Способ концентрации вирусов из жидких сред

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа концентрации вирусов из жидких сред. Способ включает адсорбцию вируса на гидрогеле метакриловой кислоты в концентрации не менее 2,0 мг/мл, сорбции при рН 5,0 от 20 минут до 24 часов при температуре от 4°С до 22°С и далее комплекс вирус-сорбент центрифугируют и вирус элюируют. Преимущество изобретения заключается в сокращении числа стадий и уменьшении времени концентрирования. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно вирусологии и биотехнологии, и может быть использовано для концентрации вирусов из воды, водных растворов, биологических сред; для выявления вирусов в воде питьевой, сточной, воде открытых водоемов, которые используются как источники водоснабжения, водопроводной воде, воде подземных источников, питьевой воде бутылированной, воде морской и пресных водоемов, которые используются для рекреационных целей, воде плавательных бассейнов; для очистки вирусных суспензий, используемых для изготовления вирусных антигенов и вакцин, очистки вирусов, полученных из тканевых культур, от клеточного детрита.

Известен способ концентрации энтеровирусов из водопроводной и речной воды при помощи ионообменных смол АВ-17, АВ-17-8, АВ-17-2П, 1К (искусственные сорбенты, представленные анионитами, а именно аминосмолами, полученными из формальдегида с мочевиной, анилином, гуанидином). / Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды. // Москва, 1982, 75 с., п.3.1.3.2, - с.14/. Концентрация вирусов при помощи ионообменных смол осуществляется следующим образом. Сухую ионообменную смолу замачивают в течение 3 суток в дистиллированной воде. Потом воду сливают и смолу обрабатывают смесью равных по объему, приготовленных непосредственно перед использованием растворов 2% HCl и 10% NaCl. Продолжительность обработки 24 часа. После этого смолу отмывают дистиллированной водой до нейтрального рН=7,0. Перед концентрацией рН исследуемой пробы воды (5 или 10 л) доводят до значений 5,5-6,0. Затем заполняют колонку диаметром 1,2-1,3 см подготовленным слоем сорбента толщиной 10-12 см. Колонку уравновешивают раствором суспензии смолы с рН=5,6-6,0. Пробу воды (5 л) пропускают через колонку со скоростью 10-12 мл/мин. Продолжительность концентрации - 12-16 ч. После завершения концентрации осуществляют десорбцию вирусов из смолы при помощи фосфатного буфера. Недостатками этого способа являются длительность подготовки сорбента, дополнительное использование колонки, продолжительность процесса концентрации - 12-16 ч, использование большого объема воды - 5 л.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ концентрации вирусов из воды при помощи природных сорбентов, а именно 5% геля бентонита (Широбоков В.П., Гирин В.Н., Якименко А.И. и др. Применение бентонита для выявления энтеровирусов у человека и во внешней среде. // Методические рекомендации. Киев, 1986, 23 с.) Схема концентрации энтеровирусов из водной среды представлена в таблице 1. Способ осуществляется следующим образом. Сухой бентонит диспергируют в деионизированной воде. Для преобразования бентонита в натриевую форму к суспензии добавляют углекислый натрий. Смесь оставляют на сутки при комнатной температуре для набухания, после чего смесь кипятят в течение 1 часа. Охлажденную смесь центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в 1 л дистиллированной воды и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость удаляют. Отбирают приблизительно 2/3 верхней части осадка, содержащей суспензию геля бентонита, остаток суспензии ресуспендируют в 1 л деионизированной воды и снова центрифугируют в течение 20 минут при 4000 об/мин. Отмытый осадок бентонита заливают 3 л воды и встряхивают в штудтельаппарате 3-4 часа. После этого суспензию центрифугируют в течение 5 минут при 1000 об/мин, 2/3 верхней части осадка отбирают, еще раз суспендируют в воде, надосадок декантируют. Отбирают 2/3 однородной части геля бентонита, которую суспендируют в 0,14 М раствора хлористого натрия и снова осаждают, как указано выше. Фракционирование повторяют трижды, увеличивая продолжительность центрифугирования и удаляя нижнюю часть осадка. После такой обработки бентонит представляет собой мелкодисперсную суспензию. Ее суспендируют в 95 объемах деионизированной воды, получая 5% суспензию геля бентонита. Полученный гель автоклавируют при 136°С в течение 20 минут. Срок хранения такого геля не ограничен. Полученный 5% гель бентонита используют для концентрации вирусов из воды, водных растворов, культуральной жидкости.

