Иммунотерапевтическое средство, пригодное для комбинированного лечения туберкулеза в сочетании с другими лекарственными средствами
Изобретение касается иммунотерапевтического средства, содержащего фрагменты клеточной стенки вирулентного штамма комплекса Mycobacterium tuberculosis. В изобретении раскрывается способ получения иммунотерапевтического средства, включающий культивирование клеток микобактерий, их гомогенизацию в присутствии неионогенного ПАВ с получением целевого продукта в виде гомогената из нефрагментированных клеток, фрагментов клеточных стенок и солюбилизированных клеточных веществ. Способ может дополнительно включать стадии центрифугирования гомогената для отделения фрагментов клеточной стенки, промывания их и лиофилизации очищенного целевого продукта. Изобретение относится также к фармацевтическим препаратам, содержащим иммунотерапевтическое средство, и к его применению для получения лекарственного средства для комбинированного лечения туберкулеза в сочетании с другими лекарственными средствами. Использование иммунотерапевтического средства, полученного способом по изобретению, позволяет увеличить эффективность используемых лекарственных средств в отношении индукции иммунного ответа против микобактерий, не находящихся в активном метаболизме, снижая тем самым риск возникновения резистентности к лекарственным препаратам. 7 н. и 27 з.п. ф-лы, 6 табл.
Техническая область
Данное изобретение относится к способу получения иммунотерапевтического средства, пригодного для комбинированного лечения туберкулеза в сочетании с другими лекарственными средствами. Оно основано на фрагментах клеточной стенки вирулентного штамма комплекса Mycobacterium tuberculosis и на иммунотерапевтическом средстве, полученном указанным выше способом.
Предшествующая область
Туберкулез представляет собой хроническое инфекционное заболевание, вызываемое бациллами комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTB-C), который в настоящее время включает следующие виды: M.tuberculosis, M.bovis, M.microti и M.africanum.
По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) ежегодно возникают 8000000 новых случаев туберкулеза и приблизительно 3000000 людей умирают. Полагают, что во всем мире инфицировано 2000000000 людей.
Современная вакцина, применяемая для профилактического лечения туберкулеза, основана на бактерии из так называемого штамма BCG (бацилла Кальмета-Герена), разновидности M.bovis.
С одной стороны, согласно WO-A-03018053 она представляет собой лучшую доступную в настоящее время вакцину для индукции иммунитета против туберкулеза. Однако безопасность и эффективность этой вакцины для людей в некоторых странах остается сомнительной, так как она неполностью защищает взрослых от легочного туберкулеза.
С другой стороны, в WO-A-03004520 как известный факт описано, что наиболее эффективное лечение для борьбы с туберкулезом у инфицированных людей, и у тех, у кого развивается заболевание, и у тех, у кого не развивается, состоит во введении определенных лекарственных средств, включающих в себя изониазид, в течение периода нескольких месяцев.
Это продолжительное лечение может индуцировать развитие микроорганизмов, устойчивых к этим лекарственным средствам, когда лечение не завершено, и, кроме того, указанные выше лекарственные средства действуют только тогда, когда у бациллы существует активный метаболизм (т.е., когда она растет), но не тогда, когда у нее нет активного метаболизма. Это представляет собой значительное неудобство вследствие того, что в течение инфекции туберкулеза бациллы сосуществуют в фазе активного метаболизма и в фазе неактивного метаболизма.
Как описано в патенте US4724144, одна из возможностей разрешения этих проблем состоит в применении для лечения туберкулеза основанного на погибших клетках M.vaccae иммунотерапевтического средства в качестве адъюванта вместе с введением других лекарственных средств, таких как рифампицин и изониазид.
Однако в патенте US6001361 указано, что такое вспомогательное средство не применялось в широкомасштабной вакцинации людей против туберкулеза, и существует очень мало информации о его эффективности.
Поэтому для лечения туберкулеза необходимо иммунотерапевтическое средство, содействующее данным лекарственным средствам, и данное средство не должно индуцировать развитие резистентных микроорганизмов, а также индуцировать иммунный ответ даже против бацилл в неактивной фазе.
