Пептидные ингибиторы токсинов, производные ll-37

Настоящее изобретение относится к пептидным соединениям, представляющим собой аминокислотную последовательность X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6, в которой X1 представляет собой N-концевой сегмент, представляющий собой IG; Х2 представляет собой К или Е; Х3 представляет собой Q или Е; Х4 представляет собой D или R; Х5 представляет собой N или Е; Х6 представляет собой С-концевой сегмент, который представляет собой последовательность, выбираемую из PRTE или RPLR; в которой N-концевой сегмент является ацетилированным и/или С-концевой сегмент является амидированным, которые имеют сродство к токсинам и, в особенности, к бактериальным токсинам, таким как липополисахарид или липотейхоевая кислота. Эти соединения могут ингибировать или нейтрализовать токсины. Также изобретение относится к фармацевтическим композициям и применению таких соединений для предотвращения или терапии заболеваний или состояний вследствии грибковой или бактериальной инфекции. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 табл.

 

Описание

Область техники, к которой относится изобретения

Изобретение относится к соединениям, которые имеют сродство к токсинам, в особенности к грибковым и бактериальным токсинам, таким как липополисахариды (LPS) или липотейхоевая кислота (LTA), и которые могут ингибировать или нейтрализовать такие токсины. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения таких соединений, их терапевтическому и диагностическому применению, композициям, включающим эти соединения, генетическому материалу, их кодирующему, и способам их применения.

Известный уровень техники

Современная фармакотерапия добилась больших успехов в борьбе с микробными и, в особенности, бактериальными инфекциями, которые являлись одной из основных причин преждевременной смерти вплоть до середины прошлого века. Однако в последнее время возникло беспокойство по поводу широко распространенного использования высокоэффективных антибиотиков в связи с постоянным ростом устойчивости бактерий. Действительно, за последние 25 лет устойчивость к антибиотикам - в особенности, множественная устойчивость к широкому диапазону антибиотических веществ - увеличилась практически у каждого из исследованных видов бактерий. В настоящее время полагают, что антибактериальные агенты наиболее передового типа, которые не подвержены обычным механизмам устойчивости, представляют собой соединения, которые используют в качестве средств отбора мутантов, устойчивых к нескольким лекарственным препаратам.

На основании этого вывода эксперты рекомендуют использовать антибиотики значительно более ограниченно, чем ранее, как в сельском хозяйстве, так и при лечении человека. Например, малозначительные заболевания - в особенности те, которые обычно даже не вызваны бактериями, такие как обыкновенная простуда, не следует лечить антибиотиками, которые скорее должны быть зарезервированы для более серьезных заболеваний. Более того, для лечения бактериальных инфекций необходимо разработать новые соединения с совершенно другими типами фармакологической активности, предпочтительно с некой активностью, которая не зависит от бактериальной устойчивости к обычным антибиотикам.

Одним из заболеваний, при котором широкое использование антибиотиков вызвало немало споров, является средний отит в его острой форме или в его хроническом состоянии. Было показано, что число пациентов с экссудативным средним отитом (ОМЕ), т.е. разновидностью отита, характеризующегося присутствием жидкости в среднем ухе без симптомов острой инфекции, резко увеличилось после назначения антибиотикотерапии в случае раннего острого среднего отита (АОМ), что наводит на мысль о том, что сами по себе антибиотики играют роль в ОМЕ (Lim et al., Laryngoscope 92, 278-286, 1982). Полагают, что такие антибиотики, как пенициллин, влияют на развитие местных иммунных ответов, таких как выработка местного IgM в среднем ухе (Howie et al., Ann. Otol. Rhinol. Laryngol., 85 Suppl. 25, 18-19, 1976). Другой недостаток антибиотикотерапии состоит в том, что бактерии погибают, но их токсины остаются активными.

Было высказано предположение, что для лечения этих и других заболеваний, вызванных бактериальной или грибковой инфекцией, может быть выгодным использовать соединения, которые не убивают микроорганизмы или бактерии сами по себе, но скорее нейтрализуют их токсины и предоставляют природным механизмам защиты хозяина контролировать распространение инфекции (Nell, The Role of Endotoxin in the Pathogenesis of Otitis Media with Effusion, PhD Thesis, Leiden, 1999). В то же самое время эта стратегия поддерживала бы быстрое восстановление функций ослабленных слизистых оболочек.

Основную роль среди микробных токсинов, таких как грибковые токсины и, в особенности, бактериальные токсины, вовлеченных в большое число инфекционных заболеваний, таких как отит, играют эндотоксины, группа липополисахаридов (LPS), обнаруживаемых в клеточной стенке грамотрицательных бактерий, состоящих из полисахарида, соединенного с высокотоксичным липидным фрагментом, липидом А. Один из новейших терапевтических подходов к лечению ОМЕ состоит во введении веществ, которые нейтрализуют эндотоксин или LPS (Nell, там же).

В настоящее время известны различные соединения, способные нейтрализовать эндотоксин или LPS. Например, были разработаны несколько антител против эндотоксинов, такие как NA-1A и E5, человеческое и мышиное моноклональное IgM антитело, соответственно. Было показано, что эти антитела улучшают коэффициент выживаемости пациентов с некоторыми серьезными заболеваниями, такими как септический шок (Ziegler et al., New Engl. J. Med. 324, 429-436, 1991). Однако было сделано заключение об их неудовлетворительной активности и специфичности.

Другую группу веществ, активных против эндотоксинов, получают из эндогенного белка человека, называемого увеличивающим проницаемость бактерицидным белком (BPI), который аккумулируется в азурафильных гранулах нейтрофилов (Gazzano-Santoro et. al., Infection and Immunity 60:11, 4754-4761, 1992). BPI, который является чрезвычайно катионным белком, не только нейтрализует свободные эндотоксины, но также ингибирует рост или убивает бактериальные клетки сами по себе за счет увеличения проницаемости их внешних мембран. BPI действительно представляет собой сильнодействующий природный антибиотик, индуцируемый присутствием LPS и некоторыми другими триггерными механизмами, включая фактор некроза опухолей (TNF). Однако большая часть его активности связана с синтезирующими его иммунными клетками, т.е. полиморфно-ядерными макрофагами.

Также было получено несколько рекомбинантных белков производных BPI, таких как rBPI23 (Kohn et al., 1993) и rBPI21 (Horwitz et al., 1996), которые в значительной степени представляют собой N-концевые участки BPI с молекулярными массами 23 и 21 кДа, соответственно. Использование BPI и соединений производных BPI при лечении ОМЕ были, например, описаны в WO-А-00/71149.

Другим классом природных соединений с антимикробной активностью являются кателицидины, класс пептидов, вырабатываемых клетками дыхательного эпителия, альвеолярными макрофагами и другими тканями. В своих природных формах эти соединения являются линейными, α-спиральными, не содержащими цистеина пептидами или белками. Кателицидины являются катионными и включают высококонсервативную сигнальную последовательность и прорегион, кателин. Однако их С-концевой домен, кодирующий зрелый пептид, демонстрирует значительную гетерогенность. Эти пептиды могут иметь от 12 до 80 аминокислот.

Наиболее перспективным человеческим кателидином является 18 кДа катионный антимикробный протеин, САР18. 37 С-концевых аминокислот САР18, т.е. пептид LL-37, представляет собой домен ответственный за высокое сродство и нейтрализующую способность по отношению к LPS (Sawa et al., Antimicr. Agents Chemoter. 42:12, 3269-3275, 1998). Было разработано и тестировано несколько укороченных пептидов, полученных из САР18 или LL-37, таких как раскрытые Sawa (Sawa et al., там же), Gustmann (Gustmann et al., Biophys. J. 80, 2935-2945, 2001) и в патенте США № 6040291 и в его европейском дубликате EP-A-0955312.

Более того, в качестве ссылки приведена статья Nagaoka Isao et al. в Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 9 (5) (2002) 972-982 и статья Kirikae et al. в Infection and Immunity 66 (5) (1998), 1861-1868.

Nagaoka et al. описывают аминокислотную последовательность LL-37 и полученный из него 18-мер К15-V32, тогда как Kirikae et al. заостряют внимание на ряде патентов по производным САР-18.

Укороченные пептиды, полученные из LL-37, в которых сохраняются природные аминокислотные последовательности, и в особенности такие пептиды, включающие аминокислотную последовательность KEFKRIVQRIKDFLRNLV, являются, следовательно, описанными в предшествующем уровне техники.

