Антитело против опухолеспецифичных антигенов в качестве мишени
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложено моноклональное антитело, специфичное к окулоспанину человека, обладающее цитотоксической активностью в отношении раковых клеток человека. В одном из вариантов антитело получают из гибридомы мыши 03B8-2C9-4F3, FERM ВР-08627. Описан набор для обнаружения рака на основе по меньшей мере указанного антитела и второго антитела, специфичного к нему. Раскрыта фармацевтическая композиция для лечения рака, клетки которого экспрессируют окулоспанин, и применение антитела для производства лекарственного средства для лечения рака, клетки которого экспрессируют окулоспанин. Использование изобретения обеспечивает высокоспецифичные антитела к окулоспанину человека, что может найти применение для диагностики опухолей, экспрессирующих окулоспанин человека. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 5 ил.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителам, которые могут использоваться при лечении рака, к фармацевтической композиции для лечения рака, характеризующейся тем, что она содержит антитело в качестве активного ингредиента, к способу обнаружения рака и к набору для обнаружения рака.
Уровень техники
Известно, что опухолевые клетки экспрессируют антигенные белки, которые присущи конкретному типу опухолевых клеток (здесь иногда называемые «опухолеспецифичными антигенами»). Были предприняты попытки разработать новые способы лечения опухолей путем воздействия на опухолеспецифичные антигены. Известно, что моноклональные антитела, которые индуцируют реакцию антиген-антитело, специфичную для таких опухолеспецифичных антигенов, индуцируют различные типы иммунных реакций in vivo (антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) и т.д.) для атаки на раковые клетки, индуцируя, таким образом, клеточную смерть. Были разработаны моноклональные антитела, которые могут использоваться при лечении опухолей.
Однако разнообразие моноклональных антител, которые могут использоваться при лечении опухолей, ограничено. Доступные в настоящее время моноклональные антитела могут использоваться для лечения только немногих типов опухолей, включающих метастатический рак молочной железы, острый лейкемический миелоз, хроническую лимфому, трудно поддающуюся лечению, неходжкинскую лимфому и множественную миелому. Разработка моноклональных антител для лечения других опухолей является желательной.
Для получения моноклональных антител, которые могут использоваться для лечения рака, необходимо идентифицировать белок, специфически экспрессируемый в опухолевой клетке, и получить моноклональное антитело против этого белкового антигена.
Человеческий белок окулоспанина был получен в качестве клона маркерных экспрессирующих последовательностей (EST) гена, экспрессируемого на пигментном эпителии сетчатки и хороидальной мембране глаза (Molecular Vision (2002) 8, 25-220). Ген человеческого белка окулоспанина имеет открытую рамку считывания 1068 п.о. Человеческий белок окулоспанина состоит из 355 аминокислот и имеет вычисленную на основе последовательности ДНК молекулярную массу 36,4 кДа. Однако взаимосвязь между человеческим белком окулоспанина и опухолями до сих пор не известна.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу обнаружения рака посредством нахождения гена, специфически экспрессируемого в раковой клетке, и определения экспрессии этого гена, к набору для обнаружения рака, используемого в способе обнаружения, к антителу, которое специфически связывает продукт экспрессии гена, к антителу, обладающему цитотоксической активностью, и к фармацевтической композиции для лечения рака, содержащей указанное антитело в качестве активного ингредиента.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали ген, специфически экспрессируемый в опухолевой ткани человека, и обнаружили, что уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина с неизвестной функцией значительно выше в клетках меланомы. На основании этого обнаружения удалось разработать способ обнаружения рака, используя указанный ген, набор для обнаружения рака и фармацевтическую композицию для лечения рака, содержащую антитело против человеческого белка окулоспанина, которые являются объектом настоящего изобретения.
Более конкретно настоящее изобретение относится:
(1) к антителу, которое специфически связывается с человеческим белком окулоспанина и обладает цитотоксической активностью в отношении клетки, экспрессирующей этот белок;
(2) к антителу, которое специфически связывается с белком, содержащим аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2 из списка последовательностей, и/или аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:4 из списка последовательностей, и которое обладает цитотоксической активностью в отношении клетки, экспрессирующей этот белок (эти белки);
(3) к антителу по пункту (1) или (2), отличающемуся тем, что цитотоксическая активность является антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью;
(4) к антителу по пункту (1) или (2), отличающемуся тем, что цитотоксическая активность является комплемент-зависимой цитотоксичностью;
(5) к антителу по пункту (1) или (2), отличающемуся тем, что цитотоксическая активность является комплемент-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью;
(6) к антителу по пункту (1) или (2), отличающемуся тем, что цитотоксическая активность является индукцией апоптоза;
(7) к антителу по любому из пунктов (1)-(6), отличающемуся тем, что антитело является моноклональным антителом;
(8) к антителу по пункту (7), отличающемуся тем, что антитело продуцируется мышиной гибридомой О3В8-2С9-4F3 (FERM BP-08627);
(9) к антителу по любому из пунктов (1)-(8), отличающемуся тем, что антитело является гуманизированным;
(10) к антителу по любому из пунктов (1)-(7), отличающемуся тем, что антитело является полным человеческим антителом;
(11) к антителу по любому из пунктов (1)-(10), отличающемуся тем, что антитело является IgG-антителом;
(12) к способу обнаружения рака, который включает в себя следующие стадии 1)-4):
1) стадию экстрагирования фракции общей РНК из образца, взятого у исследуемого индивидуума;
2) стадию экстрагирования фракции общей РНК из образца, взятого у здорового индивидуума;
3) стадию измерения уровня экспрессии полинуклеотида, представленного в нижеприведенных пунктах а) или b), во всех фракциях общей РНК, полученных на стадиях 1) и 2):
а) полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 из списка последовательностей;
b) полинуклеотида, который гибридизуется с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности полинуклеотида по пункту а), в жестких условиях; и
4) стадию анализа различия уровня экспрессии полинуклеотида между фракциями общей РНК, полученными на стадии 1) и стадии 2), измеренного на стадии 3), и таким образом, определения наличия рака у исследуемого индивидуума, который указан на стадии 1);
(13) к способу обнаружения рака, который включает в себя стадии 1)-3):
1) стадию измерения уровня экспрессии белка, содержащего аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2 из списка последовательностей, и/или уровня экспрессии белка, содержащего аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:4, в образце, взятом у исследуемого индивидуума;
2) стадию измерения уровня экспрессии по меньшей мере одного белка в соответствии со стадией 1) в образце, взятом у здорового индивидуума; и
3) стадию анализа различия уровня экспрессии между белком, определенным на стадии 1), и белком, определенным на стадии 2), и таким образом, определения наличия рака у исследуемого индивидуума;
(14) к способу по любому из пунктов 12 или 13, отличающемуся тем, что раком является рак кожи;
(15) к способу по любому из пунктов 12 или 13, отличающемуся тем, что раком является меланома;
(16) к способу по любому из пунктов (12), (14) или (15), отличающийся тем, что уровень экспрессии полинуклеотида измеряют Нозерн-блоттингом, дот-блоттингом, слот-блоттингом, ОТ-ПЦР, анализом рибонуклеазной защиты или «run-on»-анализом;
(17) к способу по любому из пунктов (12), (14) или (15), отличающемуся тем, что уровень экспрессии полинуклеотида измеряют с использованием генного чипа или матрицы, полученной из ДНК, содержащей комплементарные ДНК, полученные из указанного образца, или части последовательностей, комплементарных ДНК;
(18) к способу по любому из пунктов (13)-(15), отличающемуся тем, что уровень экспрессии белка измеряют с помощью антитела или лиганда, которые специфически связываются с белком;
(19) к способу по любому из пунктов (13)-(15), отличающемуся тем, что уровень экспрессии белка измеряют Вестерн-блоттингом, дот-блоттингом, слот-блоттингом или твердофазным иммуноферментным анализом (метод ELISA);
(20) к набору для обнаружения рака, содержащему по меньшей мере один компонент, выбранный из нижеследующих 1)-3):
1) олигонуклеотидного праймера с длиной 15-30 оснований для специфической амплификации полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 из списка последовательностей;
2) полинуклеотидного зонда из по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, способного гибридизоваться с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, в жестких условиях, и таким образом определять полинуклеотид; и
3) иммобилизованного образца, имеющего полинуклеотид содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, иммобилизованный на нем;
(21) к набору для обнаружения рака, содержащему по меньшей мере один из нижеследующих компонентов 1) и 2):
1) антитело, способное специфически связываться с белком, содержащим аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2 из списка последовательностей, и/или аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:4 из списка последовательностей, и таким образом определять белок/белки;
2) вторичное антитело, способное связываться с антителом в соответствии с пунктом 1) выше;
(22) к набору в соответствии с пунктами (20) или (21), отличающемуся тем, что раком является рак кожи;
(23) к набору в соответствии с пунктами (20) или (21), отличающемуся тем, что раком является меланома;
(24) к фармацевтической композиции для лечения рака, содержащей по меньшей мере одно антитело в соответствии с пунктами (1)-(11);
(25) к фармацевтической композиции для лечения рака, содержащей олигонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, или часть последовательности нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1;
(26) к фармацевтической композиции в соответствии с пунктами (24) или (25), отличающейся тем, что раком является рак кожи; и
(27) к фармацевтической композиции в соответствии с пунктом (24) или (25), отличающейся тем, что раком является меланома.
Краткое описание графического материала
На фиг.1 верхняя фигура является диаграммой, показывающей уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина в различных типах клеток; и нижняя фигура является диаграммой, показывающей уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина в пробах кожи здорового человека и в пробах меланомы;
На фиг.2 верхняя фигура является диаграммой, показывающей уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина в пробах кожи здорового человека и в пробах меланомы, полученных из ткани кожи; и нижняя фигура является диаграммой, показывающей уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина в пробах кожи здорового человека и в пробах меланомы, взятых из ткани лимфатического узла;
На фиг.3 представлена диаграмма, показывающая уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина в пробах, взятых из лимфатического узла здорового человека, и пробах меланомы, взятых из ткани лимфатического узла;
На фиг.4 представлена экспрессия продуктов гена человеческого белка окулоспанина в клетках NIH3T3; и
На фиг.5 представлена диаграмма, на которой показана антитело-зависимая цитотоксическая активность антитела в отношении человеческого белка окулоспанина в клетке, экспрессирующей человеческой белок окулоспанина.
Наилучший способ осуществления изобретения
В описании изобретения соединением, обладающим терапевтическим действием на рак, является соединение, обладающее активностью, подавляющей рост раковой опухоли и/или активностью, уменьшающей раковую опухоль. В описании изобретения термины "рак" и "опухоль" имеют одно и то же значение. Термин "ген", используемый в данном описании, включает в себя не только ДНК, но также мРНК, кДНК и кРНК. Таким образом, термин "ген человеческого белка окулоспанина", используемый в данном описании, включает в себя ДНК, мРНК, кДНК и кРНК гена человеческого белка окулоспанина. Термин "полинуклеотид", используемый в данном описании, имеет значение, аналогичное значению нуклеиновой кислоты, и, следовательно, включает в себя ДНК, РНК, зонд, олигонуклеотид и праймер. Термины "полипептид" и "белок" используются в данном описании взаимозаменяемо. Термин "фракция РНК", используемый в данном описании, относится к фракции, содержащей РНК. Кроме того, под термином "клетка" понимают клетку организма животного и культивируемую клетку. Термин "малигнизация клетки", используемый в данном описании, относится к патологической пролиферации клеток, которая вызвана отсутствием чувствительности к контактному ингибированию и их пролиферации, зависимой от независимой пролиферации. Клетка с такой патологической пролиферацией называется «раковой клеткой». В данном описании белок, обладающий такой же функцией, как и человеческой белок окулоспанина, например способностью к малигнизации, также называют «человеческим белком окулоспанина». Следует обратить внимание на то, что используемый термин «онкоген», включает в себя предраковый ген и протоонкоген, иной чем онкоген.
Термин «цитотоксичность», используемый в данном описании, относится к патологическому изменению в клетке, вызванному любой причиной. Таким образом, цитотоксичность включает в себя не только непосредственное повреждение извне, но также различные структурные и функциональные изменения, которые могут возникнуть внутри клетки и которые включают в себя расщепление ДНК, димеризацию оснований, хромосомное расщепление, нарушение функции митотического аппарата клетки и снижение ферментативной активности. Термин «цитотоксическая активность» относится к любой активности, которая вызывает цитотоксичность, как указано выше.
Термин «гибридизуется в жестких условиях» относится к гибридизации, которую осуществляют при 68°С в коммерчески доступном растворе для гибридизации, а именно, в ExpressHyb (производимом Clontech), или к гибридизации, которую осуществляют при 68°С в присутствии NaCl, от 0,7 до 1,0М, используя фильтр с иммобилизованной на нем ДНК, с последующей промывкой при 68°С 0,1-2Х раствором SSC (1Х раствор SSC содержит 150 мМ NaCl и 15 мМ цитрат натрия), что приводит к гибридизации. Приведенный выше термин включает в себя также гибридизацию в условиях, эквивалентных вышеуказанным.
1. Человеческой белок окулоспанина
(1) Подтверждение специфической экспрессии гена человеческого белка окулоспанина
В результате анализа уровней экспрессии гена человеческого белка окулоспанина в различных типах клеток человека было обнаружено, что значительная экспрессия указанного гена наблюдается в меланоцитах по сравнению с другими тканями. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина в меланоме значительно выше, чем экспрессия в нормальных меланоцитах. Более конкретно, было обнаружено следующее: при сравнении уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина в меланоцитах, лимфобластах и глиальных клетках и эпителиальных клеток было обнаружено, что уровень экспрессии в меланоцитах является значительно более высоким. Кроме того, при сравнении уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина в нормальных клетках кожи и уровня экспрессии окулоспанина в клетках меланомы оказалось, что уровень экспрессии значительно выше в меланоме. На основании этого обнаружения был сделан вывод, что человеческий белок окулоспанина может быть вовлечен в малигнизацию клеток и/или в пролиферацию раковых клеток. Это предполагает, что состояние малигнизации и/или состояние пролиферации раковых клеток, вызванное избыточной экспрессией человеческого белка окулоспанина, может быть определено измерением уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина в отдельных клетках и/или тканях. Примером такого рака является рак кожи, в частности меланома. Однако этот факт применим к другим типам рака, кроме рака кожи, при условии что экспрессия человеческого белка окулоспанина в этих раковых клетках значительно выше в других тканях.
Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ORF) гена человеческого белка окулоспанина представлена SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, и его аминокислотная последовательность представлена SEQ ID NO:2. Кроме того, кДНК гена человеческого белка окулоспанина зарегистрирована в GenBank как мРНК окулоспанина Homo sapiens (OCSP) под инвентарным номером No. NM_031945. Нуклеотидная последовательность кДНК, зарегистрированная в GenBank, представлена SEQ ID NO:3 из списка последовательностей. ORF представлена нуклеотидами с номерами 65-1129 SEQ ID NO:3. Кроме того, аминокислотная последовательность человеческого белка окулоспанина, зарегистрированная в GenBank, представлена SEQ ID NO:4 из списка последовательностей. Белок, содержащий аминокислотную последовательность с одной или несколькими заменами, делециями или добавлениями аминокислот в аминокислотную последовательность человеческого белка окулоспанина и проявляющий такую же биологическую активность, как и активность человеческого белка окулоспанина, также включен в данное описание как человеческий белок окулоспанина.
2. Способ обнаружения рака
Полагают, что человеческий белок окулоспанина из-за своей высокой степени экспрессии в раковых клетках, в частности в меланоме, участвует в малигнизации клеток, в частности клеток кожи, и/или в пролиферации раковых клеток. Термин «образец» относится к пробе, взятой у исследуемого индивидуума, или к клиническому образцу и включает в себя образец тканей, экскрементов или тому подобное, например образцы крови, воды в организме, предстательной железы, яичек, полового члена, мочевого пузыря, почки, полости рта, глотки, губы, языка, десен, носоглотки, пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, ободочной кишки, печени, желчного пузыря, поджелудочной железы, носа, легкого, кости, мягкой ткани, кожи, молочной железы, матки, яичника, головного мозга, щитовидной железы, лимфатического узла, мышцы и жировой ткани. В настоящем изобретении предпочтительными пробами ткани являются кожа и лимфатический узел.
(1) Способ обнаружения рака, используя уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина.
Способ обнаружения рака с использованием уровня экспрессии гена человеческого белка окулоспанина включает в себя, конкретно, следующие стадии, от 1) до 4):
1) стадию экстрагирования фракции общей РНК из образца, взятого у исследуемого индивидуума;
2) стадию экстрагирования фракции общей РНК из образца, взятого у здорового индивидуума;
3) стадию измерения уровня экспрессии гена человеческого белка окулоспанина во фракциях общей РНК в соответствии со стадиями 1) и 2) и
4) стадию анализа различия в уровне экспрессии гена между фракциями общей РНК, полученными из стадий 1) и 2), измеренном на стадии 3), и таким образом, определения наличия рака у исследуемого индивидуума стадии 1).
Отдельные стадии будут объяснены более конкретно ниже.
а) Стадия 1): Экстрагирование фракции общей РНК из образца, взятого у исследуемого индивидуума.
При экстрагировании фракции общей РНК из образца ткань человека получают подходящим способом, соответствующим этическим стандартам в отношении экспериментирования. Полученную ткань растворяют непосредственно в растворителе для экстракции РНК (содержащем ингибитор рибонуклеаз, такой как фенол). Альтернативно клетки полученной ткани собирают выскабливанием при помощи скребка так, чтобы не разрушить клетки, или мягким экстрагированием из ткани с использованием протеолитического фермента, такого как трипсин, и затем немедленно подвергают полученные клетки стадии экстрагирования РНК.
Примеры способов экстрагирования РНК, которые могут быть использованы, включают в себя: способы с использованием гуанидинтиоцианата/ультрацентрифугирования в хлориде цезия, способы с использованием гуанидинтиоцианата/горячего этанола, способы с использованием гуанидингидрохлорида и способы с использованием кислого гуанидинтиоцианата/фенола/хлороформа (Chomczynski, P. and Sacci, N., Anal. Biochem. (1987), 162, 156-159). Из них особенно предпочтительными являются способы с использованием кислого гуанидинтиоцианата/фенола/хлороформа. Альтернативно коммерчески доступный реагент для экстрагирования РНК, такой как реагент ISOGEN (производимый Nippon Gene Co., Ltd.) или TRIZOL (производимый Gibco BRL), может быть использован в соответствии с протоколом, поставляемым вместе с реагентом.
Из полученной фракции общей РНК, если необходимо, предпочтительно очищать и использовать только мРНК. Может быть использован любой подходящий способ очистки. Например, мРНК может быть очищена адсорбцией мРНК на биотинилированный олиго(dT)-зонд, присоединением мРНК к парамагнитным частицам, имеющим иммобилизованный на них стрептавидин, промыванием этих частиц и элюированием мРНК. Альтернативно мРНК может быть очищена адсорбцией мРНК на олиго(dT)-целлюлозной колонке и элюированием из нее мРНК. Однако стадия очистки мРНК не является обязательной в способах настоящего изобретения. При условии определения экспрессия желаемого полинуклеотида может использоваться фракция общей РНК, как это может быть выполнено на более поздних стадиях.
b) Стадия 2): Экстрагирование фракции общей РНК из образца, взятого у здорового индивидуума.
В настоящем изобретении под здоровым индивидуумом понимают индивидуума, который не имеет злокачественного новообразования. Определение, является или нет индивидуум здоровым, может быть осуществлено путем измерения концентрации человеческого белка окулоспанина и определения, находится или нет измеренная величина концентрации в заранее определенном для здорового индивидуума диапазоне. Альтернативно корреляция между уровнем экспрессии человеческого белка окулоспанина и степенью образования рака может быть исследована заранее, и затем можно определить, является или нет исследуемый индивидуум здоровым индивидуумом, путем измерения уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина в образце, взятом у указанного исследуемого индивидуума. Получение фракции общей РНК у здорового индивидуума может выполняться таким же образом, как описано на стадии 1) выше.
с) Стадия 3): Измерение уровня экспрессии гена человеческого белка окулоспанина во фракции общей РНК в соответствии со стадиями 1) и 2).
Уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина представлен уровнем экспрессии полинуклеотида, который может гибридизоваться с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, или полинуклеотида, содержащим нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, в жестких условиях.
Уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина может быть определен с помощью иммобилизованного образца, этот и другие способы описаны ниже.
(а) Анализ с использованием иммобилизованных проб
(i) Иммобилизованные пробы
Ниже приведены примеры иммобилизованных проб.
(i) Чипы генов
Может быть использован чип гена, на котором иммобилизован либо антисмысловой олигонуклеотид, который синтезирован на основе EST-последовательности (маркерной экспрессирующей последовательности) из базы данных, либо мРНК-последовательность. Примеры таких чипов генов включают в себя чипы генов, производимые Affymetrix (Lip Shutz, R.J. et al., Nature Genet. (1999), 21, supplement, 20-24), но не ограничиваются ими, и они могут быть получены любым известным способом. При анализе мРНК, полученной из клетки человека, предпочтительно используют чип генов, полученный из последовательностей человека. Например, могут быть использованы набор последовательностей человека U95 или набор U133, производимые Affymetrix. Однако подходящие чипы генов не ограничиваются ими, и может быть использован чип генов, например, из вида животного, родственного человеку.
ii) Матрицы или мембранные фильтры, на которых иммобилизованы кДНК или продукт ОТ-ПЦР, полученные из общей РНК человека или общей РНК, выделенной из специфической ткани человека.
кДНК или продукт ОТ-ПЦР может быть клоном, полученным в результате осуществления реакции обратной транскрипции и ПЦР с использованием праймера, полученного на основе последовательности из базы данных, например из базы данных EST человека. кДНК или продукт ОТ-ПЦР может быть выбран заранее с использованием способа вычитания (Diatchenki, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 6025-6030) или способом дифференциального дисплея (Liang, P., et al., Nucleic Acids Res., (1992) 23, 3685-3690), основанным на общей РНК, где уровень экспрессии различается между индивидуумом, имеющим опухоль, и индивидуумом, не имеющим опухоли. Матрица или фильтр может быть матрицей или фильтром, коммерчески доступным, таким как матрица или фильтры, предоставляемые IntelliGene (производимые Takara Bio). Альтернативно кДНК или продукт ОТ-ПЦР могут быть иммобилизованы с использованием коммерчески доступного устройства для нанесения пятен, такого как матрица GMS417 (производимая Takara Bio), для получения матрицы или фильтра.
