Регулирующее дифференцировку средство, содержащее ген, который регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в качестве эффективного ингредиента

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Описано средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров, содержащее в качестве эффективного ингредиента один или несколько генов. Гены, используемые в изобретении, описаны в материалах заявки. Изобретение позволяет получить новое средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров. 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к средству, регулирующему дифференцировку, содержащему ген, который регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в качестве эффективного ингредиента, и к способу скрининга на предмет обнаружения указанного гена.

Предшествующий уровень техники

Стволовые клетки обладают мультипотентностью в плане возможности дифференцировки в клетки тканей различных органов и имеют способность к самообновлению, и они обнаружены у эмбрионов и взрослых. Стволовые клетки обеспечивают дифференцировку клетки в специфическую клетку или орган, так что внимание сфокусировано на возможности применения стволовых клеток для трансплантации органов или клеточной терапии.

Кроветворные стволовые клетки, вид стволовых клеток взрослых, представляют собой клетки, которые могут дифференцироваться в каждый из видов кровеобразующих клеток, например в эритроциты, лейкоциты, тромбоциты и лимфоциты. Клетки, вовлеченные в иммунную систему, постоянно самообновляются из кроветворных стволовых клеток в костном мозге. Кроветворные стволовые клетки до сих пор использовали для лечения различных заболеваний крови, включая злокачественные опухоли, посредством трансплантации костного мозга. По последним сообщениям, кроветворные стволовые клетки могут дифференцироваться в другие типы клеток, такие как мышечные, нервные, костные, и т.д., в организме экспериментальных животных. Если кроветворные стволовые клетки можно применять в отношении человека, они могут использоваться для лечения различных заболеваний, включая диабет, болезнь Паркинсона, травму спинного мозга и т.д., поскольку они могут успешно заместить другие клетки и органы.

В частности, клетки-природные киллеры (здесь и далее обозначенные как «NK») неспецифично разрушают раковые клетки. Благодаря своей цитотоксичной способности NK-клетки в настоящее время используют для лечения солидной опухоли с использованием LAK (активируемая лимфокинами клетка-киллер) и TIL (инфильтрирующие опухоль лимфоциты) и для иммунотерапии (J Immunol., 1986, 36(10): 3910-3915; Hematologia, 1999, 84: 1110-1149), применяя вливание лимфоцитов донора, что указывает на путь к новой клеточной терапии, направленной на снижение отторжения после транплантации костного мозга или органа. Также сообщали, что дефект в дифференцировке и активации NK-клеток связан с различными заболеваниями, включая рак молочной железы (Breast Cancer Res Treat., 2003, 66(3):255-263), меланому (Melanoma Res., 2003, 13(4):349-356) и рак легких (Lung Cancer, 2002, 35(1):23-18), так что терапия NK-клетками привлекает внимание авторов изобретения в плане лечения указанных заболеваний.

Таким образом, авторы настоящего изобретения идентифицировали новый ген, регулирующий дифференцировку стволовых клеток в NK-клетки, с использованием SAGE (серийного анализа экспрессии генов), и осуществляли данное изобретение, подтверждая то, что дифференцировка NK-клеток регулируется указанным выше геном, и в дальнейшем указанный ген может оказывать большую помощь при лечении заболеваний, включая злокачественные опухоли.

Описание

Техническая проблема

Целью настоящего изобретения является предоставление средства, регулирующего дифференцировку NK-клеток, содержащего ген, который регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в качестве эффективного ингредиента, и способа скрининга на предмет обнаружения указанного гена с использованием SAGE.

Техническое решение

Для достижения указанной выше цели настоящее изобретение относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры.

Настоящее изобретение также относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из стволовых клеток в ранние клетки-природные киллеры.

Настоящее изобретение также относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из ранних клеток-природных киллеров в зрелые клетки-природные киллеры.

Настоящее изобретение также относится к противораковому средству, разработанному с использованием регулирующего дифференцировку средства по изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способу скрининга на предмет гена, регулирующего дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, основанному на SAGE.

Согласно изобретению ген, регулирующий дифференцировку, означает каждый ген, который регулирует дифференцировку их стволовых клеток в клетки-природные киллеры, то есть, такие гены могут ускорять или ингибировать дифференцировку. Более конкретно, регулирующий дифференцировку ген согласно изобретению может ускорять дифференцировку, так что он способствует прогрессу на следующую стадию. Между тем он также может функционировать по поддержанию каждой стадии или ингибируя прогресс на следующую стадию.

