Конъюгаты антрациклин-антитело

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунотерапии. Предложен конъюгат антрациклинового лекарственного средства и антитела, связанные посредством линкера, содержащего дважды замещенное непланарное циклогексановое кольцо. Антитело в составе коньюгата связывается с антигеном CD74, высокоэкспрессированным на В-клеточных лимфомах, меланомах и других опухолях. Коньюгат интернализуется клетками-мишенями и затем вновь экспрессируется на клеточной поверхности. Предложен также способ получения данного коньюгата путем коньюгирования антрациклинового средства с линкером, а затем с тиолвосстановленным моноклональным антителом. Конъюгат может быть введен больным при необходимости проведения иммунотерапии. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 5 ил.

 

Область изобретения

Изобретение относится к терапевтическим конъюгатам, которые могут быть нацелены на различные антигены. Конъюгаты содержат нацеливающий фрагмент и химиотерапевтическое лекарственное средство. Нацеливающий фрагмент и химиотерапевтическое лекарственное средство связываются посредством линкера, содержащего фрагмент, расщепляемый внутри клетки.

Предшествующий уровень техники

В течение многих лет задачей ученых, работающих в области терапии лекарственными средствами, направленными на определенные мишени, являлось использование антител с целью специфической доставки химиотерапевтических лекарственных средств к злокачественным опухолям человека. Осуществление такой задачи может способствовать в конечном счете верному решению проблемы химиотерапии рака. Значительный успех в достижении данной цели был достигнут с появлением в 1975 метода гибридом, авторы Köhler и Milstein, и с последующей возможностью производить моноклональные антитела (mAb). В течение последних 25 лет mAb были получены против многих антигенных мишеней, которые в избытке экспрессируются на раковых клетках. Многие антитела, либо в индивидуальном виде, либо в виде конъюгатов лекарственных средств, токсинов, радионуклидов или других терапевтических агентов прошли предварительные клинические и позже клинические испытания. Вообще применение mAb как таковых, часто называемых «голыми mAb», не привело к достижению нормального состояния в течение продолжительного периода времени у больных с солидными опухолями, хотя увеличение продолжительности жизни было достигнуто в последнее время при лечении посредством mAb против рака молочной железы и рака ободочной кишки (mAb против HER2-neu и 17-1А, соответственно). Лучшие результаты были достигнуты в отношении злокачественных заболеваний крови у больных, которых лечили голыми mAb, в особенности относительно В-клеточной лимфомы (mAb против CD20 и CD22 на поверхности В-клеток).

Однако очевидно, что использование конъюгатов mAb, ассоциированных с опухолью, и подходящих токсических агентов должно быть более эффективным, чем использование голых mAb против наиболее выраженных случаев рака. В этом случае mAb специфически переносит токсический агент к патологической ткани вдобавок к той токсичности, которая может иметь место в силу природных или воссозданных эффекторных функций, обусловленных Fc-белком mAb, таких как связывание комплемента и ADCC (зависимая от антитела цитотоксичность клетки), которые приводят в действие механизмы, результатом которых может быть лизис клетки. Однако возможно, что Fc-белок не требуется для осуществления терапевтического действия, как в случае фрагментов mAb, и другие механизмы, такие как апоптоз, ингибирование ангиогенеза, ингибирование метастатической активности и/или воздействие на адгезию опухолевой клетки могут вступить в действие. Токсический агент является лекарственным средством, наиболее часто применяемым в химиотерапии, излучающим частицы радионуклидом или бактериальны, или растительным токсином. Каждый тип конъюгата имеет свойственные ему отдельные преимущества. Проникающие радионуклиды и бактериальные, и растительные токсины являются очень токсичными, обычно токсичность на порядки величин выше, чем величины токсичности стандартных химиотерапевтических лекарственных средств. Этот факт способствует использованию первого из двух указанных выше агентов с mAb, поскольку в клиническом случае попадание mAb в патологическую ткань является крайне низким. Низкое попадание mAb в опухоль в клинической практике и относительно низкий профиль токсичности химиотерапевтических лекарственных средств, направленных против злокачественных опухолей, вместе взятые представляют собой главную причину того, почему конъюгаты mAb-лекарственное средство до настоящего времени не оказывали воздействия соответственно их перспективным возможностям.

В предварительных клинических работах на моделях ксенотрансплантатов на животных, предназначенных для изучения злокачественных опухолей человека, было описано много конъюгатов с mAb, которые проявляли способность полностью подавлять рост опухолей или даже излечивать животных от их опухолей. Однако поглощение опухолью конъюгатов mAb во многих из этих животных моделей ксенотрансплантатов составляет часто 10-50% инъецируемой дозы на грамм тканевой области, тогда как в клинических условиях поглощение опухолью 0,1-0,0001% инъецируемой дозы на грамм ткани является более нормальным. Неудивительно, что конъюгаты mAb, образованные с более токсичными радионуклидами и токсинами, обычно достигают в некоторой степени лучших результатов клинически, чем соответствующие конъюгаты mAb-лекарственное средство со стандартными химиотерапевтическими лекарственными средствами. Однако конъюгаты радионуклидов и mAb часто могут проявлять большую токсичность из-за наличия большого избытка циркулирующей, распадающейся радиоактивности по сравнению с локализованной в опухоли активностью. Конъюгаты токсина с mAb страдают двумя недостатками - обширным повреждением здоровой ткани и высокой иммунореактивностью по сравнению с растительным или бактериальным белком, который обычно используют. Несмотря на то, что mAb теперь могут быть получены в человеческой или гуманизированной форме (с переносом области, определяющей комплементарность), деиммунизация токсиновой части любого конъюгата, вероятно, останется значительным препятствием на пути к прогрессу.

Несмотря на отсутствие должной эффективности, наблюдаемое до настоящего времени в клинических условиях, конъюгаты mAb-лекарственное средство все еще имеют привлекательные теоретические преимущества. Лекарственное средство как таковое является хорошо изученным в структурном отношении, но находится в изоформах и может связываться с белком mAb посредством очень хорошо установленных для конъюгирования химических характеристик, часто на специфических участках, удаленных от антигенсвязывающих областей mAb. Конъюгаты mAb-лекарственное средство могут быть получены с большей воспроизводимостью, чем химические конъюгаты, содержащие mAb и токсины, и как таковые в большей степени подвергаются развитию в коммерческих целях и регулируемому спросу. По этой причине интерес к конъюгатам mAb с лекарственными средствами остается, несмотря на трудности, с которыми приходится сталкиваться. В некоторых случаях в последнее время результаты предварительно проведенных клинических испытаний оказывались весьма многообещающими. Ввиду продолжающегося прогресса в области химии конъюгирования и в способности устранять или снижать иммуногенные свойства mAb перспектива использования конъюгатов mAb-лекарственное средство вновь рассматривается в плане клинической терапии рака.

Ранее проведенная работа по конъюгатам mAb-лекарственное средство, определяемым в предварительных клинических испытаниях in vitro и in vivo, показала, что часто применяемые для связывания компонентов конъюгатов химические средства приводят к потере активности лекарственного средства. Таким образом, уже много лет назад были получены данные, свидетельствующие о том, что лекарственное средство должно высвобождаться в его первоначальном виде, затем сразу поглощаться клеткой-мишенью посредством компонента mAb, с тем, чтобы оказать полезное терапевтическое действие. Исследования в течение 1980-х и в начале 1990-х годов были сконцентрированы в основном на природе химического линкера между лекарственным средством и mAb. В частности, были созданы конъюгаты с помощью линкеров, расщепляемых слабой кислотой, на основании наблюдения, свидетельствующего о том, что значение рН внутри опухолей часто оказывалось ниже нормальных физиологических значений рН (патенты США No. 4542225; 4569789; 4618492 и 4952394). Указанный подход достиг своей кульминации в поворотной статье Trail et al. (Science 261:212-215 (1993)), в которой описано, что конъюгаты mAb-доксорубицин (DOX), приготовленные с помощью соответствующих линкеров, могут быть использованы в предклинических испытаниях при лечении мышей, несущих ряд ксенотрансплантатов человека. Этот многообещающий результат был достигнут с помощью антитела (названного BR96), а также благодаря большому числу рецепторов на опухолевых клетках-мишенях, конъюгат mAb-лекарственное средство был высокозамещенным (6-8 остатков DOX на единицу mAb) и конъюгат давали в больших дозах на основе повторных введений.

В клинических условиях поглощение mAb опухолью должно быть намного ниже, и поскольку это поглощение в некоторой степени изменчиво и его надо регулировать, то более токсичные лекарственные средства должны быть использованы для достижения терапевтического эффекта. Более токсичные лекарственные средства были использованы при разработке нескольких отдельных конъюгатов mAb-лекарственное средство (патенты США No. 5208020; 5416064; 5877296 и 6015562). Попытки использовать лекарственные средства, такие как производные мейтансиноидов и калихеамицина, которые также являются очень токсичными, были предприняты в стандартной химиотерапии. Конъюгирование с mAb дает возможность направлять на опухоль большие количества лекарственного средства с учетом неспецифического клеточного и белкового связывания, наблюдаемого при химиотерапии только. Сильная токсичность лекарственных средств, таких как упомянутые выше, может превысить наблюдаемые клинически низкие уровни направленного на опухоль mAb вследствие низкого уровня антигенсвязывающих участков, обычно наблюдаемых на опухолях-мишенях. В предклинических испытаниях наблюдали излечивание мышей, несущих опухолевые ксенотрансплантаты человека, при дозах конъюгата mAb-лекарственное средство, которые были намного ниже доз, ранее используемых с конъюгатами mAb-лекарственное средство, в которые включены стандартные лекарственные средства, такие как DOX (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8616-8623 (1996) и Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)). В случае конъюгатов мейтансиноид-mAb (Liu) количество требуемого для терапии конъюгата было более чем в 50 раз ниже того количества, которое требовалось ранее в случае конъюгатов с DOX (Trail, как указано выше).

