Получение биологически доступной фолиевой кислоты

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности. В молочнокислой бактерии обеспечивают сверхэкспрессию фермента, выбранного из гамма-глутамилгидролазы, GTP циклогидролазы, дигидронеоптеринальдолазы и 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдигидроптеридинпирофосфокиназы. Данную бактерию используют в ферментативном способе получения моноглутамилфолата и в составе пищевого продукта, в том числе, молочного. Применение изобретения позволяет получить повышенное количество фолата в биодоступной форме. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 ил.

 

Область техники к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и пищевой промышленности, в частности, к повышению продукции фолата, как в общем плане, так и специфического биологически доступного фолата, т.е. фолата, который может легко поглощаться в желудочно-кишечном тракте млекопитающих, с использованием генетически измененных микроорганизмов.

Уровень техники

Фолат(N-[4-{[(2-амино-1,4-дигидро-4-оксо-6-птеридинил)метил]амино}бензоил]-L-глутаминовая кислота; витамин В11; витамин М) представляет собой кроветворный витамин, играющий важную роль в сохранении здоровья и лечении людей и животных. Фолат не может продуцироваться млекопитающими. Главным источником фолата являются растения, в особенности шпинат и другая зелень, травы, дрожжи и другие микроорганизмы, а также, косвенно, органы животных (почки, печень). В настоящее время, снабжение организма фолатом осуществляется за счет его применения, как такового, или в витаминных препаратах. Однако следует отметить, что применение таких витаминов вне рамок обычного питания является дорогостоящим и не всегда приемлемым.

Фолат является общим термином, имеющим отношение к большому числу различных производных фолиевой кислоты; такие соединения могут отличаться по степени окисления, природе заместителя по углеродному атому в птеридиновом кольце и по числу глутаминовых остатков. Эти отличия связаны с различными физико-химическими свойствами, которые, совместно с некоторыми пищевыми компонентами, могут оказывать влияние на биологическую доступность фолата. Одним из важнейших факторов, определяющих биологическую доступность фолата, является его устойчивость. Воздействие кислорода, тепла и, что наиболее важно, кислотно-пепсиновой среды желудка, понижает устойчивость фолата. Защитой от такой неустойчивости может служить наличие в пище таких антиоксидантов, как аскорбиновая кислота и восстановленные тиолы.

Другим фактором, оказывающим влияние на биологическую доступность фолата, является присутствие в нем полиглутаминовых остатков. Имеющаяся информация по этому вопросу показывает, что биодоступность моноглутамилфолата выше, чем биологическая доступность полиглутамилфолата. Полиглутамилфолаты должны быть гидролизованы в моноглутамильные производные, прежде чем они будут поглощаться в кишечнике. Такое превращение катализируется кишечными гидролазами. Однако действие таких ферментов может ингибироваться некоторыми компонентами пищи. Кроме этого, активность этих ферментов также зависит от длины цепи глутамата (Gregory, 1989). Из сказанного можно сделать вывод, что присутствие фолата в виде моноглутамильного производного повышает биологическую доступность фолатов.

Фолат присутствует в таких пищевых продуктах, как мясо, овощи и молочные продукты. Количество моноглутамилфолатов, и, следовательно, биодоступность фолата, сильно изменяется в зависимости от природы пищевого продукта; как показал анализ, яичный желток содержит 72% моноглутамил фолатов (MGF), коровья печень содержит 56% MGF, апельсиновый сок содержит 21% MGF, капуста содержит 6% MGF, лимская фасоль содержит 5% MGF, а салат содержит менее 1% MGF (Seyoum and Selhub, 1998).

Внутриклеточный фолат молочнокислых бактерий, главным образом присутствует в виде полиглутамилфолата. Одной из функций глутаматного остатка полиглутамилфолатов, содержащихся в микроорганизмах, является удерживание фолата в клетках (Shane and Stokstad, 1975). Вследствие этого, существует возможность, что полиглутамилфолаты остаются внутри бактерии при проходе через желудочно-кишечный (GI) тракт и не являются доступными для поглощения организмом человека. Решение такой проблемы состоит в увеличении количества моноглутамилфолата и, следовательно, уменьшении степени удерживания внутриклеточного фолата.

Фолат может быть синтезирован по многоферментному маршруту из предшественников GTP, парааминобензойной кислоты и глутамата (см. фигуру 1). В некоторых микроорганизмах, включающих молочнокислые бактерии Lactococcus lactis, гены, кодирующие такой путь превращения - gch, folC, folP, dhna, hppk и dhfr - организованы в виде кластера гена. GTP циклогидролаза I (gch, ЕС 3.5.4.16) катализирует реакцию от GTP до дигидронеоптеринтрифосфата с образованием промежуточного соединения и выделением формиата. Затем фосфатный остаток удаляется, предположительно, под воздействием фосфатазы (Pase). Под воздействием дигидронеоптерин альдолазы (ЕС 4.1.2.25) на продукт реакции, происходит синтез гликолевого альдегида и 6-гидроксиметил-7,8-дигидроптерина, который превращается в 6-гидроксиметил-7,8-дигидроптерин пирофосфат при помощи 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдигидроптеридин пирофосфокиназы (hppk, ЕС 2.5.1.15). Под воздействием дигидроптероатсинтазы (dps, folP, EC 6.3.2.17) происходит сочетание парааминобензоата с получением 7,8-дигидроптероата. Фолатсинтаза (folC, ЕС 6.3.2.17) обеспечивает связывание глутамата с дигидрофолатредуктазой с образованием дигидрофолата. После дополнительного восстановления в тетрагидрофолат, под действием дигидрофолат редуктазы (dhfr, EC 1.5.1.3), в результате присоединения глутамата к карбоксильной группе боковой цепи ранее связанных глутаматных остатков с помощью фолил полиглутамат синтазы (folC, EC 6.3.2.17) происходит образование полиглутамилтетрагидрофолата (на фигуре 1 не показан).