В общем, по ряду причин, в качестве основных кандидатов терапевтических соединений предпочтительными по сравнению с белками, такими как САР18, являются относительно небольшие пептиды. В первую очередь, они могут быть более легко оптимизированы, адаптированы и модифицированы для сохранения или усиления их желаемой активности и специфичности. Во-вторых, их легче получить или синтезировать и, таким образом, они более доступны. В-третьих, их более легко готовить в виде препаратов и применять, в то время как белки часто являются нестабильными и не биодоступны после не парентерального введения.

Цель изобретения

Несмотря на усилия предшествующей технологии, существует необходимость в дополнительных пептидах и пептидных соединениях, которые обладают LPS- и LTA-нейтрализующей активностью и могут служить в качестве фармацевтических средств или приводить к разработке новых фармацевтических средств для лечения заболеваний и состояний, вызванных бактериями, таких как отит.

Более того, существует продолжительная необходимость в таких соединениях, не имеющих или имеющих слабую воспалительную активность, такую как стимуляция выработки цитокина, пролиферация Т-клеток, активация внеклеточных сигнал-регулируемых киназ (ERK) или хемотаксис нейтрофилов, все пункты из перечисленных являются частью известных к настоящему времени САР18-производных пептидов.

Одной из основных целей изобретения является обеспечение новых соединений, которые имеют сродство и нейтрализующую способность по отношению к микробным токсинам, в особенности к грибковым и бактериальным токсинам, таким как липополисахариды (LPS) или липотейхоевая кислота (LTA), но которые в то же самое время имеют пониженную воспалительную активность.

Дополнительной целью изобретения является адаптация известных активных аминокислотных последовательностей, полученных из LL-37 (и САР-18), таким образом, что функции сродства и нейтрализации и ингибирования поддерживаются на той же самой величине или даже улучшены, тогда как в то же время стабильность этих пептидов оптимизирована.

Другой целью является обеспечение способов получения таких соединений, а также терапевтических и диагностических способов и композиций.

Эти и другие объекты настоящего изобретения станут ясны на основании последующего описания.

Краткое описание изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединения со сродством к липополисахаридам (LPS) или липотейхоевой кислоте (LTA). Соединения являются пептидными по своей химической природе и включают аминокислотную последовательность X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6 (здесь и ниже также называемую центральной (аминокислотной) последовательностью), в которой Х1 представляет собой N-концевой сегмент последовательности, Х2 представляет собой К или Е, Х3 представляет собой Q или E, Х4 представляет собой D или R, Х5 представляет собой N или Е и Х6 представляет собой С-концевой сегмент; в которой одна или несколько аминокислот в центральной последовательности могут быть модифицированы; в которой N-концевой сегмент является ацетилированным и/или С-концевой сегмент является амидированным и/или аминокислотная последовательность отличается от природной аминокислотной последовательности X1KEFKRIVQRIKDFLRNLVX6.

Во втором аспекте изобретение обеспечивает способы получения таких соединений. Способы включают химическое и ферментативное сшивание аминокислотных мономеров или олигомеров, с образованием соединений. Способы также включают экспрессию последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих соединения в клетках хозяина при использовании вектора для трансфекции клеток хозяина последовательностями нуклеиновых кислот. Способ получения соединения согласно каждому из предшествующих пунктов, в котором аминокислотные мономеры, аминокислотные олигомеры или моно- или олигомеры аминокислотных аналогов или миметиков собирают химическим или ферментативным сшиванием, которое проводят в жидкой фазе и/или на границе раздела с функционализированной твердой фазой.

В дополнительном аспекте изобретение относится к применению соединений по изобретению для получения фармацевтических или диагностических композиций, которые пригодны для диагностики, предотвращения и/или лечения заболеваний и состояний, связанных с или являющихся результатом присутствия бактериальных токсинов, в особенности LPS и LTA. Эти токсины могут воздействовать на организм, даже если сами по себе инфицирующие бактерии более не присутствуют в организме. Диагностические композиции, включающие соединения по настоящему изобретению, могут быть использованы in vivo или in vitro. Фармацевтические композиции, включающие соединения по изобретению, будут также обычно содержать один или несколько фармацевтических носителей и/или эксципиентов и будут адаптированы, чтобы быть пригодными для определенного способа введения, такого как парентеральная инъекция или инфузия, местное применение, такое инстилляция, спринцевание, инъекция или инфузия; но также для ингаляции, перорального приема, назального или введения через слизистые или любым другим пригодным путем. Композиции могут дополнительно содержать агенты, обуславливающие целевую доставку лекарственного средства, агенты, повышающие биодоступность, или активные ингредиенты, отличающиеся от соединений по данному изобретению и обеспечивающие немедленное или модифицированное высвобождение.

В дополнительном аспекте, изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующих пептид, включающий аминокислотную последовательность, KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LV, в котором Х2 представляет собой К или Е, Х3 представляет собой Q или E, Х4 представляет собой D или R, Х5 представляет собой N или Е, где Х2, Х3, Х4 и Х5 не представляют собой одновременно K, Q, D и N, соответственно.

Дополнительные аспекты изобретения будут сформулированы в подробном описании ниже и в приложенной формуле изобретения.

Подробное описание изобретения

Соединения по настоящему изобретению являются пептидными соединениями со сродством к липополисахаридам (LPS) или липотейхоевой кислоте (LTA). Они включают центральную аминокислотную последовательность Х1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6, где Х1 представляет собой N-концевой сегмент последовательности, Х2 представляет собой К или Е, Х3 представляет собой Q или E, Х4 представляет собой D или R, Х5 представляет собой N или Е и Х6 представляет собой С-концевой сегмент; и где одна или несколько аминокислот в центральной последовательности могут быть модифицированы; где N-концевой сегмент является ацетилированным и/или С-концевой сегмент является амидированным и/или аминокислотная последовательность отличается от природной аминокислотной последовательности X1KEFKRIVQRIKDFLRNLVX6.

В данном описании и прилагаемой формуле изобретения термины «где N-концевой сегмент ацетилирован» имеют следующее значение. N-концевой сегмент защищен за счет реакции с карбоновой кислотой с получением амида, связанного со стабилизирующей или защитной группой. Например, пептид возможно ввести в реакцию с фумаровой кислотой с получением формилстабилизированного пептида; с уксусной кислотой с получением ацетилзащищенного пептида. Более того, пептид может быть введен в реакцию с пропионовой кислотой или другими органическими кислотами, имеющими до 6 атомов углерода и даже до 10 атомов углерода в углеводной части R. В этих органических кислотах карбогидратная группа R, имеющая до 10 атомов углерода, может быть неразветвленной, или разветвленной, или циклической и/или содержать одну или несколько ненасыщенностей. Более того, алкильная цепь может быть замещена, например, гидроксильной группой, галогеном, амино, меркапто или сульфоксидной группами. Поэтому, N-концевой сегмент следующей группы может быть представлен: -С(О)-R'. Альтернативно, вместо реакции с карбоновой кислотой, реакцию также можно проводить с сульфоновой кислотой для получения соответствующей сульфамидной связи. Следовательно, в N-концевом сегменте может присутствовать группа -SO2-R. Альтернативно, указанные термины также охватывают алкилирование и диалкилирование, так что в N-концевом сегменте может присутствовать вторичная или третичная аминогруппа -N-(R)1 или -N-(R)2, в которой каждый R имеет описанное выше значение.

В еще одном варианте осуществления «ацетилирование» охватывает реакцию пептида с изоцианатом или изотиоцианатом, в этом случае образуется мочевина или тиомочевина: R-N-C(O)- или R-N-C(S)-, соответственно, где R определен выше.

В заключении, N-концевой сегмент может быть защищен блокирующей группой, стабильной по отношению к кислоте, где группу обычно вводят в ходе синтеза пептида, но в данном случае не удаляют. Хорошо известными блокирующими группами являются Fmoc и Z-группа.

Что касается значения терминов «где С-концевой сегмент амидирован» отмечено следующее. Термин «амидирование» означает, что -ОН, обычно присутствующую в качестве С-конца, заменяют группой -Х, где -Х представляет собой (i) группу -NY2, где Y независимо представляет собой Н или R, где R такой, как описано выше, или две группы Y вместе могут составлять циклический фрагмент вместе с N, к которому они присоединены; (ii) группа -OR, в которой R такой, как описано выше, или (iii) группу -R. Пептидные амиды являются предпочтительными, поскольку они имеют наиболее высокую стабильность.