Таблица 1. Схема концентрации вирусов из водной среды
Этап	Исследуемый материал	Обработка
Адсорбция	Сточная вода (250 мл)	1) вносят 3,0 г NaCl до 0,1 М концентрации; 2) вносят 0,5 мл 5% геля бентонита; 3) вносят 1 М HCl раствор до рН=4,5-5,0; 4) встряхивание 4-5 мин; 5) центрифугирование при 1000 об/мин 7-10 мин
Обессоливание	Осадок (комплекс вирус + бентонит)	1) вносят 10 мл дист. воды (рН-1,5); 2) встряхивание 4-5 мин; 3) центрифугирование при 3000 об/мин 7-10 мин;
Элюция	Осадок (комплекс вирус + бентонит)	1) вносят 1 мл 0,05 М раствора трис-буфера (рН-8,2-9,0); 2) встряхивание 4-5 мин; 3) центрифугирование при 3000 об/мин 7-10 мин; 4) отбирают элюат, деконтаминируют и исследуют на наличие в нем вирусов или вирусных антигенов.

Известный способ включает помещение сорбента в пробу жидкой среды, выдерживание временного интервала с последующим центрифугированием исследуемой пробы, удаление надосадочной жидкости, получение комплекса вирус + сорбент и последующую элюцию вирусов. Недостатками способа являются продолжительность и трудоемкость приготовления геля бентонита, нестандартизированностъ сорбента, которая зависит от места его добычи.

В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа концентрации вирусов из жидких сред, в котором применение гидрогеля метилкремниевой кислоты сокращает продолжительность и трудоемкость способа и повышает процент выявления вирусов при исследовании различных жидких сред.

Поставленная задача решается тем, что в способе концентрации вирусов из жидких сред, который включает помещение сорбента в пробу жидкой среды, выдерживание временного интервала с последующим центрифугированием исследуемой пробы, удаление надосадочной жидкости, получение комплекса вирус + сорбент и последующую элюцию вирусов, согласно изобретению в качестве сорбента используют гидрогель метилкремниевой кислоты (ГГМКК), который обладает адсорбционными свойствами по отношению к биологическим объектам вирусной природы, временной интервал выдерживают от 20 минут до 24 часов при температуре от +4°С до +22°С, а получение комплекса вирус + сорбент осуществляют без проведения этапа обессоливания.

Согласно изобретению ГГМКК, способный в концентрации не менее 30 мг/мл адсорбировать не менее 96% вирусных частиц из водных сред, помещают в пробу водной среды, при этом исследуемую пробу подкисляют раствором кислоты до рН=5,0.

Согласно изобретению ГГМКК, который способен в концентрации не менее 2 мг/мл адсорбировать не менее 90% вирусных частиц из биологических сред, помещают в пробу биологической среды.

Заявители изобретения являются изобретателями и заявителями способа получения сорбента на основе гидрогеля метилкремниевой кислоты (заявка № а 2006 10083), в котором, благодаря новому способу получения, указанный сорбент имеет объем пор не менее 0,8 см³/г и обладает высокой адсорбционной активностью в отношении веществ с большой молекулярной массой (5-900 кД) и различных биологических объектов, в том числе вирусной природы. Гидрогель метилкремниевой кислоты - это новый эффективный сорбент, который имеет глобулярную структуру пористой кремнийорганической матрицы. На ее поверхности присутствуют гидроксильные группы, благодаря чему поверхность глобул и пор активно сольватируется полярными молекулами воды, и метильные группы, обусловливающие гидрофобные свойства и сродство к тканям и биосубстратам организма. Сорбент ГГМКК безопасен, имеет высокую селективность, адсорбционная емкость по конго красному достигает 3,0-3,5 мг/г (или 4,5-5,0 мкмоль/г). Используется как сорбент в различных отраслях медицины и ветеринарии.

Цель изобретения состоит в повышении эффективности концентрации вирусов из проб жидких сред, уменьшении стадий в процедуре выполнения, сокращении времени концентрации, создании возможности концентрации вирусов из минимальных объемов жидких сред, использовании для концентрации готового вещества (сорбента), состав и качество которого гарантируется соответствующими ФС и ТУ.