Авторы данного изобретения нашли способ, позволяющий получать новое иммунотерапевтическое средство, пригодное для комбинированного лечения туберкулеза в сочетании с другими лекарственными средствами. Данное иммунотерапевтическое средство содержит фрагменты клеточной стенки вирулентного штамма MTB-C, которые могут увеличить эффективность связанных лекарственных средств в отношении индукции эффективного иммунного ответа против бацилл, не находящихся в активном метаболизме, таким образом также снижая риск резистентности.
Цель изобретения
Целью данного изобретения является создание способа получения иммунотерапевтического средства, содержащего фрагменты клеточной стенки вирулентного штамма MTB-C, пригодного для комбинированного лечения туберкулеза в сочетании с другими лекарственными средствами.
Иммунотерапевтическое средство, получаемое с применением указанного ранее способа, и применение данного средства для получения лекарственного средства для комбинированного лечения туберкулеза в сочетании с другими лекарственными средствами также является целью данного изобретения.
Кроме того, дополнительным объектом являются фармацевтические соединения, полученные с данным иммунотерапевтическим средством.
Подробное описание изобретения
Авторы данного изобретения нашли способ получения иммунотерапевтического средства, содержащего фрагменты клеточной стенки из вирулентного штамма комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTB-C). Он отличается тем, что включает следующие стадии:
- Культивирование вирулентного штамма MTB-C в течение трех недель или более и
- Гомогенизацию клеточной культуры в неионном поверхностно-активном веществе.
Вирулентный штамм может представлять собой любой вирулентный штамм MTB-C, так как туберкулезная бацилла является очень стабильной и в иммуногенных соединениях не описано ни одной мутации. Один из наиболее часто применяемых исследователями в данной области штаммов и рассматриваемый как эталонный штамм представляет собой так называемый штамм H37Rv, который можно свободно получить, например, из National Collection of Type Cultures (NCTC), London, Great Britain (депозитарный номер NC007416).
Вирулентный штамм можно культивировать инокуляцией в хорошо известной специалистам в данной области культуральной среде. Она может представлять собой твердые среды, такие как агаровые среды типа Middlebrook 7H10 или 7H11, или жидкие среды, такие как культуральные среды Sauton или Proskauer-Beck.
В отношении данного изобретения культуру необходимо вести в течение периода времени трех недель или более, предпочтительно от 3 до 4 недель. Температуру культуры предпочтительно поддерживать в диапазоне от 34°C до 38°C.
После завершения культивирования, если его проводили в твердой фазе, для получения колоний их соскребают с планшетов во избежание извлечения среды (агара). Однако если культивирование проводили в жидкой фазе, клетки концентрируют и отмывают с применением обычных известных специалисту в данной области способов (например, центрифугирование).
Гомогенизацию штаммов проводят в забуференных средах при нейтральном pH. В данном изобретении важно, чтобы гомогенизацию проводили в присутствии неионного поверхностно-активного вещества, которое способствует получению мелкоизмельченных частиц клеточной стенки и, по меньшей мере, частично эмульсий нежелательных липидный фракций.
Гомогенизацией клетки MTB-C разрушают и получают небольшие фрагменты клеточной стенки.
Гомогенизацию можно проводить с применением разрушения ультразвуком или небольшими шариками с диаметром приблизительно 1 мм (например, из кремния или кремния-циркония) в механическом гомогенизаторе. Можно применять такой механический гомогенизатор, как модель BEADBEATER компании Biospec.
Забуференные среды делают, например, с буфером PBS (солевой раствор фосфатного буфера).
Тип применяемого неионного поверхностно-активного вещества не важен, хотя предпочтительно выбрать один из группы алкилфенолэтоксилата и сложного этоксилированного эфира сорбитана. Лучше, чтобы неионное поверхностно-активное вещество выбирали из соединений октилфенолэтоксилата. Наиболее предпочтительно применять октилфенолэтоксилат с 7-8 молями этиленоксида; например, их можно найти в продаже под названием TRITON X-114. Концентрация неионных поверхностно-активных веществ в течение гомогенизации находится в диапазоне от 1 до 5% общей гомогенизируемой массы.