Было обнаружено, что пептидные соединения по настоящему изобретению имеют оптимизированную стабильность по сравнению с природной аминокислотной последовательностью, исключенной из пункта 1 формулы изобретения.

Пептидные соединения являются пептидами, такими как олиго- или полипептиды, белками или соединениями, получаемыми из пептидов. Помимо самих пептидов, пептидные соединения также охватывают аналоги пептидов, производные пептидов, модифицированные пептиды и пептидные конъюгаты. Общей чертой пептидных соединений является наличие у них аминокислотных последовательностей. Более точно, пептиды определяют как амиды, которые могут быть получены из двух или более аминокислот комбинацией аминогрупп одной кислоты с карбоксильной группой другой (Merriam Webster Medical Dictionary 2001). Пептидное соединение, напротив, также может относиться к пептидной структуре внутри молекулы. Обычно пептиды составлены из природных (L-)-α-аминокислот, в частности из аланина (Ala или А), аргинина (Arg или R), аспарагина (Asn или N), аспарагиновой кислоты (Asp или D), цистеина (Cys или C), глутамина (Gln или Q), глутаминовой кислоты (Glu или Е), глицина (Gly или G), гистидина (His или H), изолейцина (Ile или I), лейцина (Leu или L), лизина (Lys или K), метионина (Met или М), фенилаланина (Phe или F), пролина (Pro или P), серина (Ser или S), треонина (Thr или T), триптофана (Trp или W), тирозина (Tyr или Y) и валина (Val или V).

Аналогами или функциональными эквивалентами пептидов являются пептидные молекулы, имеющие ту же активность и, в особенности, то же сродство к микробным или в особенности к таким же бактериальным токсинам, но не обязательно количественно, и могут быть, например, модифицированными пептидами, пептоидами, пептидными аналогами или пептидомиметиками.

Модифицированные пептиды являются молекулами, получаемыми из пептидов введением заместителей или функциональных групп, которые в общем случае не присутствуют в природных аминокислотах. Этот термин также включает соединения, которые получают реакцией пептидов с молекулами из других химических классов, вне зависимости от того, встречаются ли эти молекулы в природе или нет. Например, фосфорилированные, сульфонированные и биотинилированные пептиды, гликопротеины и липопротеины часто встречаются в природе, в то время как пептиды, модифицированные полиэтиленгликолем, являются примерами химически модифицированных пептидов, которые были разработаны для изменения некоторых, но не всех свойств пептидов.

Пептоиды, как и пептиды, также являются пептидными соединениями. Они также обычно являются амидами двух или нескольких аминокислот. Однако их часто получают не напрямую из природных аминокислот, но скорее из различных типов химически синтезированных L и/или D-аминокислот.

Пептидомиметики, в их наиболее широком смысле, представляют собой соединения, у которых функциональная структура более или менее сходна с пептидом, но которые также могут содержать в своей основной цепи непептидные связи или D-аминокислоты. В общем, пептидомиметики служат в качестве заменителей природных пептидов при взаимодействии с рецепторами и ферментами (Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D.J.A. Crommelin and R.D. Sindelar, Harwood Academic Publisher, 1997, p. 138). Псевдопептиды, класс пептидомиметиков, представляют собой соединения, содержащие изостеры амидной связи вместо амидных связей (там же, pp. 137-140).

Соединения по изобретению также включают соли пептидов или функциональные эквиваленты, такие как фармацевтически приемлемые аддитивные соли кислот или оснований и аддукты. Они также включают мультимеры пептидов или функциональных эквивалентов.

Соединения по изобретению имеют сродство к по крайней мере одному токсину и, в особенности, к бактериальному токсину. В частности, было показано, что концентрации пептидов около 1 микромоль демонстрируют значительное (более чем 50%) уменьшение LPS/LTA активности in vitro. В действительности термин «сродство», как используется в данном описании, относится к активности пептидов в используемых анализах. В этих анализах активность предпочтительных пептидов измеряли от низкого микромолярного до высокого наномолярного диапазона. Скорее соединения по изобретению в основном имеют субмиллимолярную активность, с более предпочтительными соединениями, показывающими более высокое сродство, например, с низкой микромолярной или наномолярной активностью. В большом числе инфекционных заболеваний бактериальные токсины, такие как класс липополисахаридов (LPS), в случае грамотрицательных бактерий, и или липотейхоевой кислоты (LTA), в случае грамположительных бактерий, связаны с проявлениями болезни. Эти токсины могут вызывать значительные воспалительные реакции. Например, при инфекции верхних дыхательных путей воспаление может приводить к повреждению слизистой среднего уха или свищам, происходящим из-за ухудшения системы мукоцилиарного клиренса (MCS), представляющей собой одну из основных защитных систем верхних дыхательных путей. Соединения по изобретению также в особенности пригодны для лечения кишечных инфекций. Сродство к грибковым или бактериальным токсинам является необходимым условием способности к нейтрализации и, предпочтительно, соединения по изобретению не только связываются с LPS и другими токсинами, но также обладают способностью нейтрализовать, ингибировать токсины или другим способом ослаблять действие указанных токсинов.

Желаемый тип активности против бактериальных токсинов наблюдается в том случае, если пептидные соединения выполняют структурные требования, как определено в п.1 формулы изобретения, согласно которым данные соединения включают аминокислотную последовательность X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6, в которой Х1 представляет собой N-концевой сегмент последовательности, Х2 представляет собой К или Е, Х3 представляет собой Q или E, Х4 представляет собой D или R, Х5 представляет собой N или Е и Х6 представляет собой С-концевой сегмент. Этот основной мотив является производным природного антимикробного протеина САР18, или пептида LL-37, который сам представляет собой производное от САР18.

Как использовано в данном описании, N-концевой сегмент представляет собой группу, атом или последовательность, представляющую собой N-концевой сегмент или домен соединения, например структуру, которая присоединена к концевой α-аминогруппе основной последовательности, которая не образует амидной связи с этой последовательностью. В случае свободной α-аминогруппы N-концевой участок может представлять собой просто атом водорода; или она может состоять из химической группы, присоединенной к атому азота концевой α-аминогруппы, такой как ацильная группа. Она также может представлять собой большую группу, такую как последовательность двух или более аминокислот, или химическую структуру, которая не состоит или состоит не только из аминокислот. С-концевой сегмент определяется аналогичным образом.

Предпочтительно соединения по настоящему изобретению включают всего более чем 18 аминокислот, определяющих центральный мотив. В одном из вариантов осуществления N-концевой сегмент включает последовательность двух или более аминокислот. Среди аминокислот, I и G являются пригодными членами этой последовательности, и предпочтительным N-концевым фрагментом является IG.

В другом варианте осуществления изобретения С-концевой сегмент также включает аминокислотную последовательность. Последовательность может включать 1, 2, 3, 4 или более чем 4 аминокислоты. В одном варианте осуществления С-концевой сегмент включает 4 аминокислоты. С-конец указанного С-концевого сегмента, состоящего из 4 аминокислот, может представлять собой Е, как в соответствующем положении в пептиде LL-37. Однако такой С-конец может быть также определен R. Аминокислота, соседняя по отношению к С-концевой аминокислоте, может представлять собой Т, как в LL-37, но может также представлять собой L. P и R являются двумя другими предпочтительными членами последовательности из 4 аминокислот С-концевого сегмента в любом из двух оставшихся положений. Более предпочтительно, С-концевой сегмент выбирают из последовательностей PRTE и RPLR.

В дополнительном варианте осуществления N-концевой сегмент и С-концевой сегмент выбирают из предпочтительных, описанных выше, с получением пептидной последовательности с общим числом аминокислот 24. Среди наиболее предпочтительных в настоящее время соединений пептиды IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE и IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR, или как пептиды сами по себе, или в виде модифицированных, или производных пептидов.

Предпочтительными среди модификаций являются амидированные и/или ацетилированные пептиды согласно вышеприведенным определениям. Одно из положений, в котором амидирование представляется в особенности благоприятным, представляет собой С-конец пептида. Ацетилирование, с другой стороны, предпочтительно производят по N-конец аминокислоты. В одном из предпочтительных в настоящее время вариантов осуществления, пептиды IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE и IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR представляют собой одновременно ацетилированные по N-концу и амидированные по С-концу. Предварительные испытания подтвердили, что такие модификации обладают увеличенной стабильностью в присутствии экзопептидаз.