В WO 01/00845 содержится информация о последовательностях четырех ферментов, участвующих в синтезе фолата в Corynebacterium glutamicum: GTP циклогидролазы I (Fol E), дигидроптероат синтазы (Fol В), дигидронеоптерин альдолазы (Fol P) и 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдигидроптеридин пирофосфокиназы (Fol К). Предлагается вводить такие Corynebacterium гены в Corynebacterium или другие микроорганизмы, однако, не приводится никаких сведений о природе используемых генов и ожидаемых результатах. Кроме этого геномная организация генов, кодирующих такие ферменты, сильно отличается для Corynebacterium, с одной стороны, и других микроорганизмов, например. Bacillus, молочнокислых бактерий и дрожжей, с другой стороны.

Раскрытие изобретения

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что могут быть получены микроорганизмы, способные продуцировать не только большее количество фолата, но также продуцировать фолат в биодоступной форме. В соответствии с этим, настоящее изобретение предусматривает рекомбинантный микроорганизм пищевого сорта, способный продуцировать полиглутамилфолат и содержащий активный гетерологический или гомологический гамма-глутамилгидролазный ген, или генетически измененный микроорагнизм, способный вырабатывать не только большее количество фолата за счет сверхпродукции индивидуального биосинтетического гена, но также относительно меньшее количество полиглутамилфолатов, что благоприятствует выделению фолата во внешнюю среду. Кроме этого настоящее изобретение предусматривает полигенный экспрессирующий кластер, содержащий гамма-глутамил гидролазный ген или такой биосинтетический ген, как GTP циклогидролазный ген с подходящими, предпочтительно, микробными регуляторными последовательностями, а также способ получения фолата с помощью культивируемых микроорагнизмов, продуцирующих фолат и содержащих полигенный экспрессирующий кластер. Кроме этого настоящее изобретение предусматривает пищевые продукты, особенно такие молочные продукты, как йогурт и другие ферментированные продукты, содержащие микроорганизмы, продуцирующие большие количества биологически доступного фолата.

Осуществление изобретение

Настоящее изобретение касается повышения продукции фолата, и особенно, биологически доступного фолата, т.е. такого фолата, который может легко поглощаться в желудочно-кишечном тракте млекопитающих. Изобретение относится к повышению продукции различных производных фолата и превращению различных производных полиглутамилфолата, образующихся в организме in vivo, в соответствующие производные моноглутамилфолата. Настоящее изобретение имеет три основных следствия:

- Во-первых, с помощью настоящего изобретения соотношение между производными поли- и моноглутамилфолата изменяется в пользу моноглутамилфолатных производных, в результате чего повышается общая биологическая доступность производных фолата, в частности производных моноглутамилфолата.

- Во-вторых, с помощью настоящего изобретения ограничивается удерживание производных фолата в клетках фолат-продуцирующего хозяина, что усиливает диффузию или транспорт фолата во внеклеточную среду. Вследствие этого повышается биодоступность фолата, поскольку внутриклеточный фолат недоступен для поглощения в желудочно-кишечном тракте млекопитающих.

- В третьих, настоящее изобретение обеспечивает клеткам возможность продуцирования больших количеств общего фолата.

Настоящее изобретение относится к микроорганизму, способному продуцировать большие количества внутриклеточного фолата в результате сверхсинтеза гомологических или гетерологических ферментов, участвующих в биосинтезе моноглутамилфолата, или содержащих гетерологический глутамилгидролазный ген. Термин глутамилгидролазный ген подразумевает ген, в ходе экспрессии которого образуется фермент, способный деконьюгировать полиглутамилфолат с образованием моноглутамилфолата.

Фолатные биосинтетические гены, предназначенные для использования в настоящем изобретении, могут представлять собой один из следующих генов в кластере гена фолата, GTP циклогидролазу I (gch), дигидронеоптерин альдолазу (dhna), и 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдигидроптеридин пирофосфокиназу (hppk), или их комбинации, например такие как gch и hppk. Измененная ферментативная активность может быть следствием измененной экспрессии ферментов, кодируемых указанными выше генами, например, наличием множественных копий гомологических или гетерологических генов, и/или присутствием сильных промоторов таких генов. Измененная активность может представлять собой повышенную или пониженную активность, каждая из которых обеспечивает относительное увеличение продукции моноглутамилфолата.

Было обнаружено, что повышенная экспрессия дигидроптероатсинтазы (dps) или фолатсинтазы (folC) не приводит к увеличению продукции фолата и что повышенная экспрессия дигидрофолатредуктазы (dhfr) даже понижает продукцию фолата. В соответствие с настоящим изобретением, наиболее предпочтительным геном для увеличения продукции фолата является gch.

Глутамилгидролаза может представлять собой эндопептидазу, т.е. глутамилгидролазу, воздействующую на внутреннюю часть полиглутамильной цепи, что в результате приводит к удалению полиглутамильной цепи за одну стадию. Глутамилгидролаза также может представлять собой экзопептидазу, т.е. энзим, отщепляющий глутамильные остатки от окончания полиглутамильной цепи, в результате чего удаление моноглутамильных остатков происходит на повторяющихся стадиях. Эндо-глутамилгидролазные гены могут представлять собой, например, гены крыс, тогда как экзо-глутамилгидролазные гены имеют человеческое происхождение.

Глутамилгидролазный ген и фолатные биосинтетические гены, введенные в микроорганизмы, могут представлять собой оригинальные (немодифицированные) гены. Для этой цели также могут использоваться модифицированные гены, по меньшей мере, содержащие область, кодирующую каталитический домен глутамилгидролазы и фолатных биосинтетических энзимов. Глутамилгидролаза, закодированная гетерологическим геном, демонстрирует, по меньшей мере, 65% идентичность последовательности, предпочтительно, по меньшей мере, 75% идентичность, согласно определению идентичности с использованием традиционного BLAST алгоритма, аминокислотным последовательностям крысиной или человеческой гамма-глутамилгидролазы, что описано Yao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996, 93(19): 10134-8 и J. Biol. Chem. 1996 271(15): 8525-8, и/или ее коррелирующая последовательность способна к гибридизации в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, описанной Yao et al.

