларгином дало положительный эффект, проявившийся в репарации зон некроза без нагноения в виде протоковых трубчатых регенератов с четким отграничением их от сохраненной ацинарной паренхимы. Только на 10 сут еще сохранялись единичные атрофичные дольки с признаками внутридолькового склероза.
На 15 сут отсутствовали признаки склероза и воспаления. Во все сроки наблюдения прослеживалась низкая степень секреторной активности АК и сохранность контуров клеточных мембран, что следует связать с угнетающим влиянием даларгина на секреторную активность ПЖ и стабилизацией клеточных мембран.
Лечение экспериментального острого панкреатита октреотидом
На 5 сут ЭОП в ткани ПЖ отсутствовали признаки внутридолькового некроза и интерстициального воспаления. В ацинарной ткани долек имелись крупномасштабные изменения АК в виде крупновакуольной дистрофии преимущественно в базальных отделах цитоплазмы. При этом дистрофические изменения в АК не сопровождались воспалительной инфильтрацией. Наряду с этим у других животных отсутствовали дистрофические изменения и преобладали крупные дольки с подчеркнутым строением ацинусов в них и малым содержанием секреторных гранул в цитоплазме АК. Единичные дольки или краевые отделы крупных долек были представлены протоковыми регенератами с разрастанием соединительной ткани между трубчатыми структурами. Только в соединительной ткани этих долек и в периваскулярных пространствах отмечалась слабо выраженная лимфоидная воспалительная инфильтрация.
На полутонких срезах преобладали ацинусы с апикальной ориентацией секреторных гранул в цитоплазме АК. В отдельных клетках секреторные гранулы занимали все отделы цитоплазмы. Центроацинозные протоки не содержали секрета.
Гистологически на 10 сут ткань ПЖ представлена разными по масштабу дольками, разобщенными прослойками рыхлой малоклеточной соединительной ткани, с наличием в них малочисленных лейкоцитов и лимфоцитов. В толще отдельных долек имелись мелкие по масштабу протоковые регенераты с лимфоидной воспалительной инфильтрацией ткани. Встречались единичные дольки, представленные не только протоковыми регенератами с кистозным расширением трубчатых структур, но и с уплощением эпителия в них. Такие атрофичные дольки были окружены рыхлой соединительной тканью, содержащей лимфоциты и макрофаги.
Изучение полутонких срезов ацинарной ткани вне зон повреждений выявило низкую степень накопления секреторных гранул только в апикальных отделах цитоплазмы АК и стертость межацинарных границ.
На 15-е сут заболевания ацинарная ткань ПЖ представлена крупными и мелкими дольками, разобщенными рыхлой соединительной тканью без признаков воспаления в ней. Отмечается подчеркнутое строение капсулы ПЖ за счет утолщения ее и умеренно выраженного склероза. Вокруг отдельных междольковых протоков видны признаки перидуктального склероза и хронического воспаления в виде диффузной лимфоидной инфильтрации.
На полутонких срезах видна четкая структура ацинусов в дольках с апикальной локализацией секреторных гранул вокруг центроацинозных протоков и наличием секрета в их просвете. Степень накопления секреторных гранул выше, чем на предыдущие сроки наблюдения.
Таким образом, лечение ЭОП октреотидом по морфологическим данным подтверждает положительное влияние на течение заболевания. При этом не прогрессировали признаки некроза и интерстициального воспаления ацинарной ткани. Некротизированные участки ткани ПЖ подвергались регенерации путем протоковой трансформации с последующим склерозом и отграничением от жизнеспособной паренхимы. На 15-е сут заболевания полностью восстанавливалось обычное строение ПЖ при сохранении очагового хронического интерстициального воспаления. Следует отметить снижение секреторной активности АК до 10-х сут заболевания с полным восстановлением асинхронного ритма деятельности к 15-м сут.