Соединения, как правило, могут быть получены способами, известными для получения пептидов и сходных соединений. Меньшие соединения, содержащие всего несколько аминокислот или сходных звеньев и, предпочтительно, не более 30-50 звеньев, могут быть получены способами химического или ферментативного сшивания, или при использовании классического подхода, при котором реакции проходят в растворе, или в суспензии, или при использовании более современного твердофазного подхода, при котором пептид собирают закрепленным на твердой поверхности, такой как полимерный шарик. Большие соединения обычно синтезируют, используя автоматические твердофазные синтезаторы пептидов.

Альтернативно, соединения могут быть получены известными способами генной инженерии. Этот подход является в особенности эффективным, если соединение действительно представляет собой пептид или незначительно модифицированный пептид. Например, последовательность ДНК, кодирующая соединение, может быть ассоциирована или комбинирована с экспрессирующим вектором, способным к трансфекции клеток. На другой стадии этого способа клетки хозяина или клетки-мишени трансфицируют указанной ДНК за счет контакта клеток с ДНК, ассоциированной с вектором, в условиях, при которых возможна трансфекция. На следующей стадии клетки хозяина или клетки-мишени культивируют в условиях, при которых возможна экспрессия соединения. Впоследствии соединение может быть выделено. Если соединение само по себе не может быть кодировано или экспрессировано, но оно очень похоже на пептид, который можно кодировать и экспрессировать, способ можно использовать для получения пептида, на который похоже соединение, с последующими одной или несколькими стадиями, в которых пептид модифицируют химическими или ферментативными способами, с получением соединения.

Для этих целей используют различные типы векторов, такие как вирусные векторы, липоплексы, полиплексы, микросферы, наносферы, дендримеры, депротеинизированная ДНК, пептидная система доставки, липиды, особенно катионные липиды, или полученные из них липосомы, полимерные векторы, в особенности полимерные векторы, полученные из поликатионных полимеров. Среди предпочтительных вирусных векторов представлены ретровирусы, аденовирусы, аденосателлитные вирусы, вирусы простого герпеса и виросомы. Предпочтительные невирусные векторы включают хитозан, SPLP, полимерные системы на основе PLGA, полиэтиленимины, полилизины, полифосфоамидаты, поли(мет)акрилаты, полифосфазены; DOPE, DOTAP и DOTMA.

Несколько более обширных обзоров способов, которые можно использовать для получения соединений по изобретению описаны в: W.F. Anderson, Nature 392 Supp., 30 April 1998, p. 25-30; Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D.J.A. Crommelin and R.D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 53-70, 167-180, 123-152, 8-20; Protein Synthesis: Methods and Protocols, Ed. R. Martin, Humana Press, 1998, p.1-442; Solid-Phase Peptide Synthesis, ED. G.B. Fields, Academic Press, 1997, p. 1-780; Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press, 1997, p. 1-89.

Соли пептидов или функциональных эквивалентов получают известными способами, которые обычно включают смешивание пептида или пептоида или с фармацевтически приемлемой кислотой с образованием аддитивной соли кислоты, или с фармацевтически приемлемым основанием с образованием аддитивной соли основания. Является ли кислота или основание фармацевтически приемлемой, может быть легко установлено специалистом в данной области, принимая во внимание то, как соединение будет использоваться по назначению. Например, не все кислоты и основания, которые являются приемлемыми для диагностических композиций in vitro, могут быть использованы для терапевтических композиций. В зависимости от цели использования, фармацевтически приемлемые кислоты включают органические и неорганические кислоты, такие как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, молочная кислота, гликолевая кислота, щавелевая кислота, пировиноградная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, коричная кислота, серная кислота, хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, азотная кислота, хлорная кислота, фосфорная кислота и тиоциановая кислота, и которые образуют аммониевые соли со свободными аминогруппами пептидов и функциональных эквивалентов. Фармацевтически приемлемые основания, которые образуют карбоксилатные соли со свободными карбоксильными группами пептидов и функциональных эквивалентов, включают этиламин, метиламин, диметиламин, триэтиламин, изопропиламин, диизопропиламин и другие моно-, ди- и триалкиламины, так же, как и ариламины. Более того, также охватываются фармацевтически приемлемые сольваты, комплексы или аддукты, такие как гидраты или этураты.

Некоторые из предпочтительных модификаций пептидов согласно настоящему изобретению могут быть легко произведены в ходе или в конце синтеза. Например, если пептид синтезируют при использовании твердофазного способа, ацетилирование по N-концу можно проводить в конце синтеза введением в реакцию аминокислотной последовательности, которая все еще связана со смолой, с уксусной кислотой вместо еще одной аминокислоты.

С другой стороны, амидирование по С-концу можно проводить при использовании в твердофазном пептидном синтезе специального типа смолы, такого как коммерчески доступная Tentagel S AM (ex, Rapp, Tübbingen, Germany). Эти смолы включают химическую «рукоятку», от которой амидированные пептиды освобождаются при расщеплении. Эти и другие способы модификации пептидов известны любому специалисту в данной области техники.

Дополнительный аспект изобретения относится к применению пептидных соединений. Соединения обладают сродством к микробным токсинам и, в особенности, к бактериальным токсинам, таким как липополисахарид (LPS) и липотейхоевая кислота (LTA). Поэтому соединения могут быть выгодно использованы в терапевтических и диагностических целях при заболеваниях и состояниях, с которыми связано присутствие этих токсинов. Связывающая способность будет, как правило, приводить к нейтрализации токсинов, благодаря чему соединения можно рассматривать как антагонисты или частичные антагонисты. Более того, они могут быть использованы в качестве нацеливающих агентов или лигандов для других соединений, которые способны к нейтрализации токсинов, и которые можно специально нацеливать на эти токсины при помощи ковалентного или нековалентного сшивания с этими соединениями, или за счет ковалентного или нековалентного связывания с поверхностью носителя лекарственного препарата, такого как липосома, нано- или микрочастица, нано- или микрокапсула, липидный комплекс или мицелла.

При диагностике соединение можно применять для качественного или количественного анализа бактериальных токсинов, присутствующих в физиологических жидкостях, таких как кровь, плазма, сыворотка, слизь, выстилающая эпителий слизистых оболочек, таких как дыхательного тракта, или в жидкостях, наличие которых связано с патологическими условиями, таких как жидкость, обнаруживаемая в среднем ухе при экссудативном среднем отите (ОМЕ). Для такого применения соединения можно включать в диагностические комплекты для использования in vitro, или в диагностические композиции, которые можно вводить пациенту. Для такого применения, необязательный вариант состоит в связывании соединения по изобретению с хелатирующим агентом, который затем образует комплекс с изотопной меткой, обнаруживаемой приемлемой системой контроля.

В предпочтительном применении, соединения вводят в качестве активных лекарственных веществ для предотвращения или лечения болезней или состояний, связанных с грибковыми или бактериальными инфекциями или присутствием грибковых или бактериальных токсинов в организме. Как уже отмечено, существуют определенные недостатки и ограничения антибиотикотерапии при острых или хронических инфекциях, такие как вызывание устойчивости и отбор устойчивых разновидностей бактерий, подавление естественных защитных систем пациента, нарушение бактериальной флоры, заселяющей слизистые в естественных условиях, высвобождение большого количества бактериальных токсинов, при гибели бактерий и т.д. Более того, могут быть заболевания и болезни, при которых основной причиной является присутствие токсинов и в особенности бактериальных токсинов, но присутствие самих микроорганизмов, как при ОМЕ, когда локальное удержание токсинов в среднем ухе может оказывать значительный вклад в проявления болезни, даже в отсутствии симптомов острой инфекции.