(ii) Получение зонда и анализ
Всю экспрессируемую мРНК, а не конкретный клон мРНК, метят и используют в качестве меченого зонда. Неочищенная мРНК может быть использована в качестве исходного материала для получения зонда; однако используют предпочтительно поли(А+)-РНК, которая очищена приведенным выше способом. Способ получения меченого зонда и способ обнаружения и анализа указанного зонда с использованием различных типов иммобилизованной пробы описаны дополнительно следующим образом.
i) Чип генов, производимый Affymetrix
Меченный биотином кДНК-зонд получают в соответствии с протоколом (Affimetrix's Expression Analysis Technical Manual), прилагаемым к GeneChip, производимому Affymetrix. Затем выполняют гибридизацию и анализ для обнаружения и анализа света, испускаемого из адипиновой кислоты, с использованием анализатора Affimetrix (GeneChip Fluidics Station 400) в соответствии с протоколом (Expression Analysis Technical Manual), прилагаемым к GeneChip, производимому Affimetrix.
ii) Матрица
Для обнаружения кДНК метка должна быть присоединена к кДНК при ее получении из поли(А+)-РНК с использованием реакции обратной транскриптазы. Для получения флуоресцентно меченной кДНК в реакционную смесь может быть включен меченный флуоресцентным красителем d-ИТР, такой как Cy3 или Cy5. Если используемую в качестве контроля поли(А+)-РНК, полученную из клетки меланомы, и поли(А+)-РНК, полученную из клетки, метят разными красителями, то в смеси одновременно могут быть использованы оба типа поли(А+)-РНК. При использовании коммерчески доступной матрицы, например матрицы, поставляемой Takara Bio Co., Ltd., гибридизацию и промывку выполняют в соответствии с прилагаемым протоколом, затем флуоресцентный сигнал определяют с использованием детектора флуоресцентного сигнала (например, сканирующего устройства (сканера) для матрицы GMS418, производимой Takara Bio Co., Ltd.) и после этого анализируют. Выбор матрицы для описанного применения не ограничивается матрицами, которые являются коммерчески доступными. Могут быть использованные «самодельные» матрицы и матрицы, специально полученные в лаборатории.
iii) Мембранный фильтр
При получении кДНК из поли(А+)-РНК обратной транскрипцией меченый зонд может быть получен добавлением к реакционной смеси радиоактивного изотопа (например, d-CTP). Гибридизацию проводят общепринятыми способами. Более конкретно, гибридизация может быть осуществлена с использованием системы Atlas (производимой Clontech), которая является микроматрицей, полученной с использованием коммерчески доступного фильтра, после гибридизации микроматрицу промывают. Затем проводят обнаружение и анализ, используя анализатор (например, Atlas Image, производимого Clontech).
В любом из этих способов i)-iii) зонд, полученный из ткани человека, гибридизуют с иммобилизованными пробами той же самой партии. Используемый зонд может быть заряженным, но используемые условия гибридизации сохраняют одинаковыми. При использовании флуоресцентно меченных зондов, если зонды мечены различными флуоресцентными красителями, зонды разных типов могут быть добавлены одновременно в форме смеси и гибридизованы с иммобилизованными пробами. После этого интенсивность флуоресценции можно считывать одновременно (Brown, P.O. et al., Nature Genet., (1999) 21, supplement, p. 33-37).
(b) Другие способы измерений
Кроме вышеуказанных способов измерений, имеются субтракционные способы клонирования (см. Experimental Medicine, Supplementary Volume, New Genetic Engineering Handbook, published by Yodosha Co., Ltd. (1996), p. 32-35); способы дифференциального дисплея (Basic Biochemical Experimental Method 4, nucleic acid.gene experiment, II. Applied series, Tokyo Kagakudojin (2001), p125-128) и способы с использованием репортерного гена: хлорамфениколацетилтрансферазы (например, вектора pCAT3-Basic, производимого Promega), β-галактозидазы (например, вектора pβgal-Basic, производимого Promega), секретируемой щелочной фосфатазы (например, вектора pSEAP2-Basic, производимого Clontech) или зеленого флуоресцентного белка (например, вектора pEGFP-1, производимого Clontech). Однако выбор способа измерения не ограничивается этими способами.
Стадия 4): Анализ различия уровня экспрессии гена между фракциями общей РНК, полученными на стадиях 1) и 2), измеренного на стадии 3), и обнаружение рака у исследуемого индивидуума стадии 1).
Анализируют различие уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина между образцом, взятым у здорового индивидуума, и образцом, взятым у исследуемого индивидуума. Если образец показывает значительно высокий уровень экспрессии человеческого белка окулоспанина, это говорит о высокой вероятности наличия рака, в частности рака кожи, и, более конкретно, меланомы, то есть рак может быть обнаружен. Термин «значительно высокий уровень экспрессии» относится к случаю, когда анализ выполняют с использованием GeneChip (производимого Affimetrix) и микроматрицы Suite Ver. 3.0 (производимой Affimetrix), средняя величина различия гена, полученного из клетки меланомы, является значительно высокой по сравнению со средней величиной нормального меланоцита.
Альтернативно, измеряют уровень экспрессии человеческого белка окулоспанина и затем оценивают для определения, находится или нет измеренная величина концентрации в заранее определенном для здорового индивидуума диапазоне. Если эта величина превышает этот диапазон, то у индивидуума имеется рак. Таким образом, может быть диагностирован рак. В другом случае предварительно исследуют взаимосвязь между уровнем экспрессии гена человеческого белка окулоспанина и степенью образования рака у здорового индивидуума и затем измеряют уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина образца, взятого у исследуемого индивидуума. Этим способом также можно определить, является или нет исследуемый индивидуум здоровым индивидуумом.
(3) Способ обнаружения рака с использованием уровня экспрессии гена человеческого белка окулоспанина (уровня экспрессии белка).
Более конкретно способ обнаружения рака с использованием уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина может быть способом, включающим в себя нижеследующие стадии 1)-3):
1) измерение уровня экспрессии белка человеческого белка окулоспанина в образце, взятом у индивидуума;
2) измерение уровня экспрессии того же самого белка, что и описанный на стадии 1), в образце, взятом у здорового индивидуума, и
3) анализ различия между уровнем экспрессии белка, измеренным на стадиях 1) и 2), и обнаружения таким образом, что у индивидуума имеется рак.
Эти отдельные стадии описаны более подробно ниже:
а) измерение уровня экспрессии белка человеческого белка окулоспанина в образце, взятом у индивидуума.
(i) Получение пробы из образца для измерения белка.
Образец подвергают высокоскоростному центрифугированию, что необходимо для удаления нерастворимых веществ, и затем получают в виде пробы для ELISA/RIA и Вестерн-блота.
Для получения пробы для ELISA/RIA ткань кожи или лимфатического узла, взятые у индивидуума, используют непосредственно или разводят подходящим образом в буферном растворе перед использованием. Для Вестерн-блоттинга (электрофореза) раствор, экстрагированный из ткани кожи или лимфатического узла, может быть использован непосредственно в качестве пробы или разведен подходящим образом буферным раствором и смешан с буферным раствором для нанесения проб (производимым Sigma), содержащим 2-меркаптоэтанол, для электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле. Для дот- или слот-блоттинга раствор, экстрагированный из ткани кожи или лимфатического узла, может быть использован непосредственно в качестве пробы или разведен подходящим образом в буферном растворе, пробы непосредственно адсорбируют на мембрану с использованием устройства для блоттинга.
(b) Иммобилизация пробы
Белок в пробе, полученной таким образом, может быть специфически определен преципитацией белка с использованием такой процедуры, как иммунопреципитация или связывание лиганда, либо без дополнительной иммобилизации, либо после его прямой иммобилизации. Для иммобилизации белка используемой мембраной может быть такая мембрана, которую используют в Вестерн-блоттинге, дот-блоттинге или слот-блоттинге. Примеры таких мембран включают в себя нитроцеллюлозные мембраны (например, производимые BioRad), нейлоновые мембраны, такие как Hybond-ECL (производимые Amersham Pharmacia), хлопчатобумажные мембраны, такие как блот-абсорбентные фильтры (например, производимые BioRad) и мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) (например, производимые BioRad).
Для обнаружения количества белка с использованием метода ELISA или RIA пробу или разведенный раствор пробы (например, разведенный забуференым фосфатом солевым раствором (здесь и далее называемым «ЗФР»), содержащим 0,05% азид натрия) распределяют в 96-луночный планшет, такой как Immunoplate, Maxisorp (производимый Nunc), и инкубируют без перемешивания при температуре в диапазоне от 4°С до комнатной температуры в течение ночи или при 37°С в течение 1-3 часов, давая возможность белку адсорбироваться на поверхности дна лунок для иммобилизации белка.
Антитело против человеческого белка окулоспанина может быть получено обычным способом (см., например, New Biochemical Experimental Course 1, Protein 1, p. 389-397, 1992), который предусматривает иммунизацию животного человеческим белком окулоспанина или полипептидом, произвольно выбранным из аминокислотных последовательностей человеческого белка окулоспанина, с выделением антитела, продуцированного в организме, и его очисткой. Альтернативно моноклональное антитело может быть получено в соответствии со способом, хорошо известным в данной области (например, Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody, p. 365-367, 1980, Plenum Press, N.Y.), который предусматривает слияние антитело-продуцирующей клетки, продуцирующей антитело против человеческого белка окулоспанина, с клеткой миеломы для образования гибридомной клетки.
Белок человеческого белка окулоспанина для использования в качестве антигена может быть получен введением гена человеческого белка окулоспанина в клетку-хозяина генной манипуляцией. Для более конкретного объяснения, белок человеческого белка окулоспанина может быть получен получением вектора, способного экспрессировать ген человеческого белка окулоспанина, введением этого вектора в клетку-хозяина, экспрессией гена и очисткой экспрессированного белка человеческого белка окулоспанина.
(с) Измерение уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина.
Уровень экспрессии человеческого белка окулоспанина может быть представлен уровнем экспрессии белка, содержащего аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2 из списка последовательностей.
Уровень экспрессии может быть измерен методом, известным в данной области, таким как Вестерн-блоттинг или дот/слот-блоттинг, с использованием антитела против человеческого белка окулоспанина.
b) Стадия 2: Измерение уровня экспрессии того же самого белка, как описано на стадии 1, в образце, взятом у здорового индивидуума.
Измерение уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина в образце, взятом из здорового человека, может быть выполнено таким же образом, как описано на стадии 1) выше.
с) Стадия 3: Анализ различия между уровнем экспрессии белка, измеренным на стадиях 1) и 2), и обнаружение таким образом, что у индивидуума имеется рак.
Анализируют различие уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина между образцами, взятыми у здорового индивидуума и исследуемого индивидуума. В результате, если образец обнаруживает значительно высокий уровень экспрессии человеческого белка окулоспанина, может быть определено, что имеется высокая вероятность, что у индивидуума имеется рак, в частности рак кожи, и более конкретно меланома. Таким образом, может быть обнаружен рак.
Альтернативно рак может быть обнаружен измерением концентрации человеческого белка окулоспанина и анализом, находится или нет измеренная величина концентрации в заранее определенном для здорового индивидуума диапазоне. В этом случае, если величина концентрации у индивидуума превышает диапазон, определенный для здорового индивидуума, то это указывает на то, что у индивидуума имеется рак. Кроме того, исследованием взаимосвязи между уровнем экспрессии человеческого белка окулоспанина и степенью образования рака у здорового индивидуума можно определить, является или нет индивидуум здоровым, на основании уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина в образце, взятом у этого индивидуума.
3. Исследование гена человеческого белка окулоспанина и человеческого белка окулоспанина
Ген человеческого белка окулоспанина и человеческий белок окулоспанина экспрессируются на значительно высоком уровне в меланоцитах в нормальных тканях человека, и они экспрессируются на значительно более высоком уровне в меланоме, чем в нормальных меланоцитах.
В способе испытания функции человеческого белка окулоспанина сначала отбирают полноразмерную кДНК из библиотеки кДНК человека, полученной из клеток, экспрессирующих человеческий белок окулоспанина, при помощи известного способа, такого как способ гибридизации колоний. Затем эту полноразмерную кДНК вводят в клетку мыши или человека, проводят в ней высокую экспрессию и проводят оценку для исследования, влияет или нет эта кДНК на клетку.
Для экспрессии кДНК у животного может быть использован способ, в котором полученную кДНК вводят в вирусный вектор и этот вектор вводят животному. Примеры трансфекции генов с использованием вирусного вектора включают в себя способы введения кДНК интеграцией ее в ДНК-вирус или РНК-вирус, такой как ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса, вирус коровьей оспы, поксвирус или полиовирус. Из них предпочтительными являются способы с использованием ретровируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса и вируса коровьей оспы.
Примеры невирусной трансфекции генов включают в себя введение экспрессионной плазмиды непосредственно в мышцу (ДНК-вакцинация), обработку липосомами, липофекцию, микроинъекцию, калий-фосфатную обработку, электропорацию и т.п. Из них предпочтительными являются ДНК-вакцинация и обработка липосомами.
Кроме того, трансфекцией полноразмерной кДНК в культивируемые клетки, такие как мышечные клетки, клетки печени или жировые клетки, полученные у человека, мыши или крысы; или в эмбриональные мышечные клетки, клетки печени, жировые клетки или клетки кожи, и экспрессией в них кДНК на высоком уровне можно испытать функции клетки-мишени, более конкретно продуцирование и поглощение сахаров и липидов, регуляцию метаболизма гликолипидов, такую как накопление гликогена, или увидеть, имеется ли какое-либо действие на морфологию клетки. Напротив, введением в клетку антисмысловой нуклеиновой кислоты к мРНК подлежащего испытанию гена можно исследовать действия, оказываемые на функцию и морфологию клетки-мишени.
Для введения полноразмерной кДНК в животное или клетку кДНК интегрируют в вектор, содержащий подходящие промоторные последовательности, и осуществляют трансформацию для трансформации клетки-хозяина этим вектором. Экспрессионный вектор для использования с клеткой позвоночного животного может иметь промотор, который обычно локализован слева от подлежащего экспрессии гена, сайт сплайсинга РНК, сайт полиаденилирования, сайт терминации транскрипции и т.д. Кроме того, если необходимо, может присутствовать сайт инициации репликации. Примеры такого экспрессионного вектора включают в себя, но не ограничиваются ими, pSV2dhfr, имеющий ранний промотор вируса 40 обезьяны (SV40) (Subramani, S. et al., Mol. Cell Biol. (1981), 1, p854-864), ретровирусные векторы pLNCX, pLNSX, pLXIN, pSIR (производимые Clontech) и космидный вектор pAxCw (производимый Takara Bio). Эти экспрессионные векторы могут быть интегрированы в клетку обезьяны, такую как клетка COS (Gluzman, Y. Cell (1981), 23, p. 175-182, ATCC: CRL-1650), линия, дефектная в отношении редуктазы дигидрофолиевой кислоты (Urlaub, G. and Chasin, L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980), 77, p. 4126-4220), клеток яичника китайского хомячка (клетка СНО, АТСС: CCL-61), клеток 293 эмбриональной почки человека (ATCC: CRL-1573) и т.п., способами, включающими в себя диэтиламиноэтил(DEAE)-декстрановый способ (Luthman, H. and Magnusson, G., Nucleic Acids Res. (1983), 11, p. 1295-1308), способ копреципитации фосфата кальция-ДНК (Graham, F.L. and van der Eb, A. J. Virology (1973), 52, p. 456-457) и способ электропорации (Neumann, E. et al., EMBO J. (1982), 1, p. 841-845). Однако способ интеграции и клетка не ограничиваются этими конкретно описанными способами и клетками. Таким образом, может быть получен желаемый трансформант.
Кроме того, с использованием манипуляции генами в здоровом животном может быть получено трансгенное животное, которое экспрессирует на высоком уровне желаемый ген. Это может быть использовано для испытания действия на морфологию клеток. Альтернативно может быть исследовано состояние клеток путем получения животного с нокаутом посредством нокаута гена-мишени в животном, имеющем меланому.
4. Набор для обнаружения гена человеческого белка окулоспанина и/или человеческого белка окулоспанина
Ген человеческого белка окулоспанина и/или человеческий белок окулоспанина может быть определен с использованием набора, содержащего по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из материалов 1)-5) ниже.
1) олигонуклеотидного праймера, имеющего непрерывную последовательность с длиной 15-30 оснований для специфической амплификации полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 из списка последовательностей;
2) полинуклеотидного зонда, имеющего непрерывную последовательность с длиной не менее 15 нуклеотидов, способного гибридизоваться с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, в жестких условиях, позволяющего таким образом определять этот полинуклеотид;
3) иммобилизованного образца, с которым может быть гибридизован полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 из списка последовательностей;
4) антитела, которое специфически связывается с белком, содержащим аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2 из списка последовательностей, позволяющего таким образом определять этот белок;
5) вторичного антитела, способного связываться с антителом по пункту 4) выше.
Праймер по пункту 10 выше может быть легко сконструирован на основе нуклеотидной последовательности гена человеческого белка окулоспанина (нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:1 из списка последовательностей) обычным способом, например, способом с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для конструирования праймеров (например, Wisconsin GCG packageVersion 10.2), и подвергнут амплификации. В качестве примера такого праймера, более конкретно, праймера для амплификации полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, может быть использована комбинация олигонуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:5 из списка последовательностей, и олигонуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:6 из списка последовательностей. Зонд по пункту 2) выше является полинуклеотидом, способным гибридизоваться специфически с геном человеческого белка окулоспанина и имеющим длину 100-1500 оснований, предпочтительно длину 300-600 оснований. Эти праймеры и зонды могут быть помечены подходящей меткой (например, ферментной меткой, радиоактивной меткой или флуоресцентной меткой) или могут иметь присоединенный к ним линкер.
Иммобилизованный образец по пункту 3) выше может быть получен иммобилизацией зонда по пункту 2) на твердую фазу, такую как стеклянная пластина, найлоновая мембрана или т.п. Способ получения иммобилизованного образца описан в разделе "2. Способ обнаружения рака", параграф "(1) Способ обнаружения рака с использованием уровня экспрессии гена человеческого белка окулоспанина, подпараграф "(1) Способ использования иммобилизованного образца". Примеры иммобилизованных образцов включают в себя чипы генов, матрицу кДНК, олиго-матрицу и мембранные фильтры.
Набор в соответствии с настоящим изобретением может содержать термостабильную ДНК-полимеразу, dNTP (смесь dATP, dCTP, dGTP и dTTP) и буферный раствор. Примеры термостабильных ДНК-полимераз включают в себя ДНК-полимеразу Taq, ДНК-полимеразу LA Taq (производимую Takara Shuzo Co. Ltd.), ДНК-полимеразу Tth и ДНК-полимеразу Pfu. Тип буферного раствора может быть выбран в соответствии с ДНК-полимеразой, которая должна использоваться, и может быть добавлен Mg2+, по мере необходимости.
Антитела по пункту 4) и 5) выше могут быть получены способом, описанным в разделе «2. Способ обнаружения рака", параграф "(3) Способ обнаружения рака с использованием уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина (уровня экспрессии белка)", или способом, описанным в разделе "5. Получение антитела против человеческого белка окулоспанина". Антитело может быть помечено подходящей меткой (например, ферментной меткой, радиоактивной меткой или флуоресцентной меткой).
Набор настоящего изобретения может быть использован для обнаружения гена человеческого белка окулоспанина и/или белка человеческого белка окулоспанина, определяя таким образом наличие или отсутствие рака, и скрининга на вещество, способное подавлять рост рака.
5. Получение антитела против человеческого белка окулоспанина
(1) Получение антигена.
Антиген для получения антитела против человеческого белка окулоспанина может быть полипептидом, содержащим человеческий белок окулоспанина, его частичной аминокислотной последовательностью, имеющей часть и непрерывную аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере 6 оснований, или его производными, имеющими произвольную аминокислотную последовательность или носитель, присоединенные к ним.
Белок человеческого белка окулоспанина может быть очищен непосредственно из тканей или клеток опухоли человека, синтезирован in vitro или получен в клетках-хозяевах генной манипуляцией. Более конкретно в получении человеческого белка окулоспанина генной манипуляцией ген человеческого белка окулоспанина интегрируют в экспрессионный вектор и затем человеческий белок окулоспанина синтезируют в растворе, содержащем ферменты, субстраты и энергетические вещества, необходимые для его транскрипции и трансляции. Альтернативно прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин может быть трансформирована этим экспрессионным вектором и затем может быть выделен человеческий белок окулоспанина. Нуклеотидная последовательность кДНК человеческого белка окулоспанина описана: Graeme Wistow, Steven L. Bernstein, M. Keith Wyatt, Robert N. Farris, Amita Behal, Jeggry W. Touchman, Gerard Bouffard, Don Smith and Katherine Peterson (2002), Expressed sequence tag analysis of human RPE/choroids for the NEIBank Project: Over 6000 non-redundant transcripts, novel genes and splice variants, Molecular Vision 8:205-220, и зарегистрирована в GenBank под номером Accession No. NM_031945. ORF этой кДНК показана в SEQ ID NO:1 из списка последовательностей. кДНК человеческого белка окулоспанина может быть получена из библиотеки кДНК, экспрессирующей человеческий белок окулоспанина, с использованием праймера для специфической амплификации кДНК человеческого белка окулоспанина из этой библиотеки кДНК в виде матрицы посредством полимеразной цепной реакции (здесь и далее называемой "ПЦР" (см. Saiki, R.K., et al., (1988), Science 239, 487-49), называемой «способом ПЦР».
Синтез in vitro полипептида может быть выполнен с использованием, например, системы быстрой трансляции (RTS), производимой Roche Diagnostics; однако подходящие способы синтеза не ограничиваются этим конкретным способом. В случае RTS желаемый ген клонируют в экспрессионный вектор при регулировании промотором Т7 и экспрессионный вектор добавляют в реакционную систему in vitro. Затем мРНК сначала транскрибируют из ДНК-матрицы РНК-полимеразой Т7, а затем выполняют трансляцию рибосомами в растворе, содержащем лизат Escherichia coli. Таким образом может быть синтезирован полипептид-мишень в реакционном растворе (Biochemica, 1, 20-23 (2001), Biochemica, 2, 28-29 (2001)).
Примеры подходящих прокариотических хозяев включают в себя Escherichia coli и Bacillus subtilis. Для трансформации желаемого гена в клетки-хозяева указанные клетки-хозяева трансформируют плазмидным вектором, полученным из вида, совместимого с хозяином, и содержащим репликон, т.е. точку инициации репликации и регуляторную последовательность. Кроме того, предпочтительно, чтобы вектор имел последовательность, способную придавать селектируемый фенотип трансформируемой клетке.
В качестве клетки-хозяина может быть использован штамм Escherichia coli, например штамм К12, и плазмиды серии pBR322 и pUS обычно могут быть использованы в качестве векторов. Однако выбор клетки-хозяина и вектора не ограничивается ими и может быть использован любой подходящий известный штамм и вектор.
Промоторы, пригодные для использования Escherichia coli, включают в себя промотор триптофана (trp), промотор лактозы (lac), промотор триптофана-лактозы (tac), промотор липопротеина (lpp) и промотор фактора удлинения полипептидной цепи Tu (tufB) и т.п. Любой из этих промоторов может быть использован для получения желаемого полипептида.
В качестве клетки-хозяина может быть использован штамм Bacillus subtilis, например предпочтительным является штамм 207-25. Может быть использован вектор pTUB 228 (Ohmura, K. et al., (1984), J. Biochem. 95, 87-93); однако выбор хозяина Bacillus subtilis и вектора не ограничивается этой конкретной комбинацией. Путем присоединения ДНК-последовательности, кодирующей последовательность сигнального пептида для α-амилазы Bacillus subtilis, представляющий интерес белок может быть экспрессирован и секретирован из клетки.
Примеры эукариотических клеток включают в себя клетки позвоночных, насекомых и дрожжей. Примеры клеток позвоночных включают в себя, но не ограничиваются ими, клетку обезьяны, клетку COS (Gluzman, Y. (1981), Cell 23, 175-182, (ATCC CRL-1650)), фибробластную клетку мыши NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) и дефектный в отношении редуктазы дигидрофолиевой кислоты штамм (Urlaub, G. and Chasin, L.A. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220) клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО, (ATCC CCL-61)).
Экспрессирующим вектором для применения с клеткой позвоночного животного может быть клетка, имеющая промотор, локализованный слева от экспрессируемого гена, сайт сплайсинга РНК, сайт полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции. Кроме того, может присутствовать сайт инициации репликации. Примеры подходящих экспрессирующих векторов включают в себя, но не ограничиваются ими, pCDNA3.1 (производимый Invitrogen), имеющий ранний промотор цитомегаловируса, и pSV2dhfr (Subramani, S. et al., (1981), Mol. Cell. Biol. 1, 854-864), имеющий ранний промотор SV40.