Лечение экспериментального острого панкреатита фармкомпозицией
На 5 сут лечения ЭОП ткань ПЖ представлена разномасштабными дольками, разобщенными рыхлой малоклеточной соединительной тканью, местами многоклеточной за счет диффузной умеренно выраженной воспалительной инфильтрацией лейкоцитами, макрофагами и лимфоцитами. Степень воспалительной инфильтрации выражена вокруг долек, полностью представленных протоковыми пролифератами или частично в субкапсулярных отделах, с разобщением жизнеспособных долек на мелкие фрагменты. Вне этих изменений крупные и мелкие дольки ПЖ имеют четко сформированные крупные ацинусы, расширенные и лишенные секрета внутридольковые протоки и полнокровные кровеносные сосуды. Отдельные протоковые регенераты подвергались кистозному расширению и окружены плотной соединительной тканью с разной степенью ее васкуляризацией и хронического воспаления.
На полутонких срезах ацинусы с четкими контурами клеточных мембран, снижением базофилии цитоплазмы и малочисленными единичными зрелыми секреторными гранулами вокруг центроацинозных протоков, что косвенно указывает на угнетение синтеза панкреатических ферментов.
На 10 сут гистологически ПЖ сохраняет обычное дольковое строение с наличием крупных и мелких долек, разобщенных рыхлой, местами многоклеточной соединительной тканью за счет диффузной и крупноочаговой воспалительной инфильтрации, представленной эозинофильными сегментоядерными лейкоцитами, макрофагами и лимфоцитами. Капсула ПЖ на некоторых участках склерозирована и инфильтрирована лейкоцитами.
На полутонких срезах ацинусы в дольках имеют четкое строение, а в цитоплазме апикальных отделов содержатся немногочисленные секреторные гранулы. В отдельных ацинусах степень накопления секреторных гранул мала, а в периостровковых зонах она выше и занимает все отделы цитоплазмы. Асинхронность накопления секреторных гранул в цитоплазме АК свойственна ацинарной ткани в нормальных условиях функционирования.
На 15 сут ЭОП ткань ПЖ сохраняет обычное дольчатое строение без признаков междолькового и внутридолькового склероза. В дольках сохраняется четкая структура строения ацинусов с хорошо выраженной базофилией цитоплазмы и эозинофилией апикальных отделов цитоплазмы АК.
На полутонких срезах сохранены четкие контуры ацинусов с накоплением зрелых секреторных гранул вокруг центроацинозных протоков. Встречаются ацинусы как с малым накоплением гранул, так и более высоким в периостровковой зоне; просветы отдельных центроацинозных и внутридольковых протоков, заполненных секретом. В ПЖ сохраняются признаки асинхронности секреторного цикла и выделения секрета в просвет протоков.
На основании морфологического изучения ПЖ при ЭОП после лечения описываемой фармкомпозицией были выявлены признаки положительного влияния лекарственной терапии на течение заболевания. При этом не прогрессировал некроз, отсутствовали признаки нагноения некротизированных тканей, рано наступала регенерация поврежденных тканей с тенденцией отграничения их от неизмененной жизнеспособной паренхимы. К 15-м сут заболевания в ПЖ не оставалось признаков склероза и интерстициального воспаления с полным восстановлением асинхронного ритма секреции панкреатических ферментов.
Как следует из вышеприведенных данных, прогноз заболевания в каждой группе лечения благоприятный с полным восстановлением ацинарной ткани ПЖ без остаточных явлений склероза и воспаления к 15-м сут после воспроизведения ЭОП.
У всех выбранных для лечения препаратов (даларгин, октреотид и фармкомпозиция на их основе) есть общие морфологические критерии положительного влияния на течение ЭОП: предотвращение увеличения масштабов некроза и интерстициального воспаления, неполноценная регенерация поврежденной ацинарной ткани через протоковую трасформацию с последующим склерозом и отграничением от неповрежденной ткани долек с восстановлением ее секреторной активности.
Выраженное терапевтическое действие несмотря на крупномасштабные исходные повреждения оказывал даларгин. Интенсивная миграция лейкоцитов в некротизированные ткани при сохранении кровообращения в системе микроциркуляции приводила к репарации без нагноения и выраженного склероза. Под влиянием лечения даларгином уже на 10-е сут прослеживалась стабилизация клеточных мембран АК, а к 15 сут полностью восстанавливался асинхронный ритм деятельности ацинарной паренхимы.