Термин «фолат» охватывает фолиевую кислоту и ее любую соль, сложный эфир и производное, включающее метилированные производные. Термин «полиглутамилфолат» относится к фолату, содержащему, по меньшей мере, два соседних глутамильных остатка в боковой цепи, тогда как термин «моноглутамилфолат» относится к такому фолату, значительная часть которого, например, по меньшей мере, 25% фолатных молекул, содержат только одну глутамильную группу.

Таким образом, настоящее изобретение относится к внутриклеточной экспрессии генов, кодирующих гамма-глутамилгидролазу или фолатные биосинтетические гены, происходящие из позвоночных растений, грибков или бактерий в пищевых микроорганизмах, приводящей к внутриклеточной гамма-глутамильной гидролитической активности. Особенно предпочтительными объектами являются гамма-глутамилгидролаза крыс (Yao с сотр. 1996а), человека (Yao et al 1996а, US 5801031), Arabidopsis thaliana (Huangpu et al. 1996), сои (Huangpu et al. 1996), и грамм-положительных бактерий Bacillus subtilis (Margot et al. 1999), Bacillus sphaericus (Hourdou et al, 1992) и Bacillus intermedius (Leshchinskaya et al, 1997), а также функционально эквивалентные гидролазы, имеющие, по меньшей мере, 65% идентичность последовательности, или даже, по меньшей мере, 75% идентичность последовательности последовательностям таких белков. Если говорить более конкретно, настоящее изобретение основано на такой интеграции гена, кодирующего указанные гамма-глутамилгидролазы в плазмиде или в хромосоме пищевых микроорганизмов, что эффективная экспрессия гена происходит конститутивно, или после индукции.

Настоящее изобретение также относится к экспрессии генов, кодирующих гамма-глутамилгидролазы, или генов, кодирующих фолатные биосинтетические гены, упомянутые выше, причем экспрессия происходит таким образом, что образуется полностью или частично активный фермент. Активность таких ферментов в результате приводит к деконьюгации полиглутамилфолатных производных. В такой реакции моно-и/или полиглутаматные остатки подвергаются ферментативному гидролизу, в результате которого полиглутамилфолатные производные превращаются в моноглутамилфолатные производные, или фолат синтезируется таким образом, что он содержит только один глутаматный остаток.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает увеличение продукции всех форм фолата и, особенно, моноглутамильных производных фолата, образующихся из производных полиглутамилфолата после экспрессии гена, кодирующего гамма-глутамил гидролазы, или прямым путем, без присоединения полиглутамильного фрагмента, в результате сверхэкспресии фолата биосинтетических генов, как описано ранее. Это ограничивает сохранение производных полиглутамилфолата в клетке, и предоставляет возможность активного или пассивного транспорта моноглутамилфолата через клеточную мембрану во внеклеточную среду. Вследствие этого, реализуется повышенная продукция и обеспечивается биодоступность фолатных производных в целом, и моноглутамилфолатных производных, в частности, в ферментированных пищевых продуктах.

Как показано ниже, в примере 1, внутриклеточная экспрессия и трансляция крысиной или человеческой гамма-глутамил гидролазы в молочнокислых бактериях приводит к деконьюгации полиглутамилфолата в моноглутамилфолат, снижает степень удерживания внутриклеточного фолата, повышает количество моноглутамил фолата и внеклеточного фолата. Таким образом, продукты и способ настоящего изобретения обеспечивают повышенную биологическую доступность фолата в ферментированных пищевых продуктах. Такое повышение биологической доступности является результатом двух явлений. Во-первых, повышение количества моноглутамилфолата ограничивает необходимость в активности природных кишечных гидролаз в процессе деконьюгации полиглутамилфолатов, что является преимуществом, которое связано с влиянием некоторых пищевых компонентов на активность кишечных гидролаз. Во-вторых, активность гамма-глутамилгидролаз, экспрессированных в микроорганизмах, ограничивает степень удерживания фолатов в клетке, обеспечивающую повышенную концентрацию внеклеточного фолата, что оказывается выгодным в условиях, когда молочнокислые бактерии остаются интактными при прохождении через GI тракт и не происходит выделения фолата. Кроме этого, повышенный экспорт (моно) глутамилфолата из клетки увеличивает общую скорость биосинтеза фолата, что связано со снижением регуляции с обратной связью.

Пример 2 иллюстрирует эффект сверхпродукции GTP-циклогидролазы (ЕС 3.5.4.16) и 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдигидроптеридин пирофосфокиназы (ЕС 2.7.6.3) в Lactococcus lactis. В L. lactis, ген gch кодирует бифункциональный белок двух ферментов. Эффект состоит не только в повышении общей продукции фолата в культурах, где используется рекомбинантный L. lactis, но и в специфическом повышении количества моноглутамилфолатов за счет полиглутамилфолатов. Наблюдаемый эффект может объясняться относительно низкой активностью энзима фолилполиглутаматсинтазы, кодируемой геном folC, которая недостаточно высока для аккомодации к высокой скорости биосинтеза фолата в ходе свехрпродукции GTP-циклогидролазы. Моноглутамилфолаты способны легче выделяться бактериями L. lactis с образованием ферментативного бульона, который содержит не только большие количества фолата, но и большее количество его биодоступных форм, которые выделяются в среду в виде моноглутамильной формы.