В ходе развития этих конъюгатов исследователи сделали предположение, что линкер между лекарственным средством и mAb является критическим для сохранения хорошей противоопухолевой активности как in vitro, так и in vivo. Описанные конъюгаты были приготовлены с фрагментом, расщепляемым внутри клетки (гидразон), и лабильной в восстановительной среде связью (дисульфид) между лекарственным средством и mAb. Хотя гидразоновая связь является довольно стабильной в условиях сыворотки in vivo, было найдено, что нормальные дисульфидные связи недостаточно стабильны для практического использования. Были получены конъюгаты, в которых стандартная дисульфидная связь была заменена на затрудненную (двойной диметил) дисульфидную связь в случае калихеамицинов или на метилдисульфид в случае мейтансиноидов. Хотя данная работа была завершена, отдельное исследование продолжалось на новых конъюгатах антрациклин-замещенное mAb. В исследованиях новых конъюгатов DOX и mAb было обнаружено, что при включении гидразона в качестве расщепляемого элемента и присоединении DOX к mAb через тиоэфирную группу вместо дисульфида (патент США No.5708146) можно достичь превосходных результатов. При связывании таким способом и также при использовании разветвленного линкера, способного к удвоению числа единиц DOX на участке замещения mAb, было достигнуто приблизительно на порядок бóльшая эффективности новых конъюгатов DOX-mAb (King et al., Bioconjugate Chem. 10:279-288, (1999)).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение направлено на новые интернализирующие конъюгаты антитела и антрациклиновых лекарственных средств. Отдельные аспекты проиллюстрированы примерами конъюгатов доксорубицина (DOX), эпирубицина, морфолинодоксорубицина (морфолино-DOX), цианоморфолинодоксорубицина (цианоморфолино-DOX) и 2-пирролинодоксорубицина (2-PDOX). 2-PDOX является особенно токсичным, в его структуре находится енамин, который действует не только как интеркалятор и ингибитор топоизомеразы, но также и как алкилирующий реагент, обладающий повышенной токсичностью. Подобно DOX, 2-PDOX имеет относительно хорошую растворимость в воде, что свидетельствует о том, что он может быть соединен с mAb в многократно замещенных количествах без преципитации mAb. Лекарственные средства, описанные более детально ниже, являются по существу замещенными в среднем 8 (обычно 7-9) фрагментами лекарственных средств на молекулу mAb. Количество лекарственных средств, однако, может изменяться от 6 до 10 молекул на молекулу mAb.

В одном аспекте, изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему нацеливающий фрагмент, антрациклиновое лекарственное средство и линкер, связывающий нацеливающий фрагмент через тиоловую группу, а антрациклиновое химиотерапевтическое лекарственное средство - через внутриклеточно расщепляемый фрагмент.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения направляющим фрагментом является mAb, антрациклиновым химиотерапевтическим лекарственным средством является DOX, 2-PDOX, морфолино-DOX и морфолиноциано-DOX, а внутриклеточно расщепляемым фрагментом является гидразон.

В другом аспекте, изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему антитело, направленное на заболевание, и антрациклиновое химиотерапевтическое лекарственное средство. Много сотен примеров антрациклиновых лекарственных средств было синтезировано в течение приблизительно последних 30-40 лет, и они обсуждены подробно в других работах (см. Anthracycline Antibiotics; New Analogs, methods of Delivery, and Mechanisms of Action, Waldemar Priebe, Editor, ACS Symposium Series 574, American Chemical Society, Washington DC, 1994). Такие аналоги входят в объем данного изобретения.

В предпочтительном аспекте, изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему антитело, направленное на заболевание, и антрациклиновое химиотерапевтическое лекарственное средство формул I и II:

где А отсутствует или может быть выбрано из группы, состоящей из NH, N-алкила, N-циклоалкила, O, S и CH₂; пунктирная линия означает простую или двойную связь, и R означает Н или CN, и линкер, связывающий нацеливающий фрагмент через сульфидную группу, а антрациклиновое химиотерапевтическое лекарственное средство - через внутриклеточно расщепляемый фрагмент. Когда А отсутствует, атомы углерода, соседние с А на каждой из сторон, соединены простой связью, таким образом образуя пятичленное кольцо.

Употребляемый в тексте термин «алкил» относится к насыщенному алифатическому углеводородному радикалу, включающему в себя группы с прямой и разветвленной цепью, состоящие из 1-20 атомов углерода (всякий раз это числовой диапазон; например, встречающееся здесь обозначение «1-20» означает, что группа - в случае алкильной группы - может содержать 1 атом углерода, 2 атома углерода, 3 атома углерода и т.д., вплоть до 20 атомов углерода, включая и это значение). Алкильные группы, состоящие из 1-4 атомов углерода, относятся к низшим алкильным группам. Наиболее предпочтительно алкильная группа является алкилом среднего размера, имеющим от 1 до 10 атомов углерода, например, метилом, этилом, пропилом, 2-пропилом, н-бутилом, изобутилом, трет-бутилом, пентилом и пр. Самое предпочтительное, когда она является низшим алкилом, имеющим от 1 до 4 атомов углерода, например, метилом, этилом, пропилом, 2-пропилом, н-бутилом, изобутилом или трет-бутилом и пр.

Термин «циклоалкил» относится к 3-8-членному углеродному моноциклическому кольцу, углеродному 5-членному/6-членному или 6-членному/6-членному конденсированному бициклическому кольцу или мультициклическому конденсированному кольцу («конденсированная» кольцевая система означает, что каждое кольцо в системе делит соседнюю пару атомов углерода с каждым другим кольцом в системе), где одно или более колец может содержать одну или более двойных связей, но ни одно из колец не имеет полностью конъюгированную пи-электронную систему. Примерами циклоалкильных групп, без ограничения, являются циклопропан, циклобутан, циклопентан, циклопентен, циклогексан, циклогексадиен, адамантан, циклогептан, циклогептатриен и пр. Циклоалкильная группа может быть замещенной или незамещенной.

В другом предпочтительном аспекте фрагментом, расщепляемым внутри клетки, является гидразон.

В предпочтительном аспекте mAb является mAb, которое нацелено на связанные с опухолью антигены. Связанные с опухолью антигены определяют как антигены, экспрессируемые опухолевыми клетками или их сосудистой сетью в большем количестве, чем в нормальных клетках, где нормальные клетки способны к осуществлению клеточных функций, существенных для выживания больного. Связанные с опухолью антигены также могут быть антигенами, связанными с различными нормальными клетками, такими как дифференцировочные антигены линий дифференцировки различных гемопоэтических клеток, В-клеток, Т-клеток или миелоидных клеток, тем самым больной может выживать, несмотря на кратковременное избирательное уменьшение количества указанных нормальных клеток, в то время как злокачественные клетки, экспрессирующие такой же антиген(ы), разрушаются в достаточной степени, чтобы ослабить симптомы болезни и также улучшить состояние больного. Антитело mAb также может быть реактивным по отношению к антигену, связанному с гематологическими злокачественными опухолями.

В другом аспекте антигены выбирают из группы антигенов, связанных с В-клетками, Т-клетками, миелоидными клетками и другими гемопоэтическими клетками, таких как CD19, CD20, CD21, CD22, CD23 в В-клетках; CD33, CD45 и CD66 в миелоидных клетках; IL-2 (TAC или CD25) в Т-клетках; MUC1, тенасцин, CD74, HLA-DR, CD80 в различных гемопоэтических типах опухолей; СЕА, CSAp, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, PAM4, EGP-1, EGP-2, AFP, HCG, HER2/neu, EGFR, VEGF, P1GF, Le(y), карбоангидразы IX, PAP, PSMA, MAGE, S100, тенасцин и TAG-72 в различных карциномах, тенасцин в глиомах, и из антигенов, экспрессируемых сосудистой сетью и эндотелиальными клетками, а также поддерживающей стромой определенных опухолей. В другом предпочтительном аспекте mAb выбирают из группы, состоящей из LL1 (антитела против CD74), LL2 (антитела против CD22), hA20 и ритуксимаб (антитела против CD20), M195 (антитела против CD33), RS7 (антитела против эпителиального гликопротеина-1 (EGP-1)), 17-1А (антитела против EGP-2), PAM-4, BrE3 и КС4 (все анти-MUC1), MN-14 (антитела против онкофетального антигена (СЕА)), Mu-9 (антитела против антигена-р, специфичного для ободочной кишки), Immu 31 (антитела против альфа-фетопротеина), анти-TAG-72 (например, СС49), анти-Tn, J591 (анти-PSMA), BC-2 (антитело против тенасцина) и G250 (mAb против карбонатангидразы IX). Другие используемые антигены, которые могут быть нацелены с помощью указанных конъюгатов, включают в себя HER-2/neu, CD19, CD20 (например, C2B8, hA20, cA20, 1F5 MAb), CD21, CD23, CD33, CD40, CD80, альфа-фетопротеин (AFP), VEGF, EGF рецептор, P1GF (фактор роста плаценты), ILGF-1 (инсулиноподобный фактор-1 роста), MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, PSMA, ганглиозиды, HCG, EGP-2 (например, 17-1А), CD37, HLA-DR, CD30, Ia, Ii, A3, A33, Ep-CAM, KS-1, Le(y), S100, PSA, тенасцин, рецептор фолата, антигены Thomas-Friedenreich, антигены некроза опухоли, антигены ангиогенеза опухоли, Ga 733, IL-2 (CD25), T101, MAGE, CD66, CEA, NCA95, NCA90 или их комбинации.

В особенно предпочтительном аспекте нацеливающее mAb направлено против поверхностного антигена, который затем быстро поглощается антителом.

В особенно предпочтительном аспекте нацеливающее mAb направлено против антигена CD74.

В другом предпочтительном аспекте, линкером является радикал 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилгидразид.

Также описаны способы получения композиций согласно изобретению вместе со способами применения указанных композиций.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой профиль элюции при гель-фильтрации с помощью ВЭЖХ конъюгата антрациклин-антитело, приготовленного описанными методами.

На фигуре 2 показана in vitro эффективность конъюгата DOX-LL1 против Raji-клеток линии африканской лимфомы Беркитта, в сравнении с содержащим DOX конъюгатом ненацеливающего MN-14-антитела, при концентрации конъюгата лекарственное средство-mAb 1 мкг/мл. Содержание конъюгата DOX-LL1 во фракции выживших клеток на три порядка отличается от содержания конъюгата DOX-MN-14.

На фигуре 3 представлена эффективность одной 100 мкг дозы конъюгата 2-PDOX-RS7 в модели DU145 ксенотрансплантата простаты у бестимусных мышей.

На фигуре 4 представлена эффективность однократных доз 2-PDOX- и DOX-конъюгатов LL1-антитела на модели RAJI/SCID агрессивной системной опухоли мыши. Животных в./в. инъецировали Raji-клетками В-клеточной лимфомы и через пять дней обрабатывали конъюгатами, обозначенными на фигуре.