Октреотид в лечении ЭОП приводил к уменьшению масштабов некроза, своевременной репарации, но длительно (до 10-х сут) сохранялись признаки очагового хронического интерстициального воспаления и внутриклеточного отека с резким снижением секреторной активности и только к 15-м сут полностью восстанавливалась функция ацинарной паренхимы.
Лечение ЭОП заявленной фармкомпозицией выявило более благоприятное воздействие на течение ЭОП с минимальными повреждениями к 5-10 сут и полным восстановлением функции ацинарной паренхимы к 15-м сут без остаточных явлений склероза и воспаления. Поэтому можно рекомендовать использование фармкомпозиции на основе даларгина и октреотида для подтверждения положительного терапевтического действия в дальнейших исследованиях.
Биохимическое исследование
Через 1 сут после воспроизведения ЭОП активность панкреатической амилазы возрастала в 1,7 раза (р<0,05) по сравнению с таковой интактных животных (таблица 1).
Через 5, 10 и 15 сут после воспроизведения ЭОП активность панкреатической амилазы превышала указанный показатель в 1,5, 1,3 и 1,2 раза соответственно (р<0,05). Даларгин, октреотид и их фармкомпозиция примерно в равной степени уменьшали активность амилазы в течение всего срока наблюдения, т.е. были примерно равно эффективны.
| Таблица 1. | |||||
| ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ НА АКТИВНОСТЬ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ АМИЛАЗЫ (МЕ/л) У КРЫС ПРИ ОСТРОМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПАНКРЕАТИТЕ (ЭОП) (М±m) | |||||
| Группа крыс | Срок после воспроизведения ЭОП, сутки | ||||
| 0 | 1 | 5 | 10 | 15 | |
| Интактные животные | 1148±37 | ||||
| Контроль | 1953±85* | 1689±28* | 1520±17* | 1421+15* | |
| Даларгин | 1307±13# | 1228+14# | 1027±96# | ||
| Октреотид | 1440±21# | 1317±24# | 1137+19# | ||
| Фармкомпозиция даларгин + октреотид | 1490±19# | 1343+15# | 1245+32# | ||
| Примечание. Здесь и далее в таблицах: * или # - р<0,05 - различия значимы по сравнению с интактными животными или с контролем соответственно. |
Анализ динамики активности другого панкреатического фермента - липазы - также показал существенные изменения ее активности при ЭОП (таблица 2). Так, например, через 1 сут после воспроизведения ЭОП активность липазы превышала таковую интактных животных в 1,6 раза (р<0,05), через 5, 10 и 15 сут - в 1,3, 1,2 и 1,1 раза соответственно (р<0,05). Даларгин и октреотид в равной степени нормализовали этот показатель. Фармкомпозиция даларгина с октреотидом действовала сходным образом. Более того, она через 15 сут была значимо (р<0,05) эффективнее октреотида.
| Таблица 2. | |||||
| ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ НА АКТИВНОСТЬ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ ЛИПАЗЫ (МЕ/л) У КРЫС ПРИ ОСТРОМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПАНКРЕАТИТЕ (ЭОП) (М±m) | |||||
| Группа крыс | Срок после воспроизведения ЭОП, сутки | ||||
| 0 | 1 | 5 | 10 | 15 | |
| Интактные животные | 3,79±0,06 | ||||
| Контроль | 5,97+0,28* | 4,88+0,05* | 4,42+0,04# | 4,16+0,03* | |
| Даларгин | 4,16+0,06# | 3,98+0,03# | 3,72+0,02# | ||
| Октреотид | 4,14+0,03# | 3,90+0,03# | 3,82±0,04# | ||
| Фармкомпозиция даларгин + октреотид | 4,13+0,02# | 3,87+0,03# | 3,66±0,03#° | ||
| ° - р<0,05 - различия значимы по сравнению с октреотидом. |
Исследование содержания продуктов ПОЛ (уровень малонового диальдегида /МДА/) в периферической крови (плазма) показало, что через 1 сут. после воспроизведения ЭОП концентрация МДА резко возрастала и превышала таковую интактных животных в 2,4 раза (р<0,05) (таблица 3). Через 5, 10 и 15 сут после воспроизведения ЭОП содержание МДА превышало указанный показатель в 1,9, 1,7 и 1,5 раза соответственно (р<0,05). Даларгин и октреотид в равной степени нормализовали этот показатель. Фармкомпозиция даларгина с октреотидом была более эффективна в этом отношении. Так, например, через 10 сут после воспроизведения ОП уровень МДА после лечения фармкомпозицией был достоверно (р<0,05) ниже, чем после курса применения даларгина.