Гомогенизируемую массу, содержащую желательные фрагменты клеточной стенки, для отделения данных фрагментов как от нефрагментированных клеток, так и от растворенных соединений подвергают обычной обработке.
Например, после отделения кремния или кремния-циркония (если применяют) посредством декантации, гомогенизированный продукт умеренно центрифугируют при скорости менее чем 5000 об./мин для удаления нефрагментированных клеток в виде осадка.
Затем полученный супернатант центрифугируют при большей скорости (например, большей чем 15000 об./мин) для удаления растворенных элементов, концентрирующихся в жидком супернатанте, тогда как фрагменты клеточной стенки концентрируются в осадке. С применением обычных известных специалисту в данной области способов, таких как отмывка в буфере PBS и центрифугирование, данный способ можно повторять несколько раз до тех пор, пока не получится совершенно чистый супернатант; затем его отбрасывают.
Полученный осадок, содержащий фрагменты клеточной стенки, диспергируют в буфере PBS и подвергают химическим (например, обработка формальдегидом) или физическим (например, обработка в автоклаве или пастеризация) способам обработки для гарантии полной инактивации клеток MTB-C, которые могли выжить после фрагментации и очистки.
В конце дисперсию фрагментов клеточной стенки в буфере PBS распределяют по ампулам и лиофилизируют при температуре от -15°C до -25°C и при пониженном давлении от 0,1 до 0,5 мбар.
Таким образом, получают и хранят при -70°C ампулы с фрагментами клеточной стенки MTB-C, которые составляют иммунотерапевтическое средство по данному изобретению.
Из иммунотерапевтического средства по данному изобретению можно получать определенные фармацевтические соединения, и это тоже представляет собой одну из целей данного изобретения; их можно получать в виде масляной эмульсии в воде (М/В) или в виде липосом. Предпочтительны фармацевтические композиции типа липосом.
Формирование липосом можно проводить с применением обычных способов, хорошо известных специалисту в данной области. Например, липосомы можно получать, смешивая лиофилизированные фрагменты клеточной стенки и вспомогательные липиды в водной среде для образования липосом и гомогенизируя смесь с применением стандартного способа, такого как высокоскоростной шейкер.
Вспомогательные липиды для получения хромосом широко известны специалистам в данной области. Как правило, они включают в себя фосфолипиды с суммарным нейтральным и/или отрицательным зарядом и стерины.
Обычно наиболее часто встречающийся компонент в лизосомах представляет собой фосфатидилхолин, который можно синтезировать или выделить из натуральных источников. Часто используемый покупаемый продукт представляет собой соевый лецитин.
Применяемые при получении липосом стерины могут, среди прочего, представлять собой холестерин или желчные кислоты.
Предпочтительно липосомы формируют с применением смеси соевого лецитина и холата.
Липосомы, необязательно, могут иметь добавки для увеличения их стабильности, такие как витамин E, действующий в качестве антиоксиданта липидов.
Полученные липосомы варьируют в размере, но 99,9% меньше чем 1 микрон.
Липосомы можно подвергать лиофилизации для получения являющегося целью изобретения иммунотерапевтического средства в виде лиофилизированных липосом.
Цель изобретения также включает в себя применение иммунотерапевтического средства для изготовления лекарственного средства для комбинированного лечения туберкулеза в сочетании с другими лекарственными средствами.
Предпочтительно, хотя и не исключая другие способы введения, являющееся целью изобретения иммунотерапевтическое средство вводят парентеральным способом.
Среди известных противотуберкулезных лекарственных средств предпочтительные лекарственные средства для комбинированного лечения с терапевтическим средством по данному изобретению представляют собой изониазид и рифампицин.
Объединение иммунотерапевтического средства по изобретению и противотуберкулезных лекарственных средств для комбинированного лечения данного заболевания можно проводить одновременно или последовательно, например, посредством одновременного введения лекарственных средств и иммунотерапевтического средства, или посредством предшествующего введения лекарственных средств с последующим введением иммунотерапевтического средства.