При использовании клетки COS или клетки NIH3T3 в качестве клетки-хозяина подходящие экспрессирующие векторы имеют сайт инициации репликации SV40, способный самопролиферироваться в клетке COS или клетке NIH3T3, и дополнительно могут иметь промотор транскрипции, сигнал терминации транскрипции и сайт сплайсинга РНК. Экспрессирующий вектор может быть интегрирован в клетку COS или клетку NIH3T3 обработкой DEAE-декстраном (Luthman, H and Magnusson, G. (1983), Nucleic Acids Res. 11, p.1295-1308), копреципитацией фосфата кальция-ДНК (Graham, F.L. and van der Eb, A.J. (1973), Virology, 52, p.456-457), электропорацией (Neuman, E. et al., (1982), EMBO J. 1, p.841-845) или другими способами. Таким образом, может быть получена желаемая клетка-трансформант. Кроме того, при использовании в качестве клетки-хозяина клетки COS, если вектор способен экспрессировать ген neo, функционирующий в качестве маркера устойчивости к антибиотику G418, например, pRSVneo (Sambrook, J. et al., (1989): Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY) или pSVneo (Southern, P.J., and Berg, P (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341), котрансфицируют с экспрессирующим вектором и затем отбирают устойчивую к G418 колонию, может быть получена трансформированная клетка, стабильно продуцирующая желаемый полипептид.
Трансформант, полученный, как описано выше, может культивироваться в соответствии с обычным способом получения желаемого полипептида, экспрессируемого внутри клетки или секретируемого из клетки наружу и, следовательно, присутствующего в культуральной среде. В качестве культуральной среды могут быть выбраны различные типы обычно используемых сред в подходящей зависимости от типа используемой клетки-хозяина. Более конкретно для клеток COS может быть использована среда RPMI 1640 или модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (здесь и далее называемая «DMEM»). Если необходимо, в эту среду могут быть добавлены сывороточные компоненты, например фетальная телячья сыворотка.
Рекомбинантный белок, продуцируемый в клетке или секретированный наружу из клетки-трансформанта и присутствующий в культуральной среде, может быть выделен и очищен различными известными методами выделения на основе физических свойств и химических свойств белка. Примеры таких методов выделения включают в себя обработку обычным агентом преципитации белков, ультрафильтрацию, хроматографию с использованием молекулярных сит (гель-фильтрацию), адсорбционную хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, различные типы жидкостных хроматографических методов, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), диализ и комбинации этих способов. Если метка гекса-His слита с рекомбинантным белком, который экспрессируется, рекомбинантный белок может быть эффективно очищен с использованием никель-аффинной колонки. Если приведенные выше способы используют в комбинации, может быть получено большое количество желаемого полипептида с высокой чистотой и с высоким выходом.
(2) Получение моноклонального антитела против человеческого белка окулоспанина
Примером антитела, которое специфически связывается с человеческим белком окулоспанина, является моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим белком окулоспанина. Способом, подходящим для получения такого моноклонального антитела, является следующий:
Для получения моноклонального антитела обязательные необходимые стадии включают в себя:
(а) очистку биомакромолекулы, которая должна быть использована в качестве антигена;
(b) иммунизацию животного инъекцией указанного антигена в животное, взятие пробы крови и определение титра антитела для определения временной точки, в которой должна вырезаться селезенка, и получение продуцирующих антитело клеток;
(с) получение клеток костной миеломы (здесь и далее называемых «миеломой»);
(d) слияние продуцирующих антитело клеток и миеломы;
(е) отбор гибридом, продуцирующих желаемое антитело;
(f) расщепление (клонирование) их в клоны отдельных клеток;
(g) необязательно культивирование гибридомы для получения большого количества моноклональных антител или выращивание животного, имеющего трансплантированную в него гибридому; и
(h) анализ физиологической активности и специфичности связывания полученного таким образом моноклонального антитела или характеристик моноклонального антитела в качестве агента мечения.
Способ получения моноклонального антитела описан более подробно ниже в соответствии с вышеуказанными стадиями. Однако способы получения моноклонального антитела не ограничиваются описанным способом. Например, продуцирующая антитело клетка может быть другой, чем клетка селезенки и миелома.
(а) Очистка антигена
В качестве антигена может быть использован белок человеческого белка окулоспанина, полученный в соответствии с вышеуказанным способом, или его часть (фрагмент). Альтернативно используемым антигеном может быть мембранная фракция, полученная из рекомбинантной клетки, экспрессирующей человеческий белок окулоспанина, или рекомбинантная клетка, экспрессирующая человеческий белок окулоспанина, или химически синтезированный пептидный фрагмент белка в соответствии с настоящим изобретением, полученный способом, известным специалисту в данной области.
(b) Получение продуцирующей антитело клетки
Антиген, полученный на стадии (а), смешивают с полным или неполным адъювантом Фрейнда или таким вспомогательным агентом, как сульфат калия-алюминия. Полученную смесь используют в качестве иммуногена и инъецируют в животное. Подходящим экспериментальным животным может быть животное, о котором известно, что оно пригодно для применения в способе получения гибридом. Конкретные примеры таких животных включают в себя мышей, крыс, коз, овец, коров и лошадей. Однако ввиду доступности клеток миеломы, которые должны быть слиты с продуцирующими антитело клетками, взятыми у указанного животного, мыши и крысы, являются предпочтительными в качестве подлежащих иммунизации животных. Выбор линий мышей или крыс, используемых на практике, не является особо ограниченным. Примеры подходящих мышиных линий включают в себя А, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BR, C57L, DBA, FL, HTH, HTI, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB и 129. Примеры крысиных линий включают в себя Low, Lewis, Spraque, Dawley, ACI, BN и Fischer. Эти мыши и крысы доступны от выращивающих экспериментальных животных фирм-поставщиков, таких как Clea Japan Inc., Charles River Japan Inc., Japan SLC Inc. и The Jackson Laboratories. Ввиду совместимости слияния с клетками миеломы, обсуждаемой ниже, особенно предпочтительными в качестве иммунизируемого животного являются "BALB/c" в качестве мышиной линии и "Low" в качестве крысиной линии. Вследствие гомологии антигена между человеком и мышью предпочтительно используют мышь, имеющую уменьшенную биологическую функцию в отношении удаления аутоантитела, другими словами, мышь, страдающую от аутоиммунного заболевания. Следует обратить внимание на то, что мышь или крыса, которая должна быть иммунизирована, предпочтительно должна иметь возраст 5-12 недель, более предпочтительно 6-8 недель.
Животное может быть иммунизировано человеческим белком окулоспанина или его рекомбинантно полученной версией известными способами, например, такими, как конкретно описано Weir, D.M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E.A. and Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Tomas Publisher Springfield Illinois (1964) и т.д. Из указанных способов иммунизации предпочтительно используемым в настоящем изобретении является, например, способ, выполняемый следующим образом. Сначала антиген, т.е. мембранную белковую фракцию, или клетку, экспрессирующую антиген, инъецируют в животное интрадермально или внутрибрюшинно. Для улучшения эффективности иммунизации могут использоваться одновременно оба способа инъекции. Более конкретно при выполнении интрадермальной инъекции в первой половине инъекций и внутрибрюшинной инъекции во второй половине инъекций или только в последней временной точке эффективность иммунизации может быть особенно увеличена. Схема введения антигена различается в зависимости от типа и индивидуальных различий и т.д. организма животного, которое должно быть иммунизировано. Однако предпочтительно антиген инъецируют 3-6 раз с интервалами 2-6 недель и более предпочтительно 3-4 раза с интервалами 2-4 недели. Предпочтительно избыточно не увеличивать число введений, так как антиген может быть затрачен напрасно. Предпочтительно также излишне не увеличивать продолжительность интервала введения, так как активность клеток уменьшается из-за старения животного. Доза антигена варьируется в зависимости от типа и индивидуальных различий и т.д. организма животного; однако эта доза обычно находится в диапазоне приблизительно от 0,05 до 5 мл, предпочтительно приблизительно 0,1-0,5 мл. Бустер-иммунизацию выполняют спустя 1-6 недель после введения антигена, предпочтительно спустя 2-4 недели, более предпочтительно спустя 2-3 недели. Если бустер-иммунизация выполняется спустя более чем 6 недель или в пределах 1 недели, такая бустер-иммунизация будет менее эффективной. Следует обратить внимание на то, что доза антигена, вводимого в качестве бустер-иммунизации, зависит от типа и размера тела животного; однако, например, для мышей она обычно составляет диапазон приблизительно от 0,05 до 5 мл, предпочтительно приблизительно 0,1-0,5 мл и более предпочтительно приблизительно 0,1-0,2 мл. Предпочтительно не вводить излишне большое количество антигена, так как после этого эффект иммунизации снижается, и это является неблагоприятным для иммунизируемого животного.
Спустя 1-10 дней, предпочтительно 2-5 дней, более предпочтительно 2-3 дня после бустер-иммунизации клетки селезенки или лимфоциты, содержащие продуцирующие антитело клетки, удаляют из иммунизированного животного в асептических условиях. В это время определяют титр антитела. Если животное, имеющее достаточно высокий титр антитела, используют в качестве источника восполнения продуцирующих антитело клеток, эффективность следующих операций может быть повышена. В качестве используемого метода определения титра антитела, подходящими являются различные типы известных методик, такие как методы RIA, методы ELISA, методы с использованием флуоресцентных антител и методы реакции пассивной агглютинации клеток крови. Ввиду чувствительности, скорости, точности и возможности автоматического проведения обнаружения, предпочтительными являются методы RIA и методы ELISA.
Определение титра антитела в соответствии с настоящим изобретением может быть выполнено методом ELISA следующим образом. Сначала очищенный или частично очищенный антиген адсорбируют на твердую поверхность, например на 96-луночный планшет для ELISA. Затем твердую поверхность, не имеющую адсорбированного на ней антигена, покрывают белком, не родственным в отношении этого антигена, таким как бычий сывороточный альбумин (здесь и далее называемый "БСА"). После промывки указанную поверхность контактируют с серийно разведенной пробой (например, сывороткой мыши), служащей в качестве первичного антитела, позволяя, таким образом, моноклональному антителу, содержащемуся в пробе, связываться с антигеном. Кроме того, к мышиному антителу добавляют вторичное антитело, т.е. меченное ферментом антитело против мышиного антитела. После промывки полученного комплекса добавляют субстрат для указанного фермента и измеряют изменение оптической плотности, которое имеет место вследствие изменения окраски, индуцированного деградацией субстрата, для расчета титра антитела.
Продуцирующие антитело клетки отделяют от клеток селезенки или лимфоцитов в соответствии с известными методами (например, описанными Kohler et al., Nature, 256, 495, 1975; Kohler et al., Eur. J. Immunol., 6, 511, 1977; Milstein et al., Nature, 266, 550, 1977; Walsh, Nature, 266, 495, 1977). Более конкретно в случае клеток селезенки продуцирующие антитело клетки могут быть отделены обычным способом, который предусматривает гомогенизацию ткани, фильтрование гомогенизированного материала через сито из нержавеющей стали и суспендирование полученных клеток в минимальной эссенциальной среде Игла (МЕМ).
(с) Получение клеток костной миеломы (здесь и далее называемой «миеломой»)
Выбор клеток миеломы, которые должны использоваться для слияния клеток, особо не ограничивается, и подходящие клетки могут быть выбраны из известных клеточных линий. Для удобства при отборе гибридомы из слитых клеток предпочтительно использовать дефектную в отношении HGPRT (гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы) линию, методика отбора для которой была установлена. Более конкретно примеры HGPRT-дефектных линий включают в себя X63-Ag8(Х63), NSI-Ag4/1(NS1), P3X63-Ag8.U1 (P2U1), X63-Ag8. 653 (Х63. 653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), F0, S149/5XXO и BU.1, полученные из мышей, 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3), полученную из крысы, и U266AR(ZKO-007), GM1500.GTG-AR(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-Hmy2(Hmy2) и 8226AR/NIP4-1(NP41), полученную из человека. Эти HGPRT-дефектные линии доступны из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС) и т.д.
Эти линии субклонируют в подходящей среде, такой как среда с 8-азагуанином [RPMI 1640, дополненная глутамином, 2-меркаптоэтанолом, гентамицином и фетальной телячьей сывороткой (здесь и далее называемой «ФТС»), и, кроме того, к ней добавлен 8-азагуанин]; модифицированная по способу Исков среда Дульбекко (здесь и далее называемая "IMDM") или модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (здесь и далее называемая "DMEM"). I В этом случае за 3-4 дня перед выполнением операции слияния указанные клетки переносят в нормальную среду [например, среду ASF104 (производимую Ajinomoto Co. Inc.), содержащую 10% ФТС] и субкультивируют в ней с получением не менее чем 2×107 клеток ко дню слияния.
(d) Слияние клеток
Слияние между продуцирующими антитело клетками и миеломными клетками предпочтительно выполняют в соответствии с известными способами (включающими: Weir, D.M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E.A. and Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Tomas Publisher Springfield Illinois (1964) в таких условиях, в которых избыточно не уменьшается выживаемость клеток. Примеры таких способов включают в себя химические способы, в которых продуцирующие антитело клетки и миеломные клетки смешивают в растворе полимера высокой концентрации, например полиэтиленгликоля; и физические способы, использующие электрическую стимуляцию. Из этих способов химический способ будет объяснен конкретно следующим образом. При использовании полиэтиленгликоля в качестве раствора полимера высокой концентрации продуцирующие антитело клетки и миеломные клетки смешивают в растворе полиэтиленгликоля, имеющего молекулярную массу 1500-6000, более предпочтительно 2000-4000, при температуре 30-40°С, предпочтительно 35-38°С, в течение 1-10 минут, более предпочтительно в течение 5-8 минут.
(е) Отбор популяций гибридом
Способ отбора гибридом, полученных слиянием клеток, особо не ограничивается. Обычно используют метод отбора НАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) [Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975); Milstein et al., Nature 266, 556 (1977)]. Он является эффективным способом, в котором гибридому получают с использованием миеломных клеток и HGPRT-дефектной линии, не способной выживать в присутствии аминоптерина. Более конкретно посредством культивирования неслитых клеток и гибридом в среде НАТ отбирают только гибридому, имеющую устойчивость к аминоптерину, и дают ей возможность сохраняться и пролиферировать.
(f) Расщепление до клона единственной клетки (клонирование)
В качестве способа клонирования для гибридомы могут быть использованы известные способы, такие как метилцеллюлозный способ, способ с использованием мягкой агарозы или способ лимитирующего разведения [см., например, Barbara, B.M. and Stanley, M.S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Company, San Francisco (1980)]. Примеры способа клонирования включают в себя способ лимитирующего разведения, в котором гибридомные клетки разводят таким образом, что они содержат единственную гибридомную клетку на лунку планшета, и культивируют; способ с использованием мягкой агарозы, в котором гибридомные клетки культивируют в среде с мягкой агарозой и колонии извлекают; способ методом взятия индивидуальных гибридомных клеток при помощи микроманипулятора и их культивирование; и так называемый «способ клонирования с использованием сортера», в котором гибридомные клетки отделяют одну от другой при помощи клеточного сортера. Из приведенных способов предпочтительным является способ лимитирующего разведения. В указанном способе высевают линию фибробластных клеток, полученную из плода крысы, или клетки-фидеры, такие как клетки селезенки здоровой мыши, клетки вилочковой железы или асцитные клетки. Гибридомные клетки разводят в среде с получением коэффициента разведения 0,2-0,5 клеток на 0,2 мл. Разведенный раствор гибридомной суспензии переносят в лунки с получением 0,1 мл на лунку и непрерывно культивируют в течение приблизительно 2 недель, заменяя приблизительно 1/3 среды свежей средой при заданных временных интервалах (например, каждые 3 дня). Таким образом могут быть пролиферированы гибридомные клоны.
Гибридомные клетки в лунке, для которой был подтвержден титр антитела, подвергают повторному клонированию по способу лимитирующего разведения, 2-4 раза. Гибридомные клетки с титром антитела, который, как подтверждается, является стабильным, отбирают в качестве гибридомных линий, продуцирующих моноклональное антитело против человеческого белка окулоспанина. Одна из клонированных гибридомных линий, полученных таким образом, обозначена как "03B8-2C9-4F3", и она депонирована в Международном депозитарии патентных организмов Национального института передовых технологий и прикладной науки (расположенном в Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) 17 февраля 2004 года под номером депозита FERM ВР-08627.
(g) Получение моноклонального антитела культивированием гибридомных клеток
Отобранные таким образом гибридомные клетки культивируют Для эффективного получения моноклонального антитела. Однако перед культивированием желательно, чтобы гибридомные клетки, продуцирующие желаемое моноклональне антитело, были подвергнуты скринингу. Скрининг выполняют с использованием известного способа.
Определение титра антитела может выполняться в настоящем изобретении, например, при помощи метода ELISA в соответствии со следующей методикой. Сначала очищенный или частично очищенный человеческий белок окулоспанина или клетки, экспрессирующие человеческий белок окулоспанина, адсорбируют на твердую поверхность 96-луночного планшета для ELISA. Затем твердую поверхность, не имеющую адсорбированного на ней антигена, покрывают белком, не родственным в отношении указанного антигена, таким как бычий сывороточный альбумин (здесь и далее называемый "БСА"). После промывки указанную поверхность контактируют с серийно разведенной пробой (например, сывороткой мыши), служащей в качестве первичного антитела, давая, таким образом, моноклональному антителу, содержащемуся в пробе, связываться с антигеном. Кроме того, к мышиному антителу добавляют антитело против мышиного антитела, меченное ферментом, служащее в качестве вторичного антитела. После промывки полученного комплекса добавляют субстрат для указанного фермента и измеряют изменение оптической плотности, которое имеет место вследствие изменения окраски, индуцированного деградацией субстрата, для расчета титра антитела. Таким образом рассчитывают титр антитела. Следует обратить внимание на то, что такая операция скрининга может выполняться после клонирования или перед клонированием гибридомной клетки, приведенном выше.
Гибридома, полученная приведенным выше способом, может храниться в замороженном состоянии в жидком азоте или в морозильнике при -80°С или ниже.
После завершения клонирования гибридому переносят из среды НАТ в обычную среду и культивируют. Крупномасштабное культивирование выполняют с использованием ротационной культуры с применением большой культуральной бутыли или с использованием непрерывно вращаемой культуры. Супернатант, полученный из крупномасштабной культуры, очищают методом, известным специалистам в данной области, таким как гель-фильтрация, с получением моноклонального антитела, которое специфически связывается с белком настоящего изобретения. Гибридома может быть инъецирована в брюшную полость мыши той же самой линии, из которой получена гибридома (например, BALB/c), или мыши Nu/Nu для пролиферации гибридомы. Таким образом может быть получена асцитная жидкость, содержащая большое количество моноклонального антитела в соответствии с настоящим изобретением. При инъекции гибридомных клеток в брюшную полость, если предварительно (за 3-7 дней до этого) было введено минеральное масло, такое как 2,6,10,14-тетраметилпентадекан (пристин), асцитная жидкость может быть получена в большем количестве. Для более конкретного объяснения, иммуносупрессивный агент инъецируют предварительно в брюшную полость мыши той же самой линии, из которой получена гибридома. Спустя двадцать дней после инактивации Т-клеток 106-107 клеток гибридомного клона суспендируют в бессывороточной среде (0,5 мл) и полученную суспензию инъецируют в брюшную полость. После растяжения брюшной полости и наполнения асцитной жидкостью указанную асцитную жидкость извлекают. На основании приведенного способ может быть получено моноклональное антитело в концентрации, в 100 раз более высокой, чем концентрация в культуральной среде.
Моноклональное антитело, полученное приведенным выше способом, может быть очищено способами, описанными, например, Weir, D.M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III,Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978). Более конкретно, примеры таких способов включают в себя методы преципитации сульфатом аммония, гель-фильтрационные методы, методы ионообменной хроматографии и аффинной хроматографии. Из них метод преципитации сульфатом аммония, если его повторяют 3-4 раза, предпочтительно 3-6 раз, успешно очищает моноклональное антитело. Однако при этом методе выход очищенного моноклонального антитела является чрезвычайно низким. Таким образом, моноклональне антитело грубо очищают методом преципитации сульфатом аммония один или два раза, а затем подвергают по меньшей мере одному методу и предпочтительно двум методам, выбранным из гель-фильтрации, ионообменной хроматографии и аффинной хроматографии или т.п. Таким путем может быть получено высокоочищенное моноклональное антитело с высоким выходом. Метод преципитации сульфатом аммония может выполняться в следующей комбинации и в следующей последовательности: а) метод преципитации сульфатом аммония - метод ионообменной хроматографии - гель-фильтрационный метод; b) метод преципитации сульфатом аммония - метод ионообменной хроматографии - метод аффинной хроматографии; и с) метод преципитации сульфатом аммония - гель-фильтрационный метод - метод аффинной хроматографии и т.д. Из этих комбинаций для получения моноклонального антитела с высокой чистотой с высоким выходом особенно предпочтительной является комбинация с).
В качестве простого способа очистки может быть использован коммерчески доступный набор для очистки антитела (например, набор MAbTrap GII, производимый Pharmacia) или т.п.
Полученное таким образом антитело имеет высокую антигенную специфичность в отношении человеческого белка окулоспанина.
h) Анализ моноклонального антитела
Полученное таким образом антитело проверяют в отношении его изотипа и подкласса. Подходящие способы идентификации включают в себя метод Ouchterlony, метод ELISA и метод RIA. Метод Оухтерлони является простым; хотя, если моноклональное антитело получено в низкой концентрации, оно должно быть концентрировано. Альтернативно при использовании метода ELISA или метода RIA культуральный супернатант может быть непосредственно подвергнут реакции с твердой фазой для адсорбции антигена. В дополнение, если в качестве вторичных антител используются различные типы антител, соответствующих изотипам и подклассам иммуноглобулинов, может быть идентифицирован изотип и подкласс моноклонального антитела. В качестве дополнительного простого способа может быть использован коммерчески доступный набор для идентификации (например, набор Mouse Typer, производимый BioRad) и т.п.
Количественное определение белка может быть выполнено анализом Фолина-Лоури на основе поглощения при 280 нм [1,4 (OD280)=1 мг/мл иммуноглобулина].
(3) Получение гуманизированного антитела против человеческого белка окулоспанина
Иммуноглобулин G (здесь и далее называемый просто "IgG") состоит из двух легких полипептидных цепей (здесь и далее называемых «легкими цепями»), каждая из которых имеет молекулярную массу приблизительно 23000, и двух тяжелых цепей (здесь и далее называемых «тяжелыми цепями»), каждая из которых имеет молекулярную массу приблизительно 50000. Каждая из тяжелых цепей и легких цепей имеет повторяющуюся структуру, в которой аминокислотная последовательность, образуемая приблизительно 110 остатками, является консервативной, что составляет базовое звено (здесь и далее называемое «доменом») трехмерной структуры IgG. Тяжелая цепь и легкая цепь составляют 4 и 2 независимых непрерывных домена соответственно. Как в тяжелой цепи, так и в легкой цепи варьирование в амино-концевом домене между различными антителами является большим, чем варьирование в других доменах. Этот домен называют вариабельным доменом (здесь и далее называемым «V-доменом»). На амино-конце IgG V-домены тяжелой цепи и легкой цепи являются комплементарно связанными с образованием вариабельной области. Напротив, остальные домены составляют константную область. Константная область имеет последовательность, специфически присущую каждому виду животного. Например, константная область мышиного IgG отличается от константной области IgG человека. Таким образом, мышиный IgG распознается как чужеродная последовательность иммунной системой человека. В результате вырабатывается реакция в виде антител человека против мышиных антител (здесь и далее называемая "HAMA") (см. Schroff et al., Cancer Res., 45, 870-85 (1985). Вследствие этого мышиное антитело не может повторяемо вводиться индивидууму-человеку. Для введения такого антитела человеку необходимо модифицировать молекулы антитела таким образом, чтобы они не вызывали реакции НАМА, при сохранении в то же самое время специфичности данного антитела.