| Таблица 3. | |||||
| ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ НА СОДЕРЖАНИЕ МАЛОНОВОГО ДИАЛЪДЕГИДА(нмоль/мл) У КРЫС ПРИ ОСТРОМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПАНКРЕАТИТЕ (ЭОП) (М±m) | |||||
| Группа крыс | Срок после воспроизведения ЭОП, сутки | ||||
| 0 | 1 | 5 | 10 | 15 | |
| Интактные животные | 5,91±0,13 | ||||
| Контроль | 14,1±1,3* | 11,3±0,4* | 9,83±0,25* | 8,80±0,06* | |
| Даларгин | 9,31±0,47# | 8,60±0,15# | 7,37±0,18# | ||
| Октреотид | 8,65±0,16# | 7,41±0,35# | 5,65±0,22# | ||
| Фармкомпозиция даларгин + октреотид | 8,16±0,47# | 7,13±0,35#° | 6,47±0,44# | ||
| ° - р<0,05 - различия значимы по сравнению с даларгином. |
Пример 4. Лечебное действие композиции октреотида и даларгина у крыс с острым панкреатитом (ОП) средней и тяжелой степеней тяжести.
Опыты проведены на белых нелинейных крысах-самцах массой 220-300 г, у которых воспроизводили ОП так, как это было описано выше в примере 2. Моделировали ОП средней и тяжелой степеней тяжести. Животные контрольных групп не получали лечения (им вводили системно-внутрибрюшинно /в/б/ - изотонический раствор натрия хлорида /NaCl/ в течение 3 суток /2 раза/сутки/). Подопытным животным через 24 часа после создания ОП вводили в/б в течение 3 суток (2 раза/сутки) октреотид или даларгин в разных дозах либо их композицию.
Полученные результаты представлены в таблицах 4 и 5.
| Таблица 4 | ||
| Изменение летальности у крыс с острым панкреатитом тяжелой степени тяжести под влиянием октреотида, даларгина и их комбинаций | ||
| Препарат (доза, мг/кг) | Число крыс | Летальность, % |
| Контроль (изотонический раствор NaCl) | 60 | 48 |
| Октреотид (0,1) | 71 | 32х |
| Октреотид (0,2) | 20 | 30 |
| Октреотид (0,3) | 20 | 35 |
| Октреотид (0,4) | 40 | 23х |
| Октреотид (0,5) | 36 | 25х |
| Октреотид (0,6) | 32 | 22х |
| Октреотид (0,7) | 36 | 17х |
| Октреотид (0,8) | 40 | 20х |
| Октреотид (0,9) | 32 | 19х |
| Даларгин (0,1) | 40 | 40 |
| Даларгин (0,2) | 32 | 41 |
| Даларгин (0,3) | 53 | 34х |
| Даларгин (0,4) | 16 | 38 |
| Даларгин (0,5) | 15 | 40 |
| Даларгин (0,6) | 48 | 33х |
| Даларгин (0,7) | 16 | 31 |
| Даларгин (0,8) | 24 | 25х |
| Даларгин (0,9) | 26 | 23х |
| Даларгин (1,0) | 20 | 20х |
| Октреотид (0,1) + даларгин (0,1) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,2) + даларгин (0,2) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,3) + даларгин (0,3) | 10 | 20 |
| Октреотид (0,4) + даларгин (0,4) | 10 | 20 |
| Октреотид (0,5) + даларгин (0,5) | 10 | 20 |
| Октреотид (0,6) + даларгин (0,6) | 10 | 20 |
| Октреотид (0,7) + даларгин (0,7) | 10 | 20 |
| Октреотид (0,8) + даларгин (0,8) | 10 | 20 |
| Октреотид (0,2) + даларгин (0,1) | 10 | 20 |
| Октреотид (0,3) + даларгин (0,1) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,4) + даларгин (0,1) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,5) + даларгин (0,1) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,6) + даларгин (0,1) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,7) + даларгин (0,1) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,8) + даларгин (0,1) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,9) + даларгин (0,1) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,3) + даларгин (0,2) | 8 | 25 |
| Октреотид (0,4) + даларгин (0,2) | 8 | 37 |
| Октреотид (0,5) + даларгин (0,2) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,6) + даларгин (0,2) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,7) + даларгин (0,2) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,8) + даларгин (0,2) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,9) + даларгин (0,2) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,1) + даларгин (0,3) | 10 | 20 |
