Способ получения адсорбента для очистки белков
Владельцы патента RU 2349377:
Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук (RU)
Изобретение относится к области хроматографии белков, может быть использовано для очистки и фракционирования ферментов с использованием адсорбента - гидроксиапатита, который получают из брушита путем обработки гидроксидом натрия при комнатной температуре с последующей выдержкой. Изобретение позволяет упростить процесс получения и увеличить сорбционную емкость целевого продукта. 1 з.п. ф-лы.
Изобретение относится к области хроматографии белков, может быть использовано в биотехнологии для очистки и фракционирования ферментов и касается способа получения адсорбента - гидроксиапатит.
Известен способ получения гидроксиапатита (RU 2209665, МПК B01J 20/04, опубл. 10.08.2003), выбранный за прототип, включающий стадию получения брушита (СаНРО4), его фильтрование, промывку двумя литрами воды, обработку суспензии брушита в 500 мл воды 100 мл 50%-ного NaOH при кипячении в течение 2 часов. При этом для получения брушита используют карбонат кальция, который обрабатывается избытком дигидрофосфата натрия (калия) при рН 1.0-4.0 и температуре 100°С.
Недостатком данного способа является низкая сорбционная емкость гидроксиапатита, что затрудняет его использование в препаративной хроматографии и для очистки белков.
Техническим результатом настоящего изобретения является увеличение сорбционной емкости целевого продукта и упрощение способа его получения.
Технический результат достигается тем, что для увеличения сорбционной емкости гидроксиапатита брушит получают из карбоната кальция путем обработки раствором ортофосфорной кислоты при рН около 1,0 и комнатной температуре, получение гидроксиапатита осуществляют посредством обработки брушита щелочью при комнатной температуре.
Способ осуществляется следующим образом.
Получение брушита проводят согласно реакции 1:
К раствору ортофосфорной кислоты с рН около 1.0 небольшими порциями при медленном перемешивании добавляют карбонат кальция. После этого суспензию оставляют на несколько часов при комнатной температуре 20-25°С для завершения реакции. Выделяющийся углекислый газ вызывает самопроизвольное перемешивание суспензии, что снижает вероятность истирания частиц в результате принудительного перемешивания. Образование брушита происходит на поверхности твердых частиц карбоната кальция, что способствует получению более крупных фракций брушита. После прекращения выделения пузырьков CO2 и достижения рН раствора примерно от 3.5 до 4.0 суспензию нейтрализуют до рН 6.8-7.2 добавлением раствора щелочи. Брушит отфильтровывают, промывают на фильтре 2 л воды и обрабатывают гидроксидом натрия при комнатной температуре 20-25°С для получения гидроксиапатита.
Сорбционную емкость целевого продукта (мг/г) определяют по связыванию бычьего сывороточного альбумина (БСА) в растворе с рН 6.0 при комнатной температуре. Концентрацию БСА определяют по поглощению раствора при λ=280 нм.
Пример 1 (прототип). К 100 г СаСО3 приливают 1 л 2 М раствора NaH2РО4, добавлением ортофосфорной кислоты устанавливают рН раствора около 1.0 и помещают суспензию в кипящую водяную баню. Для поддержания рН 1.0 в суспензию периодически добавляют 75%-ную ортофосфорную кислоту. После прекращения выделения пузырьков СО2 суспензию нейтрализуют до рН 6.8-7.2 добавлением 50%-ного NaOH и дают остыть до комнатной температуры. Брушит отфильтровывают, промывают на фильтре 2 л воды и суспендируют в 500 мл воды, после чего добавляют 100 мл 50%-ного NaOH и помещают в кипящую водяную баню, периодически перемешивая суспензию. По истечении 2 часов гидроксиапатит отфильтровывают и промывают на фильтре водой до нейтральной реакции фильтрата. Сорбционная емкость гидроксиапатита составляет 22-26 мг/г.
Пример 2. К 1 л раствора с рН около 1.0, содержащего преимущественно 98 г ортофосфорной кислоты, добавляют небольшими порциями при медленном перемешивании 100 г СаСО3. После этого суспензию оставляют на несколько часов при комнатной температуре 22.5°С для завершения реакции. После прекращения выделения пузырьков СО2 и достижения рН раствора примерно от 3.5 до 4.0 суспензию нейтрализуют до рН 6,8-7,2 добавлением 50%-ного NaOH. Брушит отфильтровывают, промывают на фильтре 2 л воды и суспендируют в 500 мл воды, после чего добавляют 100 мл 50%-ного NaOH и выдерживают 1 час при комнатной температуре 22.5°С. В случае кристаллизации суспензии ее подвергают слабому нагреву (до 40°С) или добавляют равный объем воды. Гидроксиапатит отфильтровывают и промывают на фильтре водой до нейтральной реакции фильтрата. Сорбционная емкость гидроксиапатита составляет 34-37 мг/г.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить сорбционную емкость целевого продукта по сравнению прототипом, а также упростить процесс получения гидроксиапатита за счет исключения операции кипячения.
1. Способ получения адсорбента для очистки белков, включающий получение брушита, его нейтрализацию раствором щелочи, фильтрование, промывку и обработку суспензии щелочью для получения гидроксиапатита, отличающийся тем, что брушит получают из карбоната кальция и раствора ортофосфорной кислоты при рН около 1,0 и при стехиометрическим мольном соотношении 1:1 путем последовательного добавления рассчитанного количества карбоната кальция к раствору кислоты при комнатной температуре 20-25°С и самопроизвольном перемешивании, для получения гидроксиапатита брушит обрабатывают гидроксидом натрия при комнатной температуре 20-25°C с последующей выдержкой в течение часа.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при кристаллизации суспензии гидроксиапатита ее нагревают до температуры не более 40°С или смешивают с равным количеством воды.