На фигуре 5 представлена эффективность однократной дозы 2-PDOX-LL1-антитело на модели RAJI/SCID агрессивной системной опухоли мыши по сравнению с необработанными контрольными животными, которым не давали конъюгат, или группой животных, которым давали ненацеливающий контрольный конъюгат, 2-PDOX-MN-14.

Подробное описание предпочтительных аспектов

Если не указано особо, в настоящем описании при употреблении единственного числа подразумевается "один или более".

Химиотерапевтические лекарственные средства, такие, которые описаны выше, могут быть связаны с антителом несколькими способами, с образованием конъюгата mAb-лекарственное средство. Например, химиотерапевтические лекарственные средства могут быть присоединены к mAb или его фрагментам после восстановления дисульфидных связей между цепями mAb. С помощью такого подхода образуется в среднем от восьми до десяти (в зависимости от типа IgG) свободных тиоловых групп на молекулу антитела, с воспроизводимостью при ограничении уровней тиола, используемых в реакции восстановления. Такой способ присоединения химиотерапевтических лекарственных средств является предпочтительным по следующим причинам: во-первых, присоединенные лекарственные средства располагаются на участке внутри или наполовину внутри молекулы mAb или его фрагментов, который не направлен к гидрофильным лизиновым остаткам. Такой подход способствует сохранению их стабильности благодаря более гидрофобным областям mAb, где располагаются химиотерапевтические лекарственные средства. Во-вторых, такой участок не изменяет общий заряд mAb или его фрагментов. В-третьих, расположение у внутренних тиоловых групп с меньшей вероятностью будет влиять на действие ADCC и комплемента, которые особенно важны при использовании «голых» вариантов mAb. Таким образом, участок присоединения выбирают таким, чтобы он не препятствовал проявлению активности, так, чтобы ADCC и связывание комплемента могло быть комплементарным к mAb или фрагментам mAb, играя роль носителя в доставке лекарственного средства. В-четвертых, расположение у внутренних тиоловых групп с меньшей вероятностью может привести к иммунному ответу против химиотерапевтических лекарственных средств по сравнению с расположением большого числа молекул химиотерапевтических лекарственных средств на "выставленных" лизиновых группах. В некоторых аспектах, общий электрический заряд антитела в конъюгате Ab-лекарственное средство не изменяется по сравнению с зарядом антитела до связывания. Это происходит вследствие того, что остатки лизина не используют в реакциях конъюгирования, и поэтому свободные положительные аминогруппы не модифицируются с образованием, например, нейтральных амидных связей.

Антитела

Антитело, как описано в тексте, относится к полноразмерной (т.е. природной или образованной способами рекомбинации нормального фрагмента гена иммуноглобулина) молекуле иммуноглобулина (например, антитело IgG) или иммунологически активной (т.е. специфически связанной) части молекулы иммуноглобулина, подобно фрагменту антитела.

Фрагмент антитела является частью антитела, такой как F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv, scFv (одна цепь Fv) и пр. Несмотря на структуру, фрагмент антитела связывается с таким же антигеном, который узнается интактным антителом, и поэтому антигенсвязывающий фрагмент антитела является его частью.

Термин "фрагмент антитела" также включает в себя любой синтетический или генноинженерный белок, который действует, подобно антителу, путем связывания со специфическим антигеном, с образованием комплекса. Например, фрагменты антитела включают в себя изолированные, состоящие из вариабельных областей фрагменты, такие как "Fv" фрагменты, состоящие из вариабельных областей тяжелых и легких цепей, рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, в которых легкие и тяжелые вариабельные области соединены пептидным линкером ("scFv-белки") и минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область. Фрагменты Fv могут быть созданы различными способами, чтобы получить мультивалентные и/или мультиспецифические связывающие формы. Мультивалентные связывающие формы взаимодействуют более чем с одним связывающим участком против специфического эпитопа, в то время как мультиспецифические формы взаимодействуют более чем с одним эпитопом (любого антигена или даже против специфического антигена и другого антигена).

Употребляемый в тексте термин антительный слитый белок означает полученную рекомбинантным способом антигенсвязывающую молекулу, в которой два или более одинаковых или различных природных антител, одноцепочечное антитело или сегменты фрагмента антитела с одинаковыми или различными специфичностями связываются. Слитый белок содержит по меньшей мере один специфический связывающий участок.

Валентность слитого белка указывает на общее число связывающих ветвей или участков, которые слитый белок имеет с антигеном(ами) или эпитопом(ами); т.е. моновалентный, бивалентный, трехвалентный или мультивалентный. Мультивалентность антительного слитого белка означает, что он может использовать множество взаимодействий при связывании с антигеном, таким образом увеличивая возможности связывания с антигеном или с различными антигенами. Специфичность указывает на то, как много различных типов антигена или эпитопа способен связать антительный слитый белок, т.е. моноспецифический, биспецифический, триспецифический, мультиспецифический. Используя указанные определения, можно утверждать, что природное антитело, например, IgG, является бивалентным, поскольку оно имеет две связывающие ветви, но является моноспецифическим, поскольку оно связывается с одним типом антигена или эпитопа. Моноспецифический, мультивалентный слитый белок имеет более чем один связывающий участок для одного и того же антигена или эпитопа. Например, моноспецифическое диантитело является слитым белком с двумя связывающими участками, проявляющими активность в отношении одного и того же антигена. Слитый белок может включать в себя мультивалентную или мультиспецифическую комбинацию разных компонентов антитела или множество копий одного и того же компонента антитела.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения используют антитела, такие как моноклональные антитела (mAb), которые распознают или связывают маркеры или связанные с опухолью антигены, высокие уровни которых экспрессируются на клетках-мишенях и которые экспрессируются преимущественно или только на патологических клетках, в отличие от нормальных тканей, и антитела, которые быстро интернализируются. Антитела, используемые в объеме настоящего изобретения, включают в себя антитела против связанных с опухолью антигенов, такие антитела, которые имеют описанные выше свойства (и проявляют различные свойства в отношении разных уровней интернализации с клетками и микроорганизмами), и при раке, не ограничиваясь им, предполагается использовать следующие mAb: LL1 (антитела против CD74), LL2 (антитела против CD22), M195 (антитела против CD33), MN3 (анти-NCA90), RS7 (антитела против эпителиального гликопротеина-1 (EGP-1)), PAM-4, BrE3 и KС4 (все анти-MUC1), MN-14 (антитела против онкофетального антигена (CEA)), Mu-9 (антитела против антигена-р, специфичного для ободочной кишки), Immu 31 (антитела против альфа-фетопротеина), анти-TAG-72 (например, CC49), анти-Tn, J591 (анти-PSMA), M195 (анти-CD33) и G250 (антитела против карбоангидразы IX). Другие используемые антигены и различные эпитопы таких антигенов, на которые можно направить указанные конъюгаты, включают в себя HER-2/neu, CD19, CD20 (например, C2B8, hA20, 1F5 MAb), CD21, CD23, CD25, CD30, CD33, CD37, CD40, CD74, CD80, альфа-фетопротеин (AFP), VEGF, рецептор EGF, P1GF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, PSMA, PAP, карбоангидразу IX, TAG-72, GD2, GD3, HCG, EGP-2 (например, 17-1A), HLA-DR, CD30, Ia, A3, A33, Ep-CAM, KS-1, Le(y), S100, PSA, тенасцин, рецептор фолата, Tn или антигены Thomas-Friedenreich, антигены некроза опухоли, антигены ангиогенеза опухоли, Ga 733, T101, MAGE или их комбинации. Ряд перечисленных выше антигенов описан в предварительной заявке США No. 60/426379, озаглавленной «Использование мультиспецифических, нековалентных комплексов для направленной доставки терапевтических лекарственных средств», поданной в 15 ноября 2002.

В другом предпочтительном аспекте настоящего изобретения используют антитела, которые быстро интернализируются и затем вновь экспрессируются на клеточных поверхностях, способствуя непрерывному поглощению и аккумулированию клетками циркулирующего конъюгата антитело-химиотерапевтическое лекарственное средство. В предпочтительном аспекте лекарственным средством является антрациклин, и конъюгат антитело-антрациклин интернализируется клеткам-мишеням и затем вновь экспрессируется на клеточной поверхности. Примером наиболее предпочтительной пары антиген/антитело является LL1 и CD74 (инвариантная цепь, класс II-специфический шаперон, Ii). Антиген CD74 является высокоэкспрессированным на В-клеточных лимфомах, некоторых Т-клеточных лимфомах, меланомах и некоторых других опухолях (Ong et al., Immunology 98:296-302 (1999)).

В предпочтительном аспекте антитела, которые используют при лечении заболеваний человека, являются человеческими или гуманизированными (CDR, трансплантированный в человеческую рамку считывания) вариантами антител, хотя могут быть использованы и мышиные, химерные варианты и варианты антител приматов. Для ветеринарных целей, IgG одного и того же вида, вероятно, является самым эффективным вектором, хотя IgG перекрестных видов должны оставаться пригодными, как использование мышиных антител для собак (например, L243 анти-HLA-DR-mAb для лечения лимфомы у собак). Молекулы иммуноглобулинов (IgG) одного и того же вида в качестве доставочных средств являются наиболее предпочтительными для снижения до минимума иммунных ответов. Это обстоятельство важно при учете повторных обработок. Для человека менее вероятно, что человеческое или гуманизированное IgG-антитело вызовет анти-IgG-иммунный ответ у больных. Нацеленные на интернализирующийся антиген, антитела такие как hLL1 и hLL2, быстро интернализируются после связывания с клетками-мишенями, что свидетельствует о том, что конъюгированное химиотерапевтическое лекарственное средство быстро попадает в клетки.

Иммуномодулятор, такой как цитокин, также может быть конъюгирован с моноклональным антителом-антрациклиновым лекарственным средством или может быть введен в виде не конъюгированного с конъюгатом химерное, гуманизированное или человеческое моноклональное антитело-антрациклиновое лекарственное средство, согласно предпочтительным аспектам настоящего изобретения. Иммуномодулятор может быть введен до, одновременно или после введения конъюгата моноклональное антитело-антрациклиновое лекарственное средство согласно предпочтительным аспектам настоящего изобретения. Иммуномодулятор также может быть конъюгирован с гибридным антителом, состоящим из одного или более антител, связанных с различными антигенами. Такой антиген также может быть иммуномодулятором. Например, CD40 или другие иммуномодуляторы могут быть введены в комбинации с анти-CSAp- или в комбинации с анти-CSAp/non-CSAp-антителом, либо вместе, либо до, либо после введения комбинаций антитела. Конъюгат моноклональное антитело-антрациклиновое лекарственное средство может быть использован в комбинации со слитым белком или может быть конъюгирован со слитым белком, таким как анти-CD40.