Неожиданно обнаружено, что комбинированное лечение туберкулеза посредством введения иммунотерапевтического средства по изобретению вместе с лекарственными средствами для лечения туберкулеза увеличивает эффективность данных лекарственных средств, так как оно индуцирует иммунный ответ против бацилл, которые не находятся в фазе активного метаболизма, таким образом, также уменьшая риск развития резистентности.
Следующие ниже примеры предоставляют специалисту в данной области подробное описание конкретных вариантов осуществления изобретения.
Пример 1. Получение иммунотерапевтического средства
Приблизительно 80-100 планшетов агара типа Middlebrook 7H11 инкубировали с культурой H37Rv, предоставленной из National Collection of Type Cultures (NCTC), London, Great Britain (депозитарный номер NC007416). Концентрация колониеобразующих единиц, инокулированных в каждый планшет, составляет 105-106 КОЕ. Планшеты инкубировали в течение 21 суток (3 недели) при температуре от 34°C до 38°C.
После инкубации колонии удаляли из агара с применением шпателя и выполняли это осторожно, чтобы не удалить культуральную среду. Получали от 15 до 18 г неочищенного экстракта.
Неочищенный экстракт диспергируют приблизительно в 20 мл буфера PBS, содержащего 4% по массе TRITON X-114. Добавляют 35 мл кремниевых-циркониевых шариков с диаметром размером 1 мм, а затем проводят механическую гомогенизацию с применением гомогенизатора BEADBEATER, произведенного в Biospec.
Гомогенизации продолжали до тех пор, пока не выявляли менее 5 целых бацилл после просмотра 100 полей при увеличении 1000 после окрашивания способом Циля-Нильсена.
Полученный в результате гомогенизации продукт отделяли от кремниевых-циркониевых шариков декантацией. Их отмывали в забуференном PBS растворе с 4% по массе TRITON X-114, а жидкость после всех отмывок собирали вместе с продуктом, получая, таким образом, общий объем приблизительно 80-100 мл.
Затем полученный в результате гомогенизации продукт и жидкость от отмывки центрифугировали при 3000 об./мин в течение 30 минут в охлажденной центрифуге при 4°C так, чтобы удалить нефрагментированные клетки из осадка.
Супернатант сохраняют.
Затем супернатант центрифугируют при 15100 об./мин (эквивалентно 27000 g) в течение 60 минут при 4°C, получая, таким образом, беловатый осадок, содержащий фрагменты клеточной стенки.
Осадок оставляют, а желтоватый супернатант удаляют.
Осадок сначала отмывают в буфере PBS (3×3 мл), а затем редиспергируют в 3 мл буферного раствора, доводят до 20 мл буфером PBS, а затем снова центрифугируют при 15100 об./мин в течение 60 минут при 4°C.
Полученный супернатант отбрасывают.
Отмывку и центрифугирование повторяют, а полученный супернатант является полностью прозрачным и его отбрасывают.
Осадок, содержащий фрагменты клеточной стенки, отмывают в буфере PBS (3×3 мл) и редиспергируют в 12 мл буфера PBS.
После центрифугирования и отмывки весь объем, полученный из дисперсии фрагментов клеточной стенки в буфере PBS, собирают в контейнер и пастеризуют обработкой при 65°C в течение 1 часа.
Затем смесь быстро охлаждают в ледяной бане, а дисперсию фрагментов клеточной стенки распределяют в криопробирки при объеме 1 мл на криопробирку.
Криопробирки с диспергированными фрагментами клеточной стенки замораживают при -70°C и лиофилизируют при температуре от -15°C до -22°C и при пониженном давлении от 0,180 до 0,400 мбар.
Получают от 1 до 1,5 г иммунотерапевтического средства.
Пример 2. Получение липосом с иммунотерапевтическим средством
В химическом стакане взвешивают от 740 до 770 мг полученного в примере 1 продукта. Затем добавляют 20 мл дисперсии соевого лецитина фармацевтического качества в этаноле (1 кг лецитина в 1 литре абсолютного этанола) и 7 мл раствора холата натрия фармацевтического качества в воде (200 г холата натрия в 1 литре бидистиллированной воды).
pH доводят до значения от 7,7 до 8 раствором 0,997 N HCl.
