Способ получения белкового изолята канолы
Изобретение относится к способам выделения белков из масличного сырья. Способ получения белкового изолята канолы предусматривает экстракцию муки, солюбилизацию белка с образованием водного белкового раствора, имеющего рН от 5 до 6,8, отделение водного белкового раствора, повышение концентрации белка, разбавление указанного белкового раствора охлажденной водой с образованием отдельных белковых мицелл в водной фазе, осаждение белковых мицелл с образованием белковой мицеллярной массы, выделение белковой мицеллярной массы из надосадочной жидкости, причем эта белковая мицеллярная масса имеет содержание белка, по меньшей мере, 90 мас.% (N×6,25) в расчете на сухую массу. При этом муку масличных семян канолы промывают спиртом путем диспергирования муки в спирте при соотношении масса/объем, равном от 1:3 до 1:10, и/или концентрированный белковый раствор подвергают диафильтрации до указанной стадии разбавления, и/или указанную белковую мицеллярную массу сушат и экстрагируют высушенный белковый изолят канолы водным раствором спирта, и/или концентрированный белковый раствор пастеризуют до указанной стадии разбавления. Предлагаемый способ обеспечивает уменьшение окрашивания белкового изолята. 19 з.п. ф-лы, 58 табл.
Ссылка на родственные заявки
В настоящей заявке испрашивается дата приоритета в соответствии со статьей 35 USC 119(е) по одновременно поданным предварительным заявкам на патенты США №№ 60/389957 (подана 20 июня 2002) и 60/432985 (подана 6 ноября 2002).
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу выделения белкового изолята из муки семян канолы.
Предшествующий уровень техники
В патентах США №№ 5844086 и 6005076 ("Murrey II"), переуступленных патентовладельцу настоящего изобретения, и содержание которых включено в настоящее изобретение как ссылки, описан способ выделения белковых изолятов из муки семян масличных культур, содержащей значительное количество жира, включая муку из семян канолы, имеющих достаточное содержание жира. В этом способе предусмотрены стадии, которые включают растворение белкового материала из муки семян масличных культур, сопровождающееся также растворением содержащегося в муке жира, и удаление жира из полученного водного белкового раствора. Отделение водного белкового раствора от остаточной муки из семян масличных культур можно проводить до или после стадии удаления жира. Затем обезжиренный раствор белка концентрируют с целью повышения концентрации белка при поддержании практически постоянного значения ионной силы раствора, после чего концентрированный белковый раствор может быть подвергнут дополнительному удалению жира на следующей стадии. Затем концентрированный белковый раствор разбавляется, что приводит к образованию клубовидной массы сильно агрегированных белковых молекул в виде дискретных белковых капель в мицеллярной форме. После осаждения белковых мицелл получают агрегированную, слитую, плотную аморфную клейкую массу белкового изолята, похожую на клейковину, обозначенную термином «белковая мицеллярная масса», или БММ, которая отделяется от остаточной водной фазы и высушивается.
Белковый изолят имеет содержание белка (которое определяют по анализу азота по Кьельдалю, или другим удобным методом, N×6,25), по меньшей мере, приблизительно 90 мас.%, и представляет собой преимущественно неденатурированный белок (что установлено методом дифференциальной сканирующей калориметрии) и имеет низкое остаточное содержание жира. Используемый здесь термин «содержание белка» означает количество белка в белковом изоляте в расчете на сухое вещество. Выход белкового изолята, полученного с использованием этого способа, в расчете на долю белка, экстрагированного из муки из семян масличных культур и выделенного в виде сухого белкового изолята, составляет менее 40 мас.%, обычно около 20 мас.%.
Способ, описанный в вышеуказанных патентах Murrey II, был разработан с целью модификации и усовершенствования способа получения белкового изолята из множества материалов - источников белка, включая семена масличных культур, как описано в патенте США № 4208323 (Murrey IB). Мука из семян масличных культур, которая вырабатывалась в 1980 г., когда был опубликован патент США № 4208323, не содержала столько жира, сколько мука из масличных семян канолы, полученная во время патентов Murrey II, и поэтому способ, описанный в патенте Murrey IB, не может быть применен для получения белкового материала из муки семян масличных культур с содержанием белка свыше 90%. В описании патента Murrey IB нет конкретных сведений о проведении экспериментов с использованием рапсовой муки (канолы) в качестве исходного сырья.
Способ по патенту Murrey IB, по сути, был разработан с целью усовершенствования способа, описанного в патентах США № 4169090 и 4285862 (Murrey IA), за счет введения стадии концентрирования раствора до его разбавления с образованием белковой мицеллярной массы. В патентах Murrey IA описан один эксперимент с использованием семян рапса, однако не приведена какая-либо информация о чистоте продукта. Стадия концентрирования, описанная в патенте Murrey IB, обеспечивает повышение выхода белкового изолята приблизительно от 20 мас.% по сравнению со способом Murrey IA.
Одним из недостатков, которым обладает белковый изолят канолы, полученный в упомянутых выше способах уровня техники, является его относительно темно-желтый оттенок и нежелательный запах. Сообщалось, что эти недостатки белковых продуктов канолы, в том числе муки, обусловлены наличием фенольных соединений. В каноле содержится приблизительно в десять раз больше фенольных соединений, чем в соевых бобах, причем они могут включать синапин и конденсированные таннины. При окислении фенольные соединения могут приводить к появлению темного окрашивания. Эта проблема является особенно острой для белковых продуктов канолы, полученных путем изоэлектрического осаждения, при котором в сильно щелочной среде происходит быстрое окисление фенольных соединений в хиноны, которые затем взаимодействуют с белком и его растворами. Кроме того, в образование окрашивания могут вносить вклад и другие соединения.
Краткое описание изобретения
В этой заявке разработан усовершенствованный способ получения белкового изолята канолы, в котором семена канолы обрабатывают, чтобы получить белковую муку канолы; белковую муку канолы экстрагируют с образованием водного белкового раствора, водный белковый раствор концентрируют и белковый изолят канолы выделяют из концентрированного водного белкового раствора.
Фенольные соединения экстрагируют из муки канолы на стадии экстракции, причем количество присутствующих свободных фенолов может быть оценено по ультрафиолетовому (УФ) поглощению при длине волны 330 нм (АЗЗО). Такие фенолы подвержены окислению в хиноны, которые взаимодействуют с белками и образуют окрашенные соединения, которые способны поглощать более длинноволновое излучение. Определение поглощения при 420 нм (А420) обеспечивает более точное измерение фактического видимого желтого окрашивания изолята и белковых растворов канолы. В настоящем изобретении в ходе обработки с целью получения белкового изолята канолы предусмотрены стадии для удаления фенольных соединений, для того чтобы они не смогли привести к образованию видимых окрашенных компонентов и, таким образом, ингибировать окисление фенольных соединений до видимых окрашенных компонентов и удалить другие видимые окрашенные компоненты.
Усовершенствование, предоставляемое в одном замысле настоящего изобретения, включает осуществление, по меньшей мере, одной технологической стадии в ходе описанного выше процесса, которая приводит к белковому изоляту канолы, имеющему меньшую степень окрашивания. Заявители разработали многосторонний подход к этому технологическому процессу, причем могут быть использованы одна или несколько стадий, которые включают:
переработку семян канолы,
обработку муки,
использование конкретной формы белковой муки канолы,
осуществление экстракции белка канолы в специфических условиях,
переработку экстракта,
переработку выделенного белкового изолята канолы.
Могут быть использованы два или более таких технологических процессов, причем часто применяются сочетания технологических процессов.
При осуществлении переработки семян технологический процесс включает, по меньшей мере, инактивацию мирозиназы в нелущеных семенах. В результате инактивации мирозиназы исключаются любые каталитические воздействия мирозиназы на разложение глюкозинолатов в сернистые соединения, которые не являются питательными веществами, но дают вклад в показатели вкуса и цвета.
Стадия обработки муки может включать экстракцию муки органическим растворителем, смешивающимся с водой, который включает спирты, такие как этанол, для того чтобы экстрагировать фенольные соединения и/или другие окрашивающие компоненты.
Когда используется конкретная партия белковой муки канолы, такая мука может не содержать растворителя, ее получают путем удаления на воздухе остаточного растворителя из продукта экстракции муки масличных семян канолы при температуре 50°С, обычно при температуре окружающей среды, приблизительно от 15°С до 30°С.
Кроме того, конкретная партия белковой муки канолы может представлять собой обжаренную при низкой температуре муку масличных семян канолы, которую получают путем удаления остаточного растворителя из продукта экстракции муки масличных семян канолы при повышенной температуре приблизительно ниже 100°С.
Если технологическая стадия включает стадию экстракции, эта стадия может быть осуществлена в присутствии антиоксиданта, для того чтобы ингибировать окисление фенольных соединений и образование видимых окрашенных компонентов. Альтернативно или в сочетании водный белковый раствор, образовавшийся на стадии экстракции, может быть обработан, по меньшей мере, одним агентом, адсорбирующим окрашивающие компоненты. Кроме того, альтернативно обработка, по меньшей мере, одним агентом, адсорбирующим окрашивающие компоненты, может быть осуществлена с концентрированным раствором белка канолы, образовавшимся на стадии концентрирования.
Если технологическая стадия включает стадию концентрирования, то концентрированный водный раствор белка канолы подвергается диафильтрации, для того чтобы удалить окрашивающие компоненты из концентрированного раствора белка канолы. Диафильтрация может быть проведена с использованием водного раствора, содержащего антиоксидант, для того чтобы ингибировать окисление фенольных соединений и образование видимых окрашенных компонентов в ходе диафильтрации.
Если технологическая стадия включает выделенный белковый изолят канолы, то эта технологическая стадия может включать экстракцию белкового изолята канолы с использованием водно-спиртовых растворов, таких как водный этанол, для того чтобы экстрагировать фенольные соединения и/или видимые окрашивающие компоненты из изолята белка канолы.
Белковый изолят канолы может быть извлечен из концентрированного водного белкового раствора путем добавления концентрированного водного раствора в охлажденную воду с образованием белковой мицеллярной массы и отделением белковой мицеллярной массы от надосадочной жидкости.
Надосадочная жидкость может быть обработана с целью извлечения из нее дополнительного белкового изолята канолы, подвергая концентрированную надосадочную жидкость диафильтрации, для того чтобы удалить фенольные соединения и/или видимые окрашивающие компоненты из концентрированной надосадочной жидкости, с последующим извлечением белкового изолята канолы из диафильтрованной надосадочной жидкости, таким как сушка диафильтрованной надосадочной жидкости.
За счет предотвращения образования окрашивания и улучшения цвета белкового изолята канолы этот продукт может иметь более широкую область использования. Предполагается, что удаление и предотвращение образования окрашивающих компонентов согласно изобретению также улучшает запах белкового изолята канолы.
Белковый изолят, полученный по способу согласно изобретению, может быть использован в таких традиционных областях применения белковых изолятов, как добавление белков в пищевые продукты, эмульгирование масел, формирование структуры хлебобулочных изделий и пенообразователи в продуктах, удерживающих газы. Кроме того, белковый изолят может быть сформован в виде белковых волокон, которые используются в заменителях мяса, в качестве заменителя яичного белка или наполнителя в пищевых продуктах, в которых яичный белок применяется как связующий агент. Белковый изолят канолы может использоваться также как питательная добавка. К другим сферам применения белкового изолята канолы относятся корма для домашних и сельскохозяйственных животных, промышленная переработка, производство косметических изделий и индивидуальных средств ухода.
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения разработан способ получения белкового изолята канолы из муки масличных семян канолы, который предусматривает: (а) экстракцию муки из масличных семян канолы, для того чтобы вызвать солюбилизацию белка, содержащегося в указанной муке масличных семян канолы, с образованием водного белкового раствора, имеющего рН приблизительно от 5 до 6,8, за счет использования водного раствора соли, содержащего антиоксидант; (b) отделение водного белкового раствора от остаточной муки масличных семян; (с) повышение концентрации белка в указанном водном белковом растворе при поддержании практически постоянного значения ионной силы раствора за счет применения процесса селективного разделения на мембране с целью получения концентрированного белкового раствора; (d) разбавление указанного концентрированного белкового раствора охлажденной водой, имеющей температуру ниже, чем приблизительно 15°С, для того чтобы вызвать образование отдельных белковых мицелл в водной фазе; (е) осаждение белковых мицелл с образованием аморфной, клейкой, студенистой, похожей на клейковину, белковой мицеллярной массы и (f) выделение белковой мицеллярной массы из надосадочной жидкости, причем эта белковая мицеллярная масса имеет содержание белка, по меньшей мере, приблизительно 90 мас.% (по Кьельдалю, N×6,25) в расчете на сухую массу.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения разработан способ получения белкового раствора канолы из муки масличных семян канолы, который предусматривает: (а) промывку указанной муки из масличных семян канолы спиртом; (b) экстракцию промытой муки из масличных семян канолы, для того чтобы вызвать солюбилизацию белка в промытой муке масличных семян канолы, с образованием водного белкового раствора, имеющего рН приблизительно от 5 до 6,8; (с) отделение водного белкового раствора от остаточной муки масличных семян; (d) повышение концентрации белка в указанном водном белковом растворе при поддержании практически постоянного значения ионной силы раствора за счет применения процесса селективного разделения на мембране с целью получения концентрированного белкового раствора; (е) разбавление указанного концентрированного белкового раствора охлажденной водой, имеющей температуру ниже, чем приблизительно 15°С, для того чтобы вызвать образование отдельных белковых мицелл в водной фазе; (f) осаждение белковых мицелл с образованием аморфной, клейкой, студенистой, похожей на клейковину, белковой мицеллярной массы и (g) выделение белковой мицеллярной массы из надосадочной жидкости, причем эта белковая мицеллярная масса имеет содержание белка, по меньшей мере, приблизительно 90 мас.% (N×6,25) в расчете на сухую массу.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения разработан способ получения белкового изолята канолы из муки масличных семян канолы, который предусматривает: (а) экстракцию муки из масличных семян канолы, для того чтобы вызвать солюбилизацию белка в муке масличных семян канолы, с образованием водного белкового раствора, имеющего рН приблизительно от 5 до 6,8; (b) отделение водного белкового раствора от остаточной муки масличных семян; (с) повышение концентрации белка в указанном водном белковом растворе при поддержании практически постоянного значения ионной силы раствора за счет осуществления ультрафильтрации водного белкового раствора с целью получения концентрированного белкового раствора; (d) указанный концентрированный белковый раствор подвергается диафильтрации, (е) разбавление указанного концентрированного белкового раствора охлажденной водой, имеющей температуру ниже, чем приблизительно 15°С, для того чтобы вызвать образование отдельных белковых мицелл в водной фазе; (f) осаждение белковых мицелл с образованием аморфной, клейкой, студенистой, похожей на клейковину, белковой мицеллярной массы и (g) выделение белковой мицеллярной массы из надосадочной жидкости, причем эта белковая мицеллярная масса имеет содержание белка, по меньшей мере, приблизительно 90 мас.% (N×6,25) в расчете на сухую массу.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения разработан способ получения белкового изолята канолы из муки масличных семян канолы, который предусматривает: (а) экстракцию муки из масличных семян канолы, для того чтобы вызвать солюбилизацию белка в муке масличных семян канолы, с образованием водного белкового раствора, имеющего рН приблизительно от 5 до 6,8; (b) отделение водного белкового раствора от остаточной муки масличных семян; (с) повышение концентрации белка в указанном водном белковом растворе при поддержании практически постоянного значения ионной силы раствора за счет применения процесса селективного разделения на мембране с целью получения концентрированного белкового раствора; (d) разбавление указанного концентрированного белкового раствора охлажденной водой, имеющей температуру ниже, чем приблизительно 15°С, для того чтобы вызвать образование отдельных белковых мицелл в водной фазе; (е) осаждение белковых мицелл с образованием аморфной, клейкой, студенистой, похожей на клейковину, белковой мицеллярной массы; (f) выделение белковой мицеллярной массы из надосадочной жидкости; (g) сушку белковой мицеллярной массы, для того чтобы получить белковый изолят канолы, который имеет содержание белка, по меньшей мере, приблизительно 90 мас.% (N×6,25) в расчете на сухую массу, и (h) экстракцию указанного белкового изолята канолы водным раствором спирта.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения разработан способ получения белкового изолята канолы из муки масличных семян канолы, который предусматривает: (а) экстракцию муки из масличных семян канолы, для того чтобы вызвать солюбилизацию белка в муке масличных семян канолы, с образованием водного белкового раствора, имеющего рН приблизительно от 5 до 6,8; (b) отделение водного белкового раствора от остаточной муки масличных семян; (с) повышение концентрации белка в указанном водном белковом растворе при поддержании практически постоянного значения ионной силы раствора за счет применения процесса селективного разделения на мембране с целью получения концентрированного белкового раствора; (d) пастеризацию концентрированного белкового раствора с целью получения пастеризованного белкового раствора; (е) разбавление пастеризованного белкового раствора охлажденной водой, имеющей температуру ниже, чем приблизительно 15°С, для того чтобы вызвать образование отдельных белковых мицелл в водной фазе; (f) осаждение белковых мицелл с образованием аморфной, клейкой, студенистой, похожей на клейковину, белковой мицеллярной массы и (g) выделение белковой мицеллярной массы из надосадочной жидкости, причем эта белковая мицеллярная масса имеет содержание белка, по меньшей мере, приблизительно 90 мас.% (N×6,25) в расчете на сухую массу.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения разработан способ получения белкового изолята канолы из масличных семян канолы, который предусматривает: (а) обработку масличных семян канолы с целью инактивации мирозиназы, содержащейся в масличных семенах, для того чтобы получить обработанные масличные семена, (b) обработку масличных семян канолы, с целью удаления из них масла канолы и получения муки масличных семян канолы; (с) экстракцию масличных семян канолы, для того чтобы вызвать солюбилизацию белка в масличных семенах канолы, с образованием водного раствора, имеющего рН приблизительно от 5 до 6,8; (d) отделение водного белкового раствора от остаточной муки масличных семян; (е) повышение концентрации белка в указанном водном белковом растворе при поддержании практически постоянного значения ионной силы раствора за счет применения процесса селективного разделения на мембране с целью получения концентрированного белкового раствора; (f) разбавление этого концентрированного белкового раствора охлажденной водой, имеющей температуру ниже, чем приблизительно 15°С, для того чтобы вызвать образование отдельных белковых мицелл в водной фазе; (g) осаждение белковых мицелл с образованием аморфной, клейкой, студенистой, похожей на клейковину, белковой мицеллярной массы и (h) выделение белковой мицеллярной массы из надосадочной жидкости, причем эта белковая мицеллярная масса имеет содержание белка, по меньшей мере, приблизительно 90 мас.% (N×6,25) в расчете на сухую массу.
