Способ поддержания и коррекции водно-электролитного баланса у приматов

Изобретение относится к биотехнологии. Животным перорально вводят синтетический аналог аргинин-вазотоцина - D-аргинин-вазотоцин (D-ABT) или 1-дезамино-аргинин-вазотоцин (1-d-АВТ) или 1-дезамино-D-аргинин-вазотоцин (1-d-D-ABT) или 1-дезамино-1-монокарбокси-вазотоцин в дозе не менее 50 мкг на 1 кг массы тела. Способ не вызывает у обезьян изменений деятельности сердечно-сосудистой системы при получении антидиуретического эффекта. 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, исследовательской ветеринарии и может быть использовано для различных целей при последующем получении ветеринарных и иных препаратов.

Известно, что аргинин-вазотоцин (АВТ) представляет собой один из наиболее рано возникших в эволюции гормонов семейства вазопрессина - окситоцина, секретирующийся из нейрогипофиза у всех позвоночных и являющийся (исключая млекопитающих) основным гормоном осмотической регуляции внутренней среды организма [13. Jackson Е. К. //. In: J. G. Hardman, A. Goodman Oilman, L. Е. Limbird (ed.) The pharmacological basis of therapeutics, 9th ed. NY.: McGraw Hill. 1995. P. 715-731].

У млекопитающих ведущая роль в осморегуляции принадлежит аргинин-вазопрессину (АВП). В последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о действии аргинин-вазотоцина, аргинин-вазопрессина у млекопитающих через общие рецепторы V1a, V1b, V2, активизирующие систему G-белков. Эти результаты свидетельствуют о тесном взаимодействии двух низкомолекулярных гормонов на молекулярном уровне в клетке-мишени, в том числе в полярной эпителиальной клетке, экспрессирующей ионные каналы и обменники [Bernard К, Bogliolo S, Ehrenfeld J. // Вт J Pharmacol. 2005. v.144(8). P.1037-50].

Исследования механизма действия вазотоцина на асимметричные эпителиальные клетки почечных канальцев и кишечника у амфибий, рыб и птиц показали, что АВТ может участвовать в открытии натриевых каналов апикальной мембраны, усиливая чресклеточный натриевый транспорт. В культуре основных эпителиальных клеток собирательных трубок кортикального слоя почки мыши выявлены рецепторы АДГ/АВТ, активирующие Na-транспортер в присутствии PI₃-киназы.

Увеличение внутриклеточной концентрации кальция в клетках мочевого пузыря лягушки свидетельствовало об участии этого вторичного посредника в вазотоцин-индуцированном транспорте воды [Горшков А.Н., Королев Е.В., Комисарчук Я.Ю. // Цитология. 2000, т.42 (12). C.I 113-24].

Из уровня техники известен способ поддержания и коррекции водно-электролитного баланса у млекопитающих (крыс) при введении АВТ, который, как было установлено, способен увеличивать реабсорбцию воды и осмотическое концентрирование мочи подобно вазопрессину, а при более высокой концентрации оказывает выраженное натрийуретическое действие [Гао Цзе, Наточин Ю.В. // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2004. 40 (2). С.168-172].

Недостатком известного способа является то, что он не применялся для приматов, и особенности антидиуретического и ион-регулирующего действия вазотоцина, их связь с направленными модификациями в структуре молекулы АВТ у приматов не исследовалась.

Авторы настоящего изобретения впервые провели научные исследования, не имеющие прямых аналогов, которые позволили для приматов определить необходимые условия способа получения антидиуретического эффекта - препараты, дозировки и условия, позволяющие решить данную задачу.

Итак, задачей настоящего изобретения является разработка способа поддержания и коррекции водно-электролитного баланса у приматов (исключая человека), позволяющего увеличить реабсорбцию осмотически свободной воды при сохранении баланса калия и натрия и не вызывающего изменений деятельности сердечно-сосудистой системы.

Техническим результатом данного изобретения является реализация заявленного назначения, поскольку такая задача решена впервые.

Результат достигается за счет того, что согласно изобретению животным перорально вводят синтетический аналог аргинин-вазотоцина - D-аргинин-вазотоцин (D-ABT) или 1-дезамино-аргинин-вазотоцин (1-d-ABT) или 1-дезамино-D-аргинин-вазотоцин (1-d-D-ABT) или 1-дезамино-1-монокарбокси-вазотоцин в дозе не менее 50 мкг на 1 кг массы тела.