Согласно изобретению «SAGE» означает «серийный анализ генной экспрессии». SAGE может выполняться общепринятым способом или по протоколу производителя (Invitrogen^ТМ life technologies) (http://www. invitrogen. com).

Отметка в квадратных скобках после названия гена означает ID GenBank, подразумевающий последовательность каждого гена, и ID GenBank может быть легко найден и применен специалистами в данной области.

Тип II фермента рестрикции, использованный согласно изобретению, представляет собой общепринятый фермент, широко распространенный в области генной инженерии. Он требует присутствия ионов магния для активации и распознавания конкретной нуклеотидной последовательности ДНК, так что он может расщеплять точно в требуемой области или соседней области от распознаваемой нуклеотидной последовательности. Фермент рестрикции типа II S, применяемый согласно изобретению, означает Nlalll (распознает и расщепляет область CATG каждые 250 пар оснований).

Здесь и далее настоящее изобретение описано подробно.

Настоящее изобретение относится к регулирующему дифференцировку средству для клеток-природных киллеров, которое характеризуется тем, что оно содержит в качестве эффективного ингредиента один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из белка гомеобокса MIX (AF154573), пре-про-протеиназы 3 (U97073), онкогена миелобластоза (Myb) (М16449), кислого кератинового комплекса 1, гена 13 (NM_010662), родственной РА-фосфатазе фосфоэстеразы (АК002966), гамма-парвина (ВС011200), родственного forkhead фактора транскрипции 1С (AF339105), гена кДНК RIKEN 5730501N20 (АК017744), белка c-myc (Х01023), рибосомного белка L10A (АК002613) , гена Oct 2b (Х53654), микролита (АК015601), дигидролипоамиддегидрогеназы (ВС003368), трикла (U81030), лизоцима (ВС002069), цепи Н ферритина (ВС012314), бревикана (Х87096), матриксной металлопротеиназы 12 (ВС019135), клеточного ингибитора EIA-стимулируемого гена (AF084524), S100 кальций-связывающего белка А9 (ВС027635), белка MPS1 (L20315), трансглутаминазы 2 (ВС016492), сывороточной и регулируемой глюкортикоидами протеинкиназы (AF139639), кДНК RIKEN 5830413L19 (ВС027496), индуцируемого интерфероном белка (ВС003804), глобулярного мембранного белка молочного жира фактора EGF 8 (ВС018577), гликопротеина клеточной поверхности р91 (U83172), аргиназы 1 (ВС050005), рецептора фактора некроза опухолей 1 (М59378), индуцируемой ретиноидами сериновой карбоксипептидазы (AF330052), гомолога FLJ11000 (ВС023802), предшественника связывающего интерлейкин-18 белка d (AF110803), канала ионов хлора 7 (АК009435), антигена CD36 (ВС010262), гомолога белка цинковых пальцев (ВС030186), связывающего углевод белка 35 (J03723), кальций-зависимого углевода С-типа (ВС003218), липопротеинлипазы (NM_008509), онкогена фибросаркомы двуглавой мышцы плеча v-maf (ВС038256), рецептор интерлейкина 7 (NM_008372), рецептора хемокина (С-С) 1 (ВС011092), нейрофиллина (MGDIMGI: 106206) (АК002673), серпина A3G (ХМ-127137), субъединицы 6 рецептора GABA-A (Х51986), LAPTm5 (U51239), регулятора сигнала G-белка (ВС049968), мРНК стимулирующего приманку фактора, фиксированного на GPI (L41366), белка Y-бокса 3 (АК019465), предшественника остеопонтина (J04806), представителя семейства, связывающего белок-предшественник бета-амилоида (А4) (АК021331), аналога бета-субъединицы Т-клеточного рецептора (U63547), имеющего отношение к иммунитету нуклеотида 1 (ВС005577), фактора транскрипции 1 высокой стадии дифференцировки (NM_009480), обонятельного рецептора MOR267-7 (NM_146714), специфичной для лимфоцитов протеинтирозинкиназы (М12056), ингибитора рака остеокластов (АВ013898), гомолога активного рецептора тромбоцитов (ВС024054), белка клеток-природных киллеров 2-А1 (AF106008), неидентифицированного белка MGC36662 (ВС023851), гомолога предшественника семафорина 6А (АК004390), полипептида-гомолога нейрофиламента (ВС025872), актинсвязывающего белка-гомолога корнина 2А (ВС026634), белка семейства переносчиков растворимых веществ 6 (ВС015245), гомолога временного рецептора пурина P2Y10 (АК020001) , гамма-цепи Т-клеточного рецептора (X03802), поли-А-полимеразы альфа (NM_011112), родственного ОРА белка-аналога OIP5 (АК017825) и аналога митоген-активируемой протеинкиназы 1 (ВС006708).