Употребляемый в тексте термин «иммуномодулятор» включает в себя цитокины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, такие как фактор некроза опухоли (TNF), и гематопоэтические факторы, такие как интерлейкины (например, интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 и IL-21), колониестимулирующие факторы (например, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF)), интерфероны (например, интерфероны-α, -β-γ), фактор роста стволовых клеток, обозначенный "S1-фактор", эритропоэтин и тромбопоэтин. Примеры подходящих фрагментов иммуномодуляторов включают в себя IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, интерферон-γ, TNF-α и тому подобное.

Иммуномодулятор является терапевтическим агентом, как определено в настоящем изобретении, присутствие которого изменяет, подавляет или стимулирует иммунную систему организма. Обычно иммуномодулятор, используемый в настоящем изобретении, стимулирует иммунные клетки к пролиферации, или в каскаде иммунных реакций клетки, такие как макрофаги, В-клетки и/или Т-клетки, становятся активированными. Примером иммуномодулятора, описанного в тексте, является цитокин, который представляет собой растворимый белок небольшого молекулярного веса, составляющего 5-20 кД, высвобождающийся одной клеточной популяцией (например, примированные Т-лимфоциты) при контакте со специфическими антигенами, и который действует как межклеточные медиаторы между клетками. Как известно квалифицированным специалистам, примеры цитокинов включают в себя лимфокины, монокины, интерлейкины и несколько родственных сигнальных молекул, таких как фактор некроза опухоли (TNF) и интерфероны. Хемокины представляют собой подгруппу цитокинов. Некоторые интерлейкины и интерфероны являются примерами цитокинов, которые стимулируют пролиферацию Т-клеток или других иммунных клеток.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения иммуномодулятор усиливает эффективность конъюгата антрациклиновое лекарственное средство-антитело, и в некоторых случаях - посредством стимулирующих эффекторных клеток хозяина.

Конъюгаты антитело-химиотерапевтическое лекарственное средство

Настоящее изобретение относится к конъюгату антрациклинового лекарственного средства и антитела, где антрациклиновое лекарственное средство и антитело связаны через линкер, представляющий собой гидразид и малеимид. Линкером предпочтительно является 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразид. Конъюгат предпочтительно имеет формулу:

где n равно от 6 до 10.

Кроме того, антитело направлено против антигена или распознает связанный с опухолью антиген. Антитело может быть моноклональным антителом, его антиген-связывающим фрагментом или антительным слитым белком. Антительный слитый белок может быть мультивалентным и/или мультиспецифическим. Антительный слитый белок в конъюгате может включать в себя два или более одинаковых или разных природных или синтетических антитела, одноцепочечное антитело или сегменты фрагмента антитела с одинаковыми или разными специфичностями. Антитело или антительный фрагмент слитого белка может быть выбран из группы, состоящей из LL1, LL2, M195, MN-3, RS7, 17-1A, RS11, PAM-4, KC4, BrE3, MN-14, Mu-9, Immu 31, CC49, антитела Tn, J591, антитела Le(y) и G250.

Указанный, связанный с опухолью антиген может быть мишенью интернализирующего антитела. Конъюгат используют для нацеливания на карциномы, саркомы, лимфомы, лейкемии, глиомы или опухоли кожи, такие как меланомы. Связанный с опухолью антиген предпочтительно выбирают из группы, состоящей из CD74, CD22, EGP-1, CEA, антигена-р муцина, специфического для ободочной кишки (CSAp), карбоангидразы IX, HER-2/neu, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD30, CD33, CD40, CD45, CD66, NCA90, NCA95, CD80, альфа-фетопротеина (AFP), VEGF, рецептора EGF, P1GF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, PSMA, GD2, GD3 ганглиозидов, HCG, EGP-2, CD37, HLA-D-DR, CD30, Ia, Ii, A3, A33, Ep-CAM, KS-1, Le(y), S100, PSA, тенасцина, рецептора фолата, антигенов Tn и Thomas-Friedenreich, антигенов некроза опухоли, антигенов ангиогенеза опухоли, Ga 733, IL-2, MAGE и их комбинаций. Наиболее предпочтительно, когда связанный с опухолью антиген выбирают из группы, состоящей из CD74, CD19, CD20, CD22, CD33, EPG-1, MUC1, CEA и AFP. Указанные опухоль-ассоциированные антигены могут быть дифференцировочными антигенами линий дифференцировки (CD) В-клеток, Т-клеток, миелоидных клеток или антигенами, ассоциированными с гематологическими злокачественными опухолями.

Антитело как часть конъюгата может быть мышиным, химерным, приматизированным, гуманизированным или человеческим. Антитело может быть интактным иммуноглобулином или его антигенсвязывающим фрагментом, таким как IgG или его фрагмент.Предпочтительно, если антитело направлено против В-клеток, против антигена этих клеток, выбранного из группы, состоящей из CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD30, CD37, CD40, CD52, CD74, CD80 и HLA-DR. Антитело, его антиген-связывающий фрагмент или слитый белок предпочтительно выбирают из группы LL1, LL2, L243, C2B8, A20, MN-3, M195, MN-14, анти-AFP, Mu-9, PAM-4, RS7, RS11 и 17-1A. Более предпочтительно, когда антителом является LL1, LL2, L243, C2B8 или hA20. Кроме того, антитело связывается с лекарственным средством через линкер, который присоединяют к восстановленной дисульфидной связи у антитела, которая может быть дисульфидной связью между цепями молекулы антитела.

Антрациклиновое лекарственное средство как часть конъюгата выбирают из группы, состоящей из даунорубицина, доксорубицина, эпирубицина, 2-пирролинодоксорубицина, морфолинодоксорубицина и цианоморфолинодоксорубицина. Кроме того, антрациклиновое лекарственное средство может быть связано с антителом посредством 13-кетофрагмента. Предпочтительно, когда на молекулу антитела приходится 6-10 молекул антрациклинового лекарственного средства. Кроме того, конъюгат антитело-антрациклин поглощается клетками-мишенями, и антиген затем вновь экспрессируется на клеточной поверхности.

Настоящее изобретение относится к способу получения описанного здесь конъюгата, где сначала линкер конъюгируют с антрациклиновым лекарственным средством с образованием конъюгата антрациклиновое лекарственное средство-линкер и где конъюгат антрациклиновое лекарственное средство-линкер впоследствии конъюгируют с тиол-восстановленным моноклональным антителом или фрагментом антитела. Конъюгат антрациклиновое лекарственное средство-линкер может быть очищен до конъюгирования с тиол-восстановленным моноклональным антителом или фрагментом антитела, но делать это необязательно. Таким образом, предпочтительно, когда нет необходимости очищать конъюгат антрациклиновое лекарственное средство-линкер до конъюгирования с тиол-восстановленным моноклональным антителом или фрагментом антитела. Способ приготовления конъюгата должен быть таким, чтобы вторичные, реактивные функциональные группы антрациклинового лекарственного средства не были подвергнуты риску воздействия. Кроме того, способ приготовления конъюгата не должен затрагивать алкилирующие группы антрациклиновых лекарственных средств. Антрациклиновым лекарственным средством в конъюгате предпочтительно является 2-пирролинодоксорубицин, морфолинодоксорубицин или цианоморфолинодоксорубицин.

Молекулы химиотерапевтического лекарственного средства отдельно активируют для конъюгирования с антителом таким образом, что они содержат свободную малеимидную группу, специфичную для взаимодействия с тиолом при нейтральном рН. Когда химиотерапевтическое лекарственное средство имеет в молекуле реактивный кетон, кетон может быть превращен в гидразон с помощью коммерчески доступного линкера 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилгидразида (М₂С₂Н; Pierce Chemical Co., Rockford, IL) [также поставляемого как трифторацетатная соль корпорацией Molecular Biosciences, Inc., Boulder, CO], как показано на схеме I, ниже.

На схеме I "DRUG" означает химиотерапевтическое лекарственное средство, предпочтительно антрациклиновое лекарственное средство, а R-группа представляет собой либо атом водорода, либо С₁-С₆-алкильную группу, возможно замещенную гидроксильной группой (-ОН).

Схема I

Не связывая себя теорией, исследователи полагают, что линкер М₂С₂Н является особенно пригодным линкером в контексте предпочтительных аспектов настоящего изобретения по двум причинам. Во-первых, полагают, что циклогексильная группа линкера стабилизирует функциональность гидразона. Важно то, что используемая гидразоновая связь является в основном стабильной в условиях сыворотки, и циклогексильная группа, проксимальная к образованному гидразону, приводит к более стабильной гидразоновой связи в сравнении с более стандартной алкильной группой с прямой цепью. Во-вторых, гидразон, который образуется в результате реакции кетона с указанным карбоксилгидразидом, расщепляется сразу, и конъюгат химиотерапевтическое лекарственное средство-mAb попадает в клетку.

Малеимид-замещенные химиотерапевтические лекарственные средства, в небольшом избытке (от 1 до 5-кратного молярного избытка) по отношению к тиоловым группам восстановленного mAb, смешивают в водном растворе с восстановленным mAb. Реакцию проводят при нейтральном рН, около нейтрального рН или ниже нейтрального рН, предпочтительно приблизительно от рН 4 до рН 7. Компоненты оставляют взаимодействовать в течение короткого времени реакции приблизительно от 5 до 30 минут. Квалифицированный специалист должен признать, однако, что условия реакции можно оптимизировать по времени реакции и рН. Конъюгат химиотерапевтическое лекарственное средство-mAb, представленный схематично ниже (где n равно целому числу от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 8), затем хроматографически отделяют от химиотерапевтического лекарственного средства и других буферных компонентов посредством гель-фильтрации и гидрофобной хроматографии на колонках. В предпочтительном аспекте, лекарственным средством является антрациклин, и n является целым числом от 6 до 10.