Следует подчеркнуть, что только вся совокупность существенных признаков в целом позволяет реализовать заявленное назначение, что и будет показано на приведенных ниже примерах конкретной реализации. В том числе и использование именно заявленных количественных параметров позволяет стабильно достичь указанного антидиуретического эффекта.

Способ подтверждается следующими примерами.

Пример 1.

Объектом явились ненаркотизированные обезьяны самцы Масаса mulatta в возрасте 3-4 года, с массой тела 4-6 кг. Животных помещали в приматологические кресла, не ограничивая прием воды и пищи. За несколько дней до тестирования аналогов вазотоцина животным проводили исследование антидиуретической реакции в условиях функциональной пробы, вызывающей подавление эндогенной секреции вазопрессина (водная нагрузка - 30 мл воды на кг массы тела).

АВТ вводили животным через желудочный зонд дозой не менее 50 мкг на 1 кг массы тела примата одновременно с 3% водной нагрузкой. Для достоверного подтверждения способ повторяли, но не чаще, чем один раз в 4 дня, чтобы избежать последствий изменения фонового уровня водно-солевого обмена у животных. После введения водной нагрузки (3% ВН) время выделения фракции мочи регистрировали при спонтанном мочеотделении, измеряли ее объем, концентрацию креатинина, ионов Na+, К+, осмоляльность. Пробы венозной крови отбирались венепункцией локтевой вены до начала и через 4 часа после введения ВН.

В образцах сыворотки крови и мочи, полученных от животных, измерялись: концентрация креатинина - по реакции Яффе с использованием наборов реагентов фирмы «Витал диагностик» (Россия) на анализаторе «Clima 15» (Ral, Испания); концентрация электролитов - ионоселективными электродами на анализаторе Easy LyteQS («Medica», США), осмоляльность - гигроскопическим методом на анализаторе «Varpo™» (Wescor, США). При проведении экспериментов постоянно регистрировали артериальное давление и частоту сердечных сокращений.

Статистическая обработка результатов проведена с использованием t-критерия Стьюдента по программе ANOVA.

Достижение результата было подтверждено данными экспериментальных исследований.

Введение воды в желудок животных вызывало увеличение мочеотделения. Максимум диуреза у обезьян в ответ на 3% ВН наблюдался в период 60-120 мин после введения воды. Функционально это было обусловлено изменением осмотической проницаемости собирательных трубок, в результате у животных снижалась реабсорбция осмотически свободной воды и увеличивалась ее экскреция. За 4 часа выводилось, в среднем, 83±19% введенной животному жидкости или 25,1±5,3 мл на 1 кг массы тела (табл.1). При этом практически 3/4 объема экскретируемой жидкости состояло из осмотически свободной воды, клиренс которой составил за 4 часа 17,7±7,8 мл.

Пероральное введение вазотоцина (АВТ) в дозе 50 мкг на 1 кг массы тела не приводило к достоверному изменению доли выведения водной нагрузки по сравнению с ВН (за 4 часа у обезьян экскретировалось 112,7±17,2% от введенного объема воды), что указывает на то, что сам АВТ при пероральном введении в выбранной дозе не был способен развивать антидиуретический эффект.

Пример 2.

Условия проведения способа соответствовали Примеру 1, но вместо АВТ применяли его синтетический аналог D-аргинин-вазотоцин (D-ABT). Синтез всех упомянутых аналогов АВТ был проведен ЗАО «Синтез пептидов» [Сидорова М.В., Молокоедов А.С., Азъмуко А.А. и др. // Биоорг.хим. 2004, т.30 (2). С.115-125], использовали вазотоцин фирмы Sigma и препарат сравнения - десмопрессин фирмы Ferring (Германия).

Введение в желудок аналога вазотоцина D-ABT в той же дозировке, что и АВТ, показало, что этот препарат обладает эффектом по задержке выведения водной нагрузки, но небольшим. Так, за 4 часа после перорального введения обезьянам аналога D-ABT выводилось, в среднем, 73% или 63% введенной животному жидкости. Показатели выведения осмотически свободной воды в данных сериях имели некоторую тенденцию к уменьшению (по сравнению с серией ВН).