Настоящее изобретение также относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из стволовых клеток в ранние клетки-природные киллеры, которое характеризуется тем, что содержит один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из белка гомеобокса MIX (AF154573), пре-про-протеиназы 3 (U97073), онкогена миелобластоза (Myb) (М16449), гена 13 кислого комплекса кератина 1 (NM_010662), родственной РА-фосфатазе фосфоэстеразы (АК002966), гамма-парвина (ВС011200), родственного forkhead фактора транскрипции 1С (AF339105), гена кДНК RIKEN 5730501N20 (АК017744), белка c-myc (Х01023), рибосомного белка L10A (АК002613), гена Oct 2b (X53654), микролита (АК015601), дигидролипоамиддегидрогеназы (ВС003368) и тракла (U81030), в качестве эффективного ингредиента.

Настоящее изобретение далее относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из ранних клеток-природных киллеров в зрелые клетки-природные киллеры, которое характеризуется тем, что содержит в качестве эффективного ингредиента один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из лизоцима (ВС002069), цепи ферритина Н (ВС012314), бревикана (Х87096), матриксной металлопротеиназы 12 (BC019135), клеточного ингибитора EIA-стимулируемого гена (AF084524), S100 кальций-связывающего белка A9 (BC027635), белка MPS1 (L20315), трансглутаминазы 2 (BC016492), сывороточной и регулируемой глюкортикоидами протеинкиназы (AF139639), кДНК RIKEN 5830413L19 (BC027496), индуцируемого интерфероном белка (BC003804), глобулярного мембранного белка молочного жира фактора EGF 8 (BC018577), гликопротеина клеточной поверхности p91 (U83172), аргиназы 1 (BC050005), рецептора фактора некроза опухолей 1 (M59378), индуцируемой ретиноидами сериновой карбоксипептидазы (AF330052), гомолога FLJ11000 (BC023802), предшественника связывающего интерлейкин-18 белка d (AF110803), канала ионов хлора 7 (AK009435), антигена CD36 (BC010262), гомолога белка цинковых пальцев (BC030186), связывающего углевод белка 35 (J03723), кальций-зависимого углевода C-типа (BC003218), липопротеинлипазы (NM_008509), онкогена фибросаркомы двуглавой мышцы плеча v-maf (BC038256), рецептор интерлейкина 7 (NM_008372), рецептора хемокина (C-C) 1 (BC011092) и нейрофиллина (MGD|MGI: 106206).

Настоящее изобретение далее относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку зрелых клеток-природных киллеров, которое характеризуется тем, что содержит в качестве эффективного ингредиента один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из серпина A3G (XM_127137), субъединицы 6 рецептора GABA-A (X51986), LAPTm5 (U51239), регулятора сигнала G-белка (BC049968), мРНК стимулирующего приманку фактора, фиксированного на GPI (L41366), белка Y-бокса 3 (AK019465), предшественника остеопонтина (J04806), представителя семейства, связывающего белок-предшественник бета-амилоида (А4) (АК021331), аналога бета-субъединицы Т-клеточного рецептора (U63547), имеющего отношение к иммунитету нуклеотида 1 (ВС005577), фактора транскрипции 1 высокой стадии дифференцировки (NM009480), обонятельного рецептора MOR267-7 (NM_46714), специфичной для лимфоцитов протеинтирозинкиназы (М12056), ингибитора рака остеокластов (АВ013898), гомолога активного рецептора тромбоцитов (ВС024054), белка клеток-природных киллеров 2-А1 (AF106008), неидентифицированного белка MGC36662 (ВС023851), гомолога предшественника семафорина 6А (АК004390), полипептида-гомолога нейрофиламента (ВС025872), актин-связывающего белка-гомолога корнина 2А (ВС026634), белка семейства переносчиков растворимых веществ 6 (ВС015245), гомолога временного рецептора пурина P2Y10 (АК020001), гамма-цепи Т-клеточного рецептора (Х03802), поли-А-полимеразы альфа (NM_011112), родственного ОРА белка-аналога 0IP5 (АК017825) и аналога митоген-активируемой протеинкиназы 1 (ВС006708).