Хотя пример 1 относится к крысиной или человеческой гамма-глутамилгидролазе и штамму бактерий Lactococcus lactis NZ , в качестве бактерий, продуцирующих (поли/моно)-глутамилфолат, следует иметь в виду, что настоящее изобретение также охватывает другие гамма-глутамилгидролазы в целом, и гамма-глутамилгидролазы пищевого сорта, в частности. Примерами других гамма-глутамилгидролаз, которые могут экспрессироваться в молочнокислых бактериях, являются производные Arabidopsis, соевых бобов или Bacillus intermedius. Область настоящего изобретения также включает экспрессию упомянутых гамма-глутамилгидролаз в любом другом пищевом микроорганизме, отличном от штамма NZ 9000 L. Lactis, например, в других молочнокислых бактериях, дрожжах и грибках. В рассматриваемом примере, гены гамма-глутамилгидролазы зрелой крысы или человека клонировали ниже низин - индуцибельного промотора. Кроме этого изобретение охватывает экспрессию гамма-глутамилгидролаз под контролем других индуцибельных промоторов, например, промотора, присутствующего в лактозном опероне (Van Rooijen et al. 1990, 1992), или конститутивного промотора, например, pepN гена (Tan et al. 1992).

Хотя пример 2 относится к сверхэкспрессии GTP-циклогидролазы, кодируемой гомологичным геном gch в Lactococcus lactis, приводящей к повышенной продукции фолата и специфическому увеличению количества моноглутамилфолатов по сравнению с полиглутамилфолатами, настоящее изобретение также охватывает сверхэкспрессию других гомологических и гетерологических фолатных биосинтетических генов, например, dhna и/или hppk, но не folP (dps), folC или dhfr, в L.lactis. Кроме этого настоящее изобретение охватывает экспрессию таких фолатных биосинтетических генов в пищевых микроорганизмах, отличных от штамма NZ 9000 L.Lactis, например, таких, как другие молочнокислые бактерии, дрожжи и грибки. В примере 2 gch ген клонировали на участке ниже низин-индуцируемого промотора. В область настоящего изобретения также входит экспрессия GTP-циклогидролазы и, необязательно, других фолатных биосинтетических ферментов под контролем различных индуцируемых промоторов, например, промотора, присутствующего в лактозном опероне (Van Rooijen et al. 1990, 1992) или конститутивного промотора, обнаруженного напротив pepN гена (Tan et al. 1992).

Пример 1

Материалы и методы

Зрелую экзопептидазу человеческой γ-глутамилгидролазы получали из кДНК полной длины (Yao et al. 1996 a), клонированной в векторе pCR2 с использованием полимеразной цепной реакции. Вектор был предоставлен The laboratory of Molecular Diagnostics в Wadswoth Center, Albany, New York. Продукт PCR из 885 пар оснований, кодирующий зрелую человеческую γ-глутамилгидролазу, получали с использованием следующих праймеров:

HGH-f (CATGCCATGGGACCCCACGGCGACACCGCCAAG) и

HGH-r (GCTCTAGATCAATCAAATATGTAACATTGCTG).

Прямой праймер был удлинен по 5' - концу с образованием сайта рестрикции Ncol, обеспечивающего транскрипционное слияние с индуцируемым низиновым промотором в векторе pNZ 8048 (Kuipers et al.). Использование указанного выше прямого праймера приводило к некоторой модификации зрелого гена (нуклеотиды указаны курсивом). Обратный праймер был подвергнут инсерции по 3' - концу с получением сайта рестрикции XbaI, обеспечивающего лигирование с липкими концами в вектор pNZ 8048. Вновь синтезированный вектор, несущий зрелый человеческий γ-глутамилгидролазный ген был обозначен, как pNZ 7001.

Зрелая, эндопептидазная, крысиная γ-глутамилгидролаза была получена из кДНК полной длины (Yao et al. 1996b), клонированной в вектор pCR 3 с использованием цепной полимеразной реакции. Вектор был предоставлен The laboratory of Molecular Diagnostics в Wadswoth Center, Albany, New York. Продукт PCR из 884 пар оснований, кодирующий зрелую человеческую γ-глутамилгидролазу, получали с использованием следующих праймеров:

HGH-f (CATGCCATGGGATCCTATGAGCGCGCGGCTCCAAG) и

HGH-r (GCTCTAGATCAGTTAAACATATAAGCTTGCTG).

Прямой праймер был удлинен по 5' - концу, образуя сайт рестрикции Ncol, обеспечивающий транскрипционное слияние с индуцируемым NIS промотором в векторе pNZ 8048 (Kuipers et al.). Использование указанного выше прямого праймера приводило к некоторой модификации зрелого гена (нуклеотиды указаны курсивом). Продукт PCR с тупыми концами клонировали в дефосфолированный вектор PCR (Invirogen) и трансформировали в Eschericia coli. Частично переваренный NcoI-KpnI фрагмент выделяли и лигировали в pNZ 8048. Вновь синтезированный вектор, несущий зрелый человеческий γ-глутамилгидролазный ген был обозначен, как pNZ 7002.

Вектор, несущий зрелый крысиный или человеческий γ-глутамилгидролазный ген, трансформировали электропорацией в штамм NZ 9000 Lactococcus latis, несущий nisR и nisK гены хромосомы. Экспрессию зрелого крысиного или человеческого γ-глутамилгидролазного гена проводили по следующему протоколу NICE системы (низин индуцированная контролируемая экспрессия) (De Ruter et al. 1996). Для экспрессии и трансляции человеческого γ-глутамилгидролазного гена использовали концентрации низина в интервале 0,1-5 нг/мл. Вестерн-блоттинг человеческой γ-глутамилгидролазы проводили с использованием поликлонального антитела, предоставленного Laboratory of Molecular Diagnostics в Wadsworth, Albany, New-York, USA.