Во всех этих случаях, может быть желательным лечить болезнь не лекарственными препаратами антибиотиков, а веществами, которые способны нейтрализовать бактериальные токсины. Для этой цели соединения по изобретению в особенности выгодны, поскольку они демонстрируют высокую связывающую и нейтрализующую активность против наиболее важных микробных токсинов, таких как липополисахарид (LPS) в случае грамотрицательных бактерий и липотейхоевая кислота (LTA) в случае грамположительных бактерий. При инфекциях верхних дыхательных путей, для лечения которых соединения по изобретению являются в особенности предпочтительными, эти продукты жизнедеятельности бактерий могут вызывать воспалительную реакцию в среднем ухе или синусах и могут вызывать повреждения слизистых эпителия верхних дыхательных путей. Нейтрализация включенных токсинов может позволить предотвращать, контролировать или уменьшить повреждение слизистой, включая нарушения системы мукоцилиарного криренса (MCS), и, таким образом, будет усиливать природные защитные системы. В таких случаях, включая ОМЕ, при которых бактериальные токсины могут представлять собой основную проблему даже в отсутствии значительного числа живых бактериальных клеток, терапия, основанная на введении соединения по изобретению, например, непосредственно в среднее ухо, может представлять собой основной терапевтический подход. Но также при других инфекциях дыхательных путей, таких как острый или хронический синусит или острый или хронический отит, данные соединения могут быть чрезвычайно пригодными для восстановления нормальных функций слизистых и их природных защитных систем.

В более общем виде соединения по изобретению представляют собой агенты, полезные для предотвращения и терапии состояний, вызванных инфекционными бактериями, включая Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis,β-гемолитические стрептококки группы А, Staphylococcus aureus, грамотрицательные кишечные бактерии, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, грамотрицательные бациллы Pseudomonas sp.

Особое преимущество соединений по настоящему изобретению по сравнению с природными белками и пептидами, производными которых они являются, таких как САР18 и LL-37, состоит в низкой степени проявления их нежелательной воспалительной активности. Эта активность связана с различными клеточными процессами, включая пролиферацию, дифференциацию и экспрессию генов, кодирующих про-воспалительные медиаторы, такие как цитокины. Цитокины представляют собой прямые медиаторы воспаления и влияют на развитие и направление многих иммунологических реакций. Нарушение равновесия в выработке цитокинов широко известно как критический фактор при нескольких болезненных состояниях. При состояниях, таких как экссудативный средний отит или синусит, это равновесие уже нарушено. Пролиферация Т-клеток в подобных условиях также не является благоприятной, поскольку это дополнительно стимулирует иммунный ответ, который уже не контролируется.

Таким образом, эти соединения могут быть успешно использованы в фармацевтических композициях. Согласно изобретению такие фармацевтические композиции обеспечиваются также как и сами соединения. Как использовано в данном описании, термин «фармацевтическая композиция» относится к терапевтическим и диагностическим композициям, также как и к лекарственным препаратам и диагностикам, содержащим такие композиции. Терапевтические композиции и лекарственные препараты применяют для предотвращения или лечения заболеваний и других состояний у млекопитающих, улучшение которых представляется желательным. Диагностикумы и диагностические композиции используют для диагносцирования таких заболеваний in vivo и in vitro.

Обычно такие композиции включают по крайней мере одно соединение по изобретению в качестве активного ингредиента и по крайней мере один фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Более того, композицию подвергают обработке и готовят таким образом, что ее можно вводить человеку или животному. Как использовано в данном описании, носитель или эксципиент представляют собой любое фармацевтически приемлемое вещество или смесь веществ, не обладающих значительной фармацевтической активностью, которые могут быть использованы в качестве носителя или в качестве вспомогательного вещества, для получения соединения в лекарственной дозированной форме, которая является стабильной и пригодной для введения. Примеры фармацевтически приемлемых эксципиентов известны специалистам и могут быть найдены в монографиях по основной фармакопее.

В одном из вариантов осуществления композиции составляют и готовят для парентерального введения, инстилляции или спринцевания, предпочтительно для внутрисосудистого введения, такого как внутривенное или внутриартериальное, но также внутримышечного, подкожного, интралезионного, внутрибрюшинного, местного или другого способа парентерального введения. В другом предпочтительном варианте осуществления композицию вводят непосредственно на поврежденную слизистую верхних дыхательных путей, например, среднего уха. Те же самые принципы, которыми руководствуются при разработке рецептуры других лекарственных препаратов для таких способов введения, используются специалистами в данной области для получения таких композиций. Например, одним из требований для лекарственных дозированных форм для парентерального введения является их стерильность. Другие требования описаны во всех основных фармакопеях, таких как в USP 24, в монографии «General Requirements for Test and Assays. 1. Inhections", p. 1775-1777. Для повышения стабильности рецептур для парентерального введения может быть необходимым получение сухой лекарственной дозированной формы, которая должна быть восстановлена перед введением. Примером подобной лекарственной дозированной формы являются сублимированные или лиофилизированные препараты. Композиции по изобретению могут также содержать муколитический растворитель.

Может оказаться желательным вводить соединение по изобретению в виде парентеральной лекарственной дозированной формы с контролируемым высвобождением для того, чтобы избежать частых инъекций и улучшить эффективность и удобство терапии. Известны различные способы получения депо-композиций. Продолжительное высвобождение можно обеспечивать при помощи твердых имплантатов, наночастиц, нанокапсул, микрочастиц, микрокапсул, эмульсий, суспензий, масляных растворов, липосом или сходных структур.

В случае композиций, которые должны вводиться местно на пораженные слизистые может быть полезно обеспечить композицию, имеющую свойства, которые обеспечивают продолжительное время локального удерживания в месте введения, для повышения эффективности лечения. Для достижения этой цели в композицию могут быть включены мукоадгезивные эксципиенты. Такие функциональные эксципиенты известны специалисту в данной области техники; они включают полимеры, такие как полиакриловые кислоты и их производные, полиметакриловые кислоты и их производные, эфиры целлюлозы, включая гидроксипропилметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, крахмалы, хитозан и т.д. Пригодным образом или альтернативно, композиции по изобретению могут также содержать муколитический растворитель. В частности, муколитические растворители используют для воздействия на способность к проникновению пептидного соединения по изобретению в слизь, например, в дыхательном тракте. Пригодные растворители могут включать известные мукорегуляторные или муколитические агенты, такие как N-ацетилцистеин, S-карбоксиметилцистеин, бромгексин, амброксил, ДНКаза, эрдостеин, физиологический раствор, несостеин. Предпочтительно используют бромгексин.

Дополнительные эксципиенты, которые особенно полезны для приготовления лекарственных форм для парентерального введения, в наиболее широком понимании, представляют собой растворители, сорастворители и жидкие или полутвердые носители, такие как стерильная вода, этанол, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, бутандиол, жирные кислоты, коротко и среднецепные триглицериды, лецитин, полиоксиэтиленовые производные касторового масла; вещества для установления осмотического давления и рН, такие как сахара, в частности глюкоза, сахарные спирты, особенно манит, хлорид натрия, карбонат натрия, лимонная кислота, ацетат, фосфат, фосфорная кислота, хлористоводородная кислота, гидроксид натрия и т.д.; стабилизаторы, антиоксиданты и консерванты, такие как аскорбиновая кислота, сульфит или гидросульфит натрия, этилендиаминтетраацетат, бензиловый спирт и т.д., другие эксципиенты и вспомогательные средства для лиофилизации, такие как альбумин, декстран и т.д.

Сходным образом может быть выгодным вводить соединения по изобретению в виде лекарственной дозированной формы для введения через слизистую. Этот способ введения является неинвазивным и безвредным по отношению к пациенту; в то же время он обычно приводит к улучшенной биодоступности соединения по изобретению по сравнению с пероральным введением, особенно, если соединение нестабильно в жидкостях пищеварительной системы или если оно лишком велико, чтобы эффективно абсорбироваться в кишечнике. Введение через слизистую возможно, например, при использовании назальной, трансбуккальной, сублингвальной, гингивальной или вагинальной лекарственных дозированных форм. Эти лекарственные дозированные формы могут быть получены известными технологическими способами; они могут быть составлены с обеспечением назальных капель или спреев, прокладок, пленок, пластырей, гелей, мазей или таблеток. Предпочтительно эксципиенты, используемые для лекарственных дозированных форм для введения через слизистую, также включают одно или несколько веществ, предусмотренных для мукоадгезии, таким образом увеличивая время контакта лекарственной дозированной формы с местом абсорбции и, таким образом, потенциально увеличивая продолжительность абсорбции.