| Октреотид (0,2) + даларгин (0,3) | 8 | 25 |
| Октреотид (0,4) + даларгин (0,3) | 8 | 25 |
| Октреотид (0,5) + даларгин (0,3) | 8 | 37 |
| Октреотид (0,6) + даларгин (0,3) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,7) + даларгин (0,3) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,8) + даларгин (0,3) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,9) + даларгин (0,3) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,1) + даларгин (0,6) | 10 | 10х |
| Октреотид (0,2) + даларгин (0,6) | 10 | 10х |
| Октреотид (0,3) + даларгин (0,6) | 10 | 10х |
| Октреотид (0,4) + даларгин (0,6) | 10 | 20 |
| Октреотид (0,5) + даларгин (0,6) | 10 | 20 |
| Октреотид (0,7) + даларгин (0,6) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,8) + даларгин (0,6) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,9) + даларгин (0,6) | 10 | 30 |
| Октреотид (0,1) + даларгин (0,2) | 10 | 20 |
| Октреотид (0,1) + даларгин (0,4) | 10 | 20 |
| Октреотид (0,1) + даларгин (0,5) | 10 | 20 |
| Октреотид (0,1) + даларгин (0,7) | 10 | 10х |
| Октреотид (0,1) + даларгин (0,8) | 24 | 4х*° |
| Октреотид (0,1) + даларгин (0,9) | 20 | 0х*° |
| Октреотид (0,1) + даларгин (1,0) | 10 | 10х |
| Примечание. Различия статистически значимы (точный метод Фишера) - р<0,05: | ||
| х - по сравнению с контролем; | ||
| * - по сравнению с октреотидом в дозе 0,1 мг/кг; | ||
| ° - по сравнению с даларгином в дозах 0,8 и 0,9 мг/кг соответственно. |
| Таблица 5 | ||
| Изменение летальности у крыс с острым панкреатитом средней степени тяжести под влиянием октреотида, даларгина и их комбинаций (применение препаратов с лечебной целью) | ||
| Препарат (доза, мг/кг) | Число крыс | Летальность, % |
| Контроль (изотонический раствор NaCl) | 68 | 29 |
| Октреотид (0,1) | 60 | 17х |
| Даларгин (0,8) | 60 | 15х |
| Даларгин (0,9) | 60 | 13х |
| Октреотид (0,1) + даларгин (0,8) | 30 | 0х*° |
| Октреотид (0,1) + даларгин (0,9) | 30 | 0х*° |
| Примечание. Различия статистически значимы (точный метод Фишера) - р<0,05: | ||
| х - по сравнению с контролем; | ||
| * - по сравнению с октреотидом в дозе 0,1 мг/кг; | ||
| ° - по сравнению с даларгином в дозах 0,8 и 0,9 мг/кг соответственно. |
Из таблицы 4 видно, что летальность контрольных крыс с ОП тяжелой степени тяжести составляла 48%. По отдельности октреотид в дозах 0,1, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 и 0,9 мг/кг и даларгин в дозах 0,3, 0,6, 0,8, 0,9 и 1,0 мг/кг значимо (р<0,05) уменьшали летальность животных до 17-34%. Композиция октреотида и даларгина значимо (р<0,05) снижала летальность крыс (до 0-10%) по сравнению с контролем в следующих случаях: октреотид (0,1, 0,2 и 0,3 мг/кг) + даларгин (0,6 мг/кг); октреотид (0,1 мг/кг) + даларгин (0,7, 0,8, 0,9 и 1,0 мг/кг). При этом наиболее выраженное действие оказывали комбинации октреотид (0,1 мг/кг) + даларгин (0,8 мг/кг) (летальность составляла 4%) и октреотид (0,1 мг/кг) + даларгин (0,9 мг/кг) (летальность была равна 0), которые значимо (р<0,05) давали отчетливый суммированный эффект (т.е. октреотид в дозе 0,1 мг/кг и даларгин в дозах 0,8 и 0,9 мг/кг соответственно превосходили по летальности композицию). Следовательно, имеется композиция октреотида (0,1 мг/кг) и даларгина (0,8 и 0,9 мг/кг), которая у крыс с ОП тяжелой степени тяжести способна вызывать отчетливое суммирование эффектов и оказывать выраженное лечебное действие, уменьшая летальность животных до 0-4%.