Активность зрелого крысиного или человеческого γ-глутамилгидролазного энзима определяли выращиванием L.lactis штамма NZ 9000, несущего pNZ 7001 или pNZ 7002 в 5 мл M17 (Terzaghi and Sandine, 1975), дополненной 0,5% (мас./об.) глюкозы (GM17) и 10 мкг/мл хлорамфеникола. Значение OD 600 для GM17 составило 0,5. При OD600=0,5 в систему добавляли низин (1 нг/мл) с целью индуцирования экспрессии зрелого крысиного или человеческого γ-глутамилгидролазного гена. Через два часа роста готовили 20-кратно концентрированный клеточный экстракт (1 мл 0,1 М меркаптоэтанола, 0,1 М Na-PO4 буфер рН 7,0) с использованием гранулированного оксида кремния и клеточного дезинтегратора FP120 fastprep™ (Savant Instruments Inc, Holbrook, NY, USA). 500 мкл концентрированного клеточного экстракта добавляли в раствор дрожжевого экстракта (0,5 г/л дрожжевого экстракта, Difco Laboratories, Detroit, USA), в 20 мл 0,1 М Na-PO4 буфера, рН 7,0, 1% аскорбиновая кислота) в качестве источника полиглутамилфолатных производных. Инкубацию полученной системы при 37°С продолжали в течение четырех часов с периодическим отбором образцов. Реакцию останавливали путем нагревания образцов в течение 10 минут при 100°С. Концентрацию фолата определяли с использованием Lactobacillus casei микробиологического анализа, по методике, описанной Horne и Patterson (1988). Отрицательные контрольные эксперименты проводили с использованием штамма NZ 9000, трансформированного pNZ 8048 (лишенная низина экспрессионная кассета).

Активность зрелого крысиного или человеческого γ-глутамилгидролазного энзима в отношении роста молочнокислых бактерий, определяли по росту L.lactis штамма NZ 900, несущего pNZ 7001 или pNZ 7002 в M 17 (Terzaghi and Sandine, 1975), дополненной 0,5% (мас./об.) глюкозы (GM 17) и 10 мкг/мл хлорамфеникола. При значении OD 600=0,5 добавляли низин (1,0 нг/мл) и из растущей культуры периодически отбирали образцы. Образцы центрифугировали до отделения клеток от супернатанта. Супернатант разбавляли в соотношении 1:1 0,1 М NaAc буфером с рН 4,8 в присутствии 1% аскорбиновой кислоты. Полученные гели промывали 0,1 М NaAc с рН 4,8, 1% аскорбиновая кислота, и повторно суспендировали в исходном объеме 0,1 М NaAc буфера с рН 4,8, содержащего 1% аскорбиновой кислоты. Все образцы в течение десяти минут нагревали при 100°С, после чего проводили определение концентрации фолата с использованием Lactobacillus casei микробиологического анализа, описанного Home and Patterson (1988). Наличие полиглугамилфолата определяли путем инкубации образцов в течение четырех часов при 37°С в присутствии человеческой плазмы (Sigma-Aldrich Chemie, Zwijndrecht, NL) в качестве источника γ-глутамилгидролазы, после чего определяли концентрацию фолата.

Результаты

Добавление 1,0 нг/мл низина приводило к экспрессии экспрессирующего гена человеческой γ-глутамилгидролазы, что может быть визуализировано вестерн-блоттингом с использованием поликлонального антитела. Крысиная γ-глутамилгидролаза не может быть визуализирована вестер-блоттингом в связи с недоступностью специального антитела.

Функциональная экспрессия человеческой гамма-глутамилгидролазы, контролируемая in vitro

Проведение микробиологического анализа на содержание фолата позволило, главным образом, детектировать фолатные производные с тремя или менее глутаматными остатками. Реакция роста при детекции микроорганизма на более длинные фолатные цепи (n>3) резко понижается пропорционально длине цепи (Tamura et al. 1972). Следовательно, в источнике, который включает полиглутамилфолаты, содержащие более трех глутамильных остатков, как это имеет место, например, в случае дрожжевого экстракта, который преимущественно содержит гептаглутамилфолаты (Bassett et al. 1976), фолаты могут детектироваться с помощью микробиологического анализа при удалении полиглутамильных хвостов. В связи с этим, дрожжевой экстракт используется для тестирования функциональной экспрессии человеческой γ-глутамилгидролазы в Lactococcus lactis. Добавление клеточного экстракта L.lactis NZ 9000, несущего pNZ 7001 или pNZ 7002, индуцированных низином, приводит к деконьюгации полиглутамилфолата, как это видно из данных микробиологического анализа. При добавлении клеточного экстракта L.lactis NZ 9000, несущего pNZ 8048 (лишенная низина экспрессирующая кассета), не детектируется какой-либо деконьюгирующей активности (Фигура 2).

Внутриклеточная экспрессия гамма-глутамилгидролазы, контролируемая in vivo

Штамм NZ 9000, несущий pNZ 7001 или pNZ 7002 или pNZ 8048 (лишенная низина экспрессирующая кассета), демонстрирует идентичные ростовые характеристики. Индукция низином при OD 600, равном 0,5, не влияет на скорость роста. После индукции низином измеряли концентрацию фолата в супернатанте и в клеточных экстрактах штаммов. L. lactis штаммы NZ 9000, несущие pNZ 7001 или pNZ 7002, характеризуются увеличением концентрации внеклеточного фолата в ходе роста. Концентрация внеклеточного фолата в штамме L.lactis NZ 9000, несущем pNZ 8048, остается постоянной в ходе роста. Концентрация внутриклеточного фолата в штаммах, экспрессирующих γ-глутамилгидролазы, не увеличивается в ходе роста, в отличие от концентрации внутриклеточного фолата в контрольном штамме. Фигура 3 иллюстрирует распределение внутри- и внеклеточного фолата через два часа после индукции низином. Штамм NZ 9000-pNZ 7002 характеризуется наивысшей концентрацией внеклеточного фолата, что, возможно, связано с эндопептидазной активностью крысиной γ-глутамилгидролазы, приводящей к немедленному восстановлению полиглутамилфолатов в моноглутамилфолаты. Экзопептидазная активность человеческой γ-глутамилгидролазы снижает концентрацию полиглутамилфолата за счет образования моноглутамилфолатов с промежуточным образованием более коротких полиглутамилфолатов. Клеточные экстра полиглутамилфолата, запасенного внутри клеток. Содержание фолата определяли с использованием микробиологического анализа после инкубации в присутствии человеческой плазмы в качестве источника γ-глутамилгидролазы. Штаммы NZ 9000-pNZ 7001 и pNZ 7002 не содержат полиглутамилфолат и концентрация фолата не меняется в ходе роста. Как видно из Фигуры 3, внутриклеточный фолат в штамме NZ 9000-pNZ 8048 частично состоит из полиглутамилфолатов. Повышение концентрации внеклеточного фолата в ферментационном бульоне штаммов после деконьюгации, как правило, вызвано присутствием полиглутамилфолата из дрожжевого экстракта, который присутствует в бактериальной растительной среде GM 17. Из полученных результатов можно сделать вывод, что ферментативная активность экспрессированных γ-глутамилгидролаз, способствует деконьюгации внутриклеточного полиглутамилфолата, что уменьшает время пребывания производных фолата в клетке и способствует увеличению концентрации внеклеточного фолата.