Ген, входящий в состав регулирующего дифференцировку средства согласно изобретению, имеет функции: 1) регуляции дифференцировки из стволовых клеток в ранние NK-клетки, 2) регуляции дифференцировки из ранних NK-клеток в зрелые NK-клетки, и 3) регуляции дифференцировки зрелых NK-клеток, и регулирующий дифференцировку ген, функционирующий на каждой стадии, может независимо применяться в качестве средства, регулирующего дифференцировку из стволовых клеток в NK-клетки. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения дифференцировку из стволовых клеток в ранние NK-клетки и в зрелые NK-клетки индуцируют культивированием HSC клеток с обработкой цитокином (фиг.1a - фиг.1c). С каждой стадии выделяли цельную РНК и проводили SAGE, как показано на схематичной диаграмме фиг.2. Посредством SAGE на каждой стадии дифференцировки выделяли гены, характеризовавшиеся специфичным повышением экспрессии (фиг.3a - фиг.3f). Данные гены сравнивали с другими, находящимися в GenBank. В результате данные гены не соответствовали тем, о которых сообщалось, что они имеют функцию регуляции дифференцировки из стволовых клеток в pNK-клетки (см. таблицу 3), из pNK-клеток в mNK-клетки (см. таблицу 4) и mNK-клеток (см. таблицу 5).

Поэтому гены согласно изобретению являются новой находкой, предоставляющей новый механизм дифференцировки, и фармацевтическая композиция, содержащая один или несколько таких генов, могут использоваться для регуляции дифференцировки клеток. В частности, регулирующее дифференцировку средство, вовлеченное в дифференцировку из стволовых клеток в ранние NK-клетки, могут быть получены с использованием одного или нескольких генов, перечисленных в таблице 3, и также регулирующее дифференцировку средство, вовлеченное в дифференцировку из ранних NK-клеток в зрелые NK-клетки, могут быть получены с использованием одного или нескольких генов, перечисленных в таблице 4. Регулирующее дифференцировку средство, вовлеченное в дифференцировку зрелых NK-клеток, могут быть получены с использованием одного или нескольких генов, перечисленных в таблице 5. Все гены, перечисленные в таблице 3, 4 и 5, имеют функции регуляции дифференцировки из стволовых клеток в NK-клетки, так что регулирующее дифференцировку средство, которые регулирует дифференцировку клеток-природных киллеров, может быть получено с использованием одного или нескольких указанных выше генов.

Средство, регулирующее дифференцировку клеток, согласно изобретению может также использоваться для лечения злокачественных опухолей. Регулирующее дифференцировку средство согласно изобретению, предпочтительно, может использоваться для лечения таких злокачественных опухолей, как рак молочной железы, меланома и рак легких. Дефекты дифференцировки и активации NK-клеток приводят к различным злокачественным опухолям, например, к раку молочной железы (Breast Cancer Res Treat., 2003, 66(3):255-263), меланоме (Melanoma Res., 2003, 13 (4):349-356) и раку легких (Lung Cancer, 2002, 35(1):23-18). Таким образом, указанные злокачественные опухоли можно эффективно лечить путем регуляции дифференцировки NK-клеток регулирующим дифференцировку NK-клеток средством согласно изобретению. Регулирующее клеточную дифференцировку средство согласно изобретению может вводиться орально или парентерально и применяться в основных формах фармацевтического препарата. Регулирующее клеточную дифференцировку средство согласно изобретению может быть подготовлено для орального или парентерального введения путем смешивания с обычно используемыми наполнителями, связующими средствами, увлажняющими средствами, дезинтегрирующими средствами, растворителями, такими как поверхностно-активное вещество, или с наполнителями. Твердые препараты для орального введения представляют собой таблетки, пилюли, порошки, гранулы и капсулы. Данные твердые препараты получают смешиванием с одним или несколькими подходящими наполнителями, такими как крахмал, карбонат кальция, сахароза или лактоза, желатин и т.д. Кроме простых наполнителей, могут использоваться смазки, например стеарат магния, тальк, и т.д. Жидкие препараты для орального введения представляют собой суспензии, растворы, эмульсии и сиропы, и указанные выше препараты могут содержать различные наполнители, такие как увлажняющие средства, подсластители, ароматизаторы, и консерванты в дополнение к обычно применяемым простым растворителям, таким как вода и жидкий парафин. Препараты для парентерально введения представляют собой стерилизованные водные растворы, нерастворимые в воде наполнители, суспензии, эмульсии и суппозитории. Нерастворимые в воде наполнители и суспензии могут содержать, в дополнение к активному соединению или соединениям, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растворимое масло, такое как оливковое масло, сложный эфир для инъекций, такой как этилолат, и т.д. Суппозитории могут содержать, в дополнение к активному соединению или соединениям, witepsol, macrogol, tween 61, масло какао, лауриновое масло, глицерин, желатин, и т.д.