Согласно результатам рентгеновской кристаллографии домен имеет продольную цилиндрическую структуру, в которой два слоя антипараллельных β-складок, каждая из которых образована из 3-5 β-цепей, совмещены один с другим. В вариабельной области три петли собраны для каждого из V-доменов тяжелой цепи и легкой цепи с образованием антигенсвязывающего сайта. Каждую из этих петель называют определяющей комплементарность областью (здесь и далее называемой "CDR"), в которой варьирование в аминокислотной последовательности является наиболее значительным. Другие части вариабельной области, отличные от CDR, обычно играют роль в поддержании структуры CDR и, следовательно, называются «каркасом». Kabat et al. собрали многочисленные первичные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей и легких цепей. На основании степени консервативности указанных последовательностей они классифицировали индивидуальные первичные последовательности на CDR и каркас и составили их список (см. SEQUENCE OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al.). Кроме того, каркасы классифицируются на множество подгрупп на основе общих признаков аминокислотных последовательностей. Кроме того, было обнаружено, что имеется соответствующий каркас между человеком и мышью.
Из исследований структурных признаков IgG был задуман способ получения гуманизированного антитела, описанный ниже.
Сначала было предложено химерное антитело, в котором вариабельная область антитела, полученного из мыши, соединена с константной областью, полученной у человека (см. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 (1984)). Однако такое химерное антитело все еще содержит много не человеческих аминокислотных остатков. Таким образом, при введении химерного антитела на протяжении продолжительного периода времени, возможно, может быть индуцирована реакция НАМА (см. Begent et al., Br. J. Cancer, 62, 487, (1990)).
В качестве способа дополнительного уменьшения аминокислотных остатков, полученных из источника млекопитающего не человека, которые могут индуцировать реакцию НАМА у людей, был предложен способ интеграции только CDR-части в полученное из человека антитело (см. Nature, 321, 522-525, (1986)). Однако для поддержания активности иммуноглобулина против антигена трансплантация одной CDR обычно была недостаточной.
Chothia et al. на основе данных, полученных рентгеновской кристаллографией в 1987 году, обнаружили следующее:
(i) в аминокислотной последовательности CDR имеется сайт, который связывается непосредственно с антигеном, и сайт, ответственный за поддержание структуры самой CDR, и трехмерные структуры CDR, которые могут быть приняты, классифицируются на множество типичных картин (канонических структур); и
(ii) классы канонических структур определяются не только CDR, но также типом аминокислот, присутствующих в специфическом сайте каркасной части (см. J. Mol. Biol., 196, 901-917, (1987)).
На основе этих открытий было предположено, что при использовании способа трансплантации CDR аминокислотные остатки части указанного каркаса должны быть трансплантированы в антитело человека наряду с последовательностью CDR (см. Японская национальная публикация Международной Патентной заявки № 4-502408).
Обычно полученное из млекопитающего не человека антитело, из которого CDR должна быть трансплантирована, определяется как "донор", в то время как антитело человека, в которое трансплантируют указанную CDR, определяется как "акцептор". Настоящее изобретение следует этим определениям.
Вопрос, который должен учитываться в проведении трансплантации CDR, заключается в том, что активность молекулы иммуноглобулина поддерживается сохранением структуры CDR, насколько это возможно. Для достижения этого внимание должно быть направлено на следующие два момента:
(i) из какой подгруппы антител выбран акцептор; и
(ii) какой аминокислотный остаток выбран из каркаса донора.
Queen et al. предложили способ конструирования для трансплантации аминокислотного остатка в акцептор вместе с последовательностью CDR, когда аминокислотный остаток каркаса донора соответствует по меньшей мере одной из следующих рекомендаций (см. Японская национальная публикация Международной Патентной заявки № 4-502408).
(а) аминокислота редко присутствует в положении в каркасе акцептора, в то время как соответствующая кислота донора обычно присутствует в эквивалентном положении;
(b) аминокислота присутствует вблизи одной из CDR; и
(с) предсказывается, что указанная аминокислота имеет атом боковой цепи в приблизительно 3 ангстремах от CDR в трехмерной структуре иммуноглобулина и что указанный атом боковой цепи может взаимодействовать с антигеном или CDR гуманизированного антитела.
ДНК, кодирующая тяжелую цепь или легкую цепь моноклонального антитела против человеческого белка окулоспанина настоящего изобретения, может быть получена получением мРНК из гибридомной клетки, продуцирующей моноклональное антитело против человеческого белка окулоспанина, превращением мРНК в кДНК с использованием обратной транскриптазы и выделением каждой ДНК, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь данного антитела.
При экстракции мРНК может быть использован метод с использованием гуанидинтиоцианата-горячего фенола и метод с использованием гуанидинтиоцианата-гуанидингидрохлорида; однако подходящим является также метод с использованием гуанидинтиоцианата-хлорида цезия. Получение мРНК из клетки выполняют сначала получением общей РНК и очисткой мРНК с использованием носителя для очистки поли(А+)-РНК, такого как олиго(dT)-целлюлоза или олиго(dT)-латексные гранулы, или прямой очисткой мРНК из лизата клеток с использованием указанного носителя. Для получения общей РНК можно использовать способ центрифугирования в градиенте плотности щелочного раствора сахарозы [см. Doughherry, W.G. and Hiebert, E. (1980) Virology 101, 446-474], способ с использованием гуанидинтиоцианата-фенола, способ с использованием тиоцианата-трифторцезия и способ с использованием фенола-ДСН и т.п.; однако подходящим также является способ с использованием гуанидинтиоцианата и хлорида цезия [см. Chirgwin, J.M., et al. (1979) Biochemistry 18, 5294-5299].
После синтеза одноцепочечной кДНК реакцией обратной транскриптазы с использованием в качестве матрицы полученной поли(А+)-РНК, как описано выше, может быть синтезирована двухцепочечная кДНК из одноцепочечной кДНК. Этим способом может быть способ с использованием нуклеазы S1 [см. Efstratidis, et al. (1976) Cell, 7, 279-288], способ Gubler/Hoffman [см. Gubler, U. and Hoffman, B.J. (1983) Gene 25, 263-269], способ Okayama/Berg [см. Okayama, H. and Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol. 2, 161-170] или другие способы; однако предпочтительно использовать в настоящем изобретении так называемый ОТ-ПЦР способ, в котором выполняют полимеразную цепную реакцию (здесь и далее называемую «ПЦР») [см. Saiki, R.K., et al. (1988) Science 239, 487-49] с использованием одноцепочечной кДНК в качестве матрицы.
Полученную таким образом двухцепочечную кДНК интегрируют в клонирующий вектор для получения рекомбинантного вектора, который затем вводят в микроорганизм, такой как Escherichia coli, для образования трансформанта. Трансформант может быть отобран, используя устойчивость к тетрациклину или устойчивость к ампициллину в качестве маркера. Escherichia coli может быть трансформирована по способу Hanahan [см. Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580], более конкретно получением компетентной клетки в присутствии хлорида кальция, хлорида магния или хлорида рубидия и добавлением рекомбинантного ДНК-вектора в компетентную клетку. Следует обратить внимание на то, что при использовании плазмиды в качестве вектора указанная плазмида должна иметь любой из генов устойчивости к лекарственным средствам, приведенным выше. Нет необходимости говорить, что может быть использован клонирующий вектор, иной, чем плазмида, например фаг группы лямбда.
В качестве способа отбора линии, имеющей кДНК, которая кодирует каждую из субъединиц желаемого моноклонального антитела против человеческого белка окулоспанина, из полученной, как описано выше, линии трансформанта, может быть использован любой из способов, описанных ниже. При проведении специфической амплификации желаемой кДНК по способу ОТ-ПЦР такая операция данного способа может быть опущена.
(а) Способ с использованием полимеразной цепной реакции
Когда аминокислотная последовательность желаемого белка выяснена в ее полном виде или в ее части, синтезируют олигонуклеотидные праймеры смысловой цепи и антисмысловой цепи, соответствующие части аминокислотной последовательности. Затем выполняют полимеразную цепную реакцию [Saiki, R.K., et al. (1988) Science 239, 487-49] с использованием праймеров в комбинации с амплификацией ДНК-фрагмента, кодирующего субъединицы тяжелой цепи и легкой цепи желаемого антитела против человеческого белка окулоспанина. В качестве ДНК-матрицы в данном случае может быть использована кДНК, синтезированная из мРНК гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело против человеческого белка окулоспанина, с использованием реакции обратной транскриптазы.
Полученный таким образом ДНК-фрагмент может быть непосредственно интегрирован в плазмидный вектор с использованием коммерчески доступного набора и т.д. Альтернативно ДНК-фрагмент может быть использован для отбора желаемого клона мечением указанного фрагмента 32Р, 35S или биотином и выполнением гибридизации колоний или гибридизации бляшек с его использованием в качестве зонда.
Например, способ испытания частичной аминокислотной последовательности каждой субъединицы моноклонального антитела против человеческого белка окулоспанина настоящего изобретения выполняют предпочтительно выделением каждой субъединицы с использованием известного метода, такого как электрофорез или колоночная хроматография, и затем анализируют N-концевую аминокислотную последовательность каждой субъединицы с использованием автоматического секвенатора белков (например, PPSQ-10, производимого Shimadzu Corporation).
Выделение кДНК, кодирующей каждую субъединицу моноклонального антитела против человеческого белка окулоспанина, из желаемого трансформанта, полученного, как описано выше, осуществляют в соответствии с известным методом [см. Maniatis, T., et al. (1982) in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY], и более конкретно, он может быть осуществлен путем выделения фракций, соответствующих векторной ДНК, из клетки и вырезания ДНК-области, кодирующей желаемую субъединицу, из векторной ДНК (плазмидной ДНК).
(b) Способ скрининга с использованием синтезированного олигонуклеотидного зонда
Когда полная аминокислотная последовательность или часть аминокислотной последовательности желаемого белка выяснена (любая последовательность, взятая из любой области желаемого белка, пока она является специфической последовательностью, имеющей множество смежных аминокислот), синтезируют олигонуклеотид (в данном случае может быть использована либо нуклеотидная последовательность, основанная на степени частоты используемых кодонов, либо множество нуклеотидных последовательностей из возможных нуклеотидных последовательностей в комбинации; в последнем случае количество типов нуклеотидных последовательностей может быть уменьшено интеграцией инозина), так чтобы он соответствовал указанной аминокислотной последовательности, используемой в качестве зонда (меченного 32Р, 35S или биотином); гибридизуют с нитроцеллюлозным фильтром, на котором денатурирована и иммобилизована ДНК линии трансформанта, и затем выделяют полученную положительную линию.
Последовательность полученной таким образом ДНК может быть определена способом химической модификации Максама-Гильберта [см. Maxam, A.M. and Gilbert, W. (1980) in "Methods in Enzymology" 65, 499-576] и способом терминации цепи с использованием дидезоксинуклеотидов [Messing, J. and Vieira, J. (1982) Gene 19, 269-276].
Недавно была широко использована автоматическая система определения последовательности оснований с использованием флуоресцентного красителя (например, роботы секвенирования "CATALYST 800" и секвенатор модели 373ADNA и т.д., производимые PerkinElmer Japan Co., Ltd.).
Использование такой системы делает также возможным эффективное и надежное определение нуклеотидной последовательности ДНК. На основании определенных таким образом данных настоящего изобретения, в том числе нуклеотидной последовательности ДНК и N-концевых аминокислотных последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи, можно определить полную аминокислотную последовательность тяжелой цепи и легкой цепи моноклонального антитела настоящего изобретения.
Тяжелая цепь и легкая цепь иммуноглобулина, каждая, составляют вариабельную область и константную область. Вариабельная область составляет дополнительно определяющие комплементарность области (здесь и далее называемые CDR, имеются 3 участка в каждой из тяжелой цепи и легкой цепи) и каркасные области, смежные с указанными CDR (4 участка в каждой из тяжелой цепи и легкой цепи).
Аминокислотная последовательность константной области является общей для антител, принадлежащих к одному и тому же классу иммуноглобулинов, независимо от типа антигена. В вариабельной области аминокислотная последовательность CDR является специфически присущей каждому антителу. Однако согласно исследованию, сравнивающему данные аминокислотной последовательности многочисленных антител, известно, что положение CDR и длина каркасной последовательности являются сходными между субъединицами различных антител, когда они принадлежат к одной и той же подгруппе [см. Kabat, E.A., et al. (1991) in "Sequence of Proteins of Immunological Interest Vol. II": U.S. Department of Health and Human Services]. Таким образом, можно определить положение CDR и каркасных областей и дополнительно константной области в каждой аминокислотной последовательности путем сравнения аминокислотных последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи моноклонального антитела против человеческого белка окулоспанина настоящего изобретения с известными данными аминокислотных последовательностей. Следует обратить внимание на то, что длина цепи FRH1, т.е. каркасной области, локализованной на стороне, проксимальной по отношению к N-концу, является иногда более короткой, чем общая длина 30 аминокислот. В некоторых случаях известно, что каркасная область имеет по меньшей мере 18 аминокислот [см. Kabat et al., цитированные выше]. На основании этого в антителе настоящего изобретения длина цепи каркасной области на N-конце тяжелой цепи установлена в 18-30 аминокислот, предпочтительно 30 аминокислот, пока функция антитела против человеческого белка окулоспанина не нарушена.
В целом, только искусственной модификацией пептида, имеющего ту же самую аминокислотную последовательность, что и последовательность каждой из CDR легких цепей или тяжелых цепей или часть ее непрерывной аминокислотной последовательности, определенная выше, приближая тем самым указанную структуру к третичной структуре CDR, фактически взятой из молекулы антитела против человеческого белка окулоспанина, указанной CDR может быть придана связывающая активность, способная связываться с человеческим белком окулоспанина [см. USP No. 5331573]. Таким образом, пептид, содержащий ту же самую аминокислотную последовательность, что и последовательность CDR или часть ее аминокислотной последовательности, также включен в качестве молекулы настоящего изобретения.
Модифицированная аминокислотная последовательность может быть получена делецией по меньшей мере одной или нескольких аминокислот из исходной аминокислотной последовательности в соответствии с кассетным мутагенезом [см. Toshimitu Kishimoto, "New Biochemical Experimental Lecture 2, Nucleic acid III, Recombinant DNA technique", p. 242-251].
Такие различные типы последовательностей ДНК могут быть получены в соответствии с обычным способом химического синтеза нуклеиновой кислоты, например, фосфит-триэфирным способом [см. Hunkapiller, M., et al. (1984) Nature 310, 105-111]. Следует обратить внимание на то, что кодоны, соответствующие желаемой аминокислоте, уже известны per se. Может быть выбран любой кодон. Альтернативно, какой кодон следует использовать, можно определить в соответствии с обычным способом с учетом частоты, с которой кодоны используются клеткой-хозяином. Частичная модификация нуклеотидных последовательностей кодонов может быть выполнена в соответствии с обычным способом, более конкретно в соответствии с сайт-специфическим мутагенезом [см. Mark, D.F., et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666] с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров, кодирующих желаемую модификацию.
Кроме того, можно проверить, может ли определенный тип ДНК гибридизоваться с ДНК, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь моноклонального антитела против человеческого белка окулоспанина настоящего изобретения, подвергая указанную ДНК следующему эксперименту, выполняемому с использованием ДНК-зонда, меченного [α-32Р]dCTP, в соответствии со способом со случайными праймерами [см. Feinberg, A.P. and Vigelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13] или способом ник-трансляции [см. Maniatis, T., et al. (1982) in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY].
Более конкретно, подлежащую проверке ДНК адсорбируют, например, на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану. После денатурации щелочью, если необходимо, указанную мембрану нагревают или облучают ультрафиолетом, иммобилизуя ДНК на мембране. Мембрану пропитывают раствором предварительной гибридизации, содержащем 5Х SSC (1Х SSC содержит раствор 0,15М хлорида натрия, 0,015М тринатрий-цитрата), 5% раствор Denhardt и 0,1% додецилсульфат натрия (ДСН), и выдерживают при 55°С в течение 4 или более часов. Затем к предварительно гибридизационному раствору добавляют зонд, полученный заранее, таким образом, чтобы иметь конечную удельную активность 1×106 имп. в мин/мл, и температуру поддерживают при 60°С в течение ночи. Затем мембрану промывают 6Х SSC при комнатной температуре в течение 5 минут несколько раз, дополнительно промывают 2Х SSC в течение 20 минут и подвергают радиоавтографии.
Используя приведенные выше способы, ДНК, которая гибридизуется с ДНК, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь гуманизированного антитела против человеческого белка окулоспанина настоящего изобретения, может быть выделена из случайной библиотеки кДНК или геномной библиотеки [см. Maniatis, T., et al. (1982) in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY].
Каждая из ДНК-последовательностей, полученных приведенным выше способом, может быть интегрирована в экспрессирующий вектор, который может быть затем введен в прокариотическую или эукариотическую клетку. Таким путем ген (имеющий указанную ДНК) может экспрессироваться в клетке-хозяине. Способ экспрессии аналогичен способу, описанному в разделе "5. Получение антитела против человеческого белка окулоспанина", параграфе "(1) Получение антигена", приведенном выше.
Фракция, содержащая белок антитела против человеческого белка окулоспанина, продуцируемый в клетке-трансформанте или вне клетки-трансформанта, может быть обработана различными известными методами выделения белков, основанных на использовании физических и/или химических свойств, для выделения и очистки белка. Примеры этих методов включают в себя обработку обычно используемым агентом преципитации белков, ультрафильтрацию, хроматографию, например хроматографию с использованием молекулярных сит (гель-фильтрация), адсорбционную хроматографию, ионообменную хроматографию и аффинную хроматографию, или высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), диализ и их комбинации.
Для гуманизации моноклонального антитела против человеческого белка окулоспанина аминокислотная последовательность вариабельной области должна быть сконструирована таким образом, чтобы вся определенная последовательность CDR и часть аминокислотной последовательности FR-последовательности трансплантировались в антитело человека следующим образом.
Предпочтительно в конструировании гуманизированного антитела подгруппу акцептора выбирают на основе следующих рекомендаций:
a) природную комбинацию тяжелой цепи и легкой цепи известного антитела человека, имеющего встречающуюся в природе аминокислотную последовательность, используют как таковую;
b) хотя комбинация тяжелой цепи и легкой цепи в виде одной подгруппы сохраняется, тяжелая цепь и легкая цепь могут быть получены из различных антител человека. Тяжелая цепь и легкая цепь, которые могут быть использованы, могут быть выбраны из аминокислотных последовательностей с высокой идентичностью относительно аминокислотных последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи донора соответственно и консенсусных последовательностей. В настоящем изобретении могут быть использованы вышеуказанные рекомендации. Однако имеются альтернативные способы, такие как следующие:
c) независимо от учета комбинации конкретной подгруппы может быть использован метод отбора FR тяжелой цепи и легкой цепи с высокой идентичностью относительно FR тяжелой цепи и легкой цепи донора из библиотеки первичных последовательностей антитела человека. В этих методах отбора степень идентичности аминокислот FR-области между донором и акцептором может быть установлена в 70% или более. С использованием такого метода можно уменьшить количество аминокислотных остатков антитела, подлежащих трансплантации из донора, индуцируя таким образом меньшую реакцию НАМА.
Существует операция (называемая далее «молекулярным моделированием») для предсказания третичной структуры молекулы антитела из его первичной последовательности; однако точность предсказания этой операции является ограниченной. Таким образом, роль появления аминокислотного остатка исключительно в подгруппе, к которой принадлежит донор, не может быть установлена достаточным образом. Обычно трудно определить, какой аминокислотный остаток донора или акцептора должен быть выбран для такого положения аминокислотного остатка в соответствии со способом, описанным выше Queen et al. Однако согласно методу выбора (с) можно уменьшить частоту, с которой должно производиться такое определение.
Кроме того, авторы настоящего изобретения улучшили такие способы гуманизации обеспечением нового способа идентификации аминокислоты, полученной из FR донора и важной для сохранения структуры и функции CDR донора.
После выбора акцепторной молекулы человека для каждой из легкой цепи и тяжелой цепи аминокислотный остаток, подлежащий трансплантации из FR донора, выбирают по способу, описанному ниже.
В аминокислотных последовательностях донора и акцептора, когда соответствующие аминокислотные остатки их FR отличаются один от другого, следует определить, какие аминокислотные остатки должны быть выбраны. При выполнении такого отбора нужно соблюдать осторожность, чтобы не нарушить третичную структуру CDR, получаемой из донора.
Queen et al. предложили в Японской национальной публикации Международной патентной заявки № 4-502408 способ трансплантации аминокислотного остатка на FR в акцептор вместе с последовательностью CDR, если это удовлетворяет по меньшей мере одному из следующих требований:
1) аминокислота редко присутствует в положении в FR-области акцептора человека, тогда как соответствующая аминокислота донора обычно присутствует в эквивалентном положении;
2) аминокислота локализована чрезвычайно близко к одной из CDR;
3) предсказано, что аминокислота имеет атом боковой цепи в пределах приблизительно 3 ангстрем от CDR в трехмерной модели иммуноглобулина и указанный атом боковой цепи может взаимодействовать с антигеном или CDR гуманизированного антитела.
В изложенном выше требование 2) соответствия остатка, приведенное выше, часто проявляет свойство требования 3). Таким образом, в настоящем изобретении требование 2) опускается и заново устанавливаются два требования. Более конкретно, в настоящем изобретении, если аминокислотный остаток на FR донора должен переноситься вместе с CDR, он удовлетворяет следующим требованиям:
а) аминокислота редко присутствует в положении в FR-области акцептора человека, тогда как соответствующая аминокислота донора обычно присутствует в эквивалентном положении;
b) в третичной структурной модели аминокислота предположительно взаимодействует с атомом, входящим в аминокислоту указанной CDR, и антигеном или трансплантируемой петлей CDR;
с) указанное выше положение является положением канонического определяющего класс остатка; или
d) указанное положение является положением, которое образует поверхность контакта между тяжелой цепью и легкой цепью,
затем указанный аминокислотный остаток трансплантируют из FR донора.
В требовании а) в соответствии с приведенным выше списком Kabat аминокислота, обнаруживаемая при частоте 90% или более, в положении одного и того же подкласса антитела определяется как «обычно присутствующая», тогда как аминокислота, обнаруживаемая при частоте, меньшей, чем 10%, определяется как «редко присутствующая».
В требовании с), относительно того, является или нет «указанное выше положение каноническим определяющим класс остатком», это определение может быть выполнено только в соответствии со списком Chothia, приведенным выше.
В требованиях b) и d) предварительно должно быть выполнено молекулярное моделирование вариабельной области антитела. В качестве программного обеспечения для молекулярного моделирования может быть использовано любое коммерчески доступное программное обеспечение: однако предпочтительно используется программа AbM (производимая Oxford Molecular Limited Company).
Точность предсказания посредством молекулярного моделирования является до некоторой степени ограниченной. Таким образом, в настоящем изобретении с учетом данных рентгеновской кристаллографии для вариабельных областей различных антител достоверность структуры, предсказанной молекулярным моделированием, может быть оценена в двух стадиях.
В третичной структуре вариабельной области, сконструированной программным обеспечением молекулярного моделирования, таким как AbM, если расстояние между двумя атомами является более коротким, чем величина суммы радиуса Ван-дер-Ваальса двух атомов плюс 0,5 ангстрем, то предполагается, что эти две молекулы находятся в контакте Ван-дер-Ваальса. С другой стороны, если расстояние между имеющими полярность атомами, такими как азот амида или кислород карбонила основных и боковых цепей, является более коротким, чем среднее расстояние образования водородной связи, 2,9 ангстрем плюс 0,5 ангстрем, предполагается, что между этими атомами может существовать образование водородной связи. Кроме того, если расстояние между противоположно заряженными атомами является более коротким, чем расстояние 2,85 ангстрем плюс 0,5 ангстрем, предполагается, что образована ионная связь между этими атомами.