Информация о ДНК генов, кодирующих человеческую и крысиную γ-глутамилгидролазу, содержится в работе Yao et al. 1996 а и b.

ПРИМЕР 2

Материалы и методы

Ген gch, кодирующий GTP цклогидролазу, идентифицировали анализом последовательности и сравнительным анализом гомологии части генома L.Lactis штамма MG 1363, фланкированной геном dhfr, кодирующим дигидрофолат редуктазу и dhom, кодирующим гомосериндегидрогеназу, с использованием основной геномной базы данных. Последовательность получали амплификацией геномной области с использованием праймера dhfrF (CGAAT TCCAT GGTTA TTGGA ATATG GGCAG AAG) и dhomR (CGATC CCGGG AAGCC CTGTG CCACT GTCC А). Праймеры получали из информации о последовательности, содержащейся в банке генов под № Х 60681 и Х 96988, соответственно. Исследование гомологии позволило предположить, что часть амплифицированного фрагмента (общей длиной, примерно, в Т.n.о.) содержит информацию о последовательности для GTP циклогидролазы и 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдегидроптеридин пирофосфокиназы. PCR продукт, полученный с использованием праймера hppk-2 (CATGC CATGG GGCAA АСААС ТТАТТ TAAGC ATGGG) и гена gch-r3 (GGGGT ACCGA TTCTT GATTA AGTTC TAAG), содержащий потенциальный стартовый кодон 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметил- дегидроптеридин пирофосфокиназы и потенциальный стоп-кодон GTP циклогидролазы, клонировали в Ncol и Kpnl сайт pNZ 8048 (Kuipers et al.) с получением плазмиды pN 7003. Прямой праймер был удлинен по 5'-концу с образованием Ncol рестрикционного сайта, обеспечивающего трансляционное слияние с индуцируемым низиновым промотором в векторе pNZ 8048. Использование упомянутого прямого праймера приводило к некоторой модификации исходного gch гена; экстра глицин вводился после Мет-1, не затрагивая следующую аминокислоту. Обратный праймер подвергали удлинению по 3'-концу с образованием Kpnl рестрикционного сайта, способствующего лигированию с липкими концами в векторе pNZ 8048. Такой вектор вводили в штамм L. lactis NZ 9000 (De Ruyter et al. 1996) путем электропорации с образованием L.lactis штамма NZ9000-pNZ7003. Штамм NZ 9000 экспрессирует nisRK регуляторные гены, стабильно интегрированные в pepN локусе. Экспрессия gch регулируется низиновым промотором в результате добавления низина в ферментационный бульон (De Ruyter et al. 1996). Рестрикцию, лигирование и трансформацию проводили с использованием следующих стандартных протоколов, описанных в книге Sambrook et al.

Определение ферментирующей активности GTP циклогидролазы

Проводили ферментативный анализ с целью определения активной экспрессии GTP циклогидролазы в L.Lactis. Безклеточный экстракт NZ9000-pNZ7003 использовали в качестве источника фермента, а коммерчески доступный GTP использовали в качестве субстрата. Для анализа активности GTP циклогидролазы использовали модифицированный протокол, описанный Saizeieu с сотр. (1995). Штамм L.lactis NZ9000, несущий pNZ 7003, выращивали в среде M 17 (Terzaghi and Sandine 1975), дополненной 0,5% (мас./об.) глюкозы (GM 17) и 10 мкг/мл хлорамфеникола. При OD 600, равном 0,5, добавляли низин (2 нг/мл). При значении OD 600 порядка 2,5, собирали клетки из 25 мл культурной среды и их растворяли в 1 мл 0,1 М натрий-фосфатном буфере при рН 6,5. Внутриклеточный материал выделяли с использованием гранулированного оксида кремния и дезинтегратора клеток FP 120 fastprep™ (Savant Instruments Inc., Holbrook, NY, USA). Активность GTP циклогидролазы определяли при 30°С в среде, содержащей 100 мМ Tris/HCI рН 8, 100 мМ KCI, 1 мМ ЭДТА с рН 8, 50 мМ GTP и 2% безклеточного экстракта. Образцы, отобранные через определенные промежутки времени, нагревали в течение 10 минут при 100°С с целью дезактивации фермента. За ходом потребления GTP и образования продукта следили методом ЖХВР. Образцы (25 мкл) пропускали через 8μ 1000А PL-SAX колонку (Polymer Laboratories) с объемной скоростью 1,2 мл/мин, используя проточный буфер, содержащий 50 мМ фосфата, 100 мМ NaCI, pH 6,5. За потреблением GTP следили методом ИК-спектроскопии при длине волны 254 нм, а продукт реакции детектировали флуорометрически; возбуждение при 365 нм, эмиссия при 446 нм (Фигура 4).