Эффективная дозировка средства согласно изобретению составляет 0,1-0,2 мг/кг, и предпочтительно 0,15 мг/кг. Время введения средства согласно изобретению может представлять собой от одного до трех раз в сутки.

Настоящее изобретение также относится к способу скрининга на предмет гена, регулирующего дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, включающего следующие стадии:

1) синтеза кДНК после выделения из клеток цельной РНК;

2) выделения метки после расщепления кДНК стадии 1;

3) связывания каждой метки, выделенной на стадии 2, и последующего анализа ее нуклеотидной последовательности; и

4) количественного анализа экспрессии гена, основанного на проанализированной выше последовательности нуклеотидов, с использованием программы анализа SAGE.

На стадии 1 клетки предпочтительно отбирают с каждой стадии дифференцировки из стволовых клеток в клетки-природные киллеры. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения кроветворные стволовые клетки (HSC) применяют в качестве стволовых клеток, и ранние клетки-природные киллеры и зрелые клетки-природные киллеры применяли в качестве клеток-природных киллеров.

Может использоваться любой общепринятый способ, если только с его помощью можно выделить цельную РНК из образца с высоким выходом и с предотвращением контаминации РНКазами (Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning). В общем, для выделения РНК с использованием средства выделения РНК проще всего следовать протоколу производителя. Для синтеза кДНК с цельной РНК к цельной РНК присоединяют олиго-dT-праймер, но это не единственный способ синтеза кДНК, и может использоваться любой другой способ синтеза кДНК. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения олиго-dT-праймер присоединяют к цельной РНК для синтеза кДНК, и в то же время олиго-dT-праймер должен встроить поли-A-последовательность для синтеза мРНК. Предпочтительно, чтобы в олиго-dT-праймере повторялись последовательности из 20-30 T. И также допустимо, что к одному из концов олиго-dT-праймера присоединялись магнитные гранулы, поскольку так метка может успешно выделяться без контаминации с использованием магнитных гранул.

На стадии 2 процесс отделения метки после расщепления кДНК состоит из следующих стадий:

a) получения метки путем расщепления кДНК ферментом рестрикции типа IIS 1;

b) соединения двух видов адаптеров, каждый из которых включает в себя участок распознавания фермента рестрикции типа IIS 1, в одном конечном участке связывания метки, полученной на стадии a;

c) выделения метки путем отщепления метки, связанной с адаптером на стадии b посредством фермента рестрикции типа IIS 2, и отщепления магнитных гранул с олиго-dT от метки;

d) получения двойной метки путем соединения друг с другом меток, полученных на стадии c; и

e) получения только двойной метки путем расщепления двойной метки, полученной на стадии d, ферментом рестрикции типа IIS 1 и отщепления адаптера.

На стадии a синтезированную кДНК расщепляли ферментом рестрикции типа IIS 1 по той причине, что участок расщепления данным ферментом, мог быть получен в виде участка связывания метки, и фактически было легко применять данную область для связывания с меткой, поскольку участок расщепления образовывал 5'-концевые свисания. В качестве фермента рестрикции типа IIS 1 возможно применение любого