Альтернативно, фармацевтические композиции могут быть предназначены для перорального введения и соответствующим образом изготовлены. Пригодные пероральные лекарственные дозированные формы включают таблетки, твердые капсулы, мягкие капсулы, порошки, гранулы, лекарственные дозированные формы, разрушающиеся в ротовой полости, сиропы, капли, суспензии, шипучие таблетки, жевательные таблетки, пероральные пленки, лиофилизированные лекарственные дозированные формы, лекарственные дозированные формы с длительным высвобождением, лекарственные дозированные формы с контролируемым высвобождением. В одном из предпочтительных вариантов осуществления пероральная лекарственная дозированная форма представляет собой твердую лекарственную дозированную форму с растворимым в кишечнике покрытием для обеспечения защиты соединения от кислой и протеолитической среды желудка.

Композиции также могут быть разработаны для внутрикишечного введения.

В дополнительном варианте осуществления соединения вводят через легкие, при использовании ингалятора с контролируемой дозой, аэрозольного генератора, аэрозольного спрея или сухого порошкового ингалятора. Приемлемые рецептуры могут быть изготовлены с использованием известных способов или приемов. Также в некоторых случаях может быть осуществимо чрезкожное, ректальное или внутриглазное введение.

Может быть выгодным использовать упреждающее введение лекарственных препаратов или направленные способы для более эффективной доставки соединения по изобретению. Например, если выбирают непарентеральный способ введения, пригодная лекарственная дозированная форма может содержать агент, усиливающий биодоступность, который может быть любым веществом или смесью веществ, которые усиливают доступность соединения. Этого можно достичь, например, защитой соединения от разложения, например ферментным ингибитором или антиоксидантом. Более предпочтительно, усиливающий агент усиливает биодоступность соединения за счет увеличения проницаемости абсорбционного барьера, которым обычно является слизистая оболочка. Усилители проницаемости могут действовать при использовании различных механизмов; некоторые увеличивают текучесть мембран слизистой, тогда как другие открывают или расширяют щелевые контакты между клетками слизистой. Другие уменьшают вязкость слизи, покрывающей слой клеток слизистой. Среди предпочтительных усилителей проницаемости имеются амфифильные вещества, такие как производные холевой кислоты, фосфолипиды, этанол, жирные кислоты, олеиновая кислота, производные жирных кислот, этилендиаминтетраацетат, карбомеры, поликарбофилы и хитозан.

Следующие примеры служат в целях иллюстрации изобретения, при этом не ограничивая его объем приведенными в данном описании вариантами осуществления.

Пример 1: Получение соединений

Следующие пептидные соединения, каждое из которых включает 24 аминокислоты, соединения, обозначенные как Р60, Р60.4, Р60.Ас и Р60.4Ас, получали твердофазным методом на автоматическом мультипептидном синтезаторе (SyroII, MultiSyntech, Witten, Germany). Для Р60 и Р60.4 в качестве смолы использовали Tentagel S AC (Rapp, Tübingen, Germany), привитой полимер полиэтиленгликоля и полистирола (загрузка 0.2 мЭкв, размер частиц 90 мкм). Для Р60.Ас и Р60.4Ас использовали Tentagel S AC, что приводило к получению пептида, амидированного по С-концу. Повторяющееся связывание проводили добавлением шестикратного молярного избытка (из расчета на загрузку смолы) 0,60М раствора приемлемой Fmoc-аминокислоты в N-метилпирролидоне (NMP), шестикратного молярного избытка 0,67М PyBOP в NMP и двенадцатикратного молярного избытка NMM в NMP, 2/1 (об./об.) в реакционном сосуде. Защиту боковой цепи проводили следующим образом: tBu для D, E, S, T; Вос для К; Trt для N, Q и Pmc для R. Снятие Fmoc защитной группы проводили 3-кратным добавлением смеси пиперидин/NMP 1/4 (об./об.) к каждому реакционному сосуду. Время связывания и снятия защитной группы составляло 45 мин и 3 раза по 3 мин, соответственно. Промывание после связывания и снятия Fmoc защитной группы проводили 6 раз NMP. Для Р60.Ас и Р60.4Ас, ацетилирование по N-концу проводили уксусной кислотой, при этом пептид все еще был связан со смолой. После синтеза пептидилсмолы интенсивно промывали NMP, дихлорметаном, смесью дихлорметан/эфир 1/1 (об./об.) и эфиром, соответственно, и сушили на воздухе. Пептидилсмолы затем расщепляли и снимали защитную группу с боковой цепи в смеси ТФУ/вода 95/5 (об./об.) в течение 2,5 ч (1,5 мл на 10 мкмоль пептида), смолу удаляли фильтрованием и пептид осаждали из раствора ТФУ смесью эфир/пентан 1/1 (об./об.) (10 мл на 10 мкмоль пептида). Раствор охлаждали в течение 1 ч при -20°С и осажденный пептид выделяли центрифугированием (-20°С, 2500 г, 10 мин). После растирания и перемешивания гранул с 10 мл смеси эфир/пентан 1/1 (об./об.) и выделения при использовании той же процедуры, пептиды сушили на воздухе при комнатной температуре в течение 1 ч. Пептиды растворяли в 2 мл воды или 2 мл 10% об. уксусной кислоты, раствор замораживали в жидком азоте в течение 5 мин и затем лиофилизировали при центрифугировании (1300 об./мин, 8-16 ч). Исследование пептидов проводили при использовании ВЭЖХ с обращенной фазой и MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Аминокислотные последовательности соединений представляли собой:

Р60 IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE

Р60.Ac* IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE

Р60.4 IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR

Р60.4Ac* IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR

* Индекс Ас означает, что пептид ацетилирован по N-концу и амидирован по С-концу.

Пример 2: Нейтрализация токсинов

Соединения, полученные согласно примеру 1, анализировали на их способность нейтрализовать бактериальный токсин LPS пробой с лизатом амебоцитов лимулюса (LAL) и пробой с цельной кровью (WB). LTA нейтрализацию также измеряли пробой с цельной кровью. Пептид LL-37 также использовали в качестве положительного контроля. Концентрацию пептида, посредством которой нейтрализовали 50% LPS (50% ингибирование), использовали как меру активности пептида. Эти величины концентраций были такими, как представлено в таблице 1. Различия между соединениями в каждом анализе не были статистически значимыми. В заключение, испытываемые соединения по изобретению демонстрировали примерно ту же степень антитоксической активности, что и природный антимикробный агент LL-37.

Таблица 1
Пептид50% ингибирование LTA (мкг/мл), n=350% ингибирование LPS (мкг/мл)
LAL-анализWB-анализсреднее
LL-371,6±0,51,3±0,2 (n=5)1,2±0,2 (n=3)1,3±0,2 (n=8)
P602,1±0,71,5±0,5 (n=5)1,4±0,1 (n=4)1,5±0,3 (n=9)
P60.42,0±1,31,7±0,6 (n=5)2,1±0,6 (n=2)1,8±0,6 (n=7)
P60.Ac2,1±0,11,8±0,8 (n=5)2,4±0,5(n=2)2,0±0,8 (n=7)
Таблица 1: величины 50% ингибирования LTA (±стандартное отклонение) в мкг/мл и величины 50% ингибирования LPS (±стандартное отклонение) в мкг/мл для LL-37, P60, P60.4 и P60.Ас. Ингибирование LTA испытывали в анализе с цельной кровью (WB). Ингибирование LPS испытывали в LAL-анализе, так же, как и в анализе с цельной кровью. Синтетические пептиды вызывали нейтрализацию LTA, которая не отличалась значительно от LL-37. Нейтрализация LPS, вызываемая синтетическими пептидами, также не отличалась значительно от LL-37. n=число экспериментов.

Пример 3: Активация иммунных клеток за счет соединений

Соединения, полученные согласно примеру 1, испытывали на их терапевтически нежелательную иммунологическую активность при использовании анализов Elispot, пролиферации Т-клеток, ERK-активации и хемотаксиса нейтрофилов. Elispot анализ применяют для определения действия лекарственного препарата, химического вещества или других соединений на секретирование цитокина in vitro, таким образом получая информацию об их возможной модуляторной активности на иммунологические функции in vivo. Результаты анализа представлены как доля положительных ответов на IFN-гамма. ERK-(внеклеточные сигнал-регулируемые киназы)-1/2 представляет собой часть сигнального пути МАР-киназы, который, как было показано, входит в различные клеточные процессы, включая пролиферацию, дифференциацию и экспрессию генов, кодирующих про-воспалительные медиаторы, такие как цитокины. Цитокины представляют собой прямые медиаторы воспаления и влияют на развитие и направление многих иммунологических реакций. Нарушение равновесия в выработке цитокинов широко известно как критический фактор при нескольких болезненных состояниях. При заболеваниях, таких как экссудативный средний отит или синусит, это равновесие уже нарушено. Пролиферация Т-клеток в подобных условиях также не является благоприятной, поскольку это также стимулирует иммунный ответ, который уже не контролируется. Таким образом желательно, чтобы соединения по изобретению не стимулировали выработку цитокина, пролиферацию Т-клеток, ERK-активацию или хемотаксис нейтрофилов.