Аналогичные результаты были получены и в опытах на крысах с ОП средней степени тяжести (табл.5). Действительно, было обнаружено, что летальность в группах крыс, получавших по отдельности октреотид (0,1 мг/кг) или даларгин (0,8 и 0,9 мг/кг), составляла 13-17% (р<0,05; по сравнению с контролем, равным 29%).
Комбинации октреотид (0,1 мг/кг) + даларгин (0,8 мг/кг) и октреотид (0,1 мг/кг) + даларгин (0,9 мг/кг) значимо (р<0,05) давали отчетливый суммированный эффект (в обоих случаях летальность была равна 0), уступая по летальности октреотиду в дозе 0,1 мг/кг и даларгину в дозах 0,8 и 0,9 мг/кг соответственно.
Таким образом у крыс с ОП средней и тяжелой степенями тяжести композиция октреотид (0,1 мг/кг) и даларгин (0,8 и 0,9 мг/кг) дает отчетливое суммирование эффектов и оказывает выраженное лечебное действие, уменьшая летальность животных до 0-4%. Таким образом в результате приведенных исследований установлено, что описываемая фармкомпозиция обладает высокой панкреатотропной активностью и оказывает выраженное лечебное действие при ЭОП.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гостищев В.К., Федоровский Н.М., Глушко В.А. Анналы хирургии, 1997, №4, стр.60-65.
2. Иванов Ю.В. Клиническая медицина, 1999, №9, стр.37-39.
3. Виноградов В.А., Полонский В.М. Терапевтический архив, 1988, т.60, №8, стр.147-153
4. Заболотских И.Б., Чуприн С. В., Курзанов А.Н. Вестник интенсивной терапии, 2002, №4, стр.50-53.
5. Симаварян П.С.Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 1972, №3, стр.69-72.
6. Комаров Ф.И., Коровкин Б.Ф. Биохимические показатели в клинике внутренних болезней. М., 2002.
7. Yagi К. A simple fluorometric assay for lipoperoxide in blood plasma. Biochem. Med., 1976, vol.15. No2, p.212-216.
1. Фармацевтическая композиция, обладающая панкреатотропной активностью, отличающаяся тем, что в качестве активных компонентов содержит октреотид и даларгин в терапевтически эффективных количествах.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что выполнена в лиофилизованной форме.
3. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит рН регулирующее вещество и воду.
4. Фармацевтическая композиция по п.3, отличающаяся тем, что в качестве рН регулирующего вещества используют ацетат аммония при следующем соотношении компонентов, г:
| даларгин | 0,5-5,0 |
| октреотид | 0,05-0,5 |
| ацетат аммония | 0,71 |
| 1 М уксусная кислота | до рН 4,5-5,5 |
| вода для инъекции | до 1 |
5. Способ получения фармацевтической композиции по п.1, отличающийся тем, что активные ингредиенты растворяют в очищенной воде и полученный раствор подвергают лиофилизации.