конъюгат химиотерапевтическое лекарственное средство-mAb

Описанные выше условия являются оптимальными в случае 2-PDOX. Условия реакции являются оптимальными, поскольку они способствуют взаимодействию тиоловых групп mAb, которые легко образуются с малеимид-активированным химиотерапевтическим лекарственным средством, в то время как на енамин 2-PDOX условия реакции не влияют. Удивительно то, что связывание тиол-малеимид можно проводить в присутствии группы, способной к алкилированию, как проиллюстрировано здесь на примере енаминовой группы.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения используемые химиотерапевтические лекарственные средства являются антрациклиновыми лекарственными средствами. Указанные лекарственные средства включают в себя большой класс производных, типичным представителем которого является один из первоначальных членов группы, доксорубицин (DOX, представленный ниже) и его изомер, эпирубицин.

Как доксорубицин, так и эпирубицин широко используют в терапии рака. В другом предпочтительном аспекте настоящего изобретения химиотерапевтические лекарственные средства включают в себя аналоги высокотоксичного 2-PDOX, а именно, морфолино- и цианоморфолинодоксорубицин (морфолино-DOX и цианоморфолино-DOX, соответственно). В другом аспекте химиотерапевтические лекарственные средства включают в себя даунорубицин.

Квалифицированный специалист должен признать, что антрациклиновые лекарственные средства согласно предпочтительным аспектам настоящего изобретения содержат ряд реактивных групп, которые могут быть отнесены ко вторичным реактивным функциональным группам, которые могут требовать защиты защитными группами, хорошо известными в данной области, до конъюгирования лекарственного средства с линкером и/или до конъюгирования конъюгата лекарственное средство-линкер и mAb; защита может потребоваться для того, чтобы не нарушить целостность реактивных групп. См. Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (John Wiley & Sons 2d ed. 1991). Реактивные группы включают в себя карбонильные группы в антрахиноновом ядре антрациклиновых лекарственных средств, группы, которые при определенных условиях могут взаимодействовать с нуклеофилом. Другие реактивные группы включают в себя различные спиртовые группы, которые расположены по всем молекулам антрациклинового лекарственного средства; группы, которые при определенных условиях могут взаимодействовать с электрофилами. Наконец, другие реактивные группы включают в себя аминогруппу, находящуюся в DOX, и енаминогруппу в 2-PDOX, обе из которых могут взаимодействовать с электрофилом. В случае антрациклиновых лекарственных средств, несущих алкилирующую группу (например, енамин 2-PDOX), необходимо контролировать условия реакции, чтобы целостность алкилирующей группы не была нарушена.

В классе антрациклиновых лекарственных средств индивидуальные лекарственные средства, токсичность которых изменяется в 1-10000-раз (3-4 порядка величин), могут быть взаимозаменяемы на основе их меняющихся токсичностей, с тем, чтобы производить более или менее токсичные иммуноконъюгаты. Антрациклины могут проявлять свое токсическое действие на клетки-мишени посредством нескольких механизмов, включая ингибирование ДНК-топоизомеразы 2 (топ 2), внедрение в ДНК, окислительно-восстановительные реакции и связывание с некоторыми внутриклеточными или мембранными белками. Кроме того, могут быть созданы такие аналоги, которые имеют дополнительные механизмы уничтожения клеток, такие как способность быть алкилированными. Примерами аналогов являются антрациклины, несущие алкилирующий фрагмент, как в случае аналога 2-PDOX. В данном примере алкилирующим фрагментом является енаминогруппа. В аналоге 2-PDOX енаминогруппа в пирролинокольце является высокореактивной с нуклеофилами при физиологических условиях.

Фармацевтические композиции и способы введений

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат mAb-лекарственное средство согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Под "фармацевтически приемлемым носителем" подразумевают, не ограничиваясь ими, нетоксический твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, разбавитель, инкапсулирующий материал или вспомогательный материал любого типа, известного квалифицированным специалистам в данной области. Разбавители, такие как многоатомные спирты, полиэтиленгликоль и декстраны, могут быть использованы для увеличения биологического периода полужизни конъюгата.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания у млекопитающих, включающему в себя введение, как здесь описано, конъюгата антитела и антрациклинового лекарственного средства. Настоящий способ также включает в себя введение конъюгата антитело-антрациклин, описанного здесь во всех его измененных формах, которое предшествует, сопутствует или проводится после других стандартных способов лечения, где указанное стандартное лечение выбирают из группы, состоящей из радиотерапии, хирургии и химиотерапии.

Настоящее изобретение предназначено охватить способ лечения заболевания у млекопитающего, включающий в себя введение двух или более конъюгатов антитела и антрациклинового лекарственного средства, которые нацелены на различные антигены или различные эпитопы одного и того же антигена на одних и тех же патологических клетках. Кроме того, настоящее изобретение предназначено охватить способ лечения заболевания у млекопитающего, включающий в себя введение конъюгата антитела и антрациклинового лекарственного средства, которое предшествует, сопутствует или проводится после обработки на основе второго антитела, такой, что второе антитело при обработке на основе второго антитела нацелено на другой антиген или другой эпитоп на том же антигене на патологических клетках, нежели антитело в конъюгате.

В некоторых аспектах конъюгат mAb-лекарственное средство как таковой или фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат mAb-лекарственное средство согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель, могут быть использованы в способе лечения субъекта, включающем в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата mAb-лекарственное средство согласно настоящему изобретению.

В предпочтительных аспектах субъектом является млекопитающее. Типичными млекопитающими являются человек, свинья, овца, коза, лошадь, мышь, собака, кошка, корова и т.д. Заболевания, которые можно лечить с помощью конъюгата mAb-лекарственное средство согласно настоящему изобретению, включают в себя рак, такой как рак кожи, головы и шеи, легких, молочной железы, простаты, яичников, эндометрия, шейки матки, ободочной кишки, прямой кишки, мочевого пузыря, мозга, желудка, поджелудочной железы, лимфатической системы. Больных, страдающих от В-клеточного или Т-клеточного рака, не-ходжкинской лимфомы, болезни Ходжкина, лимфолейкоза или миелолейкоза, множественной миеломы, саркомы и меланомы, можно лечить путем введения терапевтического количества конъюгата mAb-лекарственное средство согласно настоящему изобретению.

Конъюгат mAb-лекарственное средство согласно настоящему изобретению может быть введен внутривенно, внутрибрюшинно, внутриартериально, внутриоболочечно, внутрипузырно или в опухоль. Конъюгат может быть введен в виде болюса или в виде инфузии на основе повторных введений или циклами. Инфузия может быть повторена один или более раз в зависимости от дозы лекарственного средства и переносимости конъюгата с точки зрения побочных эффектов и определяется врачом. Обычный специалист примет во внимание, что эффективные количества конъюгата mAb-лекарственное средство согласно настоящему изобретению можно определить эмпирически. Агенты могут быть введены субъекту, при необходимости лечения рака, в виде фармацевтической композиции в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми наполнителями. Понятно, что при введении больному человеку общее суточное употребление агентов или композиции согласно настоящему изобретению должен решать штатный врач больницы в рамках обоснованного медицинского заключения. Специфический терапевтически эффективный уровень дозы для любого отдельного больного будет зависеть от ряда факторов: типа и степени достигаемого клеточного ответа; активности специфического конъюгата mAb-лекарственное средство или используемой композиции; специфического конъюгата mAb-лекарственное средство или используемой композиции; возраста, веса тела, общего здоровья, пола и питания больного; времени введения, способа введения и скорости выведения агента; продолжительности лечения; лекарственных средств, используемых в комбинации или сопутствующих специфическому агенту, и подобных факторов, хорошо известных в медицине. Например, исходя из практики в данной области, следует начать с доз агентов на уровнях, которые ниже уровней, требуемых для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозировки до тех пор, пока не будет достигнут желаемый эффект.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения введение конъюгата антитело-антрациклин предшествует, сопутствует или проводится после других стандартных способов лечения, включая радиотерапию, хирургию или химиотерапию.

В другом предпочтительном аспекте вводят два или более конъюгата антитела и антрациклинового лекарственного средства причем эти конъюгаты нацелены на различные антигены или различные эпитопы одного и того же антигена на одних и тех же патологических клетках. В еще одном предпочтительном аспекте конъюгат антитела и антрациклинового лекарственного средства вводят перед другой обработкой на основе антитела, одновременно или после такой обработки. Данная дополнительная обработка на основе антитела может включать в себя введение двух или более обработок на основе антитела, чтобы включить «голую» терапию, где вводят только антитело или в комбинации с другим терапевтическим средством, которое вводят либо конъюгированным, либо не конъюгированным с антителом. Для конъюгирования можно использовать описанный в тексте линкер или другой тип линкера. Когда применяют две обработки на основе антитела, то эти обработки являются такими, что какое бы антитело ни ввели, второе нацелено на другой антиген или другой эпитоп на одном и том же антигене на патологических клетках. Второе антитело также можно конъюгировать с другим (отличным) лекарственным средством или с терапевтическим изотопом, таким образом, способствуя комбинированной терапии, на основе антитела. Следует признать, что эту терапию можно комбинировать с введением цитокинов до, одновременно или после, которые либо усиливают противоопухолевые эффекты, либо предотвращают или ослабляют миелосупрессивные эффекты терапевтических конъюгатов.

Каждый из вышеуказанных способов лечения может дополнительно включать в себя введение одного или более иммуномодуляторов. Эти иммуномодуляторы могут быть выбраны из группы, состоящей из интерферонов, цитокинов, факторов роста стволовых клеток, колониестимулирующих факторов, лимфотоксинов и других гематопоэтических факторов. Интерферон представляет собой предпочтительно α-интерферон, β-интерферон или γ-интерферон, и гематопоэтические факторы могут быть выбраны из группы, состоящей из эритропоэтина, тромбопоэтина, интерлейкинов (IL), колониестимулирующих факторов (CSF), гранулоцитарно-макрофагальных колониестимулирующих факторов (GM-CSF). Интерлейкин может быть выбран из группы, состоящей из IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 и IL-21. Иммуномодулятор или гематопоэтический фактор можно вводить до терапии с помощью иммуноконъюгата, во время или после указанной терапии. Иммуномодулятор вводят для повышения эффективности введенного конъюгата согласно настоящему изобретению.

Наборы

Предпочтительные аспекты настоящего изобретения также предполагают включение наборов, содержащих конъюгат моноклонального антитела и антрациклинового лекарственного средства в подходящем контейнере. Конъюгат предпочтительно включает в себя линкер, содержащий гидразид и малеимид. Нагруженное антрациклиновым лекарственным средством моноклональное антитело находится в стерильном контейнере в жидком, замороженном или лиофилизированном виде. Нагруженное антрациклиновым лекарственным средством моноклональное антитело может, при необходимости, быть разбавлено или вновь растворено до введения больному.