Сверхпродукция gch

Влияние на продукцию фолата сверхпродукции gch, кодирующего GTP циклогидролазу и 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдигидроптеридин пирофосфокиназу в растущих молочнокислых бактериях, определяли путем выращивания Lactococcus lactis штамма NZ 9000, несущего pHZ 7003, в среде M 17 (Terzaghi and Sandine, 1975), дополненной 0,5% (мас./об.) глюкозы (GM 17) и 10 мкг/мл хлорамфеникола. При OD 600, равном 0,5, добавляли низин (2 нг/мл). При OD 600 порядка 2,5, клеточную культуру центрифугировали до отделения клеток от супернатанта. Супернатант разбавляли в соотношении 1:1 0,1 М NaAc буфером при pH 4,8 в присутствии 1% аскорбиновой кислоты. Клетки промывали 0,1 М NaAc pH 4,8, 1% аскорбиновой кислоты и ресуспендировали в исходном объеме 0,1 М NaAc буфера при pH 4,8 в присутствии 1% аскорбиновой кислоты. Образцы нагревали в течение 10 минут при 100°С, после чего проводили определение концентрации фолата с использованием Lactobacillus casei микробиологического анализа, описанного Horne и Paterson (1988). Наличие полиглутамилфолата определяли в результате инкубации образцов в течение четырех часов при 37°С в присутствии человеческой плазмы (Sigma-Aldrich Chemie, Zwijndrecht, NL) в качестве источника γ-глутамилгидролазы, после чего с использованием Lactobacillus casei микробиологического анализа, определяли концентрацию фолата.

Результаты

Анализ на ферментативную активность GTP-циклогидролазы позволил установить увеличение количества продукта реакции во времени при добавлении GTP (Фигура 4). Рассматриваемый продукт реакции имел хроматографические характеристики, аналогичные описанным ранее (время удерживания 9,52 мин) [Saizieu et al. (1995)] и, как было установлено, представлял собой трифосфат дигидронеоптерина, основного продукта реакции GTP циклогидролазы. Реакционная смесь содержала избыток GTP. Уменьшение концентрации GTP и увеличение концентрации трифосфата дигидронеоптерина наблюдалось только в безклеточном экстракте NZ 9000-pNZ 7003. В контрольных реакциях, где использовали безклеточные экстракты штамма NZ 9000-pNZ8048, не наблюдалось значительного уменьшения концентрации GTP и образования продуктов превращения GTP.

Количественный белковый анализ клеточного экстракта NZ 9000-pNZ 7003, индуцированного низином, с использованием метода SDS-PAGE, позволил установить сверхпродукцию протеина размером около 40 kD по сравнению с контрольным штаммом NZ 9000-pNZ 8048.

Индукция низином растущих клеток штамма NZ 9000-pNZ 7003 приводит к увеличению концентрации внутри- и внеклеточного фолата по сравнению с контрольным штаммом NZ 9000-pNZ 8048 (Фигура 5). В результате общая продукция фолата увеличивается вдвое. Большая часть сверпродуцированного фолата находится в растительной среде; концентрация внеклеточного фолата увеличивается примерно в 20 раз по сравнению с контрольным штаммом. Увеличение концентрации внутриклеточного фолата не играет существенной роли. Деконьюгация группы внутриклеточных фолатов показывает, что лишь в контрольном штамме внутриклеточный фолат частично присутствует в виде полиглутамилфолата. Сверхпродуцирующий GTP-циклогидролазу штамм не продуцирует фолат в виде полиглутамилфолата внутри или вне клеток.

Описание чертежей

Фигура 1. Путь биосинтеза фолата. В скобках указаны предполагаемые промежуточные вещества. Трифосфатные остатки обозначены, как (Р)3. Представленные на фигуре данные адаптированы к данным Lacks et al./ 1995.

Фигура 2. Кинетика изменения концентрации фолиевой кислоты в дрожжевом экстракте при оптимальном значении рН согласно данным микробиологического анализа после деконьюгации клеточным экстрактом L.lactis NZ 9000, индуцированным низином и несущим pNZ 7001, кодирующую крысиную гамма-глутамилгидролазу, или pNZ 7002, кодирующую человеческую гамма-глутамил гидролазу, или pNZ 8048 (пустая экспрессионная кассета) в качестве отрицательного контроля.

Фигура 3. Распределение внутри- и внеклеточного фолата через два часа после индукции низином экспоненциального роста клеток. Показано распределение фолата до и после энизиматической деконьюгации в присутствии человеческой плазмы, и дифференциация производных фолата по количеству коротких и более длинных остатков глутаминовой кислоты (N>3). PNZ 8048, RgH и Hgh напоминают L.lactis штамм NZ 9000 с плазмидой pNZ 8048 (пустая экспрессионная кассета), pNZ 7001 (nisA промотор и ген зрелой крысиной гамма-глутамилгидролазы) и pNZ 7002 (nisA промотор и ген зрелой человеческой гамма-глутамилгидролазы), соответственно. Концентрацию фолата измеряли с помощью микробиологического анализа.

Фигура 4. Сверхэкспрессия GTP-циклогидролазы, определенная по концентрации трифосфата дигидронеоптерина, согласно данным ЖХВР и флуоресценции (возбуждение при 365 нм, эмиссия при 446 нм). Легенда: Безклеточный экстракт штамма NZ 9000-pNZ 7003, содержащий gch (←) и контрольный штамм, содержащий NZ 9000-pNZ 8048 (I).

Фигура 5. Внутри- (се) и внеклеточная (sup) концентрация фолата в gch сверхпродуцирующем штамме NZ 9000-pNZ 7003 и контрольном штамме NZ 9000-pNZ 8048 (содержащем пустую плазмиду pNZ 8048). Концентрацию фолата измеряли с помощью микробиологического анализа до и после деконьюгирования в присутствии человеческой плазмы в качестве внешнего источника гамма-глутамилгидролазы.