Липосомы получают посредством гомогенизации с применением высокоскоростного шейкера.
Полученную таким способом дисперсию липосом разбавляют до 10% в бидистиллированной воде; pH доводят до значения от 7,1 до 7,3 раствором 0,997 N HCl.
Дисперсию липосом распределяют по криопробиркам (0,5 мл на пробирку) и замораживают при -80°C.
Затем их лиофилизируют и иммунотерапевтическое средство (цель изобретения) получают в виде липосом.
Пример 3. Эффективность иммунотерапевтического средства в качестве адъюванта при лечении лекарственными средствами
В модели инфекции применяли самок мышей BALB/c, 129/Sv, C57BL/6 и DBA/2 в возрасте от 6 до 8 недель и без специфического патогенного микроорганизма.
Вирулентный штамм Mycobacterium tuberculosis культивировали в среде Proskauer-Beck, пока не достигалась середина логарифмической фазы, и оставляли в аликвотах по 1 мл при -70°C до применения.
Мышей инокулировали в устройстве аэрозольной инокуляции Middelbrook, обеспечивающем инокулят в легком приблизительно из 10-50 живых бацилл.
Концентрацию бацилл, т.е. количество живых бацилл, определяли посредством инкубации серийных разведений гомогенизированного левого легкого и селезенки в агаре типа Middelbrook 7H11. Образцы левого легкого и селезенки гомогенизировали в присутствии 1 мл буфера PBS.
I) Обработка одной дозой иммунотерапевтического средства в липосомах одновременно с изониазидом
Инфицированных мышей вида BALB/c разделяли на три группы:
- Обработанные только изониазидом при дозе 25 мг/кг в сутки в течение 5 суток в неделю в течение 6 недель (контроль), или
- Обработанные изониазидом при дозе 25 мг/кг в сутки в течение 5 суток в неделю в течение 6 недель вместе с интраназальной 180 мкг дозой иммунотерапевтического средства в липосомах, цель изобретения, или
- Обработанные изониазидом при дозе 25 мг/кг в сутки в течение 5 суток в неделю в течение 6 недель вместе с интраперитонеальной 180 мкг дозой иммунотерапевтического средства в липосомах, цель изобретения.
Обработку антибиотиком изониазидом начинали на неделе 9 и продолжали до недели 15.
Дозу иммунотерапевтическое средство в липосомах, цель изобретения, вводили на неделе 13.
На неделе 15 животных умерщвляли и определяли концентрацию бацилл в левом легком и селезенке.
Рассчитанные описанным во введении к разделу C способом концентрации бацилл в легких вакцинированных мышей были значимо меньшими, тогда как результаты в селезенке от контрольной группы статистически не отличались.
Результаты, выраженные как КОЕ/мл, показаны в таблице 1.
| Таблица 1 | ||
| Группа мышей | Легкое | Селезенка |
| Контроль | 7,5±2,89 | 0,75±0,33 |
| Интраназально | 2±0* | 0,4+0,2 |
| Интраперитонеально | 2±0* | 0,52±0,44 |
| *=статистически значимая по сравнению с контрольной группой величина, p<0,05 |
Можно видеть, что животные, обработанные иммунотерапевтическим средством в липосомах, вводимом интраназально и интраперитонеально, одновременно с изониазидом, продемонстрировали значительно меньшее количество бацилл в легких, чем мыши, обработанные только антибиотиком изониазидом.
Учитывая, что количество рассчитанных бацилл включает в себя все бациллы, и те бациллы, которые находятся в активной фазе, и те бациллы, которые находятся в неактивной фазе, обработка иммунотерапевтическим средством в липосомах позволяет уменьшить время обработки антибиотиком, так как значительно уменьшает количество бацилл, которые со временем могут перейти в активную фазу.