В другом аспекте, конъюгат антрациклинового лекарственного средства и антитела, где антрациклиновое лекарственное средство и антитело связаны через линкер, включающий в себя гидразид и малеимид, и где по меньшей мере один иммуномодулятор также конъюгирован с антителом. Затем конъюгат может быть введен больным при необходимости терапии, как здесь описано для конъюгата только или в комбинации с другими способами терапии.

Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами, без ограничения объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

Общие

2-пирролинодоксорубицин был получен модифицированным способом, основанным на первоначальном описании Nagy et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 93:2464-2469 (1996)). Морфолино-DOX и цианоморфолино-DOX были синтезированы из доксорубицина с помощью опубликованных методов (Acton et al., J. Med. Chem. 27:638-645 (1984)).

Пример 1: Синтез 2-PDOX

Синтез 2-пирролинодоксорубицина (2-PDOX): 4-йодобутиральдегид: 2-(3-хлоропропил)-1,3-диоксолан (1,3 мл; 10 мМ) растворяли в 200 мл ацетона, содержащего 30 г йодида натрия (200 ммоль; 20-кратный избыток). Раствор кипятили с обратным холодильником в течение 24 ч и затем упаривали досуха. Сырую смесь использовали в следующей реакции. Хлоргидрат доксорубицина (550 мг, 946 мкмоль) растворяли в 6,5 мл DMF и 3,86 г (19,48 ммоль, 20-кратный избыток) 4-йодобутиральдегида добавляли с последующим добавлением 500 мкл N,N-диизопропилэтиламина (DIPEA). Через пять минут материал очищали ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке Waters NovaPak C-18 посредством градиента элюции. Градиент составлял от 90:10 элюента А до 70:30 элюента В при скорости 75 мл в минуту, в течение 40 минут, где элюент А представляет собой 0,1% раствор трифторуксусной кислоты (TFA) и элюент В представляет собой 90% ацетонитрил, содержащий 0,1% TFA. Идентичность продукта подтверждали масс-спектрометрией с помощью электроспрея М+Н⁺=596.

Пример 2: Конъюгирование 2-PDOX с гуманизированным LL2 (hLL2) антителом против CD22

А) Активация 2-PDOX: 2-PDOX (5,95 мг; 1х10^-5 моль) смешивали с молярным эквивалентом коммерчески доступного линкера 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилгидразида (М₂С₂Н; Pierce Chemical Co., Rockford, IL) (2,88 мг; 1х10^-5 моль) в 0,5 мл диметилсульфоксида (DMSO). Реакционную смесь нагревали при 50-60°С при пониженном давлении в течение тридцати минут. Желаемый продукт очищали препаративной ОФ-ВЭЖХ, используя градиент, состоящий из 0,3% ацетата аммония и 0,3% ацетата аммония в 90% ацетонитриле, рН 4,4, для отделения желаемого продукта от большей части непрореагировавшего 2-PDOX (элюирование 0,5 минут раньше) и от непрореагировавшего М₂С₂Н (элюирование намного раньше). Количество возвращенного обратно 2-PDOX рассчитывали при оценке уровня абсорбции образца в УФ-области (496 нм) против стандартного раствора 2-PDOX в ацетонитриле/аммонийацетатном буфере. Активированный малеимидом 2-PDOX замораживали и лиофилизировали, если не использовали немедленно. Его помещали в минимальное количество DMSO, когда требовалось провести реакцию с антителами.

b) Восстановление hLL2-IgG: 1 мл образца антитела LL2 (8-12 мг/мл) при 4°С обрабатывали 100 мкл 1,8 М трис-HCl буфера, с последующим добавлением трех мкл 2-меркаптоэтанола. Реакцию восстановления проводили в течение 10 минут и восстановленное антитело очищали на двух последовательных спин-колонках с сефадексом G-50-80, уравновешенных в 0,1 М ацетате натрия, рН 5,5, содержащем 1 мМ ЭДТА в качестве антиоксиданта. Продукт анализировали при оценке абсорбции в УФ-области при 280 нм и с помощью реакции Элмана с детекцией при 410 нм, чтобы определить число тиоловых групп на моль антитела. Эти условия реакции восстановления привели к получению приблизительно 8-12 тиоловых групп на антитело, что соответствовало полному восстановлению дисульфидных связей между цепями антитела.

с) Конъюгирование активированного 2-PDOX с восстановленным hLL2: Тиол-восстановленное антитело из раздела b) обрабатывали малеимидо-активированным 2-PDOX, не позволяя конечной концентрации DMSO подниматься выше 25% в смеси вода/DMSO. После проведения реакции в течение 15 минут при 4°С желаемый продукт получали свободным от непрореагировавшего малеимидо-DOX путем элюции через спин-колонку G-50-80, уравновешенную в 0,2 М ацетате аммония, рН 4,4, с последующей фильтрацией через колонку SM-2 Bio-Beads, уравновешенную в таком же буфере. Продукт анализировали посредством сканирования в УФ-области при 280 и 496 нм и тем самым оценивали молярное отношение 2-PDOX к mAb. Абсолютное отношение 2-PDOX к mAb определяли путем MALDI-TOF-масс-спектрального анализа. Результаты сканирования в УФ-области и масс-спектрального анализа указывают на то, что степень замещения 7-8 единиц 2-PDOX на моль антитела hLL2 получают при данных реакционных условиях. При анализе посредством исключенной по размеру ВЭЖХ (колонка GF-250, Bio-Rad, Hercules CA) со скоростью 1 мл/минуту в 0,2 М ацетатном буфере, рН 5,0, с детекцией в УФ при 496 нм обнаружено, что в основном все обнаруженные пики элюировались вблизи времени удержания антитела LL2. Полученные результаты свидетельствуют о том, что очень мало свободного лекарственного средства присутствует в продукте. Образцы конъюгата 2-PDOX-hLL2 разделяли по аликвотам в виде однократных фракций, обычно по 0,1-1,0 мг, и замораживали для дальнейшего использования, или, в качестве альтернативы, их лиофилизировали. Образцы размораживали или вновь растворяли, как этого требовалось для дальнейшего испытания.

Пример 3: Конъюгирование 2-PDOX с гуманизированным LL1 (hLL1) антителом против CD74

а) Активация 2-PDOX: 2-PDOX (5,95 мг; 1х10^-5 моль) смешивали с молярным эквивалентом коммерчески доступного линкера 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилгидразида (М₂С₂Н; Pierce Chemical Co., Rockford, IL) (2,88 мг; 1х10^-5 моль в 0,5 мл диметилсульфоксида (DMSO)). Реакционную смесь нагревали при 50-60°С при пониженном давлении в течение тридцати минут. Желаемый продукт очищали препаративной ОФ-ВЭЖХ, используя градиент, состоящий из 0,3% ацетата аммония и 0,3% ацетата аммония в 90% ацетонитриле, рН 4,4, для отделения желаемого продукта от большей части непрореагировавшего 2-PDOX (элюирование ˜ на 0,5 минут раньше) и от непрореагировавшего М₂С₂Н (элюирование намного раньше). Количество извлеченного 2-PDOX рассчитывали при оценке уровня абсорбции образца в УФ-области (496 нм) против стандартного раствора 2-PDOX в ацетонитриле/аммонийацетатном буфере. Активированный малеимидом 2-PDOX замораживали и лиофилизировали, если не использовали немедленно. Его помещали в минимальное количество диметилформамида (DMF) или DMSO, когда требовалось провести реакцию с антителами.

b) Восстановление hLL1-IgG: 1 мл образца hLL1-антитела (8-12 мг/мл) при 4°С обрабатывали посредством 100 мкл 1,8 М трис-HCl буфера с последующим добавлением трех мкл 2-меркаптоэтанола. Реакцию восстановления проводили в течение 10 минут и восстановленное антитело очищали на двух последовательных спин-колонках с сефадексом G-50-80, уравновешенных в 0,1 М ацетате натрия, рН 5,5, содержащем 1 мМ ЭДТА в качестве антиоксиданта. Продукт анализировали при оценке абсорбции в УФ-области при 280 нм и с помощью реакции Элмана с детекцией при 410 нм, чтобы определить число тиоловых групп на моль антитела. Эти условия реакции восстановления привели к получению приблизительно восьми-десяти тиоловых групп на антитело, что соответствовало полному восстановлению дисульфидных связей между цепями антитела.

с) Конъюгирование активированного 2-PDOX с восстановленным hLL1: Тиол-восстановленное антитело из раздела b), выше обрабатывали малеимидо-активированным 2-PDOX из раздела а) выше с конечной концентрацией DMSO 15% в смеси вода/DMSO. После проведения реакции в течение 15 минут при 4°С желаемый продукт получали свободным от непрореагировавшего малеимидо-DOX путем элюции через спин-колонку G-50-80, уравновешенную в 0,2 М ацетате аммония, рН 4,4, с последующей фильтрацией через колонку SM-2 Bio-Beads, уравновешенную в таком же буфере. Продукт анализировали, сканируя в УФ-области при 280 и 496 нм, и тем самым оценивали молярное отношение 2-PDOX к mAb. Абсолютное отношение 2-PDOX к mAb определяли посредством MALDI-TOF-масс-спектрального анализа. Результаты сканирования в УФ-области и масс-спектрального анализа указывают на то, что степень замещения 7-8 единиц 2-PDOX на моль антитела hLL1 получают при данных реакционных условиях. При анализе посредством ВЭЖХ с исключением по размеру (колонка GF-250, Bio-Rad, Hercules CA) со скоростью 1 мл/минуту в 0,2 М ацетатном буфере, рН 5,0, с детекцией в УФ при 496 нм обнаружено, что в основном все пики элюировались вблизи времени удержания антитела hLL1. Полученные результаты свидетельствуют о том, что очень мало или совсем не присутствует свободного лекарственного средства в продукте. Образцы конъюгата 2-PDOX-hLL1 разделяли по аликвотам в виде однократных фракций, обычно по 0,1-1,0 мг, и замораживали для дальнейшего использования, или, в качестве альтернативы, их лиофилизировали. Образцы размораживали или вновь растворяли, если это требовалось для дальнейшего испытания.