С другой стороны, на основании экспериментальных результатов рентгеновской кристаллографии для вариабельных областей различных антител в качестве положения на FR, в котором контакт с CDR может быть обнаружен с высокой частотой независимо от подгруппы, могут быть указаны следующие положения: в легкой цепи: положения 1, 2, 3, 4, 5, 23, 35, 36, 46, 48, 49, 58, 69, 71 и 88, а в тяжелой цепи положения 2, 4, 27, 28, 29, 30, 36, 38, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 69, 71, 73, 78, 92, 93, 94 и 103 (все числа представляют номера аминокислот, определенные в документах, описанных Kabat et al. То же самое определение будет также использоваться ниже). При использовании такого же стандарта, который используется в молекулярном моделировании, подтверждается, что аминокислотные остатки этих положений находятся в контакте с аминокислотными остатками CDR в части, равной 2/3 вариабельной области известного антитела. На основе этих открытий, выражение "b) в третичной структурной модели аминокислота предположительно взаимодействует с атомом, входящим в аминокислоту данной CDR, и антигеном или трансплантируемой петлей CDR" означает следующее.
В молекулярном моделировании, если положение в FR, которое, как ожидается, находится в контакте с CDR, согласуется с любым из положений, в которых контакт между FR и указанной CDR часто происходит, как сообщается в соответствии с экспериментальным обнаружением рентгеновской кристаллографией, предпочтительным является отбор аминокислоты из донора. В других случаях требование b) не учитывается.
Выражение "d) данное положение является положением, которое образует поверхность контакта между тяжелой цепью и легкой цепью" означает следующее требование. На основании экспериментальных результатов рентгеновской кристаллографии для вариабельных областей различных антител подтверждено, что контакт тяжелая цепь - легкая цепь часто наблюдается в аминокислотных остатках 36, 38, 43, 44, 46, 49, 87, 98 в легкой цепи и в аминокислотных остатках 37, 39, 45, 47, 91, 103 и 104 в тяжелой цепи. В случаях, когда возможность контакта тяжелая цепь - легкая цепь предсказана в молекулярном моделировании и положение контакта согласуется с любым из указанных выше положений, выполняют предпочтительно трансплантацию аминокислотного остатка из донора. В других случаях требование d) не учитывается.
ДНК, кодирующая вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи гуманизированного антитела против человеческого белка окулоспанина настоящего изобретения, может быть получена способами, описанными ниже.
Например, множество полинуклеотидных фрагментов, содержащих частичную нуклеотидную последовательность ДНК, длиной 60-70 нуклеотидов, химически синтезируют поочередно из смысловых и антисмысловых цепей. После этого индивидуальные полинуклеотидые фрагменты отжигают и лигируют с использованием ДНК-лигазы. Таким путем можно получить ДНК, имеющую ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи желаемого гуманизированного антитела против человеческого белка окулоспанина.
В другом способе ДНК, кодирующую всю аминокислотную последовательность вариабельной области акцептора, экстрагируют из лимфоцитов человека, выполняют замену нуклеотидов в области, кодирующей CDR, по способу, известному специалистам в данной области, для введения последовательности расщепления рестриктазы. После расщепления указанной области соответствующей рестриктазой синтезируют нуклеотидную последовательность CDR донора и лигируют ее при помощи ДНК-лигазы. Таким путем можно получить ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи желаемого гуманизированного антитела против человеческого белка окулоспанина.
Кроме того, в настоящем изобретении можно получать ДНК, содержащую ДНК, кодирующую антитело против человеческого белка окулоспанина, предпочтительно в соответствии со способом ПЦР с удлинением перекрывающихся участков (Horton et al., Gene, 77, 61-68 (1989)), описанным ниже.
Для более конкретного объяснения две различные ДНК-последовательности, которые кодируют две различные аминокислотые последовательности соответственно и которые желательно лигировать друг с другом, для удобства обозначают (А) и (В). Химически синтезируют смысловой праймер из 20-40 нуклеотидов (здесь и далее называемый «праймером (С)») для отжига с 5'-стороны ДНК-последовательности (А) и антисмысловой праймер из 20-40 нуклеотидов (здесь и далее называемый "праймером (D)") для отжига с 3'-стороны ДНК-последовательности (В). Кроме того, смысловой праймер химерного типа (здесь и далее называемый «праймером (Е)») образуют лигированием нуклеотидной последовательности из 20-30 нуклеотидов на 3'-стороне ДНК-последовательности (А), и нуклеотидную последовательность из 20-30 нуклеотидов лигируют на 5'-стороне ДНК-последовательности (В). Синтезируют антисмысловой праймер (здесь и далее называемый "праймером F)"), комплементарный праймеру (Е). При выполнении ПЦР с использованием подходящей векторной ДНК, содержащей ДНК (А) в качестве субстрата, смыслового праймера (С) и антисмыслового праймера (F) химерного типа может быть получена ДНК, в которой 20-30 нуклеотидов на 5'-стороне ДНК (В) присоединены к 3'-стороне ДНК (А) (новообразованная ДНК обозначена как ДНК (G)). Подобным образом при выполнении ПЦР с использованием подходящей векторной ДНК, содержащей ДНК (В) в качестве субстрата, антисмыслового праймера (D) и смыслового праймера (Е) химерного типа может быть получена ДНК, в которой 20-30 нуклеотидов на 3'-стороне ДНК (А) присоединены к 5'-стороне ДНК (В) (новообразованная ДНК обозначена как ДНК (Н)). В ДНК (G) и (Н) 40-60 нуклеотидов на 3'-стороне ДНК (G) образуют последовательность, комплементарную последовательности, образованной 40-60 нуклеотидами на 5'-стороне ДНК (Н). Амплифицированные ДНК (G) и (Н) смешивают и подвергают ПЦР, ДНК (G и (Н) образуются в виде одной цепи в первой реакции денатурации. Хотя большинство цепей ДНК возвращаются в их исходные состояния после реакции отжига, часть ДНК формируется в гетеро-двухцепочечную ДНК отжигом комплементарной области нуклеотидной последовательности. Выступающую одноцепочечную часть достраивают в последующей реакции удлинения с получением ДНК химерного типа (здесь и далее называемую ДНК (I)), образованной из ДНК (А) и ДНК (В), лигированных друг с другом. ДНК (I) может быть амплифицирована выполнением ПЦР с использованием ДНК (I) в качестве субстрата, смыслового праймера (С) и антисмыслового праймера (D). В настоящем изобретении ДНК, кодирующая область CDR тяжелой цепи и легкой цепи мышиного моноклонального антитела против человеческого белка окулоспанина, ДНК, кодирующая FR-область иммуноглобулина IgG человека, кроме того, ДНК, кодирующая сигнал секреции иммуноглобулина IgG человека, может быть использована в качестве ДНК (А) и (В) от случая к случаю и подвергнута приведенной выше реакции лигирования.
Следует обратить внимание на то, что кодоны, соответствующие желаемой аминокислоте, известны per se и могут быть выбраны произвольно. Более конкретно, указанные кодоны могут быть определены в соответствии с обычным способом с учетом частоты, с которой данный кодон используется хозяином. Часть нуклеотидной последовательности кодонов может быть модифицирована в соответствии с обычным способом, таким как сайт-специфический мутагенез (см. Mark, D.F., et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666), с использованием синтетического олигонуклеотидного праймера, кодирующего желаемую модификацию. Таким образом, если каждый праймер сконструирован так, чтобы вводить точечную мутацию, и затем химически синтезирован, можно получить ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи желаемого антитела против человеческого белка окулоспанина.
Посредством интеграции каждой из ДНК настоящего изобретения, полученной таким образом, в экспрессирующий вектор, может быть трансформирована прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин. Кроме того, введением подходящего промотора и последовательности, связанной с фенотипической экспрессией, каждый ген может быть экспрессирован в векторы в соответствующей клетке-хозяине.
Посредством приведенного выше способа может быть легко получено антитело против человеческого белка окулоспанина с высокой чистотой и с высоким выходом.
(4) Получение полного антитела человека против человеческого белка окулоспанина
Полным антителом человека называют антитело человека, имеющее только последовательность гена антитела, полученную из хромосомы человека. Полное антитело против человеческого белка окулоспанина может быть получено способом с использованием продуцирующей антитело человека мыши, имеющей фрагмент хромосомы человека, содержащий гены для тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека [см. Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, 16, p.133-143, 1997; Kuroiwa, Y. et al., Nuc. Acids Res., 26, p.3447-3448, 1998; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima,S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000, и т.д.], или может быть получено способом с использованием антитела человека, полученного из фагового дисплея, выбранного из библиотеки антител человека [см. Wormstone, I.M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43(7), p.2301-8, 2002; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, 1(2), p. 189-203, 2002; Siriwardena, D. et al., Ophthalnology, 109(3), p.427-431, 2002, и т.д.].
В качестве способа проверки, связывается специфически или нет рекомбинантное антитело против человеческого белка окулоспанина, полученное таким образом, с человеческим белком окулоспанина, удобно использовать метод ELISA, применяемый в оценке титра антител иммунизированной мыши.
6. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против человеческого белка окулоспанина
Из антител против человеческого белка окулоспанина, полученных по способу, описанному в разделе "5. Получение антитела против человеческого белка окулоспанина", может быть получено антитело, нейтрализующее биологическую активность человеческого белка окулоспанина, или антитело, специфически повреждающее раковую клетку, экспрессирующую человеческий белок окулоспанина. Эти антитела могут ингибировать биологическую активность человеческого белка окулоспанина в живом организме, другими словами, малигнизацию клетки. Таким образом, они могут быть использованы в качестве лекарственного средства, в частности, в качестве терапевтического агента для рака. Активность антитела против человеческого белка окулоспанина в нейтрализации биологической активности человеческого белка окулоспанина in vitro может быть определена по способности ингибировать малигнизацию клетки, в которой сверхэкспрессируется окулоспанина. Более конкретно ингибирующая активность может быть определена культивированием линии мышиных фибробластных клеток, NIH3T3, которая сверхэкспрессирует человеческий белок окулоспанина, добавлением антитела против человеческого белка окулоспанина в культуральную систему в различных концентрациях. Таким путем могут быть определены активности против образования очага, образования колоний и сфероидного роста. Цитотоксическая активность антитела против человеческого белка окулоспанина против раковой клетки in vitro может быть определена по антитело-зависимой цитотоксической активности, комплемент-зависимой цитотоксичности или комплемент-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности, проявляемой антителом против человеческого белка окулоспанина против клетки, сверхэкспрессирующей человеческий белок окулоспанина. Более конкретно культивируют клетки 293Т, сверхэкпрессирующие человеческий белок окулоспанина; затем антитело против человеческого белка окулоспанина добавляют в различных концентрациях в культуральную систему. Дополнительно добавляют клетки селезенки мыши в культуральную систему и культивируют в течение подходящего времени. Затем определяют степень индукции смерти клеток для клеток, сверхэкспрессирующих антитело против человеческого белка окулоспанина. Действие антитела против человеческого белка окулоспанина при лечении рака может быть определено in vivo с использованием экспериментального животного, более конкретно введением антитела против человеческого белка окулоспанина трансгенному животному, сверхэкспрессирующему человеческий белок окулоспанина и определением изменения в раковых клетках.
Полученное таким образом антитело для нейтрализации биологической активности человеческого белка окулоспанина или антитела, специфически повреждающего раковые клетки, экспрессирующие человеческий белок окулоспанина, полезно в качестве лекарственного средства, в частности в виде фармацевтической композиции для применения в лечении рака, или в качестве антитела для использования в иммунологической диагностике такого заболевания. В качестве типа рака могут быть приведены рак кожи и меланома, один из типов рака кожи; но раки, которые могут лечиться или диагностироваться в соответствии с настоящим изобретением, не ограничиваются этими примерами.
Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую антитело против человеческого белка окулоспанина в количестве, применимом для лечения, фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, солюбилизирующий агент, эмульгирующий агент, консервант и/или вспомогательный агент.
Вещество для применения в качестве фармацевтически приемлемого препарата в фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением является предпочтительно нетоксичным для пациента, которому должна вводиться фармацевтическая композиция, с точки зрения дозы и концентрации.
Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать вещества, подходящие для включения в препарат, которые способны изменять, поддерживать и стабилизировать рН, осмотическое давление, вязкость, прозрачность, изотоническое состояние, асептическое состояние, стабильность, растворимость, скорость высвобождения, скорость абсорбции и проникаемость. Примеры таких веществ для включения в препарат включают в себя, но не ограничиваются ими, аминокислоты, такие как глицин, аланин, глутамин, аспарагин, аргинин и лизин; антиоксиданты, такие как антибактериальные агенты, аскорбиновая кислота, сульфат натрия и гидросульфат натрия; буферирующие агенты, такие как фосфатный, цитратный, боратный буферы, гидрокарбонат, раствор Трис-HCl; наполнители, такие как маннит и глицин; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетраацетат (ЭДТА); комплексообразующие агенты, такие как кофеин, поливинилпирролидон, β-циклодекстрин и гидроксипропил-β-циклодекстрин; загущающие агенты, такие как глюкоза, манноза и декстрин; углеводы, такие как моносахариды, дисахариды, глюкоза, манноза, декстрин; гидрофильные полимеры, такие как красители, ароматизаторы, разбавители, эмульгирующие агенты, поливинилпирролидон; консерванты, такие как низкомолекулярные полипептиды, подходящие противоионы, хлорид бензалкония, бензоат, салициловая кислота, тимерозал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота и пероксид углерода; растворители, такие как глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль; сахароспирты, такие как маннит и сорбит; полисорбаты, такие как суспендирующие агенты, ПЭГ, простой эфир сорбитана, полисорбат 29 и полисорбат 80; поверхностно-активные вещества, такие как Тритон, трометамин, лецитин, холестерин; усиливающие стабильность агенты, такие как сахароза и сорбит; усиливающие эластичность агенты; агенты транспорта, разбавители; эксципиенты; и/или фармацевтические вспомогательные агенты, такие как хлорид натрия, хлорид калия, маннит/сорбит. Количество веществ, добавляемых к препарату, является 0,01-100-кратным, более предпочтительно 0,1-10-кратным относительно массы антитела против человеческого белка окулоспанина. Специалисты в данной области могут подходящим образом определить готовую форму, пригодную для приготовления фармацевтической композиции, в зависимости от заболевания и способа введения.
Эксципиент и носитель, используемые в фармацевтической композиции, могут быть жидкостью или твердым веществом. Примеры подходящего эксципиента и носителя могут включать в себя инъекционные растворы, солевой раствор, искусственную цереброспинальную жидкость и другие вещества, обычно используемые для парентерального введения. Кроме того, нейтральный солевой раствор и солевой раствор, содержащий сывороточный альбумин, могут быть использованы в качестве носителя. Фармацевтическая композиция может содержать Трис-буфер с рН 7,0-8,5 и ацетатный буфер с рН 4,0-5,5, который может быть дополнен сорбитом и другими соединениями. Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением, имеющую выбранный состав, готовят с требуемой чистотой в подходящей форме лекарственного средства или в виде лиофилизированного продукта или жидкого продукта. Для более конкретного описания, фармацевтическая композиция, содержащая антитело против человеческого белка окулоспанина, может быть приготовлена в виде лиофилизированного продукта с использованием подходящего эксципиента, такого как сахароза.
Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена для парентерального применения или для перорального применения для желудочно-кишечной абсорбции (всасывания). Состав и концентрация препарата могут быть выбраны в зависимости от способа введения. Когда антитело против человеческого белка окулоспанина содержится в фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением, оно проявляет более высокую аффинность в отношении человеческого белка окулоспанина; другими словами, чем выше аффинность антитела против человеческого белка окулоспанина в отношении человеческого белка окулоспанина, выражаемая константной диссоциации (величиной Kd), т.е. чем ниже величина Kd, тем выше эффективность фармацевтической композиции настоящего изобретения при более низкой дозе. Таким образом, может быть определено количество дозы фармацевтической композиции настоящего изобретения для индивидуума. Гуманизированное антитело против человеческого белка окулоспанина может вводиться индивидууму в виде единственной дозы в интервале 1-30 дней в количестве приблизительно 0,1-100 мг/кг.
Примеры форм фармацевтической композиции настоящего изобретения могут включать в себя инъекции, например капельные инфузии, суппозитории, агенты для введения через нос, сублингвальные агенты и агенты чрескожной абсорбции.
7. Поиск вещества, имеющего прямое взаимодействие
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к подходу к конструированию лекарственных средств для получения вещества, способного ингибировать активность человеческого белка окулоспанина на основе третичной структуры данного белка. Этот подход известен как рациональный способ конструирования лекарственного средства и используется для поиска соединения, способного эффективно ингибировать или активировать функцию, такую как ферментативная функция или связывание с лигандом, кофактором или ДНК. В качестве примера такого соединения хорошо известен ингибитор протеаз, служащий в качестве агента против ВИЧ, продаваемый в настоящее время на рынке. При анализе трехмерной структуры человеческого белка окулоспанина в соответствии с настоящим изобретением может быть предположительно использован обычно хорошо известный способ, такой как рентгеновская кристаллография или ядерный магнитный резонанс. Кроме того, при поиске или конструировании вещества для ингибирования функции человеческого белка окулоспанина может быть использован компьютерный способ конструирования лекарственных средств (CADD). В этом случае в качестве примера известно низкомолекулярное соединение (Международная публикация WO 99/58515), ингибирующее действие АР-1, которое, как ожидается, действует в качестве нового геномного лекарственного средства для лечения хронического ревматоидного артрита. Благодаря такому способу можно получить вещество, ингибирующее функцию человеческого белка окулоспанина прямым связыванием с человеческим белком окулоспанина или ингибированием взаимодействия между человеческим белком окулоспанина и другими факторами.
Кроме того, в соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к полипептиду, связанному с человеческим белком окулоспанина настоящего изобретения, другими словами, белком-партнером, для контроля активности человеческого белка окулоспанина. Более конкретно настоящее изобретение относится к способу скрининга на такой белок-партнер для контроля активности человеческого белка окулоспанина.
Один аспект такого способа скрининга предусматривает стадию приведения пробы тест-белка в контакт с человеческим белком окулоспанина, отбирая тем самым белок, связывающийся с человеческим белком окулоспанина. Такой способ включает в себя очистку белка с использованием его аффинности в отношении очищенного человеческого белка окулоспанина. Для более конкретного описания, сначала последовательность, образованную из 6 гистидинов, связывают с человеческим белком окулоспанина в качестве аффинной метки. Полученный человеческий белок окулоспанина инкубируют в растворе клеточного экстракта (т.е. фракции, прошедшей через колонку, загруженную никель-агарозой) при 4°С в течение 12 часов. Затем никель-агарозный носитель отдельно добавляют к смеси и смесь инкубируют при 4°С в течение одного часа. После достаточной промывки никель-агарозного носителя промывочным буфером к смеси добавляют 100 мМ имидазол для элюирования белка, специфически связывающегося с человеческим белком окулоспанина и содержащегося в растворе клеточного экстракта. Очищенный белок анализируют для определения его структуры. Белок, который может быть очищен, как описано выше, включает в себя белок, который связывается непосредственно с человеческим белком окулоспанина и белком, образующим комплекс в виде субъединицы с белком, который связывается непосредственно с человеческим белком окулоспанина, но не имеющим связывающей активности в отношении человеческого белка окулоспанина, связывающимся таким путем опосредованно с человеческим белком окулоспанина [см. Experimental Medicine, Supplementary volume, Biomanual series 5, "Transcriptional factor investigation method" pp 215-219 (published by Yodosha Co., Ltd.)].
В качестве альтернативных способов существует способ клонирования в соответствии с Far-Western-блоттингом (Experimental Medicine, Supplementary volume, New Genetic Engineering Handbook, pp66-75, published by Yodosha Co. Ltd.), и двухгибридная система, использующая дрожжи или клетку млекопитающего (Experimental Medicine, Supplementary volume, New Genetic Engineering Handbook, pp66-75, published by Yodosha Co. Ltd.) и "Checkmate mammalian two hybrid system" (производимая Promega). Однако настоящее изобретение не ограничивается использованием этих способов.
Если кДНК белка-партнера, прямо или опосредованно взаимодействующего с человеческим белком окулоспанина, является, таким образом, доступной, она может быть использована в функциональном скрининге вещества, ингибирующего взаимодействие между человеческим белком окулоспанина и белком-партнером. Более конкретно, может быть получен слитый белок человеческого белка окулоспанина с глутатион-S-трансферазой. Слитому белку дают связываться с микропланшетом, покрытым антителом против глутатион-S-трансферазы и биотинилированный белок-партнер приводят в контакт со слитым белком. Связывание белка-партнера со слитым белком может быть определено с использованием щелочной фосфатазы, конъюгированной со стрептавидином. При добавлении биотинилированного белка-партнера одновременно добавляют тестируемые вещества для отбора вещества, которое стимулирует или ингибирует связывание слитого белка и белка-партнера. При помощи этого способа может быть получен субстрат, непосредственно действующий на слитый белок, или вещество, непосредственно действующее на белок-партнер.
При непосредственном связывании слитого белка с белком-партнером через другой фактор анализ выполняют в присутствии раствора клеточного экстракта, содержащего этот фактор. В этом случае может быть отобрано вещество, которое может действовать на указанный фактор.
Когда полученный белок-партнер имеет активность ингибирования функции человеческого белка окулоспанина, можно проводить скрининг противоракового агента, например полезного вещества-кандидата в качестве терапевтического агента для предстательной железы, в соответствии со способом тестирования, использующим экспрессирующий вектор, содержащий ген человеческого белка окулоспанина, как описано выше. Кроме того, когда полученный белок-партнер имеет активность ингибирования функции человеческого белка окулоспанина, полинуклеотид, имеющий последовательность, кодирующую супрессор, может быть использован в генотерапии рака.
Такой полинуклеотид может быть получен анализом аминокислотной последовательности идентифицированного ингибитора, синтезом олигонуклеотидного зонда, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, и скринингом библиотеки кДНК или геномной библиотеки. Кроме того, в случае когда пептид, имеющий ингибиторную активность против функции человеческого белка окулоспанина, получен из библиотеки искусственных пептидов, синтезированных случайным образом, может быть химически синтезирована ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность данного пептида.
В генотерапии ген, кодирующий такой ингибитор, интегрируют, например, в вирусный вектор, и пациент может быть инфицирован вирусом (аттенуированным), содержащим полученный рекомбинантный вирусный вектор. В организме пациента образуется противораковый фактор и функционирует, подавляя пролиферацию раковых клеток. Таким путем можно лечить рак.
В качестве способа введения генотерапевтического агента в клетку может быть использована как трансфекция гена с использованием вирусного вектора, так и невирусная трансфекция гена [Nikkei Science, 4, (1994), p. 20-45; Experimental Medicine, Extra number, 12 (15) (1994); Experimental Medicine, Supplementary volume, "Basic Technology of Gene Therapy" Yodosha, Co. Ltd.)].
Примеры трансфекции гена с использованием вирусного вектора включают в себя способы интеграции ДНК, кодирующей ингибитор, или мутированной версии ДНК в ДНК-вирус или с использованием РНК-вируса, такого как ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, герпесвирус, вирус коровьей оспы, поксвирус, полиовирус и вирус Синдбис, и введением этого вирусного вектора в организм. Из них особенно предпочтительными являются способы, использующие ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус и вирус коровьей оспы. Примеры невирусной трансфекции гена включают в себя способ введения экспрессионной плазмиды в мышцу (способ вакцинации ДНК), липосомное введение, липофекцию, микроинъекцию, кальций-фосфатный способ и способ электропорации. Из них предпочтительными являются вакцинация ДНК и липосомный способ.