II) Обработка тремя дозами иммунотерапевтического средства в липосомах после обработки рифампицином и изониазидом
Инфицированных мышей вида 129/Sv разделяли на две группы:
- Обработанные изониазидом при дозе 25 мг/кг в сутки в течение 5 суток в неделю в течение четырех недель и рифампицином при дозе 10 мг/кг в сутки в течение 5 суток в неделю в течение четырех недель (контроль), и
- Также обработанные тремя 180 мкг дозами иммунотерапевтического средства в липосомах, цель изобретения, вводимого подкожно после обработки рифампицином и изониазидом.
Обработку антибиотиком изониазидом начинали на неделе 9 и продолжали в течение 4 недель. На неделе 13 начинали обработку рифампицином и заканчивали на неделе 17.
На неделях 17, 19 и 21 вводили три дозы иммунотерапевтического средства в липосомах, цель изобретения.
На неделе 22 животных умерщвляли и рассчитывали концентрации бацилл в левом легком и в селезенке.
Концентрация бацилл в легких вакцинированных животных по сравнению с контрольной группой была значимо меньшей, тогда как в селезенке статистических различий между контрольной группой мышей и мышами, обработанными иммунотерапевтическим средством в липосомах, не выявлено.
Результаты, выраженные в виде log10КОЕ/мл, показаны в таблице 2:
| Таблица 2 | ||
| Группа мышей | Легкое | Селезенка |
| Контроль | 2,67±0,83 | 2,35±1,18 |
| Подкожно | 1,61±0,58* | 0,4±0,2 |
| *=статистически значимая по сравнению с контрольной группой величина, p<0,05 |
Можно видеть, что мыши, обработанные иммунотерапевтическим средством в липосомах, вводимым подкожно и после обработки антибиотиками изониазидом и рифампицином, продемонстрировали значительно меньшее количество бацилл в легких, чем мыши, обработанные только антибиотиками.
В данном случае можно сделать тот же вывод, что и в разделе I).
III) Обработка тремя дозами иммунотерапевтического средства в липосомах одновременно с изониазидом
Инфицированных мышей вида C57BL/6 разделяли на две группы:
- Обработанные только изониазидом при дозе 25 мг/кг в сутки в течение 5 суток в неделю в течение 8 недель (контроль) и
- Также обработанные тремя 180 мкг дозами иммунотерапевтического средства в липосомах, цель изобретения, вводимого интраназально.
На неделе 9 начинали обработку антибиотиком изониазидом и продолжали до недели 17.
Дозы иммунотерапевтического средства в липосомах вводили на неделях 13, 15 и 17.
Мышей умерщвляли на неделях 15 и 28 и рассчитывали концентрации бацилл в левом легком и селезенке.
Концентрации бацилл в легких вакцинированных животных после введение одной или трех доз (соответственно неделям 15 и 28 соответственно) были значимо меньшими по сравнению с контрольной группой.
Результаты, полученные для легких после одной дозы иммунотерапевтического средства (неделя 15) и после 3 доз (неделя 28), выраженные в виде log10КОЕ/мл, показаны в таблице 3:
| Таблица 3 | ||
| Группа мышей | Неделя 15 (1 доза) | Неделя 28 (3 дозы) |
| Контроль | 2,34±0,24 | 3,86±0,41 |
| Интраназально | 1,59±0,61* | 3,48±0,18* |
| *=статистически значимая по сравнению с контрольной группой величина, p<0,05 |
Можно видеть, что только мыши, обработанные одной дозой иммунотерапевтического средства в липосомах, вводимого интраназальным способом, одновременно с обработкой антибиотиком изониазидом, продемонстрировали значительно меньшее количество бацилл в легких, чем мыши, обработанные только антибиотиком.
В данном случае можно сделать тот же вывод, что и в разделе I).
Что касается селезенки, концентрация бацилл у вакцинированных животных была значимо меньшей по сравнению с контрольной группой после введения 3 доз (соответственно неделе 28).
Результаты, полученные для селезенки, выраженные в виде log10КОЕ/мл, показаны в таблице 4:
| Таблица 4 | ||
| Группа мышей | Неделя 15 | Неделя 28 |
| Контроль | 1,47+0,44 | 3,84±0,48 |
| Интраназально | 1,41±0,58 | 3,43±0,29* |
| *=статистически значимая по сравнению с контрольной группой величина, p<0,05 |
Можно видеть, что мыши, обработанные тремя дозами иммунотерапевтического средства, вводимого интраназально одновременно с обработкой антибиотиком изониазидом, показали значительно меньшее количество бацилл в легких, чем мыши, обработанные только антибиотиком.