Способ осуществляется следующим образом. ГГМКК, полученный способом, заявленным в № а 2006 10083, имеющий адсорбционные свойства относительно биологических объектов вирусной природы, помещают в пробу жидкой среды, выдерживают от 20 минут до 24 часов при температуре от +4°С до +22°С. ГГМКК, способный в концентрации 30 мг/мл адсорбировать не менее 96% вирусных частиц из водной среды, помещают в пробу водной среды, а также в пробу биологической среды, загрязненные вирусами. Проводят адсорбцию вирусов, после чего ГГМКК концентрируют центрифугированием и удаляют надосадочную жидкость. Затем осуществляют элюцию вирусов и отделяют ГГМКК от раствора центрифугированием. В надосадочной жидкости осуществляют индикацию и идентификацию вирусов.

Пример 1. Концентрация вирусов из проб сточной воды.

Способ осуществляется как описано в п.п.1.2, при этом пробу воды (500 мл предварительно осветленной сточной воды) подкисляют при помощи 1 М HCl до рН=5,0, в подкисленную пробу помещают сорбент ГГМКК в количестве 1 г и выдерживают 20 минут при температуре 20°С. После экспозиции пробу с сорбентом центрифугируют при 1000 об/мин. в течение 20 минут. Надосадочную жидкость удаляют и получают комплекс вирус + сорбент, процесс обессоливания отсутствует.

Пример 2. Концентрация вирусов из проб питьевой воды.

Способ осуществляется как описано в п.п.1.2, при этом пробу воды подкисляют при помощи 1 М HCl до рН=5,0, в подкисленную пробу (10 л питьевой воды) помещают сорбент ГГМКК в количестве 20 г и выдерживают до 20 часов при температуре 20°С, надосадок осторожно сливают через край, оставляя на дне стеклянного сосуда 200 мл неплотного белого осадка. Полученный осадок (осадок + небольшое количество надосадка) встряхивают и переносят в стаканы или флаконы для центрифугирования по 250 мл и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 20 минут. Образовавшийся белый осадок также не плотный, поэтому надосадочную жидкость снова сливают через край, оставляя на дне флакона 20 мл. Этот осадок встряхивают, переносят в две пробирки для центрифугирования и повторно центрифугируют. После второго центрифугирования плотный осадок формируется на дне пробирок, надосадочную жидкость удаляют пастеровской пипеткой и получают комплекс вирус + сорбент, процесс обессоливания отсутствует.

Пример 3. Концентрация вирусов из проб воды открытых водоемов и подземных источников.

Способ осуществляется как описано в п.п.1.2, при этом пробу воды (2 л) подкисляют при помощи 1 М HCl до рН=5,0, в подкисленную пробу помещают сорбент ГГМКК в количестве 4 г и выдерживают до 20 минут при температуре 20°С. После экспозиции пробу с сорбентом центрифугируют при 1000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость удаляют и получают комплекс вирус + сорбент, процесс обессоливания отсутствует.

Пример 4.1. Концентрация вирусов из проб культуральной жидкости.

Способ осуществляется как описано в п.п.1.3, при этом в культуральную вирусосодержащую жидкость (КВЖ), содержащую ротавирус обезьян SA-11 с инфекционным титром 7,5 lg ТЦД₅₀/мл, добавляют сорбент ГГМКК из расчета 2 мг на 1 мл жидкости. Формирование комплекса ротавирус + сорбент осуществляют при температуре 20°С в течение 10 часов, периодически перемешивая. Образовавшийся комплекс ротавирус + сорбент выделяют низкоскоростным центрифугированием. В надосадочной жидкости отсутствие вируса контролируют, определяя инфекционный титр ротавируса титрованием по ЦПД в чувствительной культуре клеток. Результаты осуществления способа представлены в таблице 2.

Пример 4.2.

Способ выполняют как в примере 4.1, но ГГМКК помещают в культуральную жидкость из расчета 1,5 мг/мл. Результаты выполнения способа представлены в таблице 2.

Пример 4.3.

Способ выполняют как в примере 4.1, но ГГМКК помещают в культуральную жидкость из расчета 2,5 мг/мл. Результаты выполнения способа представлены в таблице 2.