Для использования генотерапевтического агента в качестве лекарственного средства на практике имеется способ in vivo для введения ДНК непосредственно в организм и способ ex vivo, который предусматривает взятие определенного типа клеток из организма, введение ДНК в эти клетки и возврат этих клеток в организм [Nikkei Science, 4, (1994), p. 20-45; The Pharmaceutical Monthly, 36(1), 23-48 (1994); Experimental Medicine, Extra number, 12 (15) (1994)].
При введении генотерапевтического агента в соответствии со способом in vivo его вводят подходящим способом введения, таким как введение через вену, артерию, подкожную ткань, интрадермальную ткань или мышцу, причем способ варьируется в зависимости от типа заболевания и симптомов. При введении агента в соответствии со способом in vivo генотерапевтический агент готовят обычно в форме инъекционного раствора; однако, если необходимо, может быть добавлен обычно используемый носитель. Кроме того, при получении агента в форме липосомы или мембраносвязанной липосомы (вирус Сендай-липосома и т.д.) липосомный агент может быть добавлен в качестве суспензионного агента, лиофилизированного агента или концентрированного центрифугированием и лиофилизированного агента.
Последовательность, комплементарная нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, или последовательность, комплементарная частичной последовательности нуклеотидной последовательности, может быть использована в качестве так называемой антисмысловой терапии. В качестве антисмысловой молекулы может использоваться ДНК, частично комплементарная нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:1 из списка последовательностей и обычно образованной из 15-30-мера. Можно использовать также стабильное производное ДНК, такое как фосфортиоатное производное, метилфосфонатное производное или морфолинопроизводное ДНК, или стабильное производное РНК, такое как 2'-О-алкил-РНК. Такая антисмысловая молекула может быть введена в клетку способом, известным в области, к которой относится настоящее изобретение, например инъекцией чрезвычайно малого количества антисмысловой молекулы, образованием липосомной капсулы или экспрессией ее с использованием вектора, имеющего антисмысловую последовательность. Такая антисмысловая терапия применима для лечения заболевания, вызванного избыточной активностью белка, кодируемого нуклеотидной последовательностью, представленной SEQ ID NO:1 из списка последовательностей.
Композиция, содержащая антисмысловой олигонуклеотид, полезна в качестве лекарственного средства, может быть получена известным способом, включающим в себя смешивание с фармацевтически приемлемым носителем. Примеры такого носителя и способа получения описаны в Applied Antisense Oligonucleotide Technology (1998 Wiley-Liss, Inc.). Препарат, содержащий антисмысловой олигонуклеотид и который может быть введен перорально, получают смешиванием с фармацевтически приемлемым эксципиентом или разбавителем в форме таблеток, капсул, гранул, порошка или сиропа, или введен парентерально в форме инъекции, суппозитория, пластыря или наружного препарата. Эти препараты могут быть получены известным способом с использованием добавок: эксципиентов, включающих в себя органические эксципиенты, такие как производные сахара (например, лактоза, белый сахар (сахароза), глюкоза, маннит и сорбит); производные крахмала (например, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, α-крахмал и декстрин); производные целлюлозы (например, кристаллическая целлюлоза); аравийская камедь; декстран и пуллулан; и неорганических эксципиентов, таких как производные силикатов (например, безводная кремниевая кислота, синтезированный силикат алюминия, силикат кальция и алюминат-метасиликат магния); фосфаты (например, гидрофосфат кальция); карбонаты (например, карбонат кальция) и сульфаты (например, сульфат кальция); смазывающих агентов, включающих в себя стеараты металлов (например, стеариновую кислоту, стеарат кальция и стеарат магния); тальк; колоидальный диоксид кремния; воски (например, пчелиный воск и спермацетовый воск), борную кислоту; адипиновую кислоту; сульфаты (например, сульфат натрия), гликоль; фумаровую кислоту; бензоат натрия; DL-лейцин; лаурилсульфаты (например, лаурилсульфат натрия и лаурилсульфат магния); силикаты (например, безводный силикат, гидрат силиката); и производные крахмала, указанные выше; связывающих агентов, включающих в себя гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, макрогель и те же самые соединения, которые указаны в качестве эксципиентов; дезинтегрирующих агентов, включающих в себя производные целлюлозы (например, гидроксипропилцеллюлозу с низкой степенью замещения, карбоксиметилцеллюлозу, кальций-карбоксиметилцеллюлозу, натрий-карбоксиметилцеллюлозу с внутренними сшивками и химически модифицированные крахмал-целлюлозы (например, карбоксиметилкрахмал, натрий-карбоксиметилкрахмал и сшитый поливинилпирролидон); эмульгирующих агентов, включающих в себя коллоидальный диоксид кремния (бентонит и пчелиную камедь), гидроксиды металлов (например, гидроксид магния и гидроксид алюминия), анионогенные поверхностно-активные вещества (например, лаурилсульфат натрия и стеарат кальция); катионогенные поверхностно-активные вещества (например, хлорид бензалкония) и неионогенные поверхностно-активные вещества (например, простой алкиловый эфир полиоксиэтилена, простой эфир полиоксиэтиленсорбитана и жирной кислоты и эфир сахарозы и жирной кислоты); стабилизирующих агентов, включающих в себя параоксибензоаты (например, метилпарабен, пропилпарабен); спирты (например, хлорбутанол, бензиловый спирт и фенилэтиловый спирт); хлорид бензалкония; фенолы (например, фенол и крезол); тимерозал; дегидроацетат и сорбиновую кислоту; улучшающих вкус и запах агентов, включающих в себя обычно используемые подслащивающие вещества, кислотные ароматизаторы и ароматизаторы; и разбавителей.
В качестве способа введения соединения настоящего изобретения пациенту может быть использована коллоидальная дисперсионная система наряду с приведенными выше способами. Ожидается, что коллоидальная дисперсионная система способствует увеличению стабильности соединения в организме и эффективному транспортированию указанного соединения к специфическому органу, специфической ткани или клетке. Выбор коллоидальной дисперсионной системы не является особо ограничиваемым, пока она используется обычным образом, и, например, может быть использована дисперсионная система на основе липидов, которая включает в себя полимерные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы или эмульгаторы для получения эмульсий типа масло-в-воде, мицеллы, смеси мицелл или липосомы. Предпочтительная коллоидальная дисперсионная система состоит из множественных липосом или везикул искусственной мембраны, которая эффективна в эффективном транспорте соединения к специфическому органу, ткани или клетке (Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682; Blume and Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, 1990, 1029, 01; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698).
Однослойная липосома с размером 0,2-0,4 мкм способна инкапсулировать большую долю макромолекул, содержащихся в водном буфере. Соединение может быть инкапсулировано в такой водной внутренней мембране и транспортировано в клетки головного мозга в биологически активной форме (Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 1981, 6, 77). Липосома обычно состоит из смеси липида, в частности фосфолипида, более предпочтительно фосфолипида, имеющего высокую температуру фазового перехода, с одним или несколькими типами стероида, в частности холестерином. Примеры липида, полезного для получения липосомы, включают фосфатидильные соединения, такие как фосфатидилглицин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, сфинголипид, фосфатидилэтаноламин, цереброзид и ганглиозид. Из них особенно полезным является диацилфосфатидилглицерин, в котором липидная часть имеет 14-18 атомов углерода, в частности 16-18 атомов углерода, и является насыщенной (т.е. отсутствует двойная связь в С14-С18-цепи атомов углерода). Типичные фосфолипиды включают в себя фосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин и дистеароилфосфатидилхолин.
Коллоидальная дисперсионная система, содержащая липосомы, может быть использована для пассивного или активного нацеливания. Пассивное нацеливание может быть достигнуто с использованием тенденции, присущей липосомам, которые стремятся распределяться в ретикулоэндотелиальной системе органа, содержащего синусоидные капилляры. Альтернативно, активное нацеливание может быть достигнуто модификацией липосом, например, связыванием с ними специфического лиганда, такого как белковая оболочка вируса (Morishita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 8474), моноклональное антитело (или его соответствующая связывающая часть)сахар, гликолипид и белок (или его соответствующий олигопептидный фрагмент); или, альтернативно, модификацией состава липосомы для распределения ее в органах или типах клеток, иных, чем органы и типы клеток, в которых липосомы природно локализованы. Поверхность коллоидальной дисперсионной системы может быть модифицирована различными способами для нацеливания. В системе доставки с использованием липосомы в качестве нацеливающего средства для поддержания лиганда для применения в нацеливании посредством сохранения прочной ассоциации с липидным бислоем липидную группу интегрируют в липидный бислой липосомы. Для связывания цепи липида с нацеливающим лигандом могут быть использованы различные связывающие группы. Примеры такого связывания нацеливающего лиганда со специфической молекулой клеточной поверхности, предпочтительно обнаруживаемой на клетке, к которой олигонуклеотид настоящего изобретения должен быть доставлен, включают в себя (1) гормон, фактор роста или его подходящий олигопептидный фрагмент, связывающиеся со специфическим клеточным рецептором, предпочтительно экспрессируемым клеткой, к которой желательна доставка; и (2) поликлональное антитело, моноклональное антитело или их подходящий фрагмент (например, Fab, F(ab')2), специфически связывающиеся с антигенным эпитопом, предпочтительно обнаруживаемым на клетке-мишени. Два или несколько биоактиваторов могут быть образованы в виде комплекса в одной липосоме и могут вводиться. Лекарственный агент для улучшения внутриклеточной стабильности и/или нацеливающей способности содержимого может быть добавлен к коллоидальной дисперсионной системе.
Хотя терапевтический ген настоящего изобретения может быть использован в количестве, варьируемом в зависимости от интенсивности симптомов, возраста и т.д., в случае перорального введения самый нижний предел для одной дозы составляет 1 мг (предпочтительно 30 мг) и самый верхний предел для одной дозы составляет 2000 мг (предпочтительно 1500 мг). В случае инъекции самый нижний предел для одной дозы составляет 0,1 мг (предпочтительно 5 мг) и самый верхний предел для одной дозы составляет 1000 мг (предпочтительно 500 мг). Такая доза может вводиться подкожно, внутримышечно или внутривенно.
Теперь настоящее изобретение будет описано более подробно посредством примеров, которые не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение. Следует обратить внимание на то, что отдельные операции, касающиеся манипуляции генами в последующих примерах, выполнены в соответствии со способами, описанными в "Molecular Cloning" (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., published by Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989), или выполнены с использованием коммерчески доступных реагентов или наборов в соответствии с их протоколами.
[Пример 1] Скрининг гена, специфически экспрессируемого в раковой клетке
Анализ профиля экспрессии выполняли с использованием EST-зонда (зонда Affimetrix GeneChip HG-133 223795_at: производимого Affimetrix), имеющего нуклеотидную последовательность, частично перекрывающуюся с последовательностью, представленной SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, с использованием базы данных (GeneExpress Software System Release 1.4.2), обеспечиваемой Genelogic company.
Экспрессию гена человеческого белка окулоспанина в различных клетках количественно сравнивали с учетом его транскрипции. В результате было обнаружено, что в 8 пробах меланоцитов уровни экспрессии является значительно высокими в сравнении с уровнями в пробах других клеток, включающих в себя 12 проб клеток крови, 6 проб глиальных клеток, 62 пробы эпителиальных клеток (их величины Р составляли <0,0001, =0,0007 и <0,0001 соответственно, фиг.1, верхняя фигура).
Затем уровни экспрессии гена человеческого белка окулоспанина сравнивали в пробах, полученных из ткани. Более конкретно, величину транскрипции сравнивали в отношении 66 проб, взятых у здоровых индивидуумов, и 33 проб меланомы. В результате было обнаружено, что величина транскрипции в пробах меланомы была значительно высокой (величина Р<0,0001, фиг.1, нижняя фигура). Кроме того, при сравнении проб кожи, взятых у 66 здоровых индивидуумов, с 12 пробами меланомы было обнаружено, что величина транскрипции в пробах меланомы является значительно более высокой (величина Р=0,0007, фиг.2, верхняя панель).
При сравнении проб кожи, взятых у 66 здоровых индивидуумов, с 12 пробами меланомы, полученными из ткани лимфатических узлов, было обнаружено, что величина транскрипции в пробах меланомы является значительно более высокой (величина Р=0,0003, фиг.2, нижняя панель).
Кроме того, при сравнении проб, взятых у 13 здоровых индивидуумов, с 12 пробами меланомы, полученными из ткани лимфатических узлов, было обнаружено, что величина транскрипции в пробах меланомы является значительно более высокой (величина Р=0,0011, панель фиг.3).
[Пример 2] Получение гена человеческого белка окулоспанина и конструирование экспрессионной плазмиды
а) Реакция ПЦР
В качестве праймера для амплификации кДНК человеческого белка окулоспанина при помощи ПЦР синтезировали олигонуклеотиды, имеющие следующие последовательности, в соответствии с обычным способом.
5'-CACCATGGAGGAGGGGGAGAGGAGCCC-3' (Праймер 1, SEQ ID N0:5 Из списка последовательностей)
5'-GCCCCGGGCGGGTTTGGCAGCGG-3' (Праймер 2, SEQ ID N0:6 из списка последовательностей)
Следует обратить внимание, что Праймер 1 является олигонуклеотидом, сконструированным добавлением 4 оснований, САСС, в качестве последовательности Козака, слева от инициирующего кодона гена человеческого белка окулоспанина, другими словами, олигонуклеотидом, сконструированным добавлением 4 оснований, последовательности CACC, к 5'-стороне нуклеотидной последовательности, состоящей из нуклеотидов 1-23 SEQ ID NO:1 из списка последовательностей. Последовательность САСС, поскольку она образует цепь, комплементарную 3'-концу вектора, при ее интеграции в клонирующий вектор pENTR/D-TOPO делает возможной интеграцию гена в данный вектор при сохранении ориентации указанного гена. Праймер 2 является олигонуклеотидом, состоящим из цепи, комплементарной нуклеотидной последовательности, состоящей из нуклеотидов 1043-1065 SEQ ID NO:1 из списка последовательностей.
Реакцию ПЦР выполняли с использованием ДНК-полимеразы PLATINUM Pfx (производимой Invitrogen) в соответствии с прилагаемым протоколом. Более конкретно, к 0,1 мкл полученной первой цепи кДНК добавляли 1,5 мкл каждого из 10 пмоль/мкл синтетического праймера 1 и синтетического праймера 2,5 мкл буфера для амплификации 10X Pfx, 1,5 мкл 10 мМ смеси dNTP, 1 мкл 50 мМ MgSO4, 0,5 мг ДНК-полимеразы PLATINUM Pfx, 10 мкл энхарценного раствора 10Х для ПЦР и 28,9 мкл стерилизованной воды с получением 50 мкл реакционного раствора ПЦР. Реакцию ПЦР выполняли с использованием термоциклера Peltier Thermal Cycler TPC-200 DNA Engine (производимого MJ Research), сначала нагреванием раствора ПЦР при 94°С в течение 2 минут, повторением 5 раз термоцикла, состоящего из реакций при 94°С в течение 30 секунд и 65°С в течение 2 минут; 5 раз термоцикла, состоящего из реакций при 94°С в течение 30 секунд, 60°С в течение 40 секунд и 68°С в течение одной минуты и 20 секунд; 5 раз термоцикла, состоящего из реакций при 94°С в течение 30 секунд, 55°С в течение 40 секунд и 68°С в течение одной минуты и 20 секунд; 35 раз термоцикла, состоящего из реакций при 94°С в течение 30 секунд, 50°С в течение 40 секунд и 68°С в течение одной минуты и 20 секунд, и, наконец, выдерживания раствора ПЦР при 68°С в течение 10 минут, с последующим хранением полученного раствора при 4°С. Желаемую кДНК получали, подвергая продукт реакции электрофорезу на 1,5% агарозном геле, проверкой амплификации кДНК NM_031945 (1069 п.о.) и очисткой этой ДНК из агарозного геля с использованием набора для очистки S.N.A.P. UV-Free Gel Purification (производимого Invitrogen) в соответствии с прилагаемым протоколом. Концентрацию полученной таким образом кДНК определяли с использованием программы 1D Image Analysis Software Version 3.5 (Kodak Digital Science EDAS290, производимой Kodak) со ссылкой на 1 т.п.о.-лэддер, который использовали в качестве ссылочных концентраций.
b) Клонирование кДНК человеческого белка окулоспанина в вектор pENTR/D-TOPO
кДНК NM_031945, полученную в примере 2а), клонировали в вектор pENTR/D-TOPO с использованием набора для клонирования pENTRDirectional TOPO (производимого Invitrogen) в соответствии с прилагаемым протоколом. Более конкретно, кДНК NM_031945 смешивали с вектором pENTR/D-TOPO, имеющим связанную с ним топоизомеразу, в реакционном буфере, поставляемом с указанным набором, и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Химически компетентную E. coli OneShot TOP10 (производимую Invitrogen) трансформировали с использованием продукта реакции, полученного и культивированного в агарозной среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина. Полученные колонии E. coli, которые проявляли устойчивость к канамицину, отбирали и культивировали в жидкой ТВ-среде, содержащей 1 мл 50 мкг/мл канамицина, при 37°С в течение ночи. Плазмидную ДНК выделяли и очищали с использованием набора Montage Plasmid Miniprep96 (производимого Millipore). Затем плазмиду ДНК, полученную таким образом, подвергали реакции с использованием готового реакционного набора BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing в соответствии с прилагаемым протоколом, нуклеотидную последовательность анализировали с использованием ДНК-анализатора ABI PRISM 3100 (производимого Applied Biosystems). В результате было подтверждено, что кДНК (SEQ ID NO:1 из списка последовательностей), имеющая открытую рамку считывания из нуклеотидов, представленных GenBank Accession No. NM_031945, была интегрирована в вектор pENTR/D-TOPO.
Затем ген переносили в экспрессирующий вектор, pcDNA3.1/DEST40 (производимый Invitrogen) с использованием системы GATEWAY™. Для более конкретного объяснения, 4 мкл смеси ферментов GATEWAY™ LR Clonase (производимой Invitrogen), 4 мкл реакционного буфера LR, 0,3 мкг pENTR/D-TOPO_031945 и 0,3 мкг pcDNA3.1/DEST40 смешивали и получали 20 мкл реакционного раствора в ТЕ-буфере. Реакционному раствору давали реагировать при 25°С в течение одного часа. После реакции добавляли 2 мкл протеиназы К и проводили реакцию при 37°С в течение 10 минут. С использованием полученного продукта реакции химически компетентную E. coli OneShot TOP10 (производимую Invitrogen) трансформировали и культивировали в агарозной среде LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Полученные колонии E. coli, проявляющие устойчивость к ампициллину, отбирали и культивировали в 100 мл жидкой LB-среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при 37°С в течение ночи и плазмидную ДНК (pcDNA3.1/DEST40-NM_031945) выделяли и очищали с использованием набора Plasmid MAXI (производимого Qiagen).
[Пример 3] Введение гена человеческого белка окулоспанина в клетки, подтверждение, что экспрессируется продукт гена человеческого белка окулоспанина, и получение мембранной фракции из экспрессирующих человеческий белок окулоспанина клеток для использования в качестве иммуногена
а) Трансфекция клеток NIH3T3 плазмидой pcDNA3.1/DEST40-NM_031945
Клетки NIH3T3 трансфицировали плазмидой pcDNA3.1/DEST40-NM_031945, полученной в примере 2, следующим образом. Трансфекцию клеток NIH3T3 выполняли липофекцией с использованием реагента липофектамина™ 2000, производимого Invitrogen. Более конкретно, сначала клетки NIH3T3 выращивали в 6-луночном планшете до полуконфлюентного состояния. Затем клетки промывали один раз не содержащей антибиотиков DMEM, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, затем к клеткам добавляли 200 мкл не содержащей антибиотиков DMEM, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку. Затем в пробирку Эппендофа объемом 1,5 мл добавляли 100 мкл бессывороточной среды (DMEM) и 2 мкг плазмидной ДНК (pcDNA3.1/DEST40-NM_031945), извлеченной приведенным выше способом, и смешивали. В другую пробирку Эппендофа объемом 1,5 мл добавляли 96 мкл бессывороточной среды (DMEM) и 4 мкг реагента липофектамина™ 2000 и смешивали. Раствор ДНК и раствор липофектамина смешивали и выдерживали при стоянии при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем смесь ДНК-раствор липофектамина добавляли к клеткам и культивировали при 37°С в 5% СО2. Спустя 4 часа, добавляли 1 мл DMEM, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, и клетки культивировали при 37°С в течение ночи в 5% СО2.
b) Подтверждение экспрессии плазмиды pcDNA3.1/DEST40-NM_031945 в клетках NIH3T3
Продукт культуры клеток, полученный таким образом, извлекали. Полученные отрицательные контроли, не содержащие кДНК или клеток NIH3T3, трансфицированных pcDNA3.1/DEST40-NM_031945, промывали ЗФР(-)-буферным раствором (производимым Invitrogen). Клетки диспергировали в буферном растворе для нанесения проб (производимом BioRad), содержащем 2-меркаптоэтанол, для использования в электрофорезе на ДСН-полиакриламидном геле (SDS-PAGE). SDS-PAGE проводили, используя 12,5% полиакрилатный гель (e PAGEL ET12.5L; производимом АТТО corporation) при восстанавливающих условиях.
После электрофореза полосы переносили из полиакриламидного геля на поливинилидендифторидную (PVDF) мембрану (производимую Millipore) с использованием устройства для гель-мембранного переноса (NP7513, производимого Marysol) в буферном растворе для переноса (192 мМ глицин, 20% метанол, 25 мМ Трис) в следующих условиях: 4°С, 120 минут и 200 мА.
После перенесения PVDF-мембрану подвергали Вестерн-блот-анализу с использованием анти-V5-tag-антитела (производимого Invitrogen). Более конкретно, сначала PVDF-мембрану блокировали с использованием blockace (производимого Yukijirushi Co.) один раз при комнатной температуре в течение 30 минут и помещали в пластиковый мешок (товарное название: Hybribag, производимый Cosmo Bio). В мешок добавляли анти-V5-tag-антитело (1000-кратное разведение) и 5 мл blockace и мешок встряхивали при комнатной температуре в течение одного часа. Спустя один час мембрану вынимали и промывали ЗФР, содержащим 0,05% Твин 20 (здесь и далее называемым «0,05% Твин 20-ЗФР»), один раз при комнатной температуре в течение 15 минут и два раза в течение 5 минут. Затем мембрану переносили в новый пластиковый мешок. В этот мешок добавляли 30 мл раствора, содержащего меченое пероксидазой хрена антитело против кроличьего IgG (производимое Amersham Pharmacia), разведенное в 5000 раз 0,05% Твин 20-ЗФР, и встряхивали при комнатной температуре в течение одного часа. Спустя один час мембрану вынимали и промывали ЗФР, содержащим 0,05% Твин 20, один раз при комнатной температуре в течение 15 минут и четыре раза в течение 5 минут. После промывки мембрану помещали на оберточную пленку и полосу, имеющую связанное с ней анти-V5-tag-антитело, определяли с использованием раствора для обнаружения Вестерн-блоттинга ECL (производимого Amersham Pharmacia). Мембрану помещали на оберточную пленку и пропитывали в растворе для обнаружения Вестерн-блоттинга ECL в течение одной минуты и затем экспонировали на рентгеновской пленке (одну минуту). В результате полосу, специфическую для клеток NIH3T3, имеющих ДНК плазмиды pcDNA3.1/DEST40-NM_031945, введенной в них, определяли по присутствию анти-V5-tag-антитела (фиг.4).