Канола также известна как масло семян рапса или рапсовое масло.
Подробное описание изобретения
Улучшение цвета может быть достигнуто путем обработки семян. Нелущеные семена подвергаются термической обработке водяным паром для инактивации мирозиназы. Затем инактивированные семена могут быть обработаны традиционным образом, для того чтобы извлечь из семян масло и получить муку масличных семян канолы.
В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения предпочтительно из муки масличных семян может быть удален растворитель путем обжаривания при повышенной температуре приблизительно ниже 100°С, поскольку такая мука обеспечит меньшую интенсивность цвета, чем мука, из которой растворитель удален с использованием традиционного способа, при существенно повышенной температуре обжаривания. Получение белкового изолята канолы, который имеет содержание белка, по меньшей мере, приблизительно 90 мас.% (N×6,25), предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 100% масс., описано в одновременно рассматриваемой заявке на патент США № 10/314202, поданной 9 декабря 2002 г. и переуступленной патентовладельцу настоящего изобретения, содержание которой включено в настоящее изобретение как ссылка.
Более предпочтительно удаляют растворитель из муки масличных семян на воздухе при температуре приблизительно ниже 50°С, предпочтительно приблизительно при температуре окружающей среды, приблизительно от 15°С до 30°С, так как в растворе экстракта присутствует даже меньше окрашивающих компонентов, чем в случае использования обжаренной муки. Образование белкового изолята канолы, который имеет содержание белка, по меньшей мере, приблизительно 90 мас.% (N×6,25), предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 100 мас.%, описано в одновременно рассматриваемых заявках на патент США № 60/390126, поданной 21 июня 2002 г., и № 60/401712, поданной 8 августа 2002 г., содержание которых включено в настоящее изобретение как ссылка.
Белковые изоляты канолы могут быть получены из муки масличных семян канолы. В одновременно рассматриваемых заявках на патент США № 60/288415 (подана 4 мая 2001 г., 60/326987 (подана 5 октября 2001 г.), 60/331066 (подана 7 ноября 2001 г.), 60/333494 (подана 26 ноября 2001 г.), 60/374801 (подана 24 апреля 2002 г.) и 10/133391 (подана 3 мая 2002 г., WO 02/089597), которые все переуступлены патентовладельцу настоящего изобретения и содержание которых включено в настоящее изобретение как ссылки, описан способ получения белковых изолятов канолы из муки масличных семян канолы, причем такие изоляты имеют содержание белка, по меньшей мере, около 100% (N×6,25). В этом способе применяется многостадийный процесс, который включает экстракцию муки масличных семян канолы, используя раствор соли, отделение полученного водного белкового раствора от остаточной муки масличных семян; повышение концентрации белка в водном белковом растворе, по меньшей мере, приблизительно до 200 г/л, при поддержании практически постоянного значения ионной силы раствора, с использованием технологии селективных мембран, разбавление полученного концентрированного белкового раствора охлажденной водой, для того чтобы вызвать образование белковых мицелл, осаждение белковых мицелл с образованием аморфной, клейкой, студенистой, похожей на клейковину, белковой мицеллярной массы (БММ) и выделение белковой мицеллярной массы из надосадочной жидкости, причем БММ имеет содержание белка, по меньшей мере, около 100 мас.% (N×6,25). Используемый здесь термин «содержание белка» определяется в расчете на сухое вещество. Выделенная масса БММ может быть высушена.
В одном из вариантов осуществления способа, описанного выше и конкретно описанного в заявках на патенты США № 60/326987, 60/331066, 60/333494, 60/374801 и 10/137391, надосадочную жидкость, полученную на стадии отстаивания БММ, обрабатывают, чтобы выделить белковый изолят, содержащий высушенный белковый изолят, из сырой БММ и надосадочной жидкости. Этот способ можно осуществить путем первоначального концентрирования надосадочной жидкости, используя ультрафильтрующие мембраны, путем смешивания концентрированной надосадочной жидкости с сырой БММ и сушки смеси. Полученный белковый изолят канолы имеет высокую степень чистоты, по меньшей мере, около 90% белка (N×6,25), предпочтительно, по меньшей мере, около 100% белка (N×6,25).
В другом варианте осуществления способа, описанного выше и конкретно описанного в заявках на патенты США № 60/333494, 60/374801 и 10/137391, надосадочную жидкость, полученную на стадии отстаивания БММ, обрабатывают, чтобы отделить белковый изолят от надосадочной жидкости. Этот способ можно осуществить путем первоначального концентрирования надосадочной жидкости, используя ультрафильтрующие мембраны и сушку концентрата. Полученный белковый изолят канолы имеет высокую степень чистоты, по меньшей мере, около 90% белка (N×6,25), предпочтительно, по меньшей мере, около 100% белка (N×6,25).
В способах, описанных в упомянутых выше заявках на патент США, используется периодический режим. В одновременно рассматриваемых заявках на патент США №60/331646 (подана 20 ноября 2001 г.), 60/383809 (подана 30 мая 2002 г.) и 10/298678 (подана 19 ноября 2002 г., WO 03/043439), которые все переуступлены патентовладельцу настоящего изобретения и содержание которых включено в настоящее изобретение как ссылки, описан непрерывный способ получения белковых изолятов канолы. В соответствии с этим способом муку масличных семян канолы непрерывно смешивают с раствором соли, эту смесь непрерывно подают в трубу, в которой осуществляется экстракция белка из муки масличных семян канолы и образуется водный белковый раствор; этот водный белковый раствор непрерывно отделяется от остаточной муки масличных семян канолы, водный белковый раствор непрерывно подается в процесс селективного разделения на мембране с целью повышения концентрации белка в водном белковом растворе, по меньшей мере, приблизительно до 200 г/л, при поддержании практически постоянного значения ионной силы раствора; полученный концентрированный белковый раствор непрерывно смешивается с охлажденной водой, для того чтобы вызвать образование белковых мицелл, в то время как непрерывно обеспечивается перелив надосадочной жидкости, пока в емкости-отстойнике не накопится заданное количество БММ. Эта белковая мицеллярная масса выделяется из емкости-отстойника и может быть высушена. Белковая мицеллярная масса имеет содержание белка, по меньшей мере, около 90 мас.%.
Как описано в упомянутых выше заявках на патенты США № 60/326987, 60/331066, 60/333494, 60/374801 и 10/137391, переливающаяся надосадочная жидкость может быть обработана, чтобы выделить из нее белковый изолят канолы.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения мука масличных семян может быть сначала подвергнута экстракции растворителем, для того чтобы удалить из нее фенольные соединения и окрашивающие компоненты. Такая экстракция растворителем может быть осуществлена с использованием растворимого в воде органического растворителя для фенольных соединений и/или видимых окрашивающих компонентов, таких как растворимый в воде спирт, предпочтительно этанол.
Экстракция может быть осуществлена путем диспергирования муки масличных семян канолы в растворителе при соотношении масса/объем, равном приблизительно от 1:3 до 1:10, предпочтительно около 1:5. Суспензия может перемешиваться приблизительно в течение от 5 до 60 минут, предпочтительно приблизительно от 15 до 30 минут, при температуре приблизительно от 15 до 45°С, предпочтительно приблизительно от 30 до 35°С. Подходящим набором условий является экстракция в течение 30 минут при 35°С. Такая экстракция может быть осуществлена многократно, пока не прекратится дальнейшая экстракция фенольных соединений и/или видимых окрашивающих компонентов.
В способе настоящего изобретения белковый материал солюбилизируется из муки масличных семян канолы. Этот белковый материал может представлять собой природный белок семян канолы, или белковый материал может быть модифицирован генетическими методами, однако он обладает гидрофобными характеристиками и полярными свойствами природного белка. Мука канолы может представлять собой любую муку канолы, образовавшуюся при удалении рапсового масла из масличных семян канолы, с различным содержанием природного (неденатурированного) белка, например, полученного способами экстракции горячим гексаном или холодным прессованием масла. Обычно переработка семян, когда она проводится с целью удаления рапсового масла из масличных семян канолы, осуществляется как отдельная операция в процессе выделения белкового изолята описанного здесь настоящего изобретения.
Наиболее эффективно солюбилизация белка обеспечивается с использованием раствора соли пищевого качества (далее - «пищевая соль»), так как в присутствии соли повышается степень удаления растворимого белка из муки масличных семян. Если предполагается использовать белковый изолят канолы не для пищевых целей, то могут быть использованы химикалии непищевого сорта. Этой солью обычно является хлорид натрия, хотя можно использовать и другие соли, например хлорид калия. Ионная сила раствора соли составляет, по меньшей мере, приблизительно 0,10, предпочтительно, по меньшей мере, около 0,15, для того чтобы обеспечить эффективную солюбилизацию значительного количества белка. С увеличением ионной силы раствора соли степень солюбилизации белка из муки масличных семян сначала повышается, пока не достигнет максимального значения. Однако последующее увеличение ионной силы не способствует повышению общего количества солюбилизированного белка. Ионная сила раствора пищевой соли, которая обеспечивает максимальную степень солюбилизации белка, изменяется в зависимости от вида соли и выбранной муки масличных семян. Раствор пищевой соли может иметь ионную силу в интервале приблизительно до 0,25.
С учетом того, что для осаждения белка с увеличением ионной силы требуется более высокая степень разбавления, обычно предпочтительно используется ионная сила меньше, чем приблизительно 0,8 и, более предпочтительно приблизительно от 0,15 до 0,6.
В периодическом режиме солюбилизация белка в присутствии соли осуществляется при температуре, по меньшей мере, приблизительно 5°С и предпочтительно приблизительно до 35°С и предпочтительно сопровождается перемешиванием с целью сокращения времени солюбилизации, которое обычно составляет от 10 до 60 минут. Предпочтительно, чтобы солюбилизация проводилась в таком режиме, который способствуют экстрагированию максимально возможного количества белка из муки семян масличных культур, чтобы обеспечить высокий общий выход продукта.
В качестве нижнего температурного предела выбрана температура около 5°С, так как ниже указанной температуры солюбилизация идет нецелесообразно медленно, в то время как верхним предпочтительным пределом выбрана температура около 35°С, поскольку при более высоких температурах осуществление процесса солюбилизации в периодическом режиме становится экономически невыгодным.
В непрерывном процессе экстракция белка из муки масличных семян канолы проводится любым способом, согласующимся с непрерывным осуществлением экстракции белка из муки масличных семян канолы. В одном варианте осуществления мука масличных семян канолы непрерывно смешивается с водным раствором пищевой соли, и смесь пропускают через трубу или протяженный контур при такой скорости потока и времени пребывания, которые достаточны для того, чтобы провести заданную экстракцию в соответствии с указанными выше параметрами. В таком непрерывном процессе стадия солевой солюбилизации осуществляется быстро, за время, которое обычно составляет около 10 минут, предпочтительно, чтобы солюбилизация проводилась в таком режиме, который способствует экстрагированию максимально возможного количества белка из муки масличных семян канолы. Предпочтительно солюбилизация в непрерывном процессе осуществляется при повышенной температуре, предпочтительно приблизительно выше 35°С, обычно приблизительно до 65°С или выше.
Водный раствор пищевой соли и мука из масличных семян канолы, как правило, имеют рН приблизительно от 5 до 6,8, что делает возможным образование белкового изолята в виде мицелл, как описано более подробно ниже.
При предельных (и близких к предельным) значениях рН в указанном диапазоне образование белкового изолята происходит только частично с промежуточным образованием мицелл, и выход изолята ниже того, который достигается при любом значении рН в указанном диапазоне. Поэтому предпочтительными являются слабокислотные значения рН, приблизительно от 5,3 до 6,2.
В случае необходимости величину рН раствора соли можно устанавливать на любом желаемом уровне в диапазоне приблизительно от 5 до 6,8 для использования на стадии экстракции с помощью любой подходящей кислоты, обычно соляной кислоты, или щелочи, обычно гидроксида натрия.
Концентрация муки из масличных семян в растворе пищевой соли на стадии солюбилизации может варьироваться в широких пределах. Обычные значения концентрации составляют приблизительно от 5% до 15% (масс./об.).
В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения антиоксидант может присутствовать в растворе пищевой соли, для того чтобы ингибировать окисление фенолов (в муке масличных семян канолы) в компоненты, которые реагируют с белком и вызывают темное окрашивание. Могут быть использованы любые желательные пищевые антиоксиданты, такие как сульфит натрия и аскорбиновая кислота. Количество используемого антиоксиданта в водном растворе пищевой соли зависит от применяемого материала и может составлять приблизительно от 0,01 до 1 мас.%, предпочтительно приблизительно от 0,05 до 0,1 мас.%. Ингибирование окисления фенольных соединений за счет использования антиоксидантов приводит к уменьшению окрашивания экстракта (поглощение при 420 нм), в то время как концентрация фенольных соединений (поглощение при 330 нм), в основном, остается без изменений.
В присутствии добавленного сульфита натрия, даже при столь низкой концентрации соли, как 0,05 М, концентрация белка в экстракте при рН 6,3 сопоставима с концентрацией белка в 0,15 М растворе соли, но без сульфита натрия.
Обычно белковый раствор, полученный на стадии экстракции, имеет концентрацию белка приблизительно от 5 до 40 г/л, предпочтительно приблизительно от 10 до 30 г/л.
При выборе параметров стадии экстракции желание экстрагировать как можно больше белка из муки масличных семян канолы уравновешивается желанием минимизировать окрашивание полученного экстрагированного раствора. При обсуждении данных, представленных в этом изобретении, видно, что время экстракции 30 минут обычно является достаточным, для того чтобы экстрагировать весь белок, который предполагалось экстрагировать при преобладающем значении рН и молярности раствора соли. При повышенном значении рН увеличивается количество экстрагированного белка, что приводит к белковому раствору, имеющему заметно более темное окрашивание (измеряется по поглощению при 420 нм).
Возможно экстрагировать за 10 минут 0,1 молярным раствором соли при рН 8,0 столько же белка, сколько экстрагируется за 30 минут 0,15 молярным раствором соли при рН 6,3. Наблюдается заметное снижение поглощения при 330 нм для экстракции при рН 9,8 по сравнению с экстракцией при пониженном значении рН, хотя цвет становится заметно темнее с увеличением рН. Это наблюдение можно объяснить тем, что фенольные соединения взаимодействуют с образованием веществ желтого цвета, которые не поглощают УФ при 330 нм, но довольно сильно поглощают излучение при большей длине волны, между 360 и 400 нм. По этой причине экстракция белковой муки канолы осуществляется при рН ниже 8.
Затем водная фаза, образовавшаяся на стадии экстракции, может быть отделена от остаточной муки канолы любым подходящим способом, например с использованием вакуумной фильтрации с последующим центрифугированием и/или путем фильтрации для удаления остаточной муки. Отделенная остаточная мука может быть высушена перед дальнейшим использованием.
Если мука из семян канолы содержит значительное количество жира, как описано в патентах Murray II, то могут быть проведены описанные в этих патентах стадии обезжиривания выделенного водного белкового раствора и концентрированного водного белкового раствора, которые обсуждаются ниже.
В качестве альтернативы экстракции белка из муки масличных семян канолы водным раствором соли может служить экстракция муки чистой водой, хотя использование одной воды приводит к извлечению меньшего количества белка из муки масличных семян канолы, чем при использовании водного раствора соли. При использовании указанного альтернативного способа соль в указанной выше концентрации добавляют к белковому раствору после его отделения от остаточной муки масличных семян, для того чтобы белок оставался в растворе в процессе стадии концентрирования, описанной ниже. Если проводится первая стадия обезжиривания, то соль обычно добавляется после завершения указанной операции.
Другим альтернативным способом является экстракция муки масличных семян канолы раствором пищевой соли при относительно высоком значении рН, приблизительно выше рН 6,8, обычно вплоть до рН около 11. Однако, как отмечалось выше, обычно избегают проводить экстракцию при значениях рН приблизительно выше 8, так как при таких значениях рН наблюдается образование существенного окрашивания.
Величину рН раствора пищевой соли можно регулировать в щелочном диапазоне с помощью любой подходящей пищевой щелочи, такой как водный раствор гидроксида натрия. Альтернативно, белок из муки масличных семян канолы можно экстрагировать раствором соли при относительно низком значении рН, приблизительно ниже рН 5, обычно вплоть до рН около 3. При использовании указанной альтернативы водную фазу, образовавшуюся на стадии экстракции муки масличных семян канолы, в последующем отделяют от остаточной муки канолы любым удобным способом, например, с использованием вакуумной фильтрации с последующим центрифугированием и/или путем фильтрации для удаления остаточной муки. Отделенная остаточная мука может быть высушена перед дальнейшим использованием.
Затем величина рН водного белкового раствора, полученного на стадии экстракции при высоком или низком значении рН, может быть установлена в диапазоне приблизительно от 5 до 6,8, предпочтительно приблизительно от 5,3 до 6,2, как указано выше, до последующей обработки с целью извлечения белкового изолята канолы, главным образом, путем образования мицелл, что рассмотрено ниже. Указанное регулирование величины рН может быть осуществлено с использованием любой подходящей кислоты, такой как хлористоводородная кислота, или щелочи, такой как гидроксид натрия, если это целесообразно.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения после экстракции белка белковый раствор может быть подвергнут обработке на одной или нескольких стадиях удаления окрашивания с использованием стадий ультрафильтрации/диафильтрации и контактирования с веществом, адсорбирующим пигменты. На стадии ультрафильтрации содержание белка в водном белковом растворе увеличивается, причем концентрация соли остается постоянной. Ультрафильтрация может быть осуществлена с использованием мембран с такой пропускной способностью (отсечкой) по молекулярной массе, чтобы обеспечить прохождение фенольных соединений и окрашивающих компонентов через мембрану с пермеатом (проникающий продукт), тогда как белок удерживается. Обычно мембрана ультрафильтрации имеет отсечку по молекулярной массе приблизительно от 3000 до 50000 ед. дальтона (Да), предпочтительно приблизительно от 5000 до 10000 Да, с учетом использования различных материалов и конфигураций мембран. Эти мембраны могут быть выполнены в виде полых волокон или свернутых в виде спиралей мембран. Для непрерывной работы мембраны могут иметь размеры, которые обеспечивают заданную степень концентрирования водного раствора белка при прохождении сквозь продукт.
Белковый раствор подвергается концентрированию на стадии ультрафильтрации приблизительно в 4-20 раз, и предпочтительно эта стадия осуществляется с целью получения концентрированного белкового раствора, имеющего концентрацию белка, по меньшей мере, приблизительно 200 г/л, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 250 г/л.
Затем концентрированный белковый раствор поступает на стадию диафильтрации с использованием водного раствора соли, имеющего ту же самую молярность и значение рН, что и экстрагирующий раствор. Эта стадия диафильтрации может быть проведена с использованием приблизительно от 2 до 20 объемов раствора диафильтрации, предпочтительно приблизительно от 5 до 10 объемов раствора диафильтрации. В ходе диафильтрации из водного белкового раствора удаляются дополнительные количества фенольных соединений и видимых пигментов при прохождении через продукт с пермеатом. Операция диафильтрации может быть выполнена до тех пор, пока в пермеате практически не останется заметных количеств фенольных соединений и видимых пигментов. Такая диафильтрация может быть проведена с использованием мембраны, имеющей отсечку по молекулярной массе приблизительно от 3000 до 50000 Дальтон, предпочтительно приблизительно от 5000 до 10000 Да, с учетом использования различных материалов и конфигураций мембран.
В соответствии с этим вариантом осуществления изобретения в среде диафильтрации может присутствовать антиоксидант, по меньшей мере, на каком-то этапе стадии диафильтрации. Этот антиоксидант может быть любым удобным пищевым антиоксидантом, таким как сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Количество антиоксиданта, используемого в среде диафильтрации, может составлять приблизительно от 0,01 до 1 мас.%, предпочтительно около 0,05 мас.%. Антиоксидант применяется для того, чтобы ингибировать окисление фенольных соединений, присутствующих в концентрированном растворе белкового изолята канолы.
Стадия концентрирования и стадия диафильтрации могут быть проведены при любой подходящей температуре, обычно приблизительно от 20°С до 60°С, в течение периода времени, достаточного для достижения заданной степени концентрирования. Температура и другие используемые параметры в определенной степени зависят от мембранного оборудования, используемого для осуществления концентрирования до желаемой концентрации белка в растворе.
При осуществлении операций ультрафильтрации/диафильтрации условия подбираются таким образом, чтобы обеспечить белковый раствор, имеющий самую высокую концентрацию белка и минимальное окрашивание. Учитывая данные экспериментов, приведенные ниже, ясно, что в способе ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) можно эффективно снизить концентрацию фенольных соединений (по данным А330) приблизительно на 28-74%, в зависимости от величины рН и содержания соли. Кроме того, операции ультрафильтрации/диафильтрации оказывают влияние на удаление непищевых примесей и тем самым улучшается пищевая ценность белкового изолята канолы.
Пермеаты ультрафильтрации/диафильтрации имеют наиболее высокие значения А330 при рН 8,0 и 6,3. Вероятно, эти высокие значения АЗЗО для пермеата обусловлены несвязанными фенольными соединениями, которые способны проходить через продукт в пермеат, тогда как при значениях рН 9,8 и 11,0 эти фенольные соединения реагируют с образованием окрашивающих компонентов, которые не столь сильно поглощают при 330 нм.
Проведение экстракции при повышенных значениях рН и содержании соли приводит к наивысшим начальным показаниям A330 и в большинстве случаев к минимальным показаниям A330 для конечного ретентата. При повышенных значениях рН и содержании соли в пермеатах содержится больше азота, что указывает на потери белка.
Соотношения поглощение A330/содержание белка для ретентата (продукт, не проходящий через мембрану) показывают, что наилучшие показатели достигаются при значениях рН от 6,3 до 8,0. Отсюда следует, что при малых рН отношение компонентов, поглощающих при A330, к содержанию белка меньше, чем при повышенных рН, и достигается более эффективное удаление компонентов при УФ/ДФ. При всех концентрациях соли, кроме 0 М и 0,25 М, при рН 6,3 достигается наилучшее соотношение A330/содержание белка. Учитывая этот факт, значение рН 6,3, по-видимому, является оптимальным из испытанных значений рН для диафильтрации окрашивающих компонентов из белкового раствора, при этом концентрация 0,25 М представляет собой наилучшее содержание соли, обеспечивающее самое высокое содержание белка.
После операций ультрафильтрации/диафильтрации может следовать обработка веществом, адсорбирующим пигменты. В упомянутых выше одновременно рассматриваемых заявках на патент США № 60/288415, 60/326987, 60/331066, 60/333494, 60/374801 и 10/137391 (WO 02/089597) описано применение порошкообразного активированного угля для снижения интенсивности окраски.
Как описано в этих заявках, такая стадия снижения интенсивности окраски проводится с раствором белка канолы до концентрирования, и она приводит к снижению окрашивания и менее интенсивному желтому цвету продукта - белкового изолята канолы, по сравнению с продуктом, полученным без такой стадии. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения применение вещества, адсорбирующего окрашивающие компоненты, предпочтительно осуществляется с концентрированным раствором белка канолы после диафильтрации. Порошкообразный активированный уголь может быть использован здесь, также как и гранулированный активированный уголь (ГАУ). Другой материал, который может быть использован в качестве вещества, адсорбирующего окрашивающие компоненты, представляет собой поливинилпирролидон. Альтернативно, согласно другому варианту осуществления изобретения, применение вещества, адсорбирующего окрашивающие компоненты, может быть проведено с раствором белка канолы до ультрафильтрации и необязательной диафильтрации и/или непосредственно на стадии экстракции. Когда вещество, адсорбирующее окрашивающие компоненты, используется до ультрафильтрации, то диафильтрация может быть исключена, так как в этом случае на стадии диафильтрации не удаляются дополнительные фенолы и/или видимые пигменты.
В описанных ниже экспериментах поливинилпирролидон и ГАУ (GAC) снижают поглощение А330 лучше при значениях рН 6,3 и 8,0, чем при значениях рН 9,8 и 11, вероятно, благодаря связыванию хинонов с белком при повышенных значениях рН.
Поливинилпирролидон обеспечивает хорошее снижение поглощения А330 без потери белка. Другие возможные материалы, которые были испытаны, оказались неудовлетворительными или в результате неприемлемых потерь белка, или из-за неспособности снизить поглощение А330 раствора.
Стадия обработки веществом, адсорбирующим окрашивающие компоненты, может быть проведена при любых подходящих условиях, обычно белковый раствор канолы имеет температуру окружающей среды. В случае порошкообразного активированного угля могут быть использованы количества приблизительно от 0,025 до 5% мас./об., предпочтительно приблизительно от 0,05 до 2% мас./об. Когда в качестве вещества, адсорбирующего окрашивающие компоненты, применяется поливинилпирролидон, могут быть использованы количества приблизительно от 0,5 до 5% мас./об., предпочтительно приблизительно от 2 до 3% мас./об. Вещество, адсорбирующее окрашивающие компоненты, может быть удалено из белкового раствора канолы любым подходящим способом, таким как фильтрация.
После завершения обработки диафильтрованного белкового раствора канолы веществом, адсорбирующим окрашивающие компоненты, полученный белковый раствор перерабатывают, для того чтобы выделить из него белковый изолят канолы. Извлечение белкового изолята канолы может быть проведено любым подходящим способом, в зависимости от параметров белкового раствора.
Например, белковый изолят канолы может быть извлечен путем изоэлектрического осаждения из щелочных растворов или путем осаждения белковой мицеллярной массы из более нейтральных растворов. Альтернативно, белок может быть осажден за счет повышения концентрации соли.
Предпочтительно обработка белкового раствора канолы с целью выделения белкового изолята канолы проводится с использованием процесса белковой мицеллярной массы, который описан в упомянутых выше заявках на патент США и более подробно описан ниже, так как условия рН при экстракции обеспечивают менее интенсивное окрашивание, чем при использовании способа изоэлектрического осаждения.
В зависимости от используемой температуры на стадиях удаления окрашивающих компонентов, осуществляемых с водным раствором белка канолы, концентрированный белковый раствор может быть нагрет до температуры, по меньшей мере, приблизительно от 20°С до 60°С, предпочтительно приблизительно от 25°С до 40°С, для того чтобы снизить вязкость концентрированного, необязательно диафильтрованного белкового раствора, для того чтобы облегчить проведение последующей стадии разбавления с образованием мицелл. Этот концентрированный, необязательно диафильтрованный белковый раствор не следует нагревать выше указанного интервала температур, поскольку при высокой температуре в концентрированном, необязательно диафильтрованном белковом растворе при разбавлении холодной водой не могут сформироваться мицеллы. Концентрированный, необязательно диафильтрованный белковый раствор может быть подвергнут дополнительной операции обезжиривания, если это необходимо, как описано в патентах Murray II.
Концентрированный белковый раствор, образовавшийся на стадии удаления окрашивающих компонентов, может быть подвергнут пастеризации с целью уничтожения всех бактерий, которые могут присутствовать в исходной муке в результате хранения или по другой причине и могут экстрагироваться из муки в раствор белкового изолята канолы на стадии экстракции. Такая пастеризация может быть проведена в любых желаемых условиях пастеризации. Обычно концентрированный, необязательно диафильтрованный белковый раствор нагревают до температуры приблизительно от 55°С до 70°С, предпочтительно приблизительно от 60°С до 65°С, приблизительно в течение от 10 до 15 минут. Затем пастеризованный концентрированный белковый раствор может быть охлажден для дополнительной переработки, как описано ниже, предпочтительно до температуры приблизительно от 25 до 40°С.
Затем концентрированный белковый раствор, полученный на стадии удаления окрашивающих компонентов и необязательно прошедший стадии обезжиривания и пастеризации, разбавляется, для того чтобы вызвать образование мицелл путем смешивания концентрированного белкового раствора с охлажденной водой, объем которой соответствует достижению желаемой степени разбавления. В зависимости от соотношения долей белка, которые желательно получить из мицелл и из надосадочной жидкости, степень разбавления концентрированного белкового раствора может варьироваться. Обычно чем выше степень разбавления, тем больше доля белка, которая остается в водной фазе.
Когда желательно обеспечить наибольшую долю белка, которая получается из мицелл, концентрированный раствор белка разбавляется приблизительно в 15 раз или меньше, предпочтительно приблизительно в 10 раз или меньше.
Охлажденная вода, с которой смешивается концентрированный раствор белка, имеет температуру меньше, чем приблизительно 15°С, обычно приблизительно от 3 до 15°С, предпочтительно ниже, чем приблизительно 10°С, так как при такой пониженной температуре достигается более высокий выход белкового изолята в виде белковой мицеллярной массы при заданных факторах разбавления.
В периодическом процессе загрузку концентрированного водного раствора добавляют в неподвижную массу охлажденной воды, имеющую желаемый объем, как рассмотрено выше. Разбавление концентрированного водного раствора и последующее уменьшение ионной силы приводят к образованию помутневшей массы высокоассоциированных белковых молекул в виде отдельных белковых капель в мицеллярной форме. В периодическом процессе белковым мицеллам дают осесть в массе охлажденной воды с образованием агрегированной, слитой, плотной аморфной, клейкой, похожей на клейковину белковой мицеллярной массы (БММ). Это осаждение может быть стимулировано, например, центрифугированием. Такое стимулированное осаждение приводит к снижению содержания жидкости в белковой мицеллярной массе, в результате снижается содержание влаги обычно приблизительно на 70-95 мас.%, обычно приблизительно на 50-80 мас.% от общей массы мицелл. Таким образом, снижение содержания влаги массы мицелл также снижает содержание соли, захваченной мицеллярной массой, и, следовательно, содержание соли в высушенном изоляте.
Альтернативно, процесс разбавления может быть осуществлен путем непрерывного пропускания концентрированного белкового раствора в одно входное отверстие Т-образной трубы, в то время как разбавляющая вода поступает в другое входное отверстие Т-образной трубы, обеспечивая смешивание в трубе. Разбавляющая вода поступает в Т-образную трубу со скоростью, которая достаточна для достижения желаемой степени разбавления.
Смешивание концентрированного белкового раствора с разбавляющей водой в трубе инициирует образование белковых мицелл, причем эта смесь непрерывно выводится из выпускного отверстия Т-образной трубы в емкость-отстойник, из которой при ее наполнении обеспечивается перелив надосадочной жидкости. Предпочтительно смесь поступает в массу жидкости в емкости-отстойнике таким образом, чтобы минимизировать турбулентность в массе жидкости.
В непрерывном процессе белковые мицеллы подвергаются осаждению в емкости-отстойнике с образованием агрегированной, слитой, плотной, аморфной, клейкой белковой мицеллярной массы (БММ), похожей на клейковину, причем этот процесс продолжается до тех пор, пока на дне емкости-отстойника не накопится заданное количество БММ, и затем накопленная масса БММ удаляется из емкости-отстойника.
Сочетание параметров процесса концентрирования раствора белка до содержания белка, по меньшей мере, приблизительно 200 г/л и использование коэффициента разбавления меньше, чем приблизительно 15, приводит к более высокому выходу, часто к существенно более высокому выходу в показателях извлечения белка в виде белковой мицеллярной массы из исходного экстракта муки и гораздо более чистым изолятам в показателях содержания белка по сравнению с показателями, достигнутыми при использовании любых известных из уровня техники способов получения белкового изолята, которые рассмотрены в упомянутых выше патентах США.
Осажденный изолят отделяется от остаточной водной фазы или надосадочной жидкости, например, путем декантации остаточной водной фазы с осажденной массы или путем центрифугирования. Белковая мицеллярная масса может быть использована во влажном виде или может быть высушена с использованием любой подходящей технологии, такой как распылительная сушка, сублимационная сушка или сушка в вакуумном барабане, с получением сухой формы. Сухая масса БММ имеет высокое содержание белка, приблизительно выше 90 мас.%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 100 мас.% белка (рассчитано по данным анализа, N×6,25), причем преимущественно неденатурированного белка (установлено методом дифференциальной сканирующей калориметрии). При использовании способов, описанных в патентах Murray II, сухая БММ, выделенная из муки масличных семян, имеет также низкое остаточное содержание жира, которое может быть меньше, чем приблизительно 1 мас.%.
Надосадочная жидкость со стадий образования БММ и осаждения содержит значительное количество белка канолы, не осажденного на стадии разбавления, и ее перерабатывают с целью выделения из нее белкового изолята канолы. Надосадочная жидкость со стадии разбавления после удаления БММ подвергается концентрированию, для того чтобы повысить концентрацию белка в ней. Такое концентрирование может проводиться с использованием любой подходящей технологии селективных мембран, например путем ультрафильтрации с использованием мембран с соответствующей величиной отсечки по молекулярной массе, чтобы обеспечить прохождение низкомолекулярных соединений, в том числе соли и других небелковых низкомолекулярных компонентов, экстрагированных из материала - источника белка, через мембрану, тогда как белок канолы удерживается в растворе. Могут быть использованы мембраны ультрафильтрации, которые имеют отсечку по молекулярной массе приблизительно от 3000 до 10000 ед. дальтона, с учетом использования различных материалов и конфигураций мембран. Кроме того, при концентрировании надосадочной жидкости таким способом также снижается объем жидкости, который необходимо высушить, для того чтобы извлечь белок. Обычно надосадочная жидкость подвергается концентрированию до содержания белка приблизительно от 100 до 400 г/л, предпочтительно приблизительно от 200 до 300 г/л до высушивания. Такая стадия концентрирования может проводиться в периодическом или непрерывном режиме работы, как описано выше для стадии концентрирования белкового раствора.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения до высушивания концентрированная надосадочная жидкость поступает на стадию диафильтрации с использованием воды. Стадия диафильтрации может быть проведена с использованием приблизительно от 2 до 20 объемов раствора диафильтрации, предпочтительно приблизительно от 5 до 10 объемов раствора диафильтрации. В ходе диафильтрации из водного белкового раствора удаляются дополнительные количества фенольных соединений и видимых пигментов при прохождении через продукт с пермеатом. Операция диафильтрации может выполняться до тех пор, пока в пермеате практически не останется заметных количеств фенольных соединений и видимых пигментов. Такая диафильтрация может быть проведена с использованием мембраны, имеющей отсечение по молекулярной массе приблизительно от 3000 до 50000 Да, предпочтительно приблизительно от 5000 до 10000 Да, с учетом использования различных материалов и конфигураций мембран.
В соответствии с этим вариантом осуществления изобретения в среде диафильтрации может присутствовать антиоксидант. Антиоксидант может быть любым удобным пищевым антиоксидантом, таким как сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Количество антиоксиданта, используемого в среде диафильтрации, может изменяться приблизительно от 0,01 до 1 мас.%, предпочтительно около 0,05 мас.%. Антиоксидант применяется для того, чтобы ингибировать окисление фенольных соединений, присутствующих в концентрированном растворе белкового изолята канолы.
Концентрированная надосадочная жидкость может быть использована во влажном виде или может быть высушена с использованием любой подходящей технологии, такой как распылительная сушка, сублимационная сушка или сушка в вакуумном барабане с получением дополнительного количества белкового изолята канолы в сухом виде. Этот дополнительный белковый изолят канолы имеет высокое содержание белка, приблизительно выше 90 мас.%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 100 мас.% (рассчитано как N×6,25), и практически в неденатурированном виде (установлено методом дифференциальной сканирующей калориметрии).
По желанию, по меньшей мере, часть сырой массы БММ может быть объединена, по меньшей мере, с частью концентрированной надосадочной жидкости до высушивания объединенных белковых потоков с использованием любой подходящей технологии, для того чтобы получить объединенную композицию белкового изолята канолы согласно одному варианту осуществления изобретения. Относительные доли смешанных вместе белковых материалов могут быть выбраны таким образом, чтобы обеспечить получение композиции белкового изолята канолы, имеющей желаемый профиль белков 2S/7S/12S. Альтернативно, высушенные белковые изоляты могут сочетаться в любых желаемых соотношениях, для того чтобы обеспечить в такой смеси любые желаемые конкретные профили белков 2S/7S/12S. Композиция объединенного белкового изолята канолы имеет высокое содержание белка, приблизительно выше 90 мас.%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 100 мас.% (рассчитано как N×6,25), и практически в неденатурированном виде (установлено методом дифференциальной сканирующей калориметрии).
В другом альтернативном способе, в котором только часть концентрированной надосадочной жидкости смешивается только с частью белковой мицеллярной массы, и полученную смесь сушат, оставшаяся часть концентрированной надосадочной жидкости может быть высушена так же, как любой остаток БММ. Кроме того, высушенная масса БММ и высушенная надосадочная жидкость также могут быть смешаны в сухом виде в любых желательных относительных соотношениях, как рассмотрено выше.
Работая таким образом, можно выделить ряд белковых изолятов канолы: в виде сухой массы БММ, сухой надосадочной жидкости и сухих смесей в различных массовых долях белкового изолята канолы, полученного из БММ, и белкового изолята канолы, полученного из надосадочной жидкости, обычно приблизительно от 5:95 до 95:5 по массе, что может быть желательно для достижения различных функциональных и питательных свойств на основе различных соотношений белков 2S/7S/12S в композициях.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения белковый изолят канолы, полученный из БММ, и белковый изолят канолы, полученный из надосадочной жидкости, могут быть обработаны с целью удаления компонентов, ухудшающих цвет этих изолятов. Целесообразно такую обработку проводят с использованием смешивающегося с водой органического растворителя для фенольных соединений и/или видимых окрашивающих компонентов в смеси с водой.
Таким смешивающимся с водой органическим растворителем может быть спирт. Предпочтительной является смесь этанола и воды, обычно в объемном соотношении приблизительно от 2:1 до 1:2, предпочтительно 1:1. Белковый изолят канолы диспергируется в смеси растворителей в количестве приблизительно от 5 до 25% мас./об., предпочтительно приблизительно от 8 до 23% мас./об., обычно при температуре окружающей среды. Суспензия белкового изолята канолы может перемешиваться приблизительно в течение от 30 до 60 минут, предпочтительно около 30 минут. После периода экстракции суспензия подвергается осаждению, такому как за счет центрифугирования, и белковый изолят канолы выделяется. Операция экстракции может повторяться, если это желательно, до тех пор, пока в изоляте практически не останется заметных количеств фенольных соединений и видимых пигментов. Белковый изолят канолы может снова диспергироваться в спирте, таком как этанол, с целью удаления воды из изолята, который затем может быть выделен и высушен.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
В этом примере иллюстрируется влияние различных параметров на экстракцию белка и на цвет белкового раствора.
Проводят ряд экспериментов, в которых 37,5 г промышленной муки семян канолы (AL016) смешивают с водой, содержащей желаемую концентрацию NaCl при желаемом значении рН при концентрации муки 7, 5% мас./об при температуре 20°С. Применяемые концентрации раствора хлорида натрия составляют: 0; 0,05, 0,10, 0,15 и 0,25 М (моль/л), а значения рН равны: 6,3; 8,0; 9,8 и 11,0. Образец экстракта, приблизительно 30 мл, отбирают каждые 10 минут в течение 60-минутного периода экстракции и центрифугируют в течение 5 минут при ускорении 10000g. Надосадочную жидкость (для каждого образца) анализируют на содержание белка в конце периода экстракции. Всю загрузку центрифугируют в течение 50 минут при ускорении 10000g и надосадочную жидкость подвергают вакуум-фильтрации, используя микрофильтр 0,45 мкм. Отфильтрованную надосадочную жидкость анализируют на содержание белка и определяют концентрацию свободных фенольных соединений (по поглощению при 330 нм).
Из осветленной надосадочной жидкости отбирают аликвоту (100 мл) для ультрафильтрации (УФ) с коэффициентом концентрирования, равным 4, используя установку Amicon 8400 с мембраной, имеющей отсечение по молекулярной массе 10000. Определяют концентрацию белка и поглощение при 330 нм (A330) для 25 мл удерживаемого продукта (ретентата) и всего пермеата. После ультрафильтрации раствор подвергают диафильтрации (ДФ) с диаобъемом, равным 6, используя 150 мл раствора с той же самой концентрацией NaCl и таким же значением рН, которые применялись для экстракции. В конце диафильтрации анализируют ретентат, а также весь пермеат диафильтрации на содержание белка и А330.
Затем аликвоты окончательных ретентатов пропускают через колонки, содержащие один из пяти различных адсорбентов, и снова определяют содержание белка и окрашивание (по А330) для полученных растворов белка. Использовались следующие адсорбенты: Amberlite XAD - 16 HP (полимерный адсорбент), Amberlite SF120 NA (катионообменник), Polyclar Super R (поливинилпирролидон), силикагель (от 28 до 200 меш) и гранулированный активированный уголь (пищевого сорта).
Данные, полученные в экспериментах экстракции, показывают, что время экстракции 30 минут является достаточным, чтобы удалить все экстрагируемые белки из муки. После 30 минут не отмечается какого-либо увеличения количества экстрагируемых белков при любом испытанном значении рН или содержании соли. В следующей таблице I приведены количества экстрагируемых белков, полученных при каждом рН и содержании соли.
| Таблица I | |||||
| Экстрагируемые белки (г/л) при каждом рН и содержании соли через 60 минут | |||||
| 0,0 М (ммоль/л) | 0,05 М | 0,10 М | 0,15 М | 0,25 М | |
| рН 6,3 | 5,63 | 8,00 | 8,20 | 9,16 | 7,4 |
| рН 8,0 | 4,97 | 6,66 | 9,50 | 9,29 | 8,7 |
| pH 9,8 | 7,90 | 10,68 | 10,77 | 10,9 | 10,7 |
| рН 11,0 | 12,0 | 12,56 | 12,91 | 12,36 | 12,93 |
В следующих таблицах II-VI продемонстрировано влияние концентрации соли на количество экстрагируемых белков (в г/л) в зависимости от времени при различных значениях рН:
| Таблица II | ||||
| Концентрация соли 0,0 М | рН 6,3 | рН 8,0 | рН 9,8 | pH 11,0 |
| Т10 | 3,75 | 3,94 | 6,6 | 8,4 |
| Т20 | 4,44 | 4,69 | 6,3 | 9,9 |
| Т30 | 4,39 | 4,01 | 8,1 | 12,6 |
| Т40 | 5,11 | 5,67 | 8,2 | 10.7 |
| Т50 | 4,95 | 5,55 | 8,1 | 11,7 |
| Т60 | 5,63 | 4,97 | 7,9 | 12 |
| Таблица III | ||||
| Концентрация соли 0,05 М | рН 6,3 | рН 8,0 | рН 9,8 | рН 11,0 |
| Т10 | 7,3 | 5,87 | 8 | 10,5 |
| Т20 | 8,3 | 8,11 | 9,5 | 12,04 |
| Т30 | 7.4 | 6,6 | 9,6 | 12,7 |
| Т40 | 7,5 | 7,3 | 10 | 12 |
| Т50 | 7,9 | 7,3 | 10,7 | 13 |
| Т60 | 8 | 6,7 | 10,7 | 12,6 |
| Таблица IV | ||||
| Концентрация соли 0,10 М | рН 6,3 | рН 8,0 | рН 9,8 | pH 11,0 |
| Т10 | 9,2 | 7 | 8,4 | 14,4 |
| Т20 | 8,4 | 9,6 | 10,13 | 13,17 |
| Т30 | 9,2 | 9 | 11,25 | 12,4 |
| Т40 | 9,3 | 8,9 | 11,23 | 12,57 |
| Т50 | 8,9 | 9,5 | 11,83 | 13,18 |
| Т60 | 8,2 | 9,5 | 10,77 | 12,91 |
| Таблица V | ||||
| Концентрация соли 0,15 М | рН 6,3 | рН 8,0 | рН 9,8 | pH 11,0 |
| Т10 | 8,71 | 7,05 | 11,65 | 9,05 |
| Т20 | 9,47 | 8,42 | 11,46 | 10,28 |
| Т30 | 9,36 | 8,27 | 10,93 | 11,31 |
| Т40 | 9,74 | 9,08 | 10,36 | 11,19 |
| Т50 | 10,24 | 8,36 | 10,72 | 11,54 |
| Т60 | 9,16 | 9,29 | 10,7 | 12,36 |
| Таблица VI | ||||
| Концентрация соли 0,25 М | рН 6.3 | рН 8,0 | рН 9,8 | pH 11,0 |
| Т10 | 7,2 | 7,9 | 11,65 | 11,18 |
| Т20 | 7,1 | 7,8 | 11,46 | 11,42 |
| Т30 | 7,5 | 8,3 | 10,93 | 12,44 |
| Т40 | 7,4 | 8,7 | 10,36 | 11,87 |
| Т50 | 7,3 | 8,2 | 10,72 | 12,58 |
| Т60 | 7,4 | 8,7 | 10,7 | 12,93 |
Как можно видеть из этих таблиц, при повышенных значениях рН экстракция обеспечивает более высокий выход белка при каждом содержании соли, хотя повышение концентрации соли выше 0,05 М не повышает растворимость белка в экспериментальных условиях.
В следующей таблица VII приведены величины поглощения белкового экстракта при 330 нм для каждого значения рН и содержания соли:
| Таблица VII | |||||
| Влияние рН на поглощение A330 при пяти различных концентрациях соли | |||||
| 0,0 М | 0,05 М | 0,10 М | 0,15 М | 0,25 М | |
| рН 6,3 | 21,2 | 23,6 | 58,5 | 48,8 | 51,6 |
| рН 8,0 | 27,2 | 42,1 | 66,8 | 52 | 52,5 |
| рН 9,8 | 32,8 | 39,7 | 36,2 | 31,9 | 27,9 |
| pH 11,0 | 43,1 | 42,1 | 42,8 | 36,9 | 42,9 |
Как можно видеть из таблицы VII, уменьшение поглощения A330 экстрагируемыми окрашивающими компонентами происходит при рН 9,8 в продуктах экстракции 0,1 М, 0,15 М и 0,25 М. При этом значении рН видимое окрашивание выглядит темнее, чем при других значениях рН, причем отсутствует соответствующее снижение в содержании белка. Как отмечено выше, содержание белка в этих экстрактах продолжает расти в интервале рН между 9,8 и 11,0.
В следующей таблице VIII приведено поглощение при 330 нм раствора белка после ультрафильтрации и до диафильтрации, тогда как в таблице IX характеризуется поглощение А330 раствора белка после диафильтрации. Как можно видеть из этих таблиц, в каждом опыте поглощение А330 ретентата после диафильтрации становится слабее.
| Таблица VIII | |||||
| Поглощение А330 ретентата до диафильтрации | |||||
| 0,0 М | 0,05 М | 0,10 М | 0,15 М | 0,25 М | |
| рН 6,3 | 41,7 | 49,3 | 71,4 | 63,5 | 67,6 |
| рН 8,0 | 59,8 | 52 | 77,4 | 63,4 | 66,2 |
| рН 9,8 | 39,9 | 61,6 | 59,1 | 45 | 38,5 |
| рН 11,0 | 50,9 | 70,4 | 56,4 | 55,4 | 60,1 |
| Таблица IX | |||||
| Поглощение А330 ретентата после диафильтрации | |||||
| 0,0 М | 0,05 М | 0,10 М | 0,15 М | 0,25 М | |
| рН 6,3 | 29,8 | 18,0 | 15,0 | 22,2 | 17,6 |
| рН 8,0 | 37,9 | 22,7 | 36,1 | 22,5 | 22,1 |
| рН 9,8 | 15,2 | 38,8 | 25,1 | 34,4 | 19,9 |
| рН 11,0 | 34,8 | 35,1 | 34,4 | 31 | 40,1 |
В следующей таблице X приведено уменьшение А330 (в процентах) за счет использования диафильтрации.
| Таблица X | |||||
| Уменьшение поглощения А330 за счет диафильтрации | |||||
| 0,0 М | 0,05 М | 0,10 М | 0,15 М | 0,25 М | |
| pH 6,3 | 28,5 | 63,5 | 79,0 | 65,0 | 74,0 |
| рН 8,0 | 36,6 | 56,3 | 53,4 | 64,5 | 66,6 |
| рН 9,8 | 61,9 | 37 | 57,5 | 45,8 | 48,3 |
| рН 11,0 | 31,6 | 50,1 | 39,5 | 44,0 | 33,3 |
Как можно видеть из таблицы X, наибольшее уменьшение величины А330 достигается после УФ/ДФ экстрактов, полученных при концентрации 0,1 М и рН 6,3. Из пяти различных содержаний соли в испытаниях самое низкое значение А300 во всех случаях, кроме одного, достигается при экстракции при рН 6,3.
В следующей таблице XI приведены значения отношения A330/содержание белка (г/л), с целью учета влияния различных концентраций белка в конечных ретентатах. Используя это отношение, найдено, что низкое значение А330 и высокое содержание белка соответствуют малому значению отношения, что наиболее желательно.
| Таблица XI | |||||
| Отношение A330/ г/л для ретентатов после диафильтрации | |||||
| 0,0 М | 0,05 М | 0,10 М | 0,15 М | 0,25 М | |
| рН 6,3 | 4,79 | 0,76 | 0,60 | 0,69 | 0,59 |
| рН 8,0 | 4,99 | 0,82 | 1,06 | 0,80 | 0,54 |
| рН 9,8 | 1,31 | 1,48 | 1,10 | 0,61 | Нет анализа |
| рН 11,0 | 0,69 | 0,80 | 0,96 | 0,83 | 0,67 |
Как можно видеть из таблицы XI, с учетом отношения A330/белок наилучшие результаты получаются для серий с концентрацией соли 0,25 М при каждом испытанном значении рН, причем самое низкое отношение A330/белок из всех проведенных экспериментов достигается для экстракции 0,25 М раствором при рН 8,0.
Оценка данных A330 для пермеата (не показано) как для ультрафильтрации, так и диафильтрации позволяет предположить, что при двух меньших значениях рН из пермеата вымывается больше веществ, поглощающих при 330 нм, чем при рН 9,8 и 11,0.
При испытании адсорбентов при значениях рН 6,3 и 8,0 Polyclar снижает содержание свободных фенольных соединений (A330) в ретентатах, и после стадии адсорбции содержание белка не снижается. Однако при рН 9,8 и 11,0 Polyclar не поглощает значительные количества свободных фенольных соединений. Адсорбент Amberlite XAD в большинстве опытов, проведенных при высоких рН, снижает A330, но почти в каждом случае белок также теряется.
Из других испытанных адсорбентов силикагель не позволяет снизить A330 в большинстве опытов и весьма часто приводит к помутнению образца, что приводит к повышенным показаниям А330. Адсорбент Amberlite SF120 дает некоторое уменьшение A330 при пониженных значениях рН, однако и в этом случае оказалось, что этот адсорбент не обладает такой же эффективностью при повышенных значениях рН, и во многих случаях наблюдаются значительные потери белка. Кроме того, в этих образцах после пропускания через адсорбент образуется небольшой осадок.
Гранулированный активированный углерод (ГАУ) весьма удовлетворительно снижает А330 в ретентатах при пониженных значениях рН, однако при рН 9,8 и 11,0 поглощение А330 снижается недостаточно эффективно. В большинстве испытаний с ГАУ также наблюдаются некоторые потери белка. Образцы, которые были пропущены через ГАУ, необходимо фильтровать через фильтр 0,45 мкм после обработки из-за наличия остаточных частиц углерода.
Пример 2
Этот пример иллюстрирует влияние добавления антиоксиданта на стадии экстракции.
Повторяют методику примера 1, причем экстракцию проводят при рН 8,0 и рН 6,3 в 0,1 М растворе соли с добавлением аскорбиновой кислоты и с продувкой среды экстракции гелием с целью удаления 99% растворенного кислорода. Для определения интенсивности видимого окрашивания также измеряется поглощение А420.
В следующей таблице ХII приведены данные экстракции:
| Таблица XII | |||
| Данные экстракции | |||
| Экстрагируемый белок, г/л | Экстракция A330 | Экстракция А420 | |
| 0,1 М, рН 8,0 | 11,07 | 38,3 | 11,29 |
| 0,1 М, рН 8,0, 0,01% | |||
| аскорбиновой кислоты | 11,34 | 47,5 | 5,41 |
| 0,1 М, рН 8,0, 0,05% | |||
| аскорбиновой кислоты | 12,18 | 47,2 | 4,96 |
Как можно видеть из таблицы XII, применение аскорбиновой кислоты при экстракции снижает видимое окрашивание по данным А420. Малые добавки аскорбиновой кислоты (0,05%) могут приводить к более чем двукратному уменьшению экстракции А420 или соединений, вызывающих видимое окрашивание.
В следующей таблице ХIII приведены показания A330 и А420 диафильтрационного ретентата.
| Таблица XIII | |||||
| Показания A330 и А420 ретентата | |||||
| А330 для УФ ретентата | А330 для ДФ ретентата | А420 для ДФ ретентата | Содержание белка в ДФ ретентате, г/л | Отношение А330 ретентата/содержание белка | |
| 0,1 М, рН 8,0 | 44,1 | 14,8 | 4,3 | 27,6 | 0,54 |
| 0,1 М, рН 8,0, 0,01% аскорбиновой кислоты | 58,2 | 16,5 | 3,29 | 30,6 | 0,54 |
| 0,1 М, рН 8,0, 0,05% аскорбиновой кислоты | 60,4 | 18,8 | 3,41 | 37,4 | 0,50 |
Как можно видеть из таблицы ХIII, уменьшение поглощения А420 при экстракции в присутствии аскорбиновой кислоты еще проявляется после диафильтрации. Поглощение А420 ретентатов из экстракции с аскорбиновой кислотой было меньше, чем у ретентатов, не содержащих аскорбиновую кислоту при экстракции.
В таблице XIV продемонстрировано влияние адсорбента Polyclar на поглощение А330 и А420 в ретентатах:
| Таблица XIV | ||||||
| А330 до обработки | А330 после обработки | Уменьшение А330, % | А420 до обработки | А420 после обработки | Уменьшение А420, % | |
| 0,1М,рН 8,0 | 1,8 | 11,9 | 19,6 | 4,3 | 3,25 | 24,5 |
| 0,1 М, рН 8,0, 0,01% | ||||||
| аскорбиновой | 16,5 | 10,1 | 38,8 | 3,29 | 2,41 | 26,8 |
| кислоты | ||||||
| 0,1 М, рН 8,0, 0,05% | ||||||
| аскорбиновой | 18,8 | 13,5 | 28,2 | 3,41 | 2,78 | 18,5 |
| кислоты |
Как можно видеть из таблицы XIV, эффект снижения поглощения А420 под действием аскорбиновой кислоты, используемой при экстракции, проявляется даже после обработки адсорбентом. Адсорбент Polyclar уменьшает поглощение А420 для каждого образца, однако для двух образцов, содержащих аскорбиновую кислоту, поглощение было меньше, чем для контрольного образца, без аскорбиновой кислоты.
Пример 3
Этот пример также иллюстрирует влияние концентрации соли и рН на экстракцию с антиоксидантом.
Этот пример повторяет пример 1, за исключением того, что добавляют 0,5 г (0,1%) сульфита натрия (Na2SO3) в жидкость для экстракции муки масличных семян канолы до начала стадии экстракции. Все другие использованные параметры были такими же, как в примере 1, за исключением величины объема диафильтрации, равного 5.
В следующих таблицах от XV.1 до XV.5 продемонстрированы количества белка, полученного при каждом значении рН и содержании соли:
| Таблица XV.1 | ||||
| Скорость экстракции в экспериментах с 0,0 М NaCl и 0,1% Na2SO3 (г/л) | ||||
| Время (минут) | рН 6,3 | рН 8,0 | рН 9,8 | pH 11,0 |
| 10 | 4,5 | 11,0 | 11,4 | 12,2 |
| 20 | 5,6 | 6,1 | 8,8 | 14,3 |
| 30 | 6,2 | 6,0 | 10,0 | 14,2 |
| 40 | 6,6 | 6,1 | 11,0 | 14,1 |
| 50 | 7,8 | 6,4 | 10,9 | 14,5 |
| 60 | 6,2 | 6,8 | 11,1 | 13,7 |
| Таблица XV.2 | ||||
| Скорость экстракции в экспериментах с 0,05 M NaCl и 0,1% Na2SO3 (г/л) | ||||
| Время (минут) | рН 6,3 | рН 8,0 | рН 9,8 | pH 11,0 |
| 10 | 9,2 | 8,9 | 8,9 | 11,0 |
| 20 | 8,7 | 8,7 | 9,9 | 11,1 |
| 30 | 9,2 | 8,5 | 9,0 | 12,2 |
| 40 | 9,1 | 8,4 | 10,6 | 12,4 |
| 50 | 9,5 | 8,5 | 10,0 | 13,0 |
| 60 | 10,5 | 7,3 | 10,9 | 13,8 |
| Таблица XV.3 | ||||
| Скорость экстракции в экспериментах с 0,10 M NaCl и 0,1% Na2SO3 (г/л) | ||||
| Время (минут) | pH 6,3 | рН 8,0 | рН 9,8 | рН 11,0 |
| 10 | 8,4 | 8,3 | 9,2 | 11,3 |
| 20 | 9,7 | 9,1 | 10,3 | 11,5 |
| 30 | 10,1 | 9,0 | 10,3 | 11,3 |
| 40 | 9,2 | 9,0 | 9,8 | 11,4 |
| 50 | 10,4 | 9,4 | 10,0 | 12,3 |
| 60 | 10,1 | 9,1 | 10,8 | 11,3 |
| Таблица XV.4 | ||||
| Скорость экстракции в экспериментах с 0,15 M NaCl и 0,1% Na2SO3 (г/л) | ||||
| Время (минут) | рН 6.3 | рН 8,0 | рН 9,8 | pH 11,0 |
| 10 | 8,8 | 11,0 | 11,2 | 13,0 |
| 20 | 9,5 | 10,6 | 12,5 | 13,7 |
| 30 | 8,3 | 11,4 | 12,6 | 14,0 |
| 40 | 8,8 | 10,8 | 12,4 | 14,4 |
| 50 | 9,6 | 10,5 | 12,7 | 13,6 |
| 60 | 9,8 | 10,6 | 12,5 | 14,1 |
| Таблица XV.5 | ||||
| Скорость экстракции в экспериментах с 0,25 M NaCl и 0,1% Na2SO3 (г/л) | ||||
| Время (минут) | рН 6,3 | рН 8,0 | рН 9,8 | pH 11,0 |
| 10 | 11,5 | 10,7 | 12,7 | 12,3 |
| 20 | 11,0 | 12,8 | 14,0 | 13,0 |
| 30 | 12,1 | 13,4 | 14,8 | 13,4 |
| 40 | 11,8 | 18,4 | 14,6 | 13,1 |
| 50 | 12,3 | 12,4 | 14,7 | 14,1 |
| 60 | 12,2 | 13,4 | 15,2 | 14,4 |
Как можно видеть из этих таблиц, в большинстве экспериментов экстракция достигает равновесия приблизительно через 30 минут. В отсутствие соли с увеличением рН экстрагируется больше белка. Влияние рН, по-видимому, является менее значительным при рН ниже 8,0, чем при высоких рН, выше 9,8 (таблица XV.1). Добавление соли в малой концентрации (меньше чем 0,10 М) может существенно повышать способность белков к экстракции при рН 6,3 и 8,0, однако низкая концентрация соли не способствует экстракции белка при повышенных значениях рН, равных 9,8 или 11,0 (таблицы XV.2 и XV.3).
В следующей таблице XVI продемонстрировано влияние рН и концентрации хлорида натрия на содержание свободных фенольных соединений (поглощение A3 30) в белковом экстракте.
| Таблица XVI | |||||
| Влияние рН и концентрации NaCl на поглощение А330 белкового экстракта (с Na2SO3) | |||||
| 0 NaCl | 0,05 М NaCl | 0,10 M NaCl | 0,15 M NaCl | 0,25 М NaCl | |
| рН 6,3 | 41,1 | 49,1 | 34,5 | 51,1 | 54,2 |
| рН 8,0 | 24,3 | 36 | 38,3 | 39,9 | 41,8 |
| рН 9,8 | 30 | 28,2 | 27,5 | 27,8 | 29 |
| рН 11,0 | 38,4 | 29,7 | 32,7 | 31,5 | 32,1 |
Как видно из таблицы XVI, величина поглощения А330 снижается с увеличением показателя рН до 9,8, хотя концентрация белка также возрастает в этом интервале. С повышением рН цвет экстракта становится заметно темнее. Концентрация соли оказывает менее выраженное влияние на цвет экстракта.
В следующих таблицах от XVII.1 до XVII.4 продемонстрировано влияние рН и концентрации NaCl на поглощение А330 ретентата (таблица XVII.1) и пермеата (таблица XVII.2) после ультрафильтрации и на поглощение А330 ретентата (таблица XVII..З) и пермеата (таблица XVII.4) после диафильтрации.
| Таблица XVII.1 | |||||
| Влияние рН и концентрации NaCl на поглощение А300 ретентата после ультрафильтрации (с Na2SO3) | |||||
| 0 NaCl | 0,05 М NaCl | 0,10 ОМ NaCl | 0,15 MNaCl | 0,25 М NaCl | |
| рН 6,3 | 88,7 | 71,9 | 44,4 | 73,2 | 75,3 |
| рН 8,0 | 18,3 | 55,2 | 60,0 | 62,3 | 65,5 |
| рН 9,8 | 55,9 | 48,1 | 59,1 | 49,7 | 54,2 |
| рН 11,0 | 77,6 | 57,4 | 56,4 | 61,8 | 62,3 |
| Таблица XVII.2 | |||||
| Влияние рН и концентрации NaCl на поглощение A330 пермеата после ультрафильтрации (с Na2SO3) | |||||
| 0 NaCl | 0,05 M NaCl | 0,10 M NaCl | 0,15 M NaCl | 0,25 M NaCl | |
| рН 6,3 | 31,3 | 40,6 | 24,8 | 43.4 | 41,8 |
| рН 8,0 | 16,0 | 35,9 | 29,8 | 34,4 | 30,1 |
| pH 9,8 | 25,2 | 20,6 | 23,5 | 23,9 | 24,0 |
| рН 11,0 | 25,1 | 21,3 | 23,3 | 25,4 | 25,1 |
| Таблица XVII.3 | |||||
| Влияние рН и концентрации NaCl на поглощение A330 ретентата после диафильтрации (с Na2SO3) | |||||
| 0 NaCl | 0,05 M NaCl | 0,10 М NaCl | 0,15 M NaCl | 0,25 M NaCl | |
| рН 6,3 | 34,8 | 24,7 | 14,9 | 21,2 | 21,2 |
| рН 8,0 | 13,9 | 17,8 | 20,8 | 20,0 | 23,7 |
| рН 9,8 | 30,6 | 34,3 | 32,3 | 20,2 | 22,1 |
| рН 11,0 | 58,5 | 29,0 | 24,8 | 35,0 | 24,5 |
| Таблица XVII.4 | |||||
| Влияние pH и концентрации NaCl на поглощение A330 пермеата после диафильтрации (с Na2SO3) | |||||
| 0 NaCl | 0,05 M NaCl | 0,10 M NaCl | 0,15 M NaCl | 0,25 M NaCl | |
| pH 6,3 | 7,0 | 8,5 | 6,3 | 7,9 | 8,5 |
| рН 8,0 | 3,1 | 10,0 | 6,0 | 6,5 | 5,7 |
| рН 9,8 | 8,3 | 8,0 | 6,9 | 7,0 | 5,7 |
| рН 11,0 | 6,8 | 5,4 | 5,1 | 5,8 | 5,2 |
Поскольку при ультрафильтрации концентрация белка в экстракте увеличивается в 4 раза, ретентат становится заметно темнее и имеет большее поглощение А330, чем экстракт (таблица XVII.1), за исключением случая при 0,0 NaCl и значении рН 8,0, однако последний результат может быть аномальным. Аналогично исходному экстракту до УФ минимум поглощения А330 наблюдается при рН 9,8, что не подтверждается фактическим видимым темным окрашиванием, причины которого рассмотрены ранее. По измерениям поглощения А330 при ультрафильтрации извлекается значительное количество фенольных соединений из экстракта, на что указывают высокие показания А330 в пермеате (см. таблицу XVII.2). Из таблицы XVII.3 можно видеть, что ретентат процесса диафильтрации имеет гораздо меньшее значение А330, чем ретентат процесса ультрафильтрации (таблица XVII.1). Хотя пермеат процесса диафильтрации имеет не столь высокое значение (таблица XVII.4) поглощения А330, как пермеат процесса ультрафильтрации (таблица XVII.4), тем не менее, диафильтрация приводит к дополнительному удалению значительных количеств оставшихся фенольных соединений. Это дополнительное удаление фенольных соединений путем диафильтрации приводит к гораздо меньшему поглощению А330 в ретентате процесса диафильтрации (таблица XVII.3), чем для ретентата процесса ультрафильтрации (таблица XVII.1).В следующих таблицах от XVIII.1 до XVIII.4 продемонстрировано влияние адсорбентов и рН на поглощение А330 ретентата:
| Таблица XVIII.3 | ||||||
| Влияние адсорбента и pH на поглощение A330 ретентата (0,15 M раствор NaCl с 0,1% Na2SO3) | ||||||
| рН | Контроль | Polyclar | XAD | SF 120 | Силикагель | ГАУ |
| 6,3 | 21,2 | 13,5 | 15,7 | 18,3 | 18,7 | 19,4 |
| 8,0 | 20 | 16 | 16,3 | 17,9 | 19,5 | 19,5 |
| 9,8 | 20,2 | 18 | 16,1 | 21 | 29,8 | 20 |
| 11,0 | 35 | 28 | 31,6 | 33,6 | 35,2 | 34,2 |
| Таблица XVIII.4 | ||||||
| Влияние адсорбентов и рН на поглощение А330 ретентата (0,25 М NaCl с 0, 1% Na2SO3) | ||||||
| рН | Контроль | Polyclar | XAD | SF 120 | Силикагель | ГАУ |
| 6,3 | 21,2 | 15,9 | 16,6 | 21,4 | 20,4 | 21,4 |
| 8,0 | 23,7 | 16,1 | 21 | 24,5 | 25,7 | 24,5 |
| 9,8 | 22,1 | 19,1 | 21,1 | 22,9 | 26,5 | 22,7 |
| 11,0 | 24,5 | 22,8 | 18,4 | 24,2 | 27,5 | 25,1 |
Как можно видеть из таблиц XVIII.1 - XVIII.4, при низких значениях рН (меньше 9,8) среди всех испытанных адсорбентов Polyclar особенно эффективно снижает поглощение при А330 в конечном ретентате. Как видно из таблицы XVIII.1, величина поглощения при А330 может быть снижена на 40%.
Хотя другие адсорбенты также способны снижать поглощение А330 в конкретных условиях рН и концентрации соли, их влияние было не столь значительным по сравнению с влиянием Polyclar. При использовании среды с рН 9,8 эффективность Polyclar для снижения поглощения А330 уменьшается.
В следующих таблицах от XVIII.5 до XVIII.8 продемонстрировано влияние адсорбентов на концентрацию белка (г/л) в ретентате.
| Таблица XVIII.5 | ||||||
| Влияние адсорбентов и рН на концентрацию белка ретентата (0,05 M раствор NaCl c 0,1% Na2SO3) | ||||||
| рн | Контроль | Polyclar | XAD | SF 120 | Силикагель | |
| 6,3 | 51,5 | 53,2 | 47,1 | 46,3 | 46,5 | |
| 8,0 | 39 | 46 | 37,2 | 48,5 | 41,4 | |
| 9,8 | 40,4 | 41,1 | 38,5 | 38,3 | 41,1 | |
| 11,0 | 48,2 | 51,5 | 47,8 | 50,6 | 49,1 | |
| Таблица XVIII.6 | ||||||
| Влияние адсорбентов и рН на концентрацию белка ретентата (0,1 M раствор NaCl c 0,1% Na2SO3) | ||||||
| рН | Контроль | Polyclar | XAD | SF 120 | Силикагель | ГАУ |
| 6,3 | 43,6 | 46 | 41,4 | 43,9 | 45,7 | 44,3 |
| 8,0 | 50,5 | 55,1 | 51,7 | 50,3 | 52 | 52,8 |
| 9,8 | 42,5 | 47,3 | 43,9 | 44,2 | 45,4 | 46 |
| 11,0 | 38 | 42 | 36,3 | 38,2 | 39,4 | 39,8 |
| Таблица XVIII.7 | ||||||
| Влияние адсорбентов и pH на концентрацию белка ретентата (0,15 M раствор NaCl с 0,1% Na2SO3) | ||||||
| рН | Контроль | Polyclar | XAD | SF 120 | Силикагель | ГАУ |
| 6,3 | 33,5 | 36,2 | 32,3 | 34,7 | 36,9 | 33,3 |
| 8,0 | 46,8 | 48,7 | 44,2 | 46,4 | 48,2 | 47,4 |
| 9,8 | 39,5 | 40,9 | 36,2 | 39,7 | 39,7 | 40,4 |
| 11,0 | 56,2 | 59,5 | 50,4 | 55,8 | 60,1 | 58,5 |
| Таблица XVIII.8 | ||||||
| Влияние адсорбентов и рН на концентрацию белка ретентата (0,25 М раствор NaCl с 0,1% Na2SO3) | ||||||
| рН | Контроль | Polyclar | XAD | SF120 | Силикагель | ГАУ |
| 6,3 | 38,8 | 41,7 | 36,2 | 38,4 | 40,7 | 39 |
| 8,0 | 44,7 | 46,4 | 41,4 | 43,5 | 45,8 | 45,8 |
| 9,8 | 50,3 | 54 | 48,8 | 50,5 | 52,2 | 51,7 |
| 11,0 | 41,9 | 47,2 | 38,6 | 41,4 | 44,6 | 42,5 |
Как можно видеть из таблиц от XVIII.5 до XVIII.8, все испытанные адсорбенты были достаточно инертны по отношению к белку (по концентрации) в ретентате при всех сочетаниях соли и рН, несмотря на то, что концентрация белка сильно увеличилась за счет ультрафильтрации.
Пример 4
В этом примере описано влияние использования малых добавок сульфита натрия и продувки при экстракции.
Повторяют пример 3, используя малую добавку сульфита (0,05 мас.% Na2SO3) в трех экспериментах при рН 8,0, применяя Polyclar в качестве адсорбента. Кроме поглощения А330, измеряется также А420.
В другой последовательности экспериментов экстрагированный раствор, содержащий 0,05 мас.% Na2SO3, также продувают гелием до экстракции и в ходе экстракции.
В следующей таблице XIX.1 показано влияние этих изменений на экстракцию белка.
| Таблица XIX.1 | |||
| Экстракция белка при рН 8,0 (г/л) | |||
| 0,1% Na2SO3 | 0,05% Na2SO3 | Продувка гелием | |
| 0,05 M NaCl | 8,5 | 11,8 | 11,5 |
| 0,10 М NaCl | 9,0 | 12,7 | 12,0 |
| 0,15 М NaCl | 11,4 | 14,3 | 14,5 |
Как можно видеть из таблицы XIX.1, при всех трех концентрациях добавленной соли концентрация белка в экстракте увеличивается приблизительно на 40 мас.%, когда используются небольшие количества сульфита натрия. При более высокой концентрации соли достигается более высокая концентрация белка. Продувка гелием не оказывает влияния на экстракцию белка.
В таблице XIX.2 продемонстрировано влияние этих изменений на окрашивание (по поглощению А330).
| Таблица XIX.2 | |||
| Поглощение экстракта при 330 нм | |||
| 0,1 % Na2SO3 | 0,05% Na2SO3 | Продувка гелием | |
| 0,05 М NaCl | 36,0 | 40,5 | 35,9 |
| 0,10 М NaCl | 38,3 | 36,6 | 42,3 |
| 0,15 M NaCl | 39,9 | 43,4 | 42,7 |
Как можно видеть из таблицы ХIХ.2, уменьшение концентрации Na2SO3 незначительно влияет на поглощение A330 экстракта. Хотя при продувке гелием удаляются 99% растворенного кислорода, показатели поглощения экстракта как при 330 нм, так и при 420 нм не улучшаются (таблица XIX.3 ниже):
| Таблица XIX.3 | ||
| Поглощение экстракта при 420 нм | ||
| Без продувки | Продувка гелием | |
| 0,05 М NaCl | 9,0 | 9,4 |
| 0,10 М NaCl | 5,8 | 7,1 |
| 0,15 М NaCl | 8,14 | 10,0 |
В следующей таблице XX показано влияние мембранной обработки на поглощение A330 и А420 ретентата.
| Таблица XX | ||||||
| Влияние мембранной обработки на поглощение A330 и А420 ретентата | ||||||
| Экстракт | УФ ретентат | ДФ ретентат | ||||
| Соль | А330 | А420 | А330 | А420 | А300 | А420 |
| 0,05 М | 40,5 | 9,0 | 57,9 | 10,9 | 20,7 | 4,1 |
| 0,10 М | 36,6 | 8,8 | 55,9 | 10,9 | 15,1 | 3,5 |
| 0,15 М | 43,4 | 8,4 | 69,9 | 11,4 | 20,2 | 5,4 |
| 0,05М+Не* | 35,9 | 9,4 | 55,3 | 12,4 | 18.3 | 4,0 |
| 0,10 М+Не | 42,3 | 7,1 | 67,0 | 10,4 | 20,5 | 4,7 |
| 0,15 М+Не | 42,7 | 10,0 | 61,3 | 12,9 | 20,2 | 4,3 |
| *с продувкой гелием |
Как видно из таблицы XX, диафильтрацией экстракта практически удаляются все окрашивающие компоненты. Показатели поглощения А330 и А420 для конечного ретентата уменьшаются приблизительно в два раза по сравнению с показателями для исходного экстракта. Продувка гелием не влияет на показатели A330 или А420.
В следующей таблице XXI показано влияние адсорбента Polyclar на поглощение A330 и А420 ретентата.
| Таблица XXI | ||||
| Влияние Polyclar на поглощение A330 и А420 | ||||
| Контроль | Polyclar* | |||
| Соль | А330* | А420* | А330 | А420 |
| 0,05 М | 20,7 | 4,1 | 14,9 (28%) | 3,6 (12%) |
| 0,10 М | 15,1 | 3,5 | 11,3 (25%) | 2,7 (23%) |
| 0,15 М | 20,2 | 5,4 | 16,1 (20%) | 4,6 (15%) |
| 0,05 М+Не** | 18,3 | 4,0 | 12,5 (32%) | 3,6 (10%) |
| 0,10 М+Не | 20,5 | 4,7 | 18,5 (10%) | 4,1 (13%) |
| 0,15 М+Не | 20,2 | 4,3 | 13,9 (31%) | 3,8 (12%) |
| * Цифры в скобках означают уменьшение в процентах | ||||
| ** с продувкой гелием |
Пример 5
Этот пример иллюстрирует получение белкового изолята канолы из промышленной муки канолы с использованием антиоксиданта и диафильтрации.
Промышленную муку канолы (150 кг, обжарена при повышенной температуре) добавляют к 1000 л 0,15 М раствора NaCl, содержащего 0,5 кг (0,05 мас.%) раствора аскорбиновой кислоты при 16°С и перемешивают в течение 30 минут, для того чтобы обеспечить водный раствор белка, имеющий содержание белка 20,2 г/л. Остаточную муку канолы удаляют и промывают на ленточном вакуум-фильтре. Образовавшийся белковый раствор осветляется путем центрифугирования и фильтрации, чтобы получить 1040 л осветленного белкового раствора, имеющего содержание белка 14,6 г/л.
Раствор белкового экстракта концентрируют до объема 45 л, используя систему ультрафильтрации, содержащую мембраны с отсечкой по молекулярной массе 5000 Да. Затем раствор белкового экстракта подвергают диафильтрации в системе диафильтрации, используя мембраны с отсечкой по молекулярной массе 5000 Да с 450 л 0,15 М раствора NaCl, содержащего 0,05 мас.% аскорбиновой кислоты, до конечного объема 44 л, имеющего содержание белка 225 г/л.
Концентрированный и диафильтрованный раствор с температурой 30°С разбавляют водой с температурой 4°С в отношении 1:15. Сразу образуются белые, мутные белковые мицеллы, которым дают осадиться. Удаляют верхний слой разбавляющей воды и выделяют осажденную, вязкую, клейкую массу (БММ) со дна сосуда и сушат. Найдено, что высушенный белковый продукт имеет содержание белка 103,2 мас.% (N×6,25) d.b.
Концентрируют 620 л надосадочной жидкости образовавшихся мицелл до объема 30 л с помощью системы ультрафильтрации, используя мембраны с отсечкой по молекулярной массе 5000 Да. Затем концентрированную надосадочную жидкость подвергают диафильтрации в системе диафильтрации, используя мембраны с отсечкой по молекулярной массе 5000 Да со 100 л воды, до конечного объема 27 л, имеющего содержание белка 121,8 г/л.
Концентрированный и диафильтрованный раствор сушат. Найдено, что высушенный белковый продукт имеет содержание белка 100,8 мас.% (N×6.25) d.b.
Для образцов белкового изолята канолы (БИК), полученных из БММ, и белкового изолята канолы, полученного из надосадочной жидкости, оценивают осветленность (L) и цветность (а и b), используя колориметр фирмы Minolta (CR-310). В координатах «L-a-b» величины изменяются от 0 до 100, причем показатель 100 соответствует белому и 0 соответствует черному цвету. В координатах цветности оба показателя, а и b, имеют максимальные значения +60 и -60, причем +а соответствует красному направлению и -а соответствует зеленому направлению, +b - желтому направлению и -b - синему направлению.
В следующей таблице ХХII приведены полученные результаты.
| Таблица XXII | |||
| Образец | L | а | b |
| БИК, полученный из БММ | 83,08 | -1,58 | +27,89 |
| БИК, полученный из надосадочной жидкости | 79,38 | -0,11 | +20,46 |
Для белковых изолятов канолы наблюдается более светлое (L) и меньшая интенсивность желтого (b) окрашивания, чем для белковых изолятов, полученных по этой методике, но с исключением добавления аскорбиновой кислоты (в качестве антиоксиданта) и стадий диафильтраци (данные не показаны).
Пример 6
Этот пример иллюстрирует влияние температуры на цвет белковых экстрактов из муки, обжаренной при низкой температуре, и муки, из которой растворитель удален на воздухе.
Образец (75 г) муки масличных семян канолы (а), обжаренной при низкой температуре (100°С) (НТ), и муки масличных семян канолы (b), из которой растворитель удален на воздухе при 20°С (Marc), добавляют к 500 мл образца 0,15 М раствора NaCl при температуре окружающей среды или комнатной температуре (КТ), при 55°С, 60°С и 65°С, смесь перемешивают 30 минут, при этом температура раствора поддерживается практически постоянной для того, чтобы получить водные растворы белка. Образцы водных растворов белка отбираются на анализ на 5-й, 10-й, 15-й, 20-й и 30-й минутах. Отработанную муку отделяют путем центрифугирования при ускорении 10000g в течение 5 минут и подвергают лиофильной сушке.
Для различных образцов белкового раствора определяют поглощение A330 и А420. Как уже отмечалось выше, УФ-поглощение при 330 нм характеризует концентрацию фенольных соединений в растворе, тогда как поглощение при 420 нм представляет собой непосредственное измерение фактического окрашивания. В следующих таблицах ХХIII и XXIV приведены данные для различных образцов.
| Таблица XXIII | ||||||||
| Показатели поглощения для экстрактов низкотемпературной муки | ||||||||
| Время экстракции (минут) | Комнатная температура | 55°С | 60°С | 65°С | ||||
| А330 | А420 | А330 | А420 | А330 | А420 | А330 | А420 | |
| 5 | 80,7 | 1,96 | 97,2 | 2,70 | 99,8 | 3,03 | 98,3 | 2,84 |
| 10 | 88,9 | 2,42 | 92,0 | 2,77 | 98,0 | 3,07 | 93,9 | 2,95 |
| 15 | 92,5 | 2,50 | 89,1 | 2,94 | 95,6 | 3,10 | 93,0 | 3,05 |
| 20 | 90,7 | 2,55 | 86,1 | 2,90 | 93,7 | 3,23 | 90,7 | 3,16 |
| 30 | 90,7 | 2,56 | 88,2 | 3,22 | 97,8 | 3,47 | 88,1 | 3,24 |
| Таблица XXIV | ||||||||
| Показатели поглощения для экстрактов муки Marc | ||||||||
| Время экстракции (минут) | Комнатная температура | 55°С | 60°С | 65°С | ||||
| А330 | А420 | А330 | А420 | А330 | А420 | А330 | А420 | |
| 5 | 120,3 | 2,73 | 118,8 | 2,94 | 120,5 | 3,08 | 128,4 | 3,16 |
| 10 | 116,7 | 2,73 | 118,5 | 3,07 | 121,1 | 3,15 | 127,4 | 3,19 |
| 15 | 117,0 | 2,78 | 119,5 | 3,20 | 116,3 | 3,09 | 112,5 | 3,04 |
| 20 | 119,1 | 2,84 | 113,1 | 3,17 | 112,9 | 3,19 | 121,6 | 3,09 |
| 30 | 114,1 | 2,74 | 113,1 | 3,23 | 114,6 | 3,22 | 119,1 | 3,00 |
Как можно видеть из таблиц ХХIII и XXIV, повышение температуры экстракции не оказывает значительного влияния на поглощение А330 экстрагированного белкового раствора для каждого исследованного типа муки, однако наблюдается небольшое увеличение величины поглощения А420 при повышенной температуре.
Пример 7
В этом примере приведены данные о влиянии определенных параметров на цвет белковых экстрактов из некоторых типов муки масличных семян канолы.
В первой серии экспериментов образцы (50 г) муки масличных семян канолы, которые (а) были обжарены при низкой температуре (100°С) (мука НТ) или (b) из которых растворитель был удален на воздухе при 20°С (мука Marc), добавляют к образцам (500 мл) 0,05 М или 0,10 М раствора NaCl при комнатной температуре (20°С) и смесь перемешивают 15 минут. Суспензию подвергают центрифугированию при 5000g в течение 10 минут, чтобы удалить отработанную муку.
Во второй серии экспериментов сначала нагревают до 60°С 500 мл воды (без добавления соли) на плитке с мешалкой. Затем добавляют 50 г муки масличных семян канолы, которая (а) была обжарена при низкой температуре (100°С) или (b) из которой растворитель был удален на воздухе при 20°С (мука Marc) и смесь перемешивают в течение 15 минут при постоянной температуре. Экстракт отделяют от отработанной муки путем центрифугирования при 5000g в течение 10 минут.
Для различных белковых растворов определяют показатели поглощения А330 и А420 и концентрацию белка. Полученные результаты представлены в следующих таблицах XXV.1 и XXV.2.
| Таблица XXV.1 | ||||||
| Показатели поглощения для экстрактов | ||||||
| 0,05 М раствор соли | 0,10 М раствор соли | Вода 60°С | ||||
| А330 | А420 | А330 | А420 | А330 | А420 | |
| Мука НТ | 62,4 | 1,88 | 64,4 | 1,84 | 55,4 | 2,10 |
| Мука Mars | 77,7 | 1,82 | 85,5 | 2,10 | 78,0 | 2,13 |
| Таблица XXV.2 | |||
| 0,05 М раствор соли | 0,1 М раствор соли | Вода 60°С | |
| Мука НТ | 1,11 | 1,44 | 0,98 |
| Мука Mars | 2,09 | 2,04 | 1,38 |
Как можно видеть из результатов, приведенных в таблицах XXV.1 и XXV.2, значения А330 возрастают с повышением концентрации белка, тогда как интенсивность окрашивания, оцениваемая по поглощению А420, незначительно изменяется с повышением концентрации белка, что совпадает с визуальными наблюдениями. Эти результаты показывают, что наряду с повышенным выходом белка можно ожидать, что будет получаться более светлый продукт из муки, из которой растворитель удален на воздухе, по сравнению с мукой, обжаренной при низкой температуре.
Пример 8
В этом примере охарактеризовано влияние экстракции растворителем белкового изолята канолы на цвет продукта.
Смесь белковых изолятов канолы, полученных из БММ, сформировавшаяся в трех операциях выделения, таких как полученные из БММ изоляты D29-02A С300 (57,9 мас.%), D24-02A С300 (34,7 мас.%) и D11-02A С300 (7,4% масс.) (композит 6). Кроме того, формируется смесь изолятов, полученных из надосадочной жидкости, в трех операциях выделения, таких как изоляты, полученные из надосадочной жидкости Е29-02А С200 (18,7 мас.%), D29-02A С200 (40,1 мас.%) и Е14-02А С200 (41,2 мас.%) (композит 7).
Конкретные методики, используемые для получения отдельных белковых изолятов канолы, описаны ниже.
Промышленную муку канолы («а», кг) добавляют к «b» литрам 0,15 М раствора NaCl при температуре окружающей среды, смесь перемешивают 30 минут, получая водный раствор белка, который имеет содержание белка «с», г/л. Остаточную муку канолы удаляют и промывают на ленточном вакуум-фильтре. Образовавшийся белковый раствор осветляется путем центрифугирования и фильтрации, для того чтобы получить «d» литров осветленного белкового раствора, имеющего содержание белка «е», г/л.
Аликвоту «f» литров раствора белкового экстракта концентрируют до объема «g» литров, используя систему ультрафильтрации, содержащую мембраны с отсечкой по молекулярной массе «h», Да. Полученный концентрированный белковый раствор имеет содержание белка «i», г/л.
Концентрированный раствор с температурой "j", °C, разбавляют водой с температурой 4°С в отношении "k". Сразу образуются белые, мутные белковые мицеллы, которым дают осадиться. Удаляют верхний слой разбавляющей воды и выделяют осажденную, вязкую, клейкую массу (БММ) со дна сосуда с выходом экстрагированного белка «l», %. Найдено, что высушенный белковый продукт, полученный из БММ, имеет содержание белка «m», мас.% (N×6,25) d.b. Этот продукт имеет обозначение «n».
В следующей таблице XXVI приведены значения параметров от «а» до «m»:
| Таблица XXVI | |||||
| n | BW-AL017-D11-02AC300 | BW-AL017-D24-02AC300 | BW-AL017-D29-02AC300 | BW-AL017-E14-02AC300 | BW-AL018-E29-02AC300 |
| а | 1200 | 150 | 150 | 150 | 150 |
| b | 8000 | 1000 | 1000 | 999 | 1001 |
| с | 26,3 | 25,7 | 20,2 | 20 | 24,4 |
| d | 5882 | 1152 | 1040 | 1245 | 1075 |
| е | 17,7 | 16,6 | 14,6 | 10,2 | 17,8 |
| f | 5882 | 1080 | 1040 | 1194 | 820 |
| g | 92 | 53 | 44,25 | 39 | 24 |
| h | 5000 | 5000 | 5000 | 5000 | 5000 |
| i | 289 | 246,8 | 225 | 238 | 289 |
| j | 31 | 32 | 32 | 32 | 32 |
| k | 1:15 | 1:15 | 1:15 | 1:15 | 1:15 |
| l | 8,5 | 37,3 | 29,4 | 27,7 | 23,9 |
| m | 104,4 | 105,1 | 1032 | 100,1 | 102,4 |
Объем удаленной разбавляющей воды уменьшают путем ультрафильтрации, используя мембрану с отсечкой по молекулярной массе «о», Да, до концентрации белка «p», г/л. Концентрат высушивают. С учетом белка, дополнительно извлеченного из надосадочной жидкости, суммарное выделение белка составляет «q», мас.% экстрагируемого белка. Высушенный продукт имеет содержание белка «r», мас.% (N×6,25) d.b.
Этот продукт имеет обозначение «s». В следующей таблице XXVII приведены величины параметров от «о» до «r»:
| Таблица XXVII | |||||
| Параметр | BW-AL017-D11-02AC200 | BW-AL017-D24-02АС200 | BW-AL017-D29-02АС200 | BW-AL017-E14-02АС200 | BW-AL018-E29-02АС200 |
| o | 3000 | 5000 | 5000 | 5000 | 5000 |
| p | 237,6 | 194,4 | 121,8 | 115,8 | 100,1 |
| q | 15,5 | 55,4 | 45,7 | 44,4 | 35,2 |
| r | 98,7 | 97,8 | 100,8 | 98,7 | 97,5 |
Диспергируют 1,4 кг композита 6 в смеси 3 л этанола (денатурированный этанол 85%/метиловый спирт 15%, VWR Canlab D) и 3 л воды, очищенной обратным осмосом (OO). Смесь перемешивают в течение 30 минут, используя верхнюю мешалку. Твердое вещество выделяют из массы жидкости путем центрифугирования образца в загрузках при ускорении 8000g в течение 5 минут.
Затем полученные при центрифугировании лепешки снова диспергируют и дополнительно экстрагируют смесью 3 л этанола и 3 л воды, очищенной обратным осмосом, в течение 30 минут при перемешивании. Для выделения твердого образца снова используют центрифугирование (8000g/5 мин). Затем снова диспергируют лепешки в 4 л этанола, для того чтобы удалить воду из образца. Твердое вещество собирают путем центрифугирования (8000g/5 мин) и снова диспергируют в 4 л свежего этанола.
Для выделения твердого образца снова используют центрифугирование (8000g/5 мин). Лепешки измельчают, распределяют на пекарном поддоне и выставляют в вытяжной шкаф с целью высушивания.
Эту процедуру повторяют, используя 1,4 кг композита 7, который диспергируют в смеси 4,2 л этанола и 1,8 л воды, очищенной обратным осмосом. Лепешки снова диспергируют в свежей смеси 4,2 л этанола и 1,8 л воды, очищенной обратным осмосом.
Полученные белковые порошки и образцы экстракта растворителем анализируют на общее содержание белка и методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР). Кроме того, анализируют содержание влаги в белковых порошках. Образцы, экстрагированные растворителем, также анализируют, используя спектрофотометр, чтобы получить информацию о содержании фенольных соединений (поглощение при 330 нм) и видимом окрашивании (поглощение при 420 нм). Цвет сухих белковых продуктов оценивают, колориметр Minolta CR-310.
Степень выделения композита 6, экстрагированного смесью этанол/вода, составляет 86 мас.% и для композита 7 - 80 мас.%. Потери продукта обусловлены растворимостью в растворителе экстракции, и в следующей таблице XXVIII приведены величины содержания белка в экстрактах, экстрагированных растворителем.
| Таблица XXVIII Содержание белка в экстрактах, экстрагированных растворителем | |
| Образец | белок, мас.% |
| композит 6 - первая экстракция | 1,12 |
| композит 6 - вторая экстракция | 0,46 |
| композит 7 - первая экстракция | 1,55 |
| композит 7 - вторая экстракция | 1,27 |
Прочие потери относятся к материалу, потерянному на стадиях манипулирования с образцами.
Полученные показатели цветности приведены в следующей таблице XXIX.
| Таблица XXIX Показатели цветности для образца композита до и после экстракции | |||
| Образец | L | а | b |
| Композит 6 до экстракции | 81,49 | +0,12 | +24,37 |
| Композит 6 после экстракции | 83,53 | -0,56 | +14,18 |
| Композит 7 до экстракции | 79,68 | +0,20 | +19,69 |
| Композит 7 после экстракции | 80,67 | +0,13 | +14,72 |
Как можно видеть из данных в таблице XXIX, для обоих композитов 6 и 7 экстракция белкового изолята канолы приводит к повышению показателя осветленности (L), и к снижению величин "а" и "b". Повышение показателя L означает, что продукт является более белым и менее черным. Уменьшение показателя "а" соответствует смещению окраски от красной в направлении зеленой, тогда как уменьшение показателя "b" соответствует смещению окраски от желтой в направлении синей. Уменьшение красного и желтого окрашивания образца указывает на удаление фенольных соединений и/или продуктов их взаимодействия.
В следующей таблице XXX приведены показатели поглощения для экстрактов, экстрагированных растворителем
| Таблица XXX Показатели поглощения для экстрактов, экстрагированных растворителем | ||
| Образец | А420 | А330 |
| Композит 6 - первый экстракт | 3,19 | 21,60 |
| Композит 6 - второй экстракт | 0,82 | 6,00 |
| Композит 7 - первый экстракт | 3,20 | 11,40 |
| Композит 7 - второй экстракт | 0,80 | 3,00 |
Как можно видеть из таблицы XXX, экстракты слабо окрашены, что указывает на экстракцию окрашивающих компонентов из белкового изолята.
В таблице XXXI показано содержание белка (N×6.25, процент азота определяли с использованием анализатора Leco FP52D Nitrogen Determinator) и содержание влаги в белковых изолятах, экстрагированных растворителем.
| Таблица XXXI Показатели для белковых изолятов, экстрагированных растворителем | ||
| Образец | Содержание белка | Содержание влаги |
| Композит 6 | 97,35 | 6,13 |
| Композит 7 | 94,09 | 3,75 |
Как можно видеть из таблицы XXXI, в продуктах, экстрагированных растворителем, содержится мало влаги, и они имеют достаточно высокое содержание белка, чтобы их можно было классифицировать как изоляты.
Пример 9
В этом примере охарактеризовано применение антиоксиданта и адсорбента приполучении белкового изолята канолы.
Промышленную муку канолы (150 кг), из которой растворитель удален на воздухе, при низкой температуре (100°С) добавляют к 1000 л 0,15 М раствора NaCl и перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре 21°С. Через 15 минут перемешивания в суспензию добавляют 500 г (0,05 мас.%) аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта.
Остаточную муку канолы удаляют и промывают на ленточном вакуум-фильтре, получая 953,5 л белкового раствора, имеющего содержание белка 23,9 г/л. Величина поглощения УФ при 330 нм для раствора составляет 61,2.
Добавляют к 953,5 л белкового раствора 21,2 кг (2,2 мас.%) адсорбента Polyclar Super R и смесь перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого Polyclar удаляют, пропуская белковый раствор через центрифугу для удаления шлама, и затем через фильтр-пресс, содержащий подушки, фильтрующие частицы 20 и 0,2 мкм соответственно. После удаления адсорбента Polyclar собирают 842 л белкового раствора канолы, который имеет содержание белка 19,9 г/л и величину поглощения при 330 нм, равную 33,2. В результате получают значительное уменьшение поглощения A330 при очень малой потере белка.
Затем осветленный раствор концентрируют до объема 30 л, имеющий содержание белка 338,4 г/л и поглощение при 330 нм, равное 20,4 в системе ультрафильтрации, содержащей мембраны с отсечкой по молекулярной массе 5000 Да. Концентрированный раствор белкового экстракта подвергают диафильтрации в системе диафильтрации, используя мембраны с отсечкой по молекулярной массе 5000 Да, с 300 л 0,15 М раствора NaCl, содержащего 0,05 мас.% аскорбиновой кислоты. Получают 29,0 л концентрированного и диафильтрованного белкового раствора канолы, имеющего содержание белка 299,7 г/л и поглощение при 330 нм, равное 25,6.
В отличие от результатов, полученных в примерах 1-3 и 5, диафильтрация оказывает незначительное влияние на поглощение А330, вероятно, потому, что до стадии концентрирования большая часть свободных фенолов уже удалена из раствора белка канолы с помощью Polyclar.
Концентрированный и диафильтрованный раствор с температурой 31°С разбавляют в 15 раз (по объему) водой, имеющей температуру 6,4°С. Сразу образуются белые, мутные белковые мицеллы, которым дают осадиться в течение 2 часов. Удаляют верхний слой разбавляющей воды и выделяют осажденную, вязкую, клейкую массу БММ (40,6 кг) со дна сосуда и сушат распылением. Высушенный белковый изолят имеет содержание белка 98,8 мас.% (N×6,25) d.b.
Концентрируют 440 л надосадочной жидкости образовавшихся мицелл, которая имеет содержание белка 13,3 г/л, до объема 30 л с помощью системы ультрафильтрации, используя мембраны с отсечкой по молекулярной массе 5000 Да с пятью объемами воды. Полученный раствор имеет содержание белка 161,0 г/л и поглощение при 330 нм, равное 10,8.
Концентрированный и диафильтрованный раствор сушат. Найдено, что высушенный белковый продукт имеет содержание белка 95,6 мас.% (N×6,25) d.b.
Для образцов белкового изолята канолы (БИК), полученных из БММ, и белкового изолята канолы, полученного из надосадочной жидкости, оценивают осветленность (L) и цветность (а и b), используя колориметр Minolta (CR-310).
В следующей таблице ХХХП приведены полученные результаты.
| Таблица XXXII | |||
| Образец | L | а | b |
| БИК, полученный из БММ | 81,64 | -1,46 | +29,57 |
| БИК, полученный из надосадочной жидкости | 81,24 | -0,76 | +21,15 |
Пример 10
Этот пример иллюстрирует использование антиоксиданта и адсорбента на стадии экстракции.
Были проведены пилотные эксперименты с образцами промышленной муки масличных семян канолы (из которой растворитель был удален при температуре 100°С), экстрагировали 0,15 М раствором NaCl в течение 30 минут при концентрации 15 мас.%. Экстракцию проводили как без добавления, так и с добавлением различных количеств Polyclar Super R, а именно 0,5 мас.%, 1,0 мас.%, 1,5 мас.%, 2,0 мас.%, 2.5 мас.%, 3.0 мас.%, 4.0 мас.% и 5.0 мас.%, и с добавлением 0,5 мас.% аскорбиновой кислоты или без нее. После экстракции растворы подвергают центрифугированию и затем образцы анализируют на содержание фенольных соединений (поглощение А330), определяют видимое окрашивание (поглощение А420) и содержание белка.
Результаты, полученные с добавлением аскорбиновой кислоты или без нее, приведены в таблицах XXXIII и XXXIV соответственно.
| Таблица XXXIII | |||
| Добавка Polyclar, мас.%/об. | А330 | А420 | Белок, г/л |
| Контрольный образец | 96,2 | 2,8 | 24,6 |
| 1,0% Polyclar | 93,0 | 3,3 | 25,8 |
| 1,5% Polyclar | 71,7 | 2,65 | 26,1 |
| 2,0% Polyclar | 63,0 | 2,01 | 23,5 |
| 2,5% Polyclar | 72,4 | 2,54 | 26,4 |
| 3,0% Polyclar | 64,7 | 2,63 | 26,4 |
| 4,0% Polyclar | 63,0 | 2,41 | 28,0 |
| 5,0% Polyclar | 61,6 | 2,39 | 25,9 |
| Таблица XXXIV | |||
| Добавка Polyclar, мас.%/об. | А330 | А420 | Белок, г/л |
| Контрольный образец | 90,5 | 3,12 | 25,9 |
| 1,0% Polyclar | 82,7 | 2,22 | 28,4 |
| 1,5% Polyclar | 90,6 | 2,59 | 32,8 |
| 2,0% Polyclar | 83,5 | 2,32 | 26,8 |
| 2,5% Polyclar | 80,2 | 2,09 | 27,1 |
| 3,0% Polyclar | 68,1 | 2,25 | 26,5 |
| 4,0% Polyclar | 66,5 | 2,62 | 29,9 |
| 5,0% Polyclar | 52,4 | 1,73 | 26,0 |
Как можно видеть из результатов, приведенных в таблицах XXXIII и XXXIV, достигается значительное уменьшение поглощения как A330, так и А420 в присутствии Polyclar как в сочетании с аскорбиновой кислотой, так и без аскорбиновой кислоты. При концентраци Polyclar 2,5 мас.%/об. достигается уменьшение поглощения A330 на 25% и уменьшение А420 на 11% по сравнению с контрольным образцом, в который не добавляется аскорбиновая кислота на стадии экстракции. При более высоком содержании Polyclar величины А330 и А420 дополнительно уменьшаются. Когда в процессе экстракции присутствует аскорбиновая кислота, А330 уменьшается на 12% и А420 уменьшается на 34% при использовании добавки Polyclar 2,5 мас./об. Присутствие добавки Polyclar не влияет на содержание белка в растворе.
Пример 11
Этот пример иллюстрирует влияние промывки этанолом муки масличных семян канолы на цвет продукта.
Смешивают 10 г образца муки масличных семян канолы (без шелухи) со 100 мл этанола и смесь перемешивают в течение 30 минут при 45°С, 40°С и при комнатной температуре; причем температуру поддерживают постоянной с помощью воды, циркулирующей из термостата в сосуд с рубашкой.
После перемешивания в течение 30 минут суспензию муки в растворителе выливают на фильтр, для того чтобы отделить муку от экстракта. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока происходит удаление окрашивающих компонентов или до приблизительно постоянных показателей поглощения А330 и А420. Муку с каждой стадии промывки растворителем или стадии экстракции сушат и проводят экстракцию белка 0,15 М раствором NaCl при температуре окружающей среды в течение 30 минут.
Для каждого образца экстракта проводят измерение УФ-поглощения в растворе экстракта. В таблицах XXXV, XXXVI и XXXVII продемонстрированы величины поглощения А330 и А420 для экстрактов, полученных при температуре 40°С и 45°С соответственно.
| Таблица XXXV Экстракция этанолом при комнатной температуре | ||
| А330 | А420 | |
| 1я Экстракция растворителем | 34,3 | 0,494 |
| 2я Экстракция растворителем | 12,8 | 0,232 |
| 3я Экстракция растворителем | 6,1 | 0,100 |
| 4я Экстракция растворителем | 2,8 | 0,047 |
| 5я Экстракция растворителем | 2,3 | 0,045 |
| 6я Экстракция растворителем | 1,7 | 0,040 |
| Таблица XXXVII Экстракция этанолом при температуре 45°С | ||
| А330 | А420 | |
| 1я Экстракция растворителем | 30,9 | 0,528 |
| 2я Экстракция растворителем | 20,1 | 0,257 |
| 3я Экстракция растворителем | 9,3 | 0,139 |
| 4я Экстракция растворителем | 7,01 | 0,108 |
| 5я Экстракция растворителем | 4,74 | 0,073 |
| 6я Экстракция растворителем | 6,66 | 0,063 |
| 7я Экстракция растворителем | 3,69 | 0,035 |
| 8я Экстракция растворителем | 2,57 | 0,031 |
| 9я Экстракция растворителем | 2,6 | 0,037 |
| 10я Экстракция растворителем | 2,4 | 0,033 |
| Таблица XXXVII Экстракция этанолом при температуре 45°С | ||
| А330 | А420 | |
| 1я Экстракция растворителем | 43,0 | 0,610 |
| 2я Экстракция растворителем | 21,0 | 0,301 |
| 3я Экстракция растворителем | 14,6 | 0,191 |
| 4я Экстракция растворителем | 7,83 | 0,129 |
| 5я Экстракция растворителем | 7,65 | 0,105 |
| 6я Экстракция растворителем | 7,34 | 0,092 |
| 7я Экстракция растворителем | 5,76 | 0,086 |
| 8я Экстракция растворителем | 6,04 | 0,063 |
| 9я Экстракция растворителем | 4,89 | 0,065 |
| 10я Экстракция растворителем | 4,98 | 0,052 |
Как можно видеть из этих данных, при экстракции растворителем при пониженной температуре не удаляется настолько много окрашивающих компонентов и фенольных соединений, как при экстракции в интервале температур от 40° до 45°С, причем при экстракции при комнаткой температуре удаление примесей прекращается уже после 6-й экстракции, тогда как при более высокой температуре при экстракции удаляются примеси вплоть до 10-й стадии экстракции.
Для белковых экстрагированных растворов определяется содержание белка и поглощение при 330 км и 420 нм, и эти результаты приведены в следующей таблице XXXVIII.
| Таблица XXXVIII | |||
| А330 | А420 | % Белка | |
| Контрольный опыт | 97,8 | 2,84 | 1,92 |
| Комнатная температура | 78,4 | 2,57 | 2,01 |
| 40°С | 60,1 | 1,97 | 2,23 |
| 45°С | 58,2 | 2,29 | 1,79 |
Как можно видеть из этой таблицы, можно избежать потерь белка и в то же время удалить приблизительно 40% фенольных соединений и 30% материалов, поглощающих излучение при 420 нм, в результате предварительной экстракции муки этанолом при 40°С.
Пример 12
Этот пример иллюстрирует получение белкового изолята канолы с экстракцией муки этанолом.
Одинадцать аликвот (по 600 г) муки масличных семян канолы (без шелухи) подвергают 4 раза экстракции 3 литрами этанола, используя отношение мука/этанол, равное 1:5 (масса/объем). Экстракцию проводят в течение 30 минут при 35°С.
После перемешивания в течение 30 минут суспензии дают осадиться и сливают жидкость над осадком. Для каждой экстракции определяется УФ-поглощение при 330 нм и 420 нм и измеряется содержание белка для первой экстракции из первой аликвоты экстрагированной муки.
После четвертой экстракции муку насыпают на пологий поддон, выставляют его в вытяжной шкаф и высушивают муку в течение ночи. Из всей загрузки промытой муки растворитель удаляется в вытяжном шкафу еще в течение одной ночи и затем используют 5,4 кг высушенной экстрагированной муки в периодической экстракции в объеме 50 л.
После каждой экстракции образца цвет жидкости над осадком становится более светлым, и показатели поглощения А330 и А420 уменьшаются. В среднем, наблюдается пятикратное уменьшение поглощения А330 и шестикратное уменьшение А420. Показатели поглощения А420 и А330, соответствующие различным экстрактам, представлены в следующих таблицах XXXIX и XL.
| Таблица XXXIX Поглощение при 420 нм | ||||
| Аликвота муки | Экстракт 1 | Экстракт2 | Экстракт 3 | Экстракт 4 |
| А | 1,688 | 0,606 | 0,276 | 0,181 |
| В | 0,87 | 0,379 | 0,124 | 0,103 |
| С | 0,891 | 0,432 | 0,206 | 0,129 |
| D | 0,182 | 0,334 | 0,218 | 0,116 |
| Е | 0,8 | 0.366 | 0,159 | 0,093 |
| F | 0,896 | 0,469 | 0,215 | 0,114 |
| G | 0,8 | 0,398 | 0,194 | 0,122 |
| Н | 0,821 | 0,376 | 0,203 | 0,117 |
| I | 0,836 | 0,398 | 0,189 | 0,111 |
| J | 0,827 | 0,375 | 0,203 | 0,131 |
| К | 0,833 | 0,402 | 0,265 | 0,115 |
| Таблица XL Поглощение при 330 нм | ||||
| Аликвота муки | Экстракт 1 | Экстракт 2 | Экстракт 3 | Экстракт 4 |
| А | 98,1 | 47,5 | 22,1 | 12,8 |
| В | 30,7 | 14,7 | 13,9 | 10,43 |
| С | 61,2 | 27,8 | 15,3 | 10,9 |
| D | 57,5 | 25,3 | 19,5 | 11,37 |
| Е | 60,4 | 27,7 | 16,2 | 10,4 |
| F | 58,6 | 29,3 | 18,4 | 11,4 |
| G | 58,8 | 28,6 | 17,3 | 12 |
| Н | 57,9 | 26,3 | 14,3 | 10,02 |
| I | 60,1 | 29,3 | 15,6 | 11,02 |
| J | 56,7 | 30,1 | 17,8 | 10,89 |
| К | 61,2 | 27,98 | 14,77 | 11,08 |
Экстрагированную этанолом муку (5 кг) добавляют к 50 литрам 0,15 М раствора NaCl и смесь перемешивают 30 минут при комнатной температуре, 20°С с 0,05 мас.% аскорбиновой кислоты, которую добавляют в суспензию в качестве антиоксиданта через 15 минут.
Остаточную муку канолы удаляют и промывают на ленточном вакуум-фильтре. Образовавшийся белковый раствор осветляют путем фильтрации через мешочный фильтр (20 мкм) с последующим центрифугированием при скорости 6500 об/мин в течение 5 минут, для того чтобы получить 39,6 л белкового раствора, имеющего содержание белка 23,7 г/л.
Концентрируют 37,55 л осветленного белкового раствора до объема 3 литра с помощью системы ультрафильтрации, используя мембраны с отсечкой по молекулярной массе 10000 Да. Концентрированный белковый раствор подвергают диафильтрации в системе диафильтрации, используя мембраны с отсечкой по молекулярной массе 10000 Да и используя 24 литра (т.е. 8 объемов ретентата) 0,15 М раствора NaCl, содержащего 0,05 мас.% аскорбиновой кислоты. Образовавшиеся 3 литра концентрированного и диафильтрованного белкового раствора канолы имеют содержание белка 184 г/л.
Концентрированный и диафильтрованный раствор при 30°С разбавляют в 30 литрах воды, имеющей температуру 4°С. Сразу образуются белые, мутные белковые мицеллы, которым дают осадиться. Удаляют жидкость над осадком и выделяют осажденную, вязкую, клейкую массу (БММ, 5,78 кг) со дна сосуда и сушат путем распыления.
Высушенный белковый изолят имеет содержание белка 101,2 мас.% (N×6,25) d.b.
Концентрируют 26 л надосадочной жидкости образовавшихся мицелл до объема 3 литра с помощью системы ультрафильтрации, используя мембраны с отсечкой по молекулярной массе 10000 Да. Затем концентрированную надосадочную жидкость подвергают диафильтрации в системе диафильтрации, используя мембраны с отсечкой по молекулярной массе 10000 Да с 6 литрами воды.
Концентрированный и диафильтрованный раствор сушат. Найдено, что высушенный белковый продукт имеет содержание белка 101,3 мас.% (N×6.25) d.b.
Для образцов белкового изолята канолы (БИК), полученных из БММ, и белкового изолята канолы, полученного из жидкости над осадком, оценивают осветленность (L) и цветность (а и b), используя колориметр фирмы Minolta (R-310). В следующей таблице XLI приведены полученные результаты.
| Таблица XLI | |||
| Образец | L | а | b |
| БИК, полученный из БММ | 84,32 | -1,84 | 23,85 |
| БИК, полученный из надосадочной жидкости | 81,92 | -0,5 | 14,18 |
Эти продукты были совершенно светлыми, причем значения параметров «а» и «b» позволяют предположить и относительно меньшую интенсивность красного и желтого окрашивания.
ВЫВОДЫ
Обобщая это описание, в настоящем изобретении разработан способ получения извлечения белковых изолятов канолы, имеющих меньшее окрашивание, за счет осуществления одной или нескольких операций при получении изолята с целью удаления компонентов, вызывающих окрашивание, ингибирования окисления компонентов, вызывающих окрашивание, и удаления окрашивающих компонентов. Возможны модификации способа в рамках объема изобретения.
1. Способ получения белкового изолята канолы из муки масличных семян канолы, включающий
(a) экстракцию муки из масличных семян канолы, для того чтобы вызвать солюбилизацию белка, содержащегося в указанной муке масличных семян канолы, с образованием водного белкового раствора, имеющего рН от 5 до 6,8, за счет использования водного раствора соли;
(b) отделение водного белкового раствора от остаточной муки масличных семян;
(c) повышение концентрации белка в указанном водном белковом растворе при поддержании практически постоянного значения ионной силы раствора за счет применения процесса селективного разделения на мембране с целью получения концентрированного белкового раствора;
(d) разбавление указанного концентрированного белкового раствора охлажденной водой, имеющей температуру ниже, чем 15°С, для того чтобы вызвать образование отдельных белковых мицелл в водной фазе;
(e) осаждение белковых мицелл с образованием аморфной, клейкой, желеобразной, похожей на клейковину, белковой мицеллярной массы и
(f) выделение белковой мицеллярной массы из надосадочной жидкости, причем эта белковая мицеллярная масса имеет содержание белка, по меньшей мере, 90 мас.% (N×6,25) в расчете на сухую массу,
отличающийся тем, что
(a) указанную муку масличных семян канолы промывают спиртом путем диспергирования муки масличных семян канолы в спирте при соотношении масса/объем, равном от 1:3 до 1:10, перемешивания образовавшейся суспензии в течение от 5 до 60 мин при температуре от 15 до 45°С, предпочтительно от 15 до 30°С, и выделения промытой муки масличных семян канолы из суспензии и/или
(b) концентрированный белковый раствор подвергают диафильтрации до указанной стадии разбавления и/или
(c) указанную белковую мицеллярную массу сушат и экстрагируют высушенный белковый изолят канолы водным раствором спирта и/или
(d) концентрированный белковый раствор пастеризуют до указанной стадии разбавления.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный водный раствор соли содержит антиоксидант, который представляет собой сульфит натрия или аскорбиновую кислоту, которые предпочтительно присутствуют в указанном водном растворе соли в количестве от 0,01 до 1 мас.%.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная стадия промывки осуществляется многократно, пока происходит дальнейшее извлечение фенольных соединений и/или видимых окрашивающих компонентов.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная диафильтрация проводится с использованием от 2 до 20 объемов раствора диафильтрации, предпочтительно от 5 до 10 объемов раствора диафильтрации.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная стадия экстракции проводится с использованием водного раствора соли, имеющего рН в диапазоне от 5 до 6,8, и указанный раствор диафильтрации представляет собой водный раствор соли, имеющий ту же самую концентрацию соли и значение рН, что и раствор, используемый в указанной стадии экстракции.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная стадия диафильтрации проводится с использованием мембраны, имеющей отсечку по молекулярной массе в интервале от 3000 до 50000 Дальтон, предпочтительно от 5000 до 10000 Дальтон.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный раствор диафильтрации содержит антиоксидант, по меньшей мере, в части указанной стадии диафильтрации, и указанный антиоксидант представляет собой сульфит натрия или аскорбиновую кислоту.
8. Способ по п.7, в котором указанный антиоксидант применяется в количестве от 0,01 до 1 мас.%.
9. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанная стадия экстракции проводится с использованием водного раствора соли, имеющего рН в диапазоне от 5 до 6,8 и содержащего указанный антиоксидант.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную надосадочную жидкость концентрируют, осуществляя ультрафильтрацию надосадочной жидкости для того, чтобы получить концентрированную надосадочную жидкость, и эту концентрированную надосадочную жидкость подвергают диафильтрации.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанная диафильтрация проводится с использованием от 2 до 20 объемов раствора диафильтрации, предпочтительно от 5 до 10 объемов раствора диафильтрации, предпочтительно с использованием воды в качестве раствора для диафильтрации.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанная диафильтрация проводится с использованием мембраны, имеющей отсечку по молекулярной массе в интервале от 3000 до 50000 Дальтон, предпочтительно от 5000 до 10000 Дальтон.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный диафильтрованный раствор содержит антиоксидант, по меньшей мере, в части указанной стадии диафильтрации, а указанный антиоксидант может быть сульфитом натрия или аскорбиновой кислотой и предпочтительно применяется в количестве от 0,01 до 1 мас.%.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный диафильтрованный раствор белка, до указанной стадии разбавления, контактирует с реагентом, адсорбирующим окрашивающие компоненты, который может быть поливинилпирролидоном.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанный поливинилпирролидон используется в количестве от 0,5 до 6 мас.%, предпочтительно от 2 до 3 мас.%.
16. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная стадия пастеризации проводится путем нагревания диафильтрованного белкового раствора при температуре от 55 до 70°С, в течение 10-15 мин, предпочтительно при температуре от 60 до 65°С, в течение 10 мин.
17. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный водный раствор спирта представляет собой водный раствор этанола, имеющий объемное отношение этанол: вода от 2:1 до 1:2, и указанный белковый изолят канолы экстрагируют путем диспергирования белкового изолята канолы в водном растворе спирта, в количестве от 5 до 25 мас.%, перемешивания образовавшейся суспензии в течение от 30 до 60 мин и выделения экстрагированного белкового изолята канолы из суспензии, причем указанная стадия экстракции осуществляется многократно, пока происходит дальнейшее удаление фенольных соединений и/или невидимых окрашивающих компонентов из белкового изолята канолы.
18. Способ по любому из пп.1-17, отличающийся тем, что растворитель из муки масличных семян канолы удаляется на воздухе при температуре ниже 50°С для того, чтобы удалить остаточный растворитель экстракции масла до указанной стадии экстракции.
19. Способ по любому из пп.1-17, отличающийся тем, что растворитель из муки масличных семян канолы удаляется при повышенной температуре ниже 100°С для того, чтобы удалить остаточный растворитель экстракции масла до указанной стадии экстракции.
20. Способ по любому из пп.1-17, отличающийся тем, что муку масличных семян канолы обрабатывают с целью инактивации мирозиназы, содержащейся в масличных семенах.
Приоритеты по пунктам и признакам:
20.06.2002 по пп.1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 19 за исключением признаков стадии (а), (с), (d);
20.06.2003 по пп.1, 3, 5, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 20 за исключением признаков стадии (b).