Пример 4.4.

Способ выполняют как в примере 4.1, но ГГМКК помещают в культуральную жидкость из расчета 5,0 мг/мл. Результаты выполнения способа представлены в таблице 2.

Пример 4.5.

Способ выполняют как в примере 4.1, но ГГМКК помещают в культуральную жидкость из расчета 10 мг/мл. Результаты выполнения способа представлены в таблице 2.

Примеры 4.6-4.10.

Способ выполняют как в примерах 4.1-4.5, но используют культуральную жидкость, которая содержит вирус полиомиелита II типа штамм Себина с инфекционным титром 10,5 lg ТЦД₅₀/мл. Результаты выполнения способа представлены в таблице 2.

Примеры 5.1-5.5. Концентрация вирусов из проб плазмы крови человека.

Способ осуществляют как в п.3 и примерах 4.1.-4.5, но вместо вирусосодержащей жидкости используют плазму крови человека, которая содержит вирус везикулярного стоматита (ВВС), штамм Индиана. Результаты осуществления способа представлены в таблице 2.

Пример 6. Способ концентрации вирусов-колифагов из проб питьевой воды.

Способ осуществляется как описано в п.п.1.2 и в примере 2, только концентрируемые вирусы являются колифагами Т2 (бактериофаг эшерихии Т2), а ГГМКК вносят из расчета 50 мг/мл. После экспозиции пробу с сорбентом центрифугируют при 1000 об/мин в течение 20 минут, надосадочную жидкость удаляют и получают комплекс колифаг Т2 + сорбент, процесс обессоливания отсутствует.

Примеры осуществления способа с элюцией вирусов.

Пример 7.1.

Способ осуществляют как в примере 4.1., но удаленный низкоскоростным центрифугированием комплекс «ротавирус SA-11 + сорбент» помещают в раствор 0,14 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) с рН=8,5, объем которого в 10 раз меньше объема КВЖ, из которой был адсорбирован ротавирус. Полученную суспензию интенсивно встряхивают в течение 10 минут при температуре 20°С и оставляют в тех же условиях для десорбции еще на 20 минут. Сорбент удаляют низкоскоростным центрифугированием. Супернатантную жидкость, содержащую ротавирус, отбирают в стерильную пробирку, доводят ее рН до 7,2-7,4 1 М раствором HCl, и деконтаминируют. Инфекционный титр ротавируса в полученном супернатанте определяют по ЦПД титрованием микрометодом в культуре клеток НЕР-2. Одновременно, в этих же условиях титруют и образцы КВЖ, из которой адсорбируют ротавирус. Титрование повторяют в трех параллельных опытах. Титрование каждого образца проводят в 4 рядах лунок 96-лункового культурального планшета. Инфекционный титр ротавируса в культуральной жидкости и в образцах элюата рассчитывают по методу Кербера. Результаты выполнения способа представлены в таблице 3.

Пример 7.2.

Способ осуществляют как в примере 7.1, но элюцию проводят при рН=8,0. Результат выполнения способа представлен в таблице 3.

Пример 7.3.

Способ осуществляют как в примере 7.1, но элюцию проводять при рН=9,0. Результат виполнения способа представлен в таблице 3.

Пример 7.4.

Способ осуществляют как в примере 7.1, но элюцию проводят при рН=9,3. Результат выполнения способа представлен в таблице 3.

Пример 7.5.

Способ осуществляют как в примере 7.1, но элюцию проводят в 0,05 М трис-буферном растворе при рН=8,5. Результаты выполнения способа представлены в таблице 3.

Пример 7.6.

Способ осуществляют как в примере 7.5, но элюцию проводят при рН=8,0. Результаты выполнения способа представлены в таблице 3.

Пример 7.7.

Способ осуществляют как в примере 7.5, но элюцию проводят при рН=9,0. Результаты выполнения способа представлены в таблице 3.

Пример 7.8.