с) Трансфекция клеток BALB-3T3 плазмидой pcDNA3.1/DEST40-NM_031945
Клетки BALB/c (American Type Culture Collection No. CCL-163) культивировали в трех клеточных лотках (площадь культивирования: 500 см2, производимых Sumitomo Bakelite Co., LTD.) для культуры клеток в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (здесь и далее называемой «DMEM»), производимой Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., содержащей 10% коровью сыворотку (здесь и далее называемую "BS"), производимую Gibco, при 37°С в 5% газообразном СО2 до полуконфлюентного состояния. Затем клетки BALB/c трансфицировали плазмидой pcDNA3.1/DEST40-NM_031945. Трансфекцию клеток BALB/c выполняли липофекцией с использованием реагента для трансфекции Geneporter™ 2 (производимого Gene Therapy Systems). Более конкретно, клетки промывали один раз с использованием бессывороточной среды DMEM. К клеткам добавляли 500 мл бессывороточной среды (DMEM). Затем в пробирку Falcon объемом 50 мл добавляли 6 мл разбавителя ДНК (New DNA diluent) и 240 мкг плазмидной ДНК (pcDNA3.1/DEST40-NM_031945), полученной приведенным выше способом, и смешивали. В другую пробирку Falcon объемом 50 мл добавляли 4,8 мл бессывороточной среды (DMEM) и 1200 мкл реагента Geneporter™ 2 и смешивали. Раствор ДНК и раствор Geneporter™ 2 смешивали и выдерживали при стоянии при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем к клеткам добавляли смесь раствора с Geneporter™ 2 (4 мл/лоток) и культивировали при 37°С в присутствии 5% СО2. Спустя 4 часа добавляли DMEM, содержащую 20% бычью сыворотку в количестве 50 мл/лоток и культивировали при 37°С в 5% СО2 в течение ночи.
d) Получение фракции клеточных мембран
Клетки, культивируемые вышеуказанным способом, промывали ЗФР(-)-буферным раствором (производимым Invitrogen). Клетки собирали с использованием клеточного скребка (скрепера) (производимого Sumitomo bakelite Co., Ltd.) и суспендировали в 7 мл 5 мМ Трис-буфера при рН 8,0. Полученный раствор клеток выдерживали при стоянии при 4°С в течение 30 минут. Клетки измельчали с использованием гомогенизатора Даунса типа В (30 тактов) и центрифугировали при 1000g в течение 10 минут. Супернатант извлекали, центрифугировали при 78000g в течение 100 минут с использованием ультрацентрифуги (производимой Hitachi) и осадок извлекали. Осадок подвергали центрифугированию в градиенте плотности сахарозы для концентрирования фрагментов мембран. Более конкретно, осадок растворяли в 3 мл раствора 57% сахарозы и 0,25М Трис-буфера, рН 8,0. Полученный раствор переносили в ультрацентрифужную пробирку. Аликвоту 3 мл раствора 57% сахарозы и 0,25М Трис-буфера, рН 8,0, и 1,5 мл раствора 37,5% сахарозы и 0,25М Трис-буфера рН 8,0 наслаивали последовательно на раствор осадка клеток. Затем центрифугирование проводили с использованием ультрацентрифуги при 75500g в течение 16 часов. Аликвоту 1 мл отбирали из верхней части каждой пробирки. К каждой аликвоте (фракции) добавляли 10 мл 5 мМ Трис-буфера рН 8,0 и ультрафентрифугировали при 78000g в течение одного часа для извлечения осадка. К осадку добавляли 500 мкл 5 мМ Трис-буфера рН 8,0 и раствор клеток гомогенизировали с использованием гомогенизатора Даунса типа В (10 тактов). Фракцию клеточных мембран идентифицировали при помощи Вестерн-блоттинга, описанного в разделе «Подтверждение экспрессии», и использовали в качестве иммуногена.
[Пример 4] Иммунизация мышей и слияние клеток
(4-1) Иммунизация
1 мл (количество общего белка: 100 мкг) раствора мембранной фракции экспрессирующих человеческий белок окулоспанина клеток, полученных в примере 3, инъецировали внутрибрюшинно в мышей BALB/c, которые имели возраст 4-10 недель (купленных у Lapan SLC Inc.). Спустя две недели тот же самый раствор мембранной фракции (20 мкг белка/мышь) инъецировали в брюшную полость в качестве бустер-иммунизации.
(4-2) Слияние клеток
Селезенку вырезали из мыши на третий день после бустер-иммнизации и добавляли к 10 мл бессывороточной среды RPMI 1640 (10,4 г/л, RPMI 1640 "Nissui"(1): производимой Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., здесь и далее называемой «бессывороточной средой RPMI 1640»), содержащей 20 мМ HEPES-буфер (рН 7,3), 350 мг/мл гидрокарбоната натрия, 0,05 мМ β-меркаптоэтанол, 50 единиц/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 300 мкг/мл L-глутаминовой кислоты, и селезенку измельчали на сетке клеточного сита (клеточные сита, производимые Falcon) с использованием шпателя. Раствор суспензии клеток, пропущенный через сетку, центрифугировали для сбора клеток селезенки. Клетки селезенки промывали дважды бессывороточной средой RPMI 1640, суспендировали в бессывороточной среде RPMI 1640 и подсчитывали количество клеток.
Миеломные клетки NSI (American Type Culture Collection TIB-18) культивировали в среде ASF 104 (производимой Ajinomoto; здесь и далее называемой "содержащей сыворотку средой ASF"), модифицированной 10% ФТС (производимой Gibco BRL), при 37°С в 5% газе СО2, так чтобы плотность клеток не превышала 1×108 клеток/мл. Полученные таким образом клетки миеломы промывали бессывороточной средой RPMI 1640 таким же образом, как описано выше, и суспендировали в бессывороточной среде RPMI 1640 и подсчитывали количество клеток.
Раствор суспензии клеток NSI, содержащий приблизительно 3×107 клеток, и раствор суспензии клеток селезенки, содержащий приблизительно 3×108 клеток, смешивали, подвергали центрифугированию и затем супернатант полностью удаляли. Операцию слияния клеток, описанную ниже, выполняли при выдерживании пластиковой центрифужной пробирки, содержащей осадок, в химическом стакане, содержащем горячую воду при 37°С. К осадку медленно добавляли 1 мл 50% (масса/объем) полиэтиленгликоля 1500 (производимого Boehringer Mannheim) при помощи пипетки при перемешивании осадка, используя кончик пипетки. Затем осторожно добавляли дважды 1 мл бессывороточной среды RPMI 1640, предварительно нагретой до 37°С, и дополнительно добавляли 7 мл бессывороточной среды RPMI 1640. После центрифугирования супернатант удаляли и добавляли пипеткой 10 мл гипоксантин-аминоптерин-тимидиновой среды (здесь и далее называемой "средой НАТ", производимой Boehringer Mannheim), содержащей 10% ФТС, при осторожном перемешиванием при помощи кончика пипетки. После добавления 20 мл среды НАТ, содержащей 10% ФТС, полученный раствор распределяли в 96-луночный культуральный микропланшет в количестве 100 мкл на лунку и культивировали при 37°С в 5% газообразном СО2. Спустя семь-восемь дней в лунки, содержащие среду с желтым оттенком, добавляли свежую среду НАТ в количестве 100 мкл на лунку. Полученные таким образом слитые клетки подвергали скринингу с использованием анализа лимитирующего разведения, описанного ниже.
(4-3) Лимитирующее разведение
Вилочковую железу вырезали из самок мышей BALB/c в возрасте 4-10 недель (купленных у Lapan SLC Inc.) и измельчали на сетке клеточного сита (клеточные сита, производимые Falcon) с использованием шпателя. Клетки, пропущенные через сетку, промывали дважды гипоксантин-тимидиновой средой (здесь и далее называемой "средой НТ", производимой Boehringer Mannheim), содержащей 10% ФТС. Клетки вилочковой железы мыши суспендировали в 30 мл среды НТ, содержащей 10% ФТС. Полученный таким образом раствор суспензии использовали в качестве раствора клеток-фидеров. Культуральный раствор, содержащий слитые клетки, полученные в разделе (4-2), разводили в 10-100 раз раствором клеток-фидеров в зависимости от плотности клеток и дополнительно серийно разводили раствором клеток-фидеров до плотности слитых клеток 5 клеток/мл, 1 клетка/мл и 0,5 клеток/мл. Каждую из полученных таким образом проб помещали в 96-луночный микропланшет для культивирования в количестве 100 мкл на лунку и культивировали при 37°С в 5% газообразном СО2 в течение 5 дней.
(4-4) Скрининг
(4-4-1) Клетки ELISA
Экспрессирующие человеческий белок окулоспанина клетки поддерживали культивированием их в среде RPMI 1640 (производимой Invitrogen), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (производимой Moregate Biotech), 20 мМ HEPES (производимого Sigma) и 55 мкМ 2-меркаптоэтанолом (производимым Invitrogen) при 37°С в газообразном СО2. Экспрессирующие человеческий белок окулоспанина клетки в логарифмической фазе роста высевали в сосуд для культивирования клеток при плотности 2×104 клеток/см2 и культивировали в течение 3 дней. Полученные таким образом экспрессирующие человеческий белок окулоспанина клетки переносили в пробирку объемом 50 мл и центрифугировали с использованием HITACHI himac CF8DL при 1000 об/мин в течение 5 минут (Условие 1 центрифугирования). Супернатант удаляли и экспрессирующие человеческий белок окулоспанина клетки суспендировали в среде. После этого количество живых клеток считали с использованием 0,4% раствора трипанового синего (производимого Sigma). Плотность живых экспрессирующих человеческий белок окулоспанина клеток доводили до 107 клеток на мл, используя среду, и полученную среду разливали в 96-луночный планшет с U-донными лунками в количестве 100 мкл на лунку. 96-луночный планшет с U-донными лунками центрифугировали с использованием HITACHI himac CF8DL при 15000 об/мин в течение одной минуты (Условие 2 центрифугирования). Супернатант удаляли при помощи наконечника 200 мкл. 96-луночный планшет с U-донными лунками постукивали по боковой поверхности для суспендирования экспрессирующих человеческий белок окулоспанина клеток. К суспензии добавляли в количестве 100 мкл на лунку растворы гибридомного культурального супернатанта, концентрации которых были доведены до 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл средой, охлажденной на льду. При перемешивании 96-луночного планшета с U-донными лунками, используя планшет-миксер (производимый Fujirebio Inc.) c интервалами 15 минут, реакцию проводили при 4°С в течение 1,5 часов. После завершения реакции 96-луночный планшет с U-донными лунками центрифугировали при условии 2 центрифугирования и супернатант удаляли при помощи наконечника 200 мкл. В лунки добавляли раствор (ЗФР-5% ФТС), приготовленный добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки к ЗФР(-) (производимый Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) в количестве 200 мкл на лунку. После перемешивания при помощи планшет-миксера центрифугирование проводили при условии 2 центрифугирования и супернатант удаляли при помощи наконечника 200 мкл. Затем вышеуказанную операцию повторяли дважды. 96-луночный планшет с U-донными лунками постукивали по боковой поверхности для суспендирования экспрессирующих человеческий белок окулоспанина клеток. К суспензии добавляли меченное пероксидазой антитело против IgG человека (производимое Kirkegaad & Perry Laboratories), разведенное в 500 раз ЗФР-5%ФТС, охлажденное на льду, в количестве 100 мкл на лунку. При перемешивании 96-луночного планшета с U-донными лунками, используя планшет-миксер с интервалами 15 минут, проводили реакцию при 4°С в течение 1,5 часов. После завершения реакции 96-луночный планшет с U-донными лунками центрифугировали при условии 2 центрифугирования и супернатант удаляли с использованием наконечника 200 мкл. Затем добавляли ЗФР-5%ФТС в количестве 200 мкл на лунку и перемешивали, используя планшет-миксер, центрифугировали при условии 2 центрифугирования и затем супернатант удаляли с использованием наконечника 200 мкл. Затем вышеописанную операцию повторяли дважды. 96-луночный планшет с U-донными лунками постукивали по боковой поверхности для суспендирования экспрессирующих человеческий белок окулоспанина клеток. К суспензии добавляли субстрат для пероксидазы (производимый Nacalai Tesque Inc.) для развития окрашивания при комнатной температуре в количестве 100 мкл на лунку и перемешивали, используя планшет-миксер, в течение 10 минут. После центрифугирования при условии 2 центрифугирования супернатант переносили на 96-луночный плоскодонный планшет в количестве 50 мкл на лунку и измеряли оптическую плотность при 405 нм с использованием планшет-ридера (1420 ARVO multilabel counter, производимый PerkinElmer Inc.).
(4-4-2) Проточная цитометрия
Экспрессирующие человеческий белок окулоспанина клетки, полученные в примере 3, культивировали и выращивали в среде RPMI 1640, содержащей 10% ФТС, при 37°С в 5% газообразном СО2. Раствор клеточной суспензии, приготовленный таким образом, что он содержал 1×107 клеток/мл, распределяли в 96-луночный U-донный планшет (производимый Nunk) в количестве 50 мкл на лунку и центрифугировали (при 90g, 4°С в течение 10 минут). Супернатант удаляли и добавляли супернатант слитых клеток, культивируемых в разделе (4-3) выше, в количестве 50 мкл на лунку и перемешивали. Планшет выдерживали при стоянии в течение одного часа на льду, центрифугировали (при 90g, 4°С в течение 10 минут) и супернатант удаляли. Осадок промывали дважды буферным раствором для проточной цитометрии (ЗФР, содержащим 5% ФТС и 0,04% (м/о) азида натрия) в количестве 100 мкл на лунку и добавляли разведенную в 500 раз фракцию IgG козьего антитела против мышиного IgG (производимого Organon Technica), меченого флуоресцеин-5-изотиоцианатом (здесь и далее называемым «FITC»), в качестве вторичного антитела и выдерживали при стоянии на льду в течение одного часа. После центрифугирования (при 90g, 4°С в течение 10 минут) супернатант удаляли. Осадок промывали дважды 100 мкл буферного раствора для проточной цитометрии на лунку и после этого добавляли 50 мкл 3,7% раствора формалина и полученную смесь выдерживали при стоянии в течение 10 минут на льду. Таким образом клетки иммобилизовали. После центрифугирования (при 90g, 4°С в течение 10 минут) супернатант удаляли. Осадок снова промывали 100 мкл буферного раствора для проточной цитометрии на лунку и суспендировали в 100 мкл буфера для проточной цитометрии на лунку. Суспензию использовали в качестве пробы для проточной цитометрии. Интенсивность флуоресценции FITC, испускаемой из клеток в каждой пробе, измеряли с использованием проточного цитометра (Epics Elite, производимого Coulter) при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны обнаружения 530 нм. Когда интенсивность флуоресценции FITC экспрессирующих человеческий белок окулоспанина клеток, подвергнутых действию супернатанта из культуры слитых клеток, была гораздо более высокой (приблизительно 100-1000), чем интенсивность флуоресценции FITC (около 0,3) экспрессирующих человеческий белок окулоспанина клеток, не подвергнутых действию супернатанта из культуры слитых клеток, соответствующие слитые клетки отбирали.
(4-5) Клонирование
Клетки, отобранные в разделе (4-4) выше, подвергали ряду стадий (4-3)-(4-4) пять раз. Таким путем получали несколько гибридомных клонов, которые были способны продуцировать единственное антитело, способное связываться с экспрессирующими человеческий белок окулоспанина клетками, но не способное связываться с нетрансфицированными исходными клетками.
[Пример 5] Очистка моноклонального антитела против человеческого белка окулоспанина
Гибридомные клетки мышь-мышь, сконструированные в примере 4, культивировали в 1 литре среды ASF, содержащей 10% ФТС, при 37°С в 5% газообразном СО2, пока плотность клеток не достигала 1×106 клеток/мл. Культуральный раствор центрифугировали (при 1000 об/мин в течение 2 минут), супернатант отбрасывали и собранные клетки промывали один раз бессывороточной средой ASF. После этого клетки ресуспендировали в 1 литре бессывороточной среды ASF и культивировали при 37°С в 5% газообразном СО2 в течение 48 часов. Культуральный раствор центрифугировали (при 1000 об/мин в течение 2 минут), супернатант извлекали и переносили в диализную пробирку (пределы исключения молекулярной массы: 12000-14000, производимую Gibco BRL). Диализ выполняли против 10-кратного количества 10 мМ забуференного фосфатом натрия раствора (рН 8,0). IgG, содержащийся в растворе в диализной пробирке, грубо очищали с использованием прибора для высокоэффективной жидкостной хроматографии (система FPLC, производимая Pharmacia) в условиях, описанных ниже:
Колонка: колонка DEAE-Сефарозозы CL-6B (размер колонки 10 мл, производимая Pharmacia);
Растворитель: 10 мМ забуференного фосфатом натрия раствора (рН 8,0);
Объемный расход: 1 мл/мин;
Элюирование: линейный градиент концентрации 1М хлорида натрия (0-50%, 180 минут).
Элюат фракционировали на пробы по 5 мл. Титр антител антитела против человеческого белка окулоспанина в каждой фракции проверяли по методу ELISA с использованием белка человеческого белка окулоспанина. Сначала раствор мембранной фракции, полученной из экспрессирующих человеческий белок окулоспанина клеток, полученной в примере 3, добавляли в 96-луночный микропланшет для ELISA в количестве 100 мкл на лунку и выдерживали в тепле при 37°С в течение одного часа. Затем раствор мембранной фракции отбрасывали и каждую лунку промывали три раза 100 мкл ЗФР-Твин на лунку. Затем добавляли 100 мкл ЗФР, содержащего 2% бычий сывороточный альбумин, на лунку и выдерживали в тепле при 37°С в течение одного часа. После промывки 100 мкл ЗФР-Твин на лунку добавляли 100 мкл элюированных фракций и выдерживали в тепле при 37°С в течение одного часа. Кроме того, после промывки три раза 100 мкл ЗФР-Твин на лунку добавляли меченное пероксидазой хрена антитело против мышиного иммуноглобулина (производимое Amersham), разведенное в 2000 раз в ЗФР-Твин, в количестве 100 мкл на лунку, давали реагировать при 37°С в течение одного часа и затем промывали три раза 100 мкл ЗФР-Твин на лунку. Затем добавляли субстрат для пероксидазы хрена (производимый BioRad) в количестве 100 мкл на лунку, выдерживали при стоянии в течение 5 минут и затем измеряли оптическую плотность каждой лунки при 415 нм с использованием микропланшет-ридера.
Соответствующие фракции, обнаруживающие высокую оптическую плотность, собирали и наносили на две колонки для аффинной очистки антител (Hitrap Protein G Column, объем колонки 5 мл, производимая Pharmacia). После промывки содержимого колонок 25 мл буфера для уравновешивания (20 мМ натрий-фосфатный буфер (рН 7,0) на одну колонку антитело элюировали с использованием 15 мл буфера для элюирования (0,1М гидрохлорид глицина (рН 2,7)) на колонку. Каждый элюат собирали в тест-пробирку, содержащую 1,125 мл 1М гидрохлорид Трис (рН 9,0). Сразу после завершения элюирования элюат наносили на верхнюю часть ультрафильтра в форме центрифужной пробирки (Centriprep 10, производимого Grace Japan) и центрифугировали при 3000g при 4°С в течение 2 часов. После удаления фильтрата, собранного в нижней части фильтра, к верхней части добавляли 15 мл ЗФР и снова центрифугировали при 3000g при 4°С в течение 2 часов. В целом, эту операцию повторяли пять раз. При 5-м повторении центрифугирование выполняли до тех пор, пока количество жидкости в верхней части фильтра не достигало 0,5 мл. Жидкость, оставшуюся в верхней части фильтра, использовали в качестве пробы антитела против человеческого белка окулоспанина.
[Пример 6] Цитотоксическая активность
Антитело-зависимую цитотоксическую активность измеряли в виде индекса биоактивности.
Количество экспрессирующих человеческий белок окулоспанина клеток (пример 3) считали методом окрашивания трипановым синим, концентрацию клеток доводили до 1×106 клеток/мл средой RPMI 1640 (производимой Invitrogen, здесь и далее называемой «средой RPMI»), содержащей 10% фетальную коровью сыворотку (производимую Moregate). К клеткам добавляли 2,5 мкл бис(ацетоксиметил)-2,2':6'2"-терпиридин-6,6"-дикарбоновой кислоты (BATDA, агент мечения, производимый Perkin Elmer), хорошо перемешивали и инкубировали при 37°С в 5% диоксиде углерода в течение 30 минут при перемешивании с интервалами 15 минут перевертыванием культуры. К культуральной среде добавляли 10 мл среды RPMI, перемешивали и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. Эту операцию промывки повторяли еще два раза. Полученные таким образом меченые BATDA экспрессирующие человеческий белок окулоспанина клетки ресуспендировали в 10 мл среды RPMI 1640. Аликвоту 50 мкл (5×103 клеток) суспензионного раствора высевали в каждую лунку круглодонного микропланшета, который готовили заранее добавлением очищенного мышиного антитела против человеческого белка окулоспанина, заранее доведенного средой RPMI 1640 до концентрации 1 мкг/мл, или супернатанта среды культивирования гибридомы и выдерживанием при 4°С в течение 30 минут. Микропланшет выдерживали при стоянии при 4°С в течение дополнительных 30 минут. В лунку отрицательного контроля добавляли либо очищенное мышиное антитело против человеческого белка окулоспанина, либо среду RPMI 1640 вместо гибридомного супернатанта.
Эффекторные клетки получали следующим образом. Клетки J774A.1 (доступные от Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) культивировали в присутствии 100 нг/мл колониестимулирующего фактора макрофагов (производимого Sigma) в течение 3 дней. Количество клеток J774A.1 считали по методу окрашивания трипановым синим и затем доводили до концентрации 1×106 клеток/мл средой RPMI. В каждую лунку указанного выше 96-луночного круглодонного микропланшета засевали аликвоту 100 мкл (1×105 клеток) клеток. Микропланшет центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут и инкубировали при 37°С в 5% газообразном СО2. В лунку положительного контроля добавляли 1% Тритон Х-100 вместо эффекторных клеток, чтобы полностью убить BATDA-меченые экспрессирующие человеческий белок окулоспанина клетки. После 4-часовой инкубации из каждой лунки отбирали 20 мкл культурального супернатанта и переносили в белый 96-луночный планшет. В планшет добавляли 200 мкл раствора европия (производимого PerkinElmer). Планшет встряхивали при комнатной температуре в течение 15 минут и измеряли уменьшение флуоресценции во времени.
Степень индукции смерти клеток в каждой лунке рассчитывали на основе приведенного ниже уравнения:
Степень индукции смерти клеток (%)=(величина флуоресценции для каждой тестируемой лунки-величина фона для лунки отрицательного контроля)/(величина флуоресценции для лунки положительного контроля-величина фона для лунки отрицательного контроля)×100.
Сравнением с контролем, содержащим только среду RPMI 1640, было подтверждено, что смерть клеток, экспрессирующих человеческий белок окулоспанина, индуцировалась добавлением очищенного мышиного антитела против человеческого белка окулоспанина или гибридомного супернатанта.
[Пример 7] Получение экспрессирующих человеческий белок окулоспанина клеток и их мембранной фракции в качестве иммуногена и антигена для обнаружения антитела.