Пример 4: Конъюгирование DOX с антителом hLL1 против CD74

а) Активация DOX: DOX (1×10^-5 моль) смешивали с молярным эквивалентом коммерчески доступного линкера 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилгидразида (М₂С₂Н; Pierce Chemical Co., Rockford, IL) (2,88 мг; 1х10^-5 моль) в 0,5 мл DMSO. Реакционную смесь нагревали при 50-60°С в течение тридцати минут. Желаемый промежуточный продукт, формула которого представлена ниже, очищали препаративной ОФ-ВЭЖХ, используя градиент, состоящий из 0,3% ацетата аммония и 0,3% ацетата аммония в 90% ацетонитриле, рН 4,4, для отделения желаемого продукта от большей части непрореагировавшего DOX (элюирование ˜ на 0,5 минут раньше) и от непрореагировавшего М₂С₂Н (элюирование намного раньше).

Количество непрореагировавшего DOX рассчитывали при оценке уровня абсорбции образца в УФ-области (496 нм) против стандартного раствора DOX в буфере ацетонитрил/аммонийацетат. Активированный малеимидом DOX замораживали и лиофилизировали, если не использовали немедленно. Его помещали в минимальное количество DMF или DMSO, когда требовалось провести реакцию с антителами.

b) Восстановление hLL1-IgG: 1 мл образца антитела hLL1 (10 мг/мл) при 4°С обрабатывали посредством 100 мкл 1,8 М трис-HCl буфера, с последующим добавлением трех мкл 2-меркаптоэтанола. Реакцию восстановления проводили в течение 10 минут и восстановленное антитело очищали на двух последовательных спин-колонках с сефадексом G-50-80, уравновешенных в 0,1 М ацетате натрия, рН 5,5, содержащем 1 мМ ЭДТА в качестве антиоксиданта. Продукт анализировали при оценке абсорбции в УФ-области при 280 нм и с помощью реакции Элмана с детекцией при 410 нм, чтобы определить число тиоловых групп на моль антитела. Эти условия реакции восстановления привели к получению приблизительно восьми-десяти тиоловых групп на антитело, что соответствовало полному восстановлению дисульфидных связей между цепями антитела.

с) Конъюгирование активированного DOX с восстановленным hLL1: Тиол-восстановленное антитело из раздела b) обрабатывали малеимидо-активированным DOX из раздела а) выше с конечной концентрацией DMSO 15% в смеси вода/DMSO. После проведения реакции в течение 15 минут при 4°С желаемый продукт получали свободным от непрореагировавшего малеимидо-DOX путем элюции через спин-колонку G-50-80, уравновешенную в 0,2 М ацетате аммония, рН 4,4, с последующей фильтрацией через колонку SM-2 Bio-Beads, уравновешенную в таком же буфере. Продукт анализировали, сканируя в УФ-области при 280 и 496 нм, и тем самым оценивали молярное отношение DOX к mAb. Абсолютное отношение DOX к mAb определяли посредством MALDI-TOF-масс-спектрального анализа. Результаты сканирования в УФ-области и масс-спектрального анализа указывают на то, что степень замещения 7-8 единиц DOX на моль антитела hLL1 получают при данных реакционных условиях. При анализе посредством ВЭЖХ с исключением по размеру (колонка GF-250, Bio-Rad, Hercules CA) со скоростью 1 мл/минуту в 0,2 М ацетатном буфере, рН 5,0, с детекцией в УФ при 496 нм, обнаружено, что в основном все пики элюировались вблизи времени удержания антитела hLL1. Запись элюирования (см. фигуру 1; определение абсорбции в УФ при 496 нм для обнаружения DOX) выявила конъюгат доксорубицин-LL1 в виде одного пика при времени удержания около девяти минут без агрегированных белков или свободного DOX (время удержания около 14 минут). Полученные результаты свидетельствуют о том, что очень мало или совсем не присутствует свободного лекарственного средства в продукте. Образцы конъюгата DOX-hLL1 разделяли по аликвотам в виде однократных фракций, обычно по 0,1-1,0 мг, и замораживали для дальнейшего использования, или, в качестве альтернативы, их лиофилизировали. Образцы размораживали или вновь растворяли, если это требовалось для дальнейшего испытания.

Пример 5: Сочетание доксорубицина с hLL1 и образование конъюгата dox-hLL1

а) Реакция доксорубицина с SMCC-гидразидом

Смешивали 90 мг доксорубицина (1,56×10^-4 моль) и 60,23 мг SMCC-гидразида в 13 мл смеси метанол:этанол (безводные) 1:2 и добавляли 10,4 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь оставляли на мешалке в течение 4 ч в темноте при комнатной температуре. Затем реакционный раствор фильтровали через фильтр в шприце с размером пор 0,22 микрона в 100-мл круглодонную колбу. Затем добавляли семьдесят пять мкл диизопропилэтиламина, и растворитель упаривали на роторном испарителе при 300°С. Остаток растирали с ацетонитрилом 4×40 мл и затем диэтиловым эфиром 1×40 мл и сушили до получения порошка на роторном испарителе в высоком вакууме. Порошок вновь растворяли в 5 мл безводного метанола, вновь упаривали досуха, как указано выше, и затем хранили при -200°С до тех пор, пока не потребуется.

b) Восстановление hLL1-IgG дитиотрейтолом

В 20 мл круглодонной колбе смешивали 8,4 мл hLL1-IgG (10,3 мг/мл, 5,78×10^-7 моль), 160 мкл 0,1 М натрийфосфатного буфера, рН 7,5, 500 мкл 0,2 М ЭДТА, рН 7,0, и 290 мкл деионизированной воды. Смесь подвергали дезоксигенированию путем прохождения раствора шесть раз между вакуумом и атмосферой аргона. Свежеприготовленный раствор 40 мМ дитиотрейтола (DTT) в воде (0,015 г в 2,4 мл воды, 2,3×10^-5 моль; 40-кратный молярный избыток относительно IgG) подвергали дезоксигенированию путем пропускания аргона через раствор в течение 10 минут и 640 мкл этого водного раствора DTT добавляли к дезоксигенированному раствору антитела hLL1. Полученную смесь инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Восстановленное антитело очищали диафильтрацией (один фильтр 30К, в атмосфере аргона, при 4°С) против дезоксигенированного буфера 10 мМ PBS/100 мМ L-гистидина, рН 7,4. Буфер добавляли непрерывно до тех пор, пока общий объем фильтрата не достигал 300 мл. Объем раствора восстановленного антитела hLL1 (hLL1-SH) снижали до 10 мл.

с) Конъюгирование доксорубицина-SMCC с hLL1-SH и очистка конъюгата

Активированный доксорубицин (1,9 мл, 2,09×10^-5 моль, 36-кратный избыток относительно IgG) помещали в диметилсульфоксидный (DMSO) раствор и затем медленно добавляли к раствору антитела hLL1-SH (40 мл) в атмосфере аргона при комнатной температуре. Конечная концентрация DMSO составила 5%. Реакция протекала при слабом перемешивании в течение 40 минут при 4°С. Реакционную смесь помещали в колонку BioBeadTM (Bio-Rad, Richmond CA) (1,5 см диаметр × 34 см высота, уравновешенная буфером 10 мМ PBS/100 мМ L-гистидина, рН 7,4) и пропускали со скоростью 2 мл/мин. Полученный конъюгат концентрировали фильтрацией в ячейке Amicon и фильтровали через фильтр в шприце с размером пор 0,22 микрона до приготовления для лиофилизирования.

d) Приготовление конъюгата и лиофилизирование

К 40 мл раствора вышеупомянутого конъюгата hLL1-dox добавляли 8 мл 0,5 М раствора маннита в воде и 0,48 мл 1% полисорбата-20, при этом конечная концентрация достигала 1,64 мг/мл hLL1-dox, 82,5 мМ маннита и 0,01% полисорбата-20. Образцы лиофилизировали в количестве 1 мг и 10 мг dox-hLL1 (3- и 10-мл пузырьки, соответственно), замораживали на сухом льду и лиофилизировали в вакууме в течение 48 ч. Пузырьки закупоривали в вакууме и хранили запаянными при -20°С в темноте для дальнейшего использования.

Пример 6: Приготовление конъюгатов антител морфолино-DOX и цианоморфолино-DOX

Морфолино-DOX и цианоморфолино-DOX приготовляли посредством восстановительного алкилирования доксорубицина 2,2'-окси-бис[ацетальдегидом], используя процедуру Acton, et al. (J. Med. Chem. 27:638-645 (1984)).

Указанные аналоги DOX сочетали с М₂С₂Н таким же образом, как описано выше для аналогов DOX и 2-PDOX. Цианоморфолино-DOX сочетали с 10% молярным избытком гидразида в безводном метаноле (вместо DMSO) в течение ночи при комнатной температуре. После удаления растворителя с последующей флэш-хроматографией получали гидразон. Масс-спектральный анализ с помощью электроспрея: М+Н m/e 872, M+Na 894; M-H 870. Подобным же образом морфолино-DOX был превращен в его производное гидразон с помощью SMCC-гидразида, с использованием 1,5 эквивалента реагента в безводном метаноле в течение 4 ч, и продукт очищали флэш-хроматографией. Масс-спектрометрия с помощью электроспрея: М+Н m/e 847, M-H m/e 845, M+Cl m/e 881.

Дисульфидные связи между цепями антител восстанавливали до свободных тиолов, как описано выше в примерах 2-4, с получением дисульфид-восстановленных mAb, и конъюгаты приготовляли такими же способами, как описано в разделе с) каждого из примеров 2, 3 и 4. Были получены следующие конъюгаты mAb и морфолино-DOX и цианоморфолино-DOX:

Конъюгаты морфолино-DOX-антитело:

конъюгат mRS7: лекарственное средство-mAb, степень замещения: 6,4:1.

конъюгат mMN-14: лекарственное средство-mAb, степень замещения: 8,9:1.

Конъюгаты цианоморфолино-DOX-антитело:

конъюгат mRS7: лекарственное средство-mAb, степень замещения: 5,3:1.

конъюгат mMN-14: лекарственное средство-mAb, степень замещения: 7,0:1.