Для пролиферации Т-клеток 150000 периферических мононуклеарных клеток крови (PBMC) культивировали в отсутствии или в присутствии 10 мкг/мл соединения в течение 5 дней в 96-луночных круглодонных микропланшетах (Costar Inc. Cambridge, MA) в конечном объеме 150 мкл полного IMDM. В качестве положительного контроля PBMC культивировали в присутствии 25 Е/мл рекомбинантного IL-2. В течение последних 20 часов культивации PBMC импульсно метили [3H]тимидином (0,5 микрокюри/лунка), после чего измеряли включение 3Н при использовании жидкостного сцинтилляционного подсчета. Для определения цитокинов Т-клеток, IFN и IL-10 Elispot исследованием, 1,5×106 PBMC культивировали в 0,5 мл полного IMDM в отсутствии или в присутствии различных концентраций синтетического пептида. В качестве положительного контроля PBMC стимулировали 10 мкг/мл митогена фитолакки американской (PWM). После 48 часов культивирования РВМС собирали аккуратным промыванием лунок теплым IMDM для сбора не прилипших клеток, которые промывали в большом объеме IMDM. Затем РВМС помещали в планшеты, предварительно покрытые антителами ELISA, и культивировали в течение 5 часов в IMDM, дополненной 2% объединенной АВ сывороткой человека при 37° С 5% СО2, после чего планшеты проявляли согласно протоколу от производителя (U-CyTech, Utrecht, The Netherlands). Пятна подсчитывали при использовании микроскопа Olympus и анализировали с использованием программного обеспечения Olympus Micro Image 4.0 (Paes Nederland, Zoeterwoude, The Netherlands). Окончательные результаты представлены как доля индексов положительной стимуляции (положительный: >2).

Активацию ERK-1/2 анализировали с клетками из клеточной линии мукоэпидермоидной опухоли легкого NCI-H292 (ATCC, Rockville, MD), которые культивировали в 24- или 6-луночных планшетах для культивирования в RPMI1640 среде (Gibco, Grand Island, NY) дополненной 2 мМ L-глутамина (Bio Wittaker, Walkersville, MD), 200 Е/мл пенициллина (Bio Wittaker), 200 мкг/мл стрептомицина (Bio Wittaker) и 10% (об./об.) околоплодной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием (Gibsco). После достижения близкого скопления, клетки культивировали в течение ночи в среде, не содержащей сыворотки. Затем клетки стимулировали в течение 15 минут указанными стимулирующими воздействиями. Лизаты клеток получали при использовании лизирующего буфера (0,5%[об./об.] Triton X-100, 0,1М Tris-HCl pH 7,4, 100 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 1 мМ Na3VO4, мини-полного коктейля ингибитора протеазы [Boeringer Manheim, Roche, Basel, Switzerland]). Образцы подвергали SDS-PAGE на 10% геле на основе глицина и разделенные белки переносили на поливинилидендифторидную (PVDF) мембрану. Неспецифические связывающие участки блокировали смесью PBS/0.05% Tween-20/1% казеина. Реплики инкубировали с поликлональными антителами кролика против фосфорилированного ERK-1/2 (New England Biolabs, Beverly, MA) и вторичная пероксидаза хрена конъюгировала с антителами против IgG кролика. Для обнаружения иммунореактивности использовали усовершенствованную хемолюминесцентную систему вестерн-блоттинг детекции (Amsterdam Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden).

Хемотаксис нейтрофилов измеряли при использовании нейтрофилов, выделенных из периферической крови при использовании Percoll плотностного центрифугирования (плотность: 1,082 г/мл). Клетки повторно суспендировали при концентрации 2,5×106 клеток/мл в среде хемотаксиса (20 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота (HEPES буфер) HEPES, 132 мМ NaCl, 6 мМ KCl, 1,2 мМ KH2PO4, 1 мМ MgSO4, 5,5 мМ глюкозы, 0,1 мМ CaCl2 и 0,5 % (масс./об.) сывороточного альбумина человека [Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service (CLB), Amsterdam, The Netherlands], разведенного 1:1 бессывороточным RMPI. Хемотаксическую активность соединений оценивали при использовании модифицированного способа Бойдена Камбера. Кратко, 26 мкл стимуляторов, разбавленных HEPES буфером, добавляли к лункам нижнего компартмента и 50 мкл суспензии нейтрофилов (2,5×106 клеток/мл) добавляли в верхний компартмент. Компартменты разделяли двумя фильтрами: нижний фильтр с размером пор 0,45 мкм (Millipore Products, Bedford, MA) и верхний фильтр с размером пор 8 мкм (Sartorius Filter, San Francisco, CA). После инкубации в течение 90 минут при 37оС верхние фильтры убирали, фиксировали в смеси этанол-бутанол (80:20 об./об.) и окрашивали раствором Вайгерта. Для определения хемотаксической активности нейтрофилов нейтрофилы подсчитывали в шести случайных полях при большом увеличении (×400) и рассчитывали процент нейтрофилов на мембране по сравнению с положительным контролем (10-8М N-формилметионил-лейцил-фенилаланин (FMLP, Sigma).

Результаты представлены в таблице 2. В заключении, испытанные соединения по изобретению, и, в частности, Р60.4, вызывали очень низкий иммунный ответ, ниже чем природный пептид LL-37. Они показали низкую ERK-активацию и практическое отсутствие хемотаксиса нейтрофилов.

Таблица 2

Иммуногенность соединений
Соединениеγ-IFN ElispotПролиферация

Т-клеток
ERK-активацияХемотаксис (%)
P601/80/8-76±39
P60.Ac3/80/8±61±36
P60.43/80/8±0±0
P60.4Асnd0/8±24*
LL-37(контроль)4/84/8+84±17
*только одно измерение

nd=не определяли

Пример 4: In vivo переносимость

Соединение Р60.4Ас получали согласно примеру 1 и тестировали на его переносимость in vivo. Более конкретно, была оценена его способность вызывать раздражение глаз и кожи у кроликов, тогда как его ототоксичность исследовали на модели морской свинки. Более того, его системную токсичность оценивали после внутривенного введения.

Для опытов на раздражение глаз и кожи, трех кроликов подвергали действию 0,5 мл забуференного фосфатом раствора пептида в (2 мг/мл), наносимого на бритую кожу в течение 4 часов при использовании полуокклюзивной повязки. Наблюдения проводили через 1, 24, 48 и 72 часа после воздействия. Единичные образцы по 0,1 мл забуференного фосфатом раствора пептида (2 мг/мл) (рН 7,5) закапывали в один глаз каждого из трех кроликов для проведения исследования острого раздражения/повреждения глаза. Наблюдения проводили через 1, 24, 48 и 72 часа после закапывания.

В результате не было отмечено раздражения кожи. Закапывание раствора пептида в глаза приводило к покраснению конъюнктивы, которое полностью исчезало в течение 20 часов после закапывания.

Системную токсичность Р60.4Ас оценивали в исследованиях токсичности с одиночными и повторяющимися дозами у крыс. Пептид вводили ежедневно внутривенно с возрастающими дозами. На этой стадии определяли максимально переносимую дозу (MTD). Токсичность повторяющихся доз также исследовали на стадии MTD. На стадии возрастающих доз 9 крыс разделили на три группы и они получали 0,4, 2 или 8 мг/кг/день в течение двух дней. Клинические симптомы записывали два раза в день в день дозировки и через один день после дозировки, массу тела записывали перед первой дозой и через один день после дозировки. На MTD стадии 5 самок и 5 самцов крыс получали 8 мг/кг/день в течение 5 последующих дней. Клинические симптомы записывали два раза в день в дни дозировки, массу тела в день 1 и 6. Клинические лабораторные исследования проводили перед вскрытием трупа. Макроскопию проводили после окончания MTD стадии.