а) Конструирование плазмиды pEF/DEST51-NM_031945
кДНК NM_031945, полученную в примере 2а), клонировали в вектор pENTR/D-TOPO с использованием набора для клонирования pENTR Directional TOPO (производимого Invitrogen) в соответствии с прилагаемым протоколом. кДНК NM_031945 смешивали с вектором pENTR/D-TOPO, имеющим связанную с ним топоизомеразу, в реакционном растворе, прилагаемом к набору, и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. С использованием полученного продукта реакции химически компетентную E. coli Oneshot TOP10 (производимую Invitrogen) трансформировали и культивировали в агарозной среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина. Полученные колонии E. coli, устойчивые к канамицину, отбирали и культивировали в 1 мл жидкой ТВ-среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина, при 37°С в течение ночи. Плазмидную ДНК выделяли и очищали с использованием набора Montage Plasmid Miniprep96 (производимого Millipore). Затем полученную таким образом плазмидную ДНК подвергали реакции секвенирования, выполняемой с использованием набора для реакции BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction в соответствии с прилагаемым протоколом, нуклеотидную последовательность анализировали с использованием ДНК-анализатора ABI PRISM 3100 (производимого Applied Biosystems). В результате было подтверждено, что кДНК (SEQ ID NO:1 из списка последовательностей), имеющая открытую рамку считывания нуклеотидной последовательности, представленной Accession No. NM_031945, интегрировалась в вектор pENTR/D-TOPO.
Затем ген переносили в экспрессирующий вектор, pcDNA3.1/DEST40 (производимый Invitrogen) с использованием системы GATEWAY™. Более конкретно, 4 мкл смеси ферментов GATEWAY™ LR Clonase™ (производимой Invitrogen), 4 мкл реакционного буфера LR, 0,3 мкг pENTR/D-TOPO-NM_031945 и 0,3 мкг pcDNA3.1/DEST40 смешивали c ТЕ-буфером с получением 20 мкл раствора, которому давали реагировать при 25°С в течение одного часа. После завершения реакции добавляли 2 мкл протеиназы К и проводили реакцию при 37°С в течение 10 минут. Химически компетентную E. coli OneShot TOP10 (производимую Invitrogen) трансфицировали продуктом реакции и культивировали в агарозной среде LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Полученные колонии E. coli, устойчивые к ампициллину, отбирали и культивировали в 100 мл жидкой LB-среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при 37°С в течение ночи. В результате плазмидную ДНК (pcDNA3.1/DEST40-NM_031945) выделяли и очищали с использованием набора Plasmid MAXI (производимого Qiagen).
Аналогичным образом ген переносили в экспрессирующий вектор pEF/DEST51 (производимый Invitrogen) с использованием системы GATEWAY™. Более конкретно, 4 мкл смеси ферментов GATEWAY™ LR Clonase™ (производимой Invitrogen), 4 мкл реакционного буфера LR, 0,3 мкг pENTR/D-TOPO-NM_031945 и 0,3 мкг pEF/DEST51 смешивали c ТЕ-буфером с получением 20 мкл раствора, которому давали реагировать при 25°С в течение одного часа. После реакции добавляли 2 мкл протеиназы К и проводили реакцию при 37°С в течение 10 минут. Химически компетентную E. coli OneShot TOP10 (производимую Invitrogen) трансфицировали продуктом реакции и культивировали в агарозной среде LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Полученные колонии E. coli, устойчивые к ампициллину, отбирали и культивировали в 100 мл жидкой LB-среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при 37°С в течение ночи. В результате плазмидную ДНК (pEF/DEST51-NM_031945) выделяли и очищали с использованием набора Plasmid MAXI (производимого Qiagen).
b) Трансфекция клеток BALB-3T3 и клеток 293Т плазмидой pEF-DEST51-NM_031945
Клетки BALB-3T3 (доступные от RIKEN, клон А31) культивировали в 330 чашках 150 мм для культивирования клеток (площадь культивирования: 148 см2, производимых IWAKI), содержащих модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (здесь и далее называемую «DMEM», производимую Sigma), содержащую 10% коровью сыворотку (производимую GIBCOT, здесь и далее называемую "BS"), при 37°С в 5% газообразном СО2 до полуконфлюентного состояния. Затем клетки BALB-3Т3 трансфицировали плазмидой pEF-DEST51-NM_031945. Трансфекцию клеток BALB-3N3 выполняли липофекцией с использованием реагента для трансфекции Geneporter™ 2, производимого Gene Therapy Systems. Более конкретно, клетки промывали один раз бессывороточной средой (DMEM) и добавляли 20 мл бессывороточной среды (DMEM). Затем в пробирку Falcon объемом 50 мл добавляли 0,6 мл разбавителя ДНК (New DNA diluent) и 24 мкг плазмидной ДНК (pEF-DEST51-NM_031945), полученной приведенным выше способом, и смешивали. В другую пробирку Falcon объемом 50 мл добавляли 84 мкл бессывороточной среды (Opti-MEM I, производимой GIBCO) и 84 мкл реагента Geneporter™ 2 и смешивали. Раствор ДНК и раствор Geneporter™ 2 смешивали и выдерживали при стоянии при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем к клеткам добавляли смесь растворов ДНК-Geneporter™ 2 (1 мл на чашку) и культивировали при 37°С в присутствии 5% СО2. Спустя 3 часа среду заменяли 20 мл DMEM, содержащей 10% коровью сыворотку, на чашку и культивировали при 37°С в 5% СО2 в течение ночи.
В дополнение, плазмиду pEF-DEST51-NM_031945 вводили в клетки 293Т следующим образом. Введение в клетки 293Т выполняли с использованием реагента липофектамина™ 2000 (производимого Invitrogen). Клетки 293Т высевали при плотности 2,5×107 клеток/9,2 см2 и культивировали при 37°С в течение в 5% СО2. В полипропиленовой пробирке объемом 5 мл смешивали 10 мкл реагента липофектамина™ 2000 и 250 мкл среды OPTI-MEM I с уменьшенной сывороткой (производимой Invitrogen) и давали реагировать друг с другом при комнатной температуре в течение 5 минут. В другой полипропиленовой пробирке объемом 5 мл смешивали 4 мкг плазмиды (pEF-DEST51-NM_031945) и 250 мкл среды OPTI-MEM I с уменьшенной сывороткой. Раствор липофектамина и раствор ДНК смешивали и давали реагировать друг с другом при комнатной температуре в течение 20 минут. Супернатант удаляли из клеток 293Т, культивируемых в течение ночи, и к клеткам добавляли не содержащую антибиотиков модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (производимую Gibco), содержащую 10% фетальную телячью сыворотку (производимую Moregate) в количестве 2 мл/9,2 см2. Раствор липофектамин-ДНК добавляли к клеткам 293Т и инкубировали при 37°С в 5% газообразном СО2 в течение 2 дней.
с) Получение фракции клеточных мембран (10 литров)
Клетки, культивируемые вышеуказанным способом, промывали ЗФР(-)-буферным раствором (производимым Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd.). Клетки собирали с использованием клеточного скребка (скрепера) (производимого IWAKI) и суспендировали в 230 мл 5 мМ Трис-буфера, рН 7,4. Полученный раствор клеток выдерживали при стоянии при 4°С в течение 30 минут. Клетки измельчали с использованием гомогенизатора Даунса типа В (50 тактов) и центрифугировали при 1000g в течение 10 минут. Супернатант извлекали, центрифугировали при 1000g в течение 10 минут с использованием ультрацентрифуги (производимой KUBOTA) и супернатант извлекали.
Супернатант центрифугировали при 78000g в течение 100 минут с использованием ультрацентрифуги (производимой BECKMAN) и осадок извлекали. На осадок наслаивали 14 мл 57% сахарозы в Трис-буфере и центрифугировали в градиенте плотности сахарозы при 78000g в течение 16 часов при 4°С. В результате извлекали мембранную фракцию из верхнего слоя. К мембранной фракции добавляли 55 мл 5 мМ Трис-буфера рН 7,4 и ультрацентрифугировали при 78000g в течение 60 минут при 4°С. Осадок извлекали. К осадку добавляли 1500 мкл 5 мМ Трис-буфера рН 7,4 и затем раствор клеток гомогенизировали с использованием гомогенизатора Даунса типа В (10 тактов). Фракцию клеточных мембран идентифицировали при помощи Вестерн-блоттинга, описанного в разделе «Подтверждение экспрессии».
[Пример 8] Иммунизация мыши и слияние клеток
а) Иммунизация
1×107 экспрессирующих человеческий белок окулоспанина клеток, полученных в примере 7, инъецировали внутрибрюшинно самкам мышей BALB/c, которые имели возраст 5 недель (купленных в Lapan SLC Inc.). Спустя 2, 4, 6 и 8 недель экспрессирующие человеческий белок окулоспанина клетки (1×107 клеток/мышь) инъецировали внутрибрюшинно в качестве бустер-иммунизации таким же образом.
b) Слияние клеток
Селезенку вырезали у мыши на четвертый день после бустер-иммнизации и добавляли к 10 мл бессывороточной среды МЕМ (9,4 г/л, среда МЕМ Игла "Nissui"(1): производимая Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., здесь и далее называемая «бессывороточной средой МЕМ»), содержащей 10 мМ HEPES-буфер (рН 7,4), 0,02 мг/л гидрокарбоната натрия и 300 мкг/мл L-глутаминовой кислоты, и затем клетки селезенки извлекали, используя шприц 21G' и пинцеты. Раствор суспензии клеток центрифугировали для осаждения клеток селезенки. Клетки селезенки промывали дважды бессывороточной средой МЕМ, суспендировали в бессывороточной среде МЕМ и подсчитывали количество клеток.
Миеломные клетки SP2/0 культивировали в среде для выращивания миеломы (здесь и далее называемой «средой МЕ»), содержащей 15% ФТС (производимую GIBCO), 306 мкг/мл глутаминовой кислоты и 0,05 мМ β-меркаптоэтанол, при 37°С в присутствии 7% газообразного диоксида углерода, так чтобы плотность клеток не превышала 1×106 клеток/мл. Культивируемые таким образом клетки миеломы промывали бессывороточной средой МЕМ, суспендировали в бессывороточной среде МЕМ и подсчитывали количество клеток.
Раствор суспензии клеток SP2/0, содержащий клетки, количество которых соответствовало приблизительно 1/5 клеток селезенки, и раствор суспензии всех клеток селезенки смешивали. После центрифугирования супернатант полностью удаляли. Операцию слияния клеток выполняли при выдерживании пластиковой центрифужной пробирки, содержащей осадок, при комнатной температуре. К осадку медленно добавляли 1 мл 40% (м/о) полиэтиленгликоля 4000 (производимого Merck) при встряхивании этой центрифужной пробирки. Затем осторожно добавляли 9 мл бессывороточной среды МЕМ, предварительно нагретой до 37°С, в виде трех порций. После центрифугирования супернатант удаляли и добавляли пипеткой гипоксантин-аминоптерин-тимидиновую среду (здесь и далее называемую "средой НАТ", производимую SIGMA), содержащую 20% ФТС, при осторожном перемешивании при помощи кончика пипетки таким образом, чтобы плотность клеток составила 2,5×106 клеток/мл. НАТ-среду распределяли в 96-луночном микропланшете для культивирования клеток в количестве 100 мкл на лунку и культивировали при 37°С в присутствии 7% газообразного диоксида углерода. Спустя один день во все лунки добавляли свежую НАТ-среду в количестве 100 мкл на лунку и затем среду заменяли свежей средой с интервалами 2-3 дня. Полученные таким образом слитые клетки подвергали скринингу с использованием анализа лимитирующего разведения, как описано ниже.
с) Лимитирующее разведение
Культуральный раствор, содержащий слитые клетки, полученные в разделе (b) выше, серийно разводили таким образом, чтобы плотность слитых клеток в НАТ-среде (НТ-среде в случае 2-го клонирования или позднее) составляла 1 клетка на лунку (10 клеток/мл) и 5 клеток на лунку (50 клеток/мл). Каждую из полученных таким образом проб распределяли в количестве 100 мкл на лунку в 96-луночном микропланшете, уже содержащем 100 мкл НТ-среды, и микропланшеты культивировали при 37°С в присутствии 7% газообразного диоксида углерода в течение 10 дней.
d) Скрининг
d-1) ELISA
Фракцию клеточных мембран, полученную в примере 7, готовили в растворе 1 мкг/мл, разлитом в 96-луночный планшет EIA (производимый Costar) в количестве 50 мкл на лунку. Планшет выдерживали при стоянии при 4°С в течение одного дня, раствор антигена в планшете отбрасывали встряхиванием лунки и добавляли 80 мкл раствора, содержащего 1% БСА в ЗФР(-) на лунку. Планшет герметизировали и хранили при 4°С до использования. При использовании планшет возвращали в условия комнатной температуры и промывали три раза с использованием устройства Serawasher (производимого Bio-Tec), при помощи которого подают ЗФР (ЗФР-Т), содержащий 0,1% Твин 20. В качестве первичного антитела в каждую лунку добавляли 50 мкл супернатанта клеточной культуры, полученного после 10-12-дневного слияния клеток, и давали планшеты выдерживали при стоянии при комнатной температуре в течение одного часа. После завершения реакции с первичным антителом планшет промывали три раза ЗФР-Т и в лунки добавляли меченное щелочной фосфатазой антитело против мышиного IgG (производимое BIO SOURCE), разведенное в 5000 раз раствором (раствором для разведения антигена), содержащим 0,5% БСА, добавленный к ЗФР-Т в количестве 50 мкл на лунку, и выдерживали при стоянии при комнатной температуре в течение одного часа. После завершения реакции со вторичным антителом субстрат для щелочной фосфатазы, п-нитрофенилфосфат, 2Na6H2O (pNPP, производимый Waco Pure Chemical Industry Ltd.), возвращенный в условия комнатной температуры, растворяли до концентрации 1 мг/мл в pNPP-буфере (97 мл/л диэтаноламин, 0,1 г/л MgCl2.6Н2О, рН 9,8) и добавляли в количестве 100 мкл на лунку. Оптическую плотность измеряли при 405 нм и 630 нм с использованием планшет-ридера (производимого Nalgene Nunc International).
d-2) Проточная цитометрия
Клетки НЕК293, полученные в примере 7, культивировали в среде DMEM, содержащей 10% ФТС, при 37°С в 5% газообразном СО2. После трансфекции клетки культивировали в течение 24 часов и суспензию клеток готовили таким образом, чтобы она содержала 2×107 клеток/мл. Раствор суспензии клеток разливали в 96-луночные V-донные микропланшеты (производимые Corning) в количестве 50 мкл на лунку и центрифугировали (1000g, 20°С в течение 5 минут). Супернатант удаляли и супернатант слитых клеток, культивируемых на стадии с) выше, добавляли в количестве 50 мкл на лунку, перемешивали, выдерживали при стоянии на льду в течение 0,75 часа, центрифугировали (1000g, 20°С в течение 5 минут) и затем супернатант удаляли. Осадок промывали дважды буферным раствором для проточной цитометрии (МЕМ, содержащим 5% ФТС) в количестве 150 мкл на лунку. Затем к осадку добавляли 100 мкл разведенного в 33 раза кроличьего антитела против мышиного IgG (производимого Waco Pure Chemical Industry Ltd.), меченного флуоресцеин-5-изотиоцианатом (здесь и далее называемым «FITC»), в качестве вторичного антитела, выдерживали при стоянии на льду в течение 0,75 часа и центрифугировали (1000g, 20°С в течение 5 минут). Супернатант удаляли, осадок промывали дважды с использованием 150 мкл на лунку буфера для проточной цитометрии в количестве 500 мкл на лунку. Затем его использовали в качестве пробы для проточной цитометрии. В каждой пробе интенсивность флуоресценции FITC, испускаемой из клеток, измеряли проточной цитометрией (FC500, производимый Beckman) при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны обнаружения 530 нм. В результате слитые клетки отбирали из пробы, проявляющей более высокую интенсивность флуоресценции, чем интенсивности флуоресценции транзиторно экспрессирующих клеток НЕК293, к которым не добавляли супернатант культуры слитых клеток.
е) Клонирование
Клетки, отобранные на стадии (d), подвергали дважды операциям стадий с)-d). В результате получали несколько гибридомных клонов, которые продуцировали моноклональное антитело, которое связывается с транзиторно экспрессирующимися клетками НЕК293, но не связываются с клетками, в которые не была введена экспрессирующая человеческий белок окулоспанина плазмида. Одна из полученных таким образом гибридомных линий была названа О3В8-2С9-4F3 и депонирована в Международном Депозитарии патентных организмов Международного Института передовой промышленной научной технологии 17 февраля 2004 года под номером депозита FERM BP-08627.
[Пример 9] Очистка моноклонального антитела против человеческого белка окулоспанина
Гибридому мышь-мышь, полученную в примере 8, суспендировали в среде HY в концентрации 1×106 клеток/мл и выдерживали при стоянии при 37°С в присутствии 7% диоксида углерода в течение 3 дней. Полученный таким образом культуральный раствор центрифугировали при 1600 об/мин в течение 5 минут. Супернатант извлекали и IgG грубо очищали следующим образом:
Буфер для связывания: рН 7,0 (20 мМ Na2HPO4.12Н2О, 20 мМ Na2HPO4.2Н2О);
Буфер для элюирования: рН 3,0, 100 мМ глицин-HCl;
Буфер для нейтрализации: рН 9,0, 1 М Трис-HCl.
Отбирали необходимую аликвоту носителя-белка G (производимого Amersham Bioscience). После удаления этанола аликвоту носителя-белка G промывали дважды ультрачистой водой и один раз буфером для связывания. Буфер для связывания добавляли к аликвоте носителя-белка G с получением 50% суспензии геля. Суспензию геля белка G добавляли к супернатанту гибридомы. Полученную смесь вращали при 4°С в течение 24 часов и промывали три раза буфером для связывания. После промывки добавляли буфер для элюирования, чтобы элюировать антитела. Элюат получали с использованием пробирки, содержащей буфер для нейтрализации в количестве 1/10 буфера для элюирования. Элюат наносили на верхнюю часть ультрафильтра пробирки для пробы (Amicon Ultrafree-MC: производимого Millipore) и центрифугировали при 5000g, 4°С в течение 20 минут. При удалении фильтрата, собранного в нижней части фильтра, элюат добавляли таким образом, чтобы количество жидкости в верхней части фильтра был по меньшей мере 50 мкл. После добавления всего количества элюата добавляли ЗФР(-) в объеме, в 3 раза большем, чем объем элюата. Таким образом выполняли замену буфера. Жидкость, оставшуюся в верхней части фильтра, обрабатывали в качестве пробы антитела против человеческого белка окулоспанина.
[Пример 10] Цитотоксическая активность
Антитело-зависимую цитотоксическую активность измеряли в виде индекса биоактивности. Количество экспрессирующих человеческий белок окулоспанина клеток, полученных в примере 7, считали методом окрашивания трипановым синим и затем концентрацию клеток доводили до 8×109 клеток/0,4 мл средой RPMI 164 0 (производимой Invitrogen, здесь и далее называемой «средой RPMI»), содержащей 10% фетальную коровью сыворотку (производимую Moregate). Затем к клеткам добавляли Хром-51 (хромат натрия, производимый Amersham Bioscience), клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 2 часов. К клеткам добавляли 8 мл среды RPMI, перемешивали и затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. Эту операцию промывки повторяли еще два раза. Полученные таким образом меченные Хромом-51 экспрессирующие человеческий белок окулоспанина клетки ресуспендировали в 4 мл среды RPMI и высевали в 96-луночный круглодонный планшет, в котором уже присутствовали 50 мкл 5 мкг/мл очищенного мышиного антитела против человеческого белка окулоспанина, доведенного средой RPMI, в количестве 50 мкл (1×104 клеток) на лунку и выдерживали при стоянии при 4°С в течение дополнительных 30 минут. В лунку отрицательного контроля или лунку измерения фона добавляли среду RPMI вместо очищенного мышиного антитела против человеческого белка окулоспанина.
Эффекторные клетки получали следующим образом. Клетки селезенки отбирали из мыши BALB/c-nu/nu (самки 7-недельного возраста в соответствии с обычным способом. Затем считали количество клеток методом окрашивания трипановым синим, концентрацию клеток доводили средой RPMI до 1,5×107 клеток/мл. Клетки высевали в 96-луночные круглодонные микропланшеты в количестве 100 мкл (1,5×106 клеток), центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут и инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 4 часов. В лунки положительного контроля добавляли 2% Тритон Х-100 вместо эффекторных клеток, чтобы полностью убить меченые Хромом-51 экспрессирующие человеческий белок окулоспанина клетки. В лунку для измерения фона добавляли среду RPMI 1640 вместо эффекторных клеток. Затем инкубировали в течение 4 часов, отбирали 50 мкл культурального супернатанта из каждой из этих лунок и переносили в 96-луночный планшет Luma (производимый PerkinElmer). Планшет дегидратировали при 50°С в течение ночи, количество Хрома-51 в каждой лунке измеряли сцинтилляционным счетчиком для микропланшетов (TopCourt NTX, производимым PerkinElmer).
Степень, в которой смерть клеток индуцировалась в каждой лунке, рассчитывали в соответствии со следующей формулой:
Степень индукции смерти клеток (%)=(величина радиоактивности для каждой тестируемой лунки - величина фона для лунки отрицательного контроля)/(величина радиоактивности для лунки положительного контроля-величина фона для лунки отрицательного контроля)×100.
Путем сравнения с отрицательным контролем было подтверждено, что добавление очищенного мышиного антитела против человеческого белка окулоспанина (фиг.5) индуцировало клеточную смерть в экспрессирующих человеческий белок окулоспанина клетках.
Промышленная применимость
В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что уровень экспрессии человеческого белка окулоспанина в меланоме является значительно высоким. В соответствии с настоящим изобретением предоставлен способ обнаружения рака с использованием гена человеческого белка окулоспанина и набор для обнаружения рака, дополнительно предоставлены антитело, имеющее цитотоксическую активность против экспрессирующих окулоспанин клеток, и фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая указанное антитело.
Независимый от списка последовательностей текст
SEQ ID NO:5: смысловой праймер ПЦР для амплификации человеческого белка окулоспанина.
1. Моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком окулоспанина человека, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, и обладает цитотоксической активностью в отношении раковых клеток, экспрессирующих указанный белок, где указанное антитело получают с использованием белка окулоспанина человека, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4 или являющегося фрагментом последовательности SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4.
2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что раковой клеткой является клетка рака кожи.
3. Антитело по п.1, отличающееся тем, что раковой клеткой является клетка меланомы.
4. Антитело по п.1, отличающееся тем, что цитотоксическая активность является антитело-зависимой клеточной цитотоксичностью.
5. Антитело по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело продуцируется гибридомой мыши O3B8-2C9-4F3, номер доступа FERM ВР-08627 в International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Япония.
6. Антитело по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело является гуманизированным.
7. Антитело по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело является полным антителом человека.
8. Антитело по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело является IgG-антителом.
9. Набор для обнаружения рака, содержащий по меньшей мере два нижеследующих компонента:
1) моноклональное антитело по п.1,
2) второе антитело, способное связываться с моноклональным антителом по п.1.
10. Набор по п.9, отличающийся тем, что раком является рак кожи.
11. Набор по п.9 или 10, отличающийся тем, что раком является меланома.
12. Фармацевтическая композиция для лечения рака, клетки которого экспрессируют белок окулоспанин, содержащая антитело по п.1 в количестве, эффективном для лечения.
13. Фармацевтическая композиция по п.12, отличающаяся тем, что раком является рак кожи.
14. Фармацевтическая композиция по п.12, отличающаяся тем, что раком является меланома.
15. Применение антитела по п.1 для производства лекарственного средства для лечения рака, клетки которого экспрессируют белок окулоспанин, определенный в п.1.
16. Применение по п.15, отличающееся тем, что раком является рак кожи.
17. Применение по п.15, отличающееся тем, что раком является меланома.
Приоритет по пунктам:
10.03.2003 - пп.1-4, 6-17;
09.03.2004 - п.5.