Пример 7: Эффективность in vitro конъюгатов антрациклин-антитело

Raji-клетки В-лимфомы получали из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Rockville, MD) и выращивали в RPMI 1640 среде, содержащей 12,5% сыворотки плода коровы (Hyclone, Logan, UT), снабженной глутамином, пируватом, пенициллином и стрептомицином (Life Technologies, Grand Island, NY). Кратко, 3,75×10⁵ клеток инкубировали в течение 2 дней с указанной концентрацией конъюгата лекарственное средство-mAb в 1,5 мл тканевой культуральной среды в лунках 24-луночных планшетов. Затем клетки переносили в колбы Т25, содержащие 20 мл среды, и инкубировали в течение периода вплоть до 21 дня или до тех пор, пока количество клеток не увеличивалось в 16 раз. Подсчет жизнеспособных клеток выполняли с использованием трипанового синего на день 0, день 2, а затем каждые 3-5 дней. Исходя из степени роста необработанных клеток, было рассчитано время удвоения, и фракцию выживших клеток рассчитывали, исходя из времени, требуемого для того, чтобы количество обработанных клеток увеличилось в 16 раз, предполагая, что время удвоения не являлось результатом обработки. Даже одна жизнеспособная клетка легко определялась. При концентрации конъюгата лекарственное средство-mAb 1 мкг/мл, конъюгат DOX-LL1 продемонстрировал разницу на три порядка величин во фракции выживших клеток в сравнении с конъюгатом DOX-MN-14. См. фигуру 2.

Пример 8: Обработка животных - опухоленосителей конъюгатами антрациклин-антитело

а) Обработка в модели ксенотрансплантата солидной опухоли. Группы мышей с врожденным отсутствием вилочковой железы инъецировали подкожно злокачественными клетками опухоли простаты человека DU145. Приблизительно через две недели, когда пальпируемые ксенотрансплантаты опухоли простаты выросли у животных, половину из них обрабатывали одноразовой дозой конъюгата нагруженного лекарственным средством антитела 2-PDOX-RS7, а половину оставляли необработанной (контроли). На фигуре 3 представлен рост опухолевых ксенотрансплантатов у необработанных мышей против роста ксенотрансплантатов у мышей, обработанных 2-PDOX-RS7. Полученные данные свидетельствуют о достижении терапевтического эффекта у животных, обработанных нагруженным лекарственным средством антитела, исходя из замедления роста ксенотрансплантатов.

b) Обработка модельных животных с системным злокачественным заболеванием. Мышей NCr-SCID, по десяти животных в группе, подвергали внутривенному инъецированию суспензии 2,5×10⁶ клеток человеческой линии африканской В-клеточной лимфомы Беркитта, Raji-клеток, путем введения в хвостовую вену. Через пять дней часть животных оставляли необработанными, а остальных обрабатывали однократными дозами либо 350 мкг DOX-LL1, либо 150 мкг 2-PDOX-LL1. На фигуре 4 показаны результаты эксперимента. Необработанных животных парализовало, и они умерли приблизительно на 23 день после инъецирования Raji-клетками от системного рака. Животные, обработанные DOX- и 2-PDOX-конъюгатами антитела LL1, выживали в течение периода, соответствующего приблизительно четырехкратной продолжительности жизни животных, обработанных 2-PDOX-LL1, и даже выше повышенной продолжительности жизни животных, обработанных DOX-LL1.

с) Обработка модельных животных с системной злокачественной опухолью. Мышей NCr-SCID, по десяти животных в группе, подвергали внутривенному инъецированию суспензии 2,5×10⁶ клеток человеческой линии африканской В-клеточной лимфомы Беркитта, Raji-клеток, путем введения в хвостовую вену. Через пять дней часть животных оставляли необработанными, а остальных обрабатывали однократными дозами либо 150 мкг 2-PDOX-LL1, либо 150 мкг 2-PDOX-MN-14 (неспецифический контрольный конъюгат антитела). На фигуре 5 показаны результаты эксперимента. Необработанных животных парализовало, и они умерли приблизительно на 23 день после инъецирования Raji-клеток из системной злокачественной опухоли, как и животные, обработанные конъюгатом 2-PDOX-MN-14. Животные, обработанные конъюгатом 2-PDOX-LL1, выживали в течение продолжительного периода.

Исходя из вышеприведенного описания, квалифицированный специалист в данной области может легко определить существенные характеристики изобретения и, не отклоняясь от смысла и объема изобретения, может произвести различные изменения и модификации изобретения, чтобы приспособить его к различному использованию и различным условиям без излишнего экспериментирования. Все патенты, патентные заявки и публикации, цитированные в тексте, включены в описание в виде ссылки во всей своей полноте.

Ссылки

Патентные документы США:

Arcamone et al., U.S. Patent No. 4125607.

Greenfield et al., U.S. Patent No. 5122368.

Janaky et al., U.S. Patent No. 6214969.

Kaneko et al., U.S. Patent No. 5349066.

Kaneko et al., U.S. Patent No. 5137877.

McKenzie et al., U.S. Patent No. 5798097.

King et al., U.S. Patent No. 6307026.

King et al., U.S. Patent No. 5824805.

King et al., U.S. Patent No. 5162512.

Moreland et al., U.S. Patent No. 5241078.

Schally et al., U.S. Patent No. 6184374.

Schally et al., U.S. Patent No. 5843903.

Willner et al., U.S. Patent No. 5708146.

Willner et al., U.S. Patent No. 5622929.

Willner et al., U.S. Patent No. 5606017.

Другие ссылки:

Anthracycline Antibiotics: New Analogs, Methods of Delivery, and Mechanisms of Action.

ACS Symposium Series 574, W. Priebe, editor, Publ. American Chemical Society, 1995.

Acton et al., J. Med. Chem., 27:638-645, 1984.

Arencibia et al., Anticancer Drugs, 12:71-78, 2001.

Benali et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97:9180-9185, 2000.

Chastzistamou et al., Clin. Cancer Res., 6:4158-4165,.2000.

Denmeade et al., Cancer Res., 58:2537-40, 1998.

Dubowchik et al., Bioconjug. Chem., 13:855-869, 2002.

Halmos et al., Cancer Lett., 136:129-136,1999.

Hansen et al., Biochem J., 320:393-300, 1996.

Kahan et al., Breast Cancer Res. Treat., 59:255-262, 2000.

Kahan et al., Int. J. Cancer, 82:592-598, 1999.

Kahan et al., Cancer 85:2608-2615, 1999.

Kiaris et al., Eur. J. Cancer, 37:620-628, 2001.

Kiaris et al., Br. J. Cancer, 81:966-971, 1999.

Koppan et al., Cancer Res., 58:4132-4137, 1998.

Krebs et al., Cancer Res., 60:4194-4199, 2000.

Michel et al., Clin. Cancer Res., 8:2632-2639, 2002.

Miyazaki et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 180:1095-103, 1999.

Miyazaki et al., J. Natl. Cancer Inst., 89:1803-1809, 1997.

Mosure et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 40:251-258, 1997.

Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97:829-834, 2000.

Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95:1794-1799, 1998.

Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94:652-656, 1997.

Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:7269-7273, 1996.

Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A., 93:2464-2469, 1996.

Ong et al. Immunology, 98:296-302, 1999.

Pawlyk-Byczkowska et al., Cancer Res., 49:4568-4577, 1989.

Plonowski et al., Int. J. Cancer, 88:652-657, 2000.

Plonowski et al., Cancer Res., 60:2996-3001, 2000.

Plonowski et al., Cancer Res., 59:1947-1953, 1999.

Roche et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8581-8585, 1993.

Schally et al., Clin. Cancer Res., 7:2854-2861, 2001.

Schally et al., Prostate, 45:158-166, 2000.

Schally et al., Eur. J. Endocrinol., 141:1-14,1999.

Shih et al., Cancer Immunol. Immunother., 49:208-216, 2000.

Suzawa et al., J. Contr. Release, 79:229-242, 2002.

Westphalen et al., Int. J. Oncol. 17:1063-1069, 2000.

Wraight et al., J. Biol. Chem., 265:5787-5792, 1990.

1. Конъюгат антрациклинового лекарственного средства и антитела, где указанное антрациклиновое лекарственное средство и указанное антитело связаны посредством линкера 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразида, причем указанный конъюгат имеет следующую формулу:

где R означает метил или гидроксиметильный фрагмент, а n означает целое число от 6 до 10;

и где указанное лекарственное средство связано с указанным линкером через эндогенную кетоновую или альдегидную группу, присутствующую в указанной молекуле лекарственного средства;

указанное антитело является химерным или гуманизированным антителом, которое содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG; указанное антитело связывается с антигеном CD74, а указанный линкер присоединен к восстановленной дисульфидной связи между цепями антитела.

2. Конъюгат по п.1, где указанный антиген CD74 является мишенью для интернализирующего антитела.

3. Конъюгат по п.1, нацеленный на карциномы, лимфомы, лейкемии или злокачественные опухоли кожи.

4. Конъюгат по п.3, где указанной злокачественной опухолью кожи является меланома.

5. Конъюгат по п.1, где антитело является химерным или гуманизированным антителом LL1.

6. Конъюгат по п.1, где указанное антрациклиновое лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из даунорубицина, доксорубицина, эпирубицина, 2-пирролинодоксорубицина, морфолинодоксорубицина и цианоморфолинодоксорубицина.

7. Конъюгат по п.6, где указанное антрациклиновое лекарственное средство связано с антителом через 13-кетофрагмент.

8. Конъюгат по п.1, где антителом является фрагмент IgG.

9. Конъюгат по п.1, где конъюгат антитело-антрациклин интернализируется в клетки-мишени.

10. Конъюгат антрациклинового лекарственного средства и антитела по п.1, где антителом является гуманизированное анти-СD74-антитело LL1, где указанное антрациклиновое лекарственное средство и указанное гуманизированное анти-СD74-антитело LL1 связаны посредством линкера 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразида и где указанный конъюгат имеет следующую формулу:

где R означает метил или гидроксиметильный фрагмент, n означает целое число от 6 до 10, указанное лекарственное средство связано с указанным линкером через эндогенную кетоновую или альдегидную группу, присутствующую в указанной молекуле лекарственного средства, указанное гуманизированное анти-СD74-антитело LL1 содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgGI; указанное антитело связывается с антигеном CD74, а указанный линкер присоединен к восстановленной дисульфидной связи между цепями гуманизированного анти-СD74-антитела LL1.

11. Способ получения конъюгата по п.1, где линкер сначала конъюгируют с антрациклиновым лекарственным средством, тем самым получая конъюгат антрациклиновое лекарственное средство-линкер, и где после этого указанный конъюгат антрациклиновое лекарственное средство-линкер конъюгируют с тиол-восстановленным моноклональным антителом или фрагментом антитела.