Литература

De Saizieu A., Vankan P. and Van Loon, A.P. G.M. (1995) Enzymic Characterization of Bacillus subtilis GTP Cyclohydrolase I.Journal of Biochemistry 306: 371-377;

Gregory J.F. Chemical and nutritional aspects of folate research: analytical procedures, methods of folate synthesis, stability, and bioavailability of dietary folates. Adv. Food Nutr. Res. 1989; 33: 1-101;

Home D.W., Patterson D. Lactobacillus casei microbiological assay of folic acid derivatives in 96 well microtiter plates. Clin. Chem 34, 2357-2359 (1988);

Huangpu J., Pak J.H., Graham M.C., Rickle S.A., Graham J.S. Purification and molecular analysis of an extracellular gamma-glutamyi hydrolase present in young tissues of the soybean plant. Biochem. Biophys. Res. Commun. 226, 1-6 (1996);

Kuipers O.P., de Ruyter P., Kleerebezem M., and de Vos W. Quorum sensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria. 1998; 64:15-21;

Lacks S. A., Greenberg B. and Lopez P. (1995) A Cluster of Four Genes Encoding Enzymes for Five Steps in the Folate Biosynthetic Pathway of Streptococcuus pneumoniae. Journal of Bacteriology, 66-74;

Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., Itskovitch E.L., Balaban N.P., Mardano A.M., Sharipova M.R., Blagova E.V., Levdikov V.M., Kuranova I.P., Rudenskaya G.N. and Stepanov V.M. (1997). Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedius strain 3-19. Purification, properties, and crystallization. Biochemistry (Mosc) 62: 903-908;

Rooijen R.J. van, Gasson M.J., de Vos W.M. Characterization of the Lactococcus lactis lactose operon promoter: contribution of flanking sequences and LacR represser to promoter activity. J. Bacteriol, 174(7), 2273-80 (1992).

Rooijen R.J. van, de Vos W.M. Molecular cloning, transcriptional analysis, and nucleotide sequence of lacR, a gene encoding the repressor of the lactose phosphotransferase system of Lactococcus lactis. J Biol Chem. 265(30), 18499-503 (1990);

Rosenberg I.H., Godwin H.A. Inhibition of intestinal gamma-glutamyl carboxypeptidase by yeast nucleic acid: an explanation of variability in utilization of dietary polyglutamye folate. J. Clin. Investig. 1971;

Ruyter P.G. de, Kuipers O.P., de Vos W.M. Controlled gene expression systems for Lactococcus lactis with the food-grade inducer nisin. Appl. Environ. Microbiol. 1996 Oct.; 62(10): 3662-7;

Seyoum E, Selhub J Properties of food folates determined by stability and susceptibility to intestinal pteroylpolyglutamate hydrolase action. J.Nutr. 1998 Nov.; 128(11): 1956-60;

Shane B. Folylpolyglutamate synthesis and role in the regulation of one-carbon metabolism. Vitam Horm. 1989; 45:263-335;

Tan P.S., van Alen-Boerrigter I.J., Poolman В., Siezen R.J., de Vos W.M., Konings W.N. Characterization of the Lactococcus lactis pepN gene encoding an aminopeptidase homologous to mammalian aminopeptidase N. FEBS Lett. 1992 Jul. 13; 306(1): 9-16;

Terzaghi B.E. and Sandine W.E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1975; 38: 17-22;

Yao R., Schneider E., Ryan T.J., Galivan J. Human gamma-glutamyl hydrolase: cloning and characterization of the enzyme expressed in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996a Sep. 17; 93(19): 10134-8;

Yao R., Nimec Z., Ryan T.J., Galivan J. Identification, cloning, and sequencing of a cDNA coding for rat gamma-glutamyl hydrolase. J. Biol. Chem. 1996b Apr. 12; 271(15): 8525-8.

1. Генетически измененная пищевая молочнокислая бактерия, способная продуцировать увеличенное количество моноглутамилфолата по сравнению с количеством, продуцируемым немодифицированной молочнокислой бактерией, в результате сверхэкспрессии в указанной генетически модифицированной пищевой молочнокислой бактерии гена, кодирующего фермент гамма-глутамилгидролазу, или гена, выбранного из группы, состоящей из гена, кодирующего фермент GTP циклогидролазу (gch), гена, кодирующего фермент дигидронеоптеринальдолазу (dhna), и гена, кодирующего фермент 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдигидроптеридинпирофосфокиназу (hppk).

2. Молочнокислая бактерия по п.1, в которой указанная сверхэкспрессия является следствием наличия множества копий соответствующего гена.

3. Молочнокислая бактерия по п.1, в которой указанная сверхэкспрессия является следствием присутствия промотора, усиливающего экспрессию соответствующего гена.

4. Молочнокислая бактерия по п.1, в которой указанные гены имеют животное происхождение, предпочтительно происходят из млекопитающих.

5. Молочнокислая бактерия по п.1, в которой указанные гены имеют растительное происхождение.

6. Молочнокислая бактерия по п.1, в которой указанные гены происходят из пищевых микроорганизмов, предпочтительно молочнокислых бактерий или дрожжей.

7. Способ получения моноглутамилфолата, включающий культивирование молочнокислой бактерии, способной продуцировать увеличенное количество моноглутамилфолата, по любому из пп.1-6 в подходящей культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии указанных генов, и извлечение продуцированных фолатов.

8. Пищевой продукт, содержащий молочнокислую бактерию по любому из пп.1-6.

9. Пищевой продукт по п.8, представляющий собой молочный продукт.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии. .

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового улучшенного способа выделения клавулановой кислоты из водного культурального бульона продуцента клавулановой кислоты.

Изобретение относится к способу стереоселективного восстановления фенилалкилкетонов до их соответствующих (S)-гидроксисоединений и новому штамму. .

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологическому синтезу и выделению из биомассы актиномицета Streptomyces avermitilis авермектинов, используемых для антипаразитарных препаратов.

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма актиномицета для производства антипаразитарных препаратов на основе авермектинов. .
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно, к получению берберина в иммобилизованной клеточной культуре василистника малого (Thalictrum minus L.). .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микроэлектронике для изготовления светодиодов, антистатических и антикоррозионных покрытий. .

Изобретение относится к получению водного раствора акриламида. .
Наверх