Пример 3.

Условия проведения способа соответствовали Примеру 1, но вместо АВТ применяли его синтетический аналог 1-дезамино-аргинин-вазотоцин (1-d-ABT).

Введение в желудок аналога вазотоцина 1-d-АВТ в той же дозировке, что и АВТ, показало, что этот препарат вызывает наиболее выраженный антидиуретический эффект, сравнимый с таковым при приеме десмопрессина. Так, за 4 часа после перорального введения обезьянам аналога 1-d-ABT выводилось, в среднем, лишь 25% введенной водной нагрузки или 7,5 мл на кг массы тела.

Пример 4.

Условия проведения способа соответствовали Примеру 1, но вместо АВТ применяли его другой синтетический аналог 1-дезамино-D-аргинин-вазотоцин (1-d-D-ABT). Пероральное введение 1-d-D-ABT в дозе 50 мкг/кг показало, что он развивает антидиуретический эффект, по выраженности сходный с таковым аналога аргинин-вазопрессина - десмопрессина. Следовательно, выбранная дозировка была достаточной для того, чтобы часть гормонально активного агента, при всасывании в кровь через стенку желудочно-кишечного тракта, оказывала специфическое действие на орган-мишень. При этом оказалось, что наиболее выраженным антидиуретическим действием обладал аналог 1-d-D-ABT, во время пробы с которым клиренс осмотически свободной воды становился отрицательным, то есть регистрировался уровень реабсорбции осмотически свободной воды по величине больший, чем диурез.

Пример 5.

Условия проведения способа соответствовали Примеру 1, но вместо АВТ применяли его другой синтетический аналог - 1-дезамино-1-монокарбокси-вазотоцин. Достоверный эффект регистрировался при его пероральном введении обезьянам, в пробе с его приемом снижение скорости мочеотделения за 4 часа составляло 13,8±3,6 мл/кг.

Пример 6 (сравнительный).

Условия способа аналогичны Примеру 1. Препаратом сравнения служил десмопрессин, синтетический аналог вазопрессина (АДГ), вводимый в такой же дозировке. Прием десмопрессина на фоне 3% ВН вызывал выраженное снижение скорости мочеотделения: за 4 часа почки животных выводили только 28,2±16,4% объема водной нагрузки. Выведение осмотически свободной воды в серии с десмопрессином подавлялось, что свидетельствовало о реализации антидиуретического эффекта через рецепторы природного агониста - вазопрессина. С другой стороны, результаты данной серии показывали, что при дозировке в 50 мкг/кг достаточная доля препарата проникала через стенку желудочно-кишечного тракта в неизменном виде и, транспортируемая кровью, достигала органа-мишени (почки).

Итак, очевидно, что пероральное введение АВТ, десмопрессина и аналогов АВТ (D-ABT, 1-d-ABT, 1-d-D-ABT и 1-дезамино-1-монокарбокси-ВТ) в дозе 50 мкг/кг показало, что препараты способны развивать антидиуретический эффект различной степени. Следовательно, выбранная дозировка была достаточной для того, чтобы часть гормонально активного агента, при всасывании в кровь через стенку желудочно-кишечного тракта, оказывала специфическое действие на орган-мишень. При этом оказалось, что наиболее выраженным антидиуретическим действием обладал аналог 1-d-D-ABT, во время пробы с которым клиренс осмотически свободной воды становился отрицательным, то есть регистрировался уровень реабсорбции осмотически свободной воды по величине больший, чем диурез.

Как следует из результатов оценки почечной функции, отраженных в табл.1, за 4 часа пробы с некоторыми аналогами не происходило полного выведения нагрузки. Поэтому была поставлена задача наблюдения за дальнейшими изменениями показателей выведения жидкости и электролитов (табл.2). Кроме того, из результатов, представленных в табл.2, следует, что за 8 часов после приема 1-d-ABT выводилась вся введенная водная нагрузка (ее доля не отличалась от таковой в контроле, серии с 3% ВН). Однако 1-d-D-ABT продолжал оказывать антидиуретический эффект, который был даже более надежным (показатели почечной функции имели меньший разброс), чем в серии с приемом десмопрессина. В частности, за 8 часов после введения в желудок обезьян водной нагрузки и аналога АВТ экскретировалось примерно 18 мл жидкости на кг веса из 30 мл введенного объема. Таким образом, антидиуретический эффект отдельных аналогов АВТ был столь же продолжительным, как и у десмопрессина, при пероральном приеме препаратов.