В результате при исследованиях систематического повышения дозы не было отмечено смертности. Более того, в клинических симптомах и массе тела не наблюдалось четких отклонений. В течение MTD стадии также не было отмечено смертности и не было отмечено четких заключений, связанных с пептидом, в клинических симптомах, массе тела, гематологии и клинических биохимических параметрах и при макроскопическом исследовании.

Для оценки ототоксичности использовали 9 здоровых самцов морских свинок-альбиносов (500-1200 г) без внешних ушных патологий. Животных анестезировали внутрибрюшинными инъекциями кетамина 40 мг/кг и ромпуна 10 мг/кг. После проведения контрольного испытания слуха хирургически открывали слуховой пузырек для нанесения небольшого кусочка спонгостана на мембрану окна улитки (RWM) и различные растворы (приблизительно 10 мкл) вводили на спонгостан. Кожу сшивали и затем проводили дополнительное испытание слуха.

Морских свинок разделяли на три группы, каждая состоящая из двух животных, подвергаемых обработке, и одного контрольного животного. Испытываемые и контрольные составы вводили на RWM правого уха, тогда как левое ухо оставляли без обработки. В группе 1 две морские свинки получали цисплатин (0,66 мг/мл в PBS) и одно животное получало PBS в качестве контроля. Цисплатин, ототоксичность которого известна, служил в качестве положительного контроля в испытании. Группа 2 получала пептид (2 мг/мл) в фосфатном буфере (рН 7,5) и группа 3 получала пептид (2 мг/мл) в растворе состава, включающего 7% макрогола 10000 в изотоническом растворе хлорида натрия, консервированного при помощи 0,02% хлорида бензалкония и 0,1% Na2EDTA, забуференного фосфатом при рН 5,5.

Акустический ответ ствола мозга (ABR) регистрировали при использовании автоматизированной системы усреднения сигнала (Tuker-Davis Technology, Aluha, FL, USA) перед ведением лекарственного препарата и непосредственно после хирургического вмешательства и через 3, 7, 14 и 22 дня. Морских свинок анестезировали и во внешний канал уха помещали головной телефон с ушным вкладышем. Подкожные электроды помещали над макушкой (активный) и над слуховым пузырьком с той же стороны (электрод сравнения). Заземляющие электроды помещали над мышцами шеи. ABR регистрировали в экранированном от электричества, двухстенном, экранированном от радиочастот помещении в ответ на 10 мс тональную посылку при 1кГц. Интенсивности стимула измеряли и выражали в dB. Пороговое значение ABR определяли как наименьшую интенсивность, способную вызывать воспроизводимый, визуально обнаруживаемый ответ. Пороговое значение ABR после обработки сравнивали с пороговыми значениями ABR перед обработкой.

В результате, применение PBS на окно улитки в группе 1 приводило к изменению порогового значения -9 dB через 22 дня после хирургического вмешательства, тогда как цисплатин вызывал изменения -49 dB и -64 dB, соответственно (см. таблицу 3). Во второй группе, применение фосфатного буфера не вызывало изменения порогового значения (см. таблицу 4). Фосфатный буфер с 2 мг/мл пептида вызывало изменение порогового значения -7 dB через 22 дня после хирургического вмешательства. У одного животного невозможно было открыть слуховой пузырек и животное было исключено из исследования. В последней группе введение пептида в составе раствора приводило к очень небольшому изменению порогового значения 2 и 1 dB, соответственно (см. таблицу 5).

Таблица 3

Ототоксичность цисплатина (положительный контроль)
Группа 1Только PBSЦисплатин в PBSЦисплатин в PBS
Пороговое значение (dB)Δ до хирургического вмешательстваПороговое значение (dB)Δ до хирургического вмешательстваПороговое значение (dB)Δ до хирургического вмешательства
До хирургического вмешательства865882
После хирургического вмешательства72-1456-281-1
3 дня67-1926-3244-38
7 дней76-1026-3237-45
14 дней78-828-3023-59
22 дня77-99-4918-64

Таблица 4

Отсутствие ототоксичности Р60.4Ас в фосфатном буфере
Группа 2Только PBSР60.4Ас в PBS
Пороговое значение (dB)Δ до хирургического вмешательстваПороговое значение (dB)Δ до хирургического вмешательства
До хирургического вмешательства7772
После хирургического вмешательства78170-2
3 дня74-370-2
7 дней74-3720
14 дней77060-12
22 дня77065-7

1. Пептидное соединение со сродством к бактериальным и грибковым токсинам, и в особенности к липополисахариду (LPS) или липотейхоевой кислоте (LTA), представляющее собой аминокислотную последовательность X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6,

в которой X1 представляет собой N-концевой сегмент, представляющий собой IG;

Х2 представляет собой К или Е;

Х3 представляет собой Q или Е;

Х4 представляет собой D или R;

Х5 представляет собой N или Е;

Х6 представляет собой С-концевой сегмент, который представляет собой последовательность, выбираемую из PRTE или RPLR;

в которой N-концевой сегмент является ацетилированным и/или С-концевой сегмент является амидированным.

2. Соединение по п.1, состоящее из последовательности из 24 аминокислот или их производных, в котором указанную последовательность выбирают из IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE и IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR.

3. Соединение по п.2, в котором N-концевой сегмент ацетилирован и С-концевой сегмент амидирован.

4. Применение соединения по п.1 для диагностики, предотвращения или терапии заболевания или состояния, включающего или являющегося следствием грибковой или бактериальной инфекции или воздействия грибкового или бактериального токсина, такого как липополисахарид (LPS) или липотейхоевая кислота (LTA).

5. Применение по п.4 для лечения грибковой или бактериальной инфекции верхних дыхательных путей или дыхательной системы или заболеваний, являющихся их следствием, таких как острый или хронический синусит, острый или хронический отит или эксудативный средний отит.

6. Фармацевтическая композиция, обладающая LPS- и LTA-нейтрализующей активностью, включающая соединение по п.1 и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов.

7. Фармацевтическая композиция по п.6, составленная, изготовленная и предназначенная для парентерального введения, предпочтительно для внутрисосудистого, внутримышечного, подкожного или интралезионного введения.

8. Фармацевтическая композиция по п.6, составленная, изготовленная и предназначенная для местного введения на слизистую пораженной области или ткани, такая как в форме промывающей жидкости, ушных капель, капель для носа, аэрозоля, порошкового аэрозоля, жидкости для распыления, геля, суспензии или мукоадгезивной лекарственной формы.

9. Фармацевтическая композиция по п.6, дополнительно включающая нацеливающий агент, агент, улучшающий биодоступность, и/или агент, контролирующий доставку.

10. Фармацевтическая композиция по п.7, дополнительно включающая нацеливающий агент, агент, улучшающий биодоступность, и/или агент, контролирующий доставку.

11. Фармацевтическая композиция по п.8, дополнительно включающая нацеливающий агент, агент, улучшающий биодоступность, и/или агент, контролирующий доставку.

12. Последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая пептидное соединение, включающее аминокислотную последовательность, выбранную из IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE и IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и касается применение РАМ, или его функциональных фрагментов, или производных для получения фармацевтических соединений для лечения боли.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к холестеринсвязывающим белкам, и может быть использовано для выделения таких белков из кишечника. .

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к получению новых белков-стимуляторов МАР-киназ и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области медицины и касается иммунотерапии против ангиогенеза. .

Изобретение относится к антителу против CCR5, содержащему (i) две легких цепи, где каждая легкая цепь содержит продукт экспрессии плазмиды, обозначенной pVK:HuPRO140-VK (АТСС - РТА-4097), и (ii) две тяжелых цепи, где каждая тяжелая цепь содержит продукт экспрессии плазмиды, обозначенной pVg4:HuPRO140 HG2-VH (АТСС - РТА-4098) или плазмиды, обозначенной pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (АТСС - РТА-4099), или фрагменту такого антитела, связывающемуся с CCR5 на поверхности клетки человека.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в терапии гиперпролиферативных нарушений. .
Изобретение относится к области биотехнологии. .
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения стафилококкового носительства в носоглотке. .
Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и касается комплексного лечения острых кишечных инфекций. .
Изобретение относится к области ветеринарии. .

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности. .

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к химерным полипептидам, содержащим антагонист рецептора гормона роста, и может быть использовано в медицине.
Наверх