В данном случае можно сделать тот же вывод, что и в разделе I).
IV) Сравнительное исследование для изучения эффекта антибиотиков, иммунотерапевтического средства в липосомах и взаимодействий между ними.
Проводили несколько исследований с мышами DBA/2, следуя факторному плану 22 при условиях, показанных в таблице 5:
| Таблица 5 | ||
| Исследование | Антибиотик | Иммунотерапевтическое средство в липосомах |
| 1 | Нет | Нет |
| 2 | Да | Нет |
| 3 | Нет | Да |
| 4 | Да | Да |
В исследовании 1 инфицированных мышей оставляли без обработки.
В исследовании 2 инфицированные мыши получали только антибиотик изониазид при дозе 25 мг/кг в сутки в течение 5 суток в неделю в течение 4 недель и рифампицин при дозе 10 мг/кг в сутки в течение 5 суток в неделю в течение 4 недель, начиная на неделе 9 после инфицирования.
В исследовании 3 инфицированных мышей обрабатывали только тремя 180 мкг дозами иммунотерапевтического средства в липосомах, вводимого подкожно на неделях 9, 11 и 15 после инфицирования.
В исследовании 4 обработку антибиотиком изониазидом начинали на неделе 9 и вводили в течение 4 недель. На неделе 13, начинали обработку рифампицином и заканчивали на неделе 17. На неделях 17, 19 и 21 вводили три дозы иммунотерапевтического средства в липосомах, цель изобретения.
На неделе 22 всех животных умерщвляли и рассчитывали концентрации бацилл в левом легком. Результаты, полученные для легких, выражены в виде log10КОЕ/мл и показаны в таблице 6:
| Таблица 6 | |||
| Исследование | Антибиотик | Иммунотерапевтическое средство в липосомах | log10КОЕ/мл |
| 1 | Нет | Нет | 5,37±0,27 |
| 2 | Да | Нет | 3,29±0,8* |
| 3 | Нет | Да | 5,69+0,22 |
| 4 | Да | Да | 0,69±0** |
| *=статистически значимая величина по сравнению с исследованиями 1,3 и 4 для p<0,05; **=статистически значимая величина по сравнению с исследованиями 1, 2 и 3 для p<0,05 |
Можно видеть, что совместное лечение антибиотиками изониазидом и рифампицином с иммунотерапевтическим средством в липосомах вызывает значительно большее уменьшение количества бацилл по сравнению с уменьшением, выявленным для любых других двух факторов (антибиотики и иммунотерапевтическое средство в липосомах) по одному.
Учитывая, что количество рассчитанных бацилл включает в себя все бациллы, и те бациллы, которые находятся в активной фазе, и те бациллы, которые находятся в неактивной фазе, обработка иммунотерапевтическим средством в липосомах в сочетании с другими лекарственными средствами позволяет уменьшить время обработки этими лекарственными средствами, так как значительно уменьшает количество бацилл, которые со временем могут перейти в активную фазу.
1. Способ получения иммунотерапевтического средства для комбинированного лечения туберкулеза, содержащего фрагменты клеточной стенки из вирулентного штамма комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTB-C), который включает следующие стадии:
a) культивирование клеток в течение, по меньшей мере, трех недель, и
b) гомогенизацию клеток в присутствии неионогенного поверхностно-активного вещества и получение целевого продукта в виде гомогената, включающего нефрагментированные клетки, фрагменты клеточной стенки и солюбилизированные клеточные вещества.
2. Способ по п.1, в котором период культивирования клеток составляет от 3 до 4 нед.
3. Способ по п.1, в котором неионогенное поверхностно-активное вещество выбирают из группы, состоящей из алкилфенолэтоксилатов и сложных эфиров этоксилированного сорбитана.
4. Способ по п.3, в котором неионогенное поверхностно-активное вещество является октилфенолэтоксилатом.
5. Способ по п.4, в котором неионогенное поверхностно-активное вещество является октилфенолэтоксилатом, имеющим 7-8 молей этиленоксида.
6. Способ по п.1, в котором гомогенизацию проводят в забуференной среде, имеющей нейтральный рН.
7. Способ по п.6, в котором среда забуферена фосфатно-буферным раствором (PBS).
8. Способ по п.1, который дополнительно включает следующие стадии:
c) центрифугирование смеси гомогенизированных клеток для отделения фрагментов клеточной стенки от нефрагментированных клеток и солюбилизированных клеточных веществ,
d) промывание фрагментов клеточной стенки и дополнительная обработка фрагментов клеточной стенки для инактивации всех возможно оставшихся вирулентных клеток штамма, и
e) лиофилизация полученного иммунотерапевтического средства, представляющего собой фрагменты клеточной стенки МТВ-С.
9. Способ по п.8, в котором период культивирования клеток составляет от 3 до 4 нед.
10. Способ по п.8, в котором неионное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из алкилфенолэтоксилатов и сложных эфиров этоксилированного сорбитана.
11. Способ по п.10, в котором неионное поверхностно-активное вещество является октилфенолэтоксилатом.
12. Способ по п.11, в котором неионогенное поверхностно-активное вещество является октилфенолэтоксилатом, имеющим 7-8 молей этиленоксида.
13. Способ по п.8, в котором клетки гомогенизируют в забуференной среде, имеющей нейтральный рН.
14. Способ по п.13, в котором среда забуферена буфером PBS.
15. Иммунотерапевтическое средство, полученное способом по п.1 для комбинированного лечения туберкулеза.
16. Иммунотерапевтическое средство, полученное способом по п.8 для комбинированного лечения туберкулеза.
17. Фармацевтическая композиция, содержащая иммунотерапевтическое средство по п.15 для комбинированного лечения туберкулеза.
18. Фармацевтическая композиция по п.17 в форме липосом.
19. Фармацевтическая композиция по п.18, в которой липосомы включают вспомогательные липиды, выбранные из нейтральных и/или отрицательно заряженных фосфолипидов и стеринов.
20. Фармацевтическая композиция по п.19, в которой фосфолипиды выбраны из фосфатидилхолина, фосфатидилсерина и фосфатидилинозита.
21. Фармацевтическая композиция по п.19, в которой стерины выбраны из холестерина и солей желчных кислот.
22. Фармацевтическая композиция по п.18, дополнительно включающая витамин Е.
23. Способ комбинированного лечения туберкулеза, включающий введение иммунотерапевтического средства по п.15 в комбинации с, по меньшей мере, одним лекарственным средством, пригодным для лечения туберкулеза.
24. Способ по п.23, в котором комбинированная терапия является последовательной или одновременной.
25. Способ по п.23, в котором лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из изониазида, рифампицина и их комбинаций.
26. Фармацевтическая композиция, включающая иммунотерапевтическое средство по п.16 для комбинированного лечения туберкулеза.
27. Фармацевтическая композиция по п.26 в форме липосом.
28. Фармацевтическая композиция по п.27, в которой липосомы включают вспомогательные липиды, выбранные из нейтральных и/или отрицательно заряженных фосфолипидов и стеринов.
29. Фармацевтическая композиция по п.28, в которой фосфолипиды выбраны из фосфатидилхолина, фосфатидилсерина и фосфатидилинозита.
30. Фармацевтическая композиция по п.28, в которой стерины выбраны из холестерина и солей желчных кислот.
31. Фармацевтическая композиция по п.27, дополнительно включающая витамин Е.
32. Способ комбинированного лечения туберкулеза, включающий введение иммунотерапевтического средства по п.16 в комбинации с, по меньшей мере, одним лекарственным средством, пригодным для лечения туберкулеза.
33. Способ по п.32, в котором комбинированная терапия является последовательной или одновременной.
34. Способ по п.32, в котором лекарственное средство выбирают из группы, состоящей из изониазида, рифампицина и их комбинаций.