Способ осуществляют как в примере 4.6, но выделенный низкоскоростным центрифугированием комплекс «вирус полиомиелита II типа штамм Себина + сорбент» помещают в раствор 0,14 М фосфатно-солевого буфера с рН=8,5, объем которого в 10 раз меньше объема КВЖ, из которой был адсорбирован полиовирус. Полученную суспензию интенсивно встряхивают в течение 10 минут при температуре 20°С и оставляют в тех же условиях для десорбции еще на 20 минут. Сорбент удаляют низкоскоростным центрифугированием. Супернатантную жидкость, содержащую полиовирус, отбирают в стерильную пробирку, доводят ее рН до 7,2-7,4 1 М раствором HCl и деконтаминируют. Инфекционный титр полиовируса в полученном супернатанте определяют по ЦПД титрованием микрометодом в культуре клеток НЕР-2. Одновременно, в тех же условиях титруют и образцы КВЖ, из которой адсорбировали полиовирус. Титрование повторяют в трех параллельных опытах. Титрование каждого образца виполняют в 4 рядах лунок 96-лункового культурального планшета. Инфекционный титр полиовируса в культуральной жидкости рассчитывают по методу Кербера. Результаты выполнения способа представлены в таблице 3.

Пример 7.9.

Способ виполняют как в примере 7.8, но элюцию проводят в 0,05 М трис-буферном растворе при рН=8,5. Результаты виполнения способа представлены в таблице 3.

Пояснение. Элюцию вируса везикулярного стоматита из комплекса «вирус + сорбент» не проводили, поскольку цель состояла в максимальном очищении плазмы крови от вируса, а не в его концентрировании, в этом случае поиск условий десорбции ВВС не нужен.

Предлагаемый способ обеспечивает сокращение стадий в процессе выполнения, уменьшение времени концентрирования, возможность концентрации вирусов из минимальных объемов жидких сред, благодаря чему увеличивается точность и повышается процент выявления вирусов при исследовании различных жидких сред.

Таблица 3. Эффективность элюции (десорбции) вирусов из комплексов «вирус + сорбент» в буферных растворах при различных значениях их ионной силы (рН).
№/№ примера	lg инфекционного титра вируса в исходной КВЖ	М±м	Буферный раствор для элюции	рН буферного раствора	lg инфекционного титра вируса в элюате	М±м
Ротавирус обезьян SA-11
7.1.	7,50; 7,25; 7,75	7,50±0,25	0.14 М ФСБ	8,5	8,5; 8,25; 8,25	8,33±0,14
7.2.	7,50; 7,25; 7,50	7,50±0,25	0.14 М ФСБ	8,0	8,0; 7,5; 7,0	7,50±0,50
7.3.	7,50; 7,25; 7,50	7,50±0,25	0.14 М ФСБ	9,0	8,5; 8,25; 8,50	8,42±0,14
7.4.	7,50; 7,25; 7,50	7,50±0,25	0,14 М ФСБ	9,3	6,50; 7,0; 6,25	6,58±0,38
7.5.	7,50; 7,25; 7,75	7,50±0,25	0,05 М трис-буфер	8,5	8,50; 8,25; 8,50	8,42±0,14
7.6.	7,50; 7,25; 7,75	7,50±0,25	0,05 М трис-буфер	8,0	6,50; 6,75; 6,50	6,58±0,14
7.7.	7,50; 7,25; 7,75	7,50±0,25	0,05 М трис-буфер	9,0	5,25; 6,75; 6,0	6,17±0,80
Вирус полиомиелита II типа штамм Себина
7.8.	10,50; 10,25; 10,75	10,5±0,25	0.14 М ФСБ	8,5	11,50; 11,25; 11,50	11,48±0,14
7.9.	10,50; 10,25; 10,75	10,5±0,25	0,05 М трис-буфер	8,5	11,25; 11,50; 11,25	11,48±0,14

1. Способ концентрации вирусов в жидких средах, включающий сорбцию вирусов из жидких сред на сорбенте в течение временного интервала с последующим отделением комплекса вирус + сорбент центрифугированием и элюцией вирусов, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют гидрогель метилкремневой кислоты в концентрации не менее 2 мг/мл сорбента, сорбцию проводят при рН 5,0 от 20 мин до 24 ч при температуре от +4 до +22°С.

2. Способ концентрации вирусов по п.1, отличающийся тем, что используют гидрогель метилкремниевой кислоты, в концентрации не менее 30,0 мг/мл, который обладает способностью адсорбировать не менее 96% вирусных частиц из водных сред, при рН 5,0.