Одним из желаемых качеств антидиуретических препаратов, для клиницистов, является избирательность в выведении основных ионов внеклеточной жидкости - натрия и калия, полученные результаты показывают, что наряду с выраженным антидиуретическим действием апробированные аналоги АВТ обладали у обезьян ион-сберегающим действием, т.е. не приводили к повышенной экскреции почками электролитов (табл.2).

При этом у обезьян обнаружено сходство в реакции на одну и ту же дозу аналогов АВТ в их влиянии на реабсорбцию воды. Было отмечено достоверное снижение выделения натрия после инъекции двух из исследованных аналогов (табл.2).

Важно, что данный способ с АВТ и его аналогами, как показали экспериментальные исследования, не вызывал у обезьян изменений деятельности сердечно-сосудистой системы.

Таким образом, авторами изобретения разработан способ, позволяющий получить антидиуретический эффект у приматов, исключая человека, путем перорального введения синтетических аналогов аргинин-вазотоцина.

Таблица 1
Показатели функции почки у обезьян за 4 часа после водной нагрузки и перорального введения АВТ, его аналогов и десмопрессина (М±m)
Серия эксперимента	% выведения нагрузки за 4 часа	Выведение за 4 часа на кг веса
V, мл		UNa ·V, мкмоль/кг	UK·V, мкмоль/кг
3%ВН, (n=18)	83,1±19,3	25,1±5,3	17,7±7,8	465±б0	180±66
3%ВН+АВТ, (n=4)	112,7±17,2	34,1±5,0	28,1±5,0
3%BH+D-ABT, (n=5)	72,8±17,3	23,1±5,6	13,5±5,2	149±б8	13,4±3,7
3%BH+1-d-ABT, (n=7)	62,5±32,4	18,7±9,5	12,8±9,6	46,0±18,4	7,3±6,1
3%BH+1-d-D-АВТ, (n=4)	24,9±15,0*	7,5±4,4*	-0,5±2,6**	2,46±2,1	1,4±0,8
3%ВН+Десмопрессин, (n=9)	28,2±16,4*	8,4±4,8*	0,17±2,7**	54,2±68,4	77,6±122,2
3%ВН+1-дезамино-1-монокарбокси-ВТ, (n=8)	40,3±17,1*	13,8±3,6*	11,4±5,0	93,2±42,3	6,1±1,1
Примечание: * - различия с серией ВН достоверны с р<0,05; ** - с р<0,01

Таблица 2
Показатели функции почки у обезьян за 8 часов после водной нагрузки и перорального введения отдельных аналогов АВТ и десмопрессина (М±m)
Серия эксперимента	% выведения нагрузки за 8 часов	Выведение за 8 часов на кг веса
V, мл		UNa ·V, мкмоль/ кг	UK ·V, мкмоль/кг
3%ВН, (n=18)	83,1±19,3	25,1±5,3	17,7±7,8	465±60	180±66
3%BH+1-d-ABT, (n=7)	67,9±31,2	20,3±9,2	13,9±10,1	49,6±б3,1	4,0±2,8
3%BH+1-d-D-АВТ, (n=4)	58,7±7,5*	17,6±2,2*	4,6±2,5*	5,7±2,2	3,0±2,5
3%ВН+1-дезамино-1-монокарбокси-ВТ, (n=8)	88,7±27,6
3%ВН+Десмопрессин, (n=9)	52,2±36,6	21,2±19,1	9,9±14,3	14,4±9,6	7,8±7,2

Способ поддержания и коррекции водно-электролитного баланса у приматов, отличающийся тем, что животным перорально вводят синтетический аналог аргинин-вазотоцина-D-аргинин-вазотоцин (D-ABT), или 1-дезамино-аргинин-вазотоцин (1-d-ABT), или 1-дезамино-D-аргинин-вазотоцин (1-d-D-АВТ), или 1-дезамино-1-монокарбокси-вазотоцин в дозе не менее 50 мкг на 1 кг массы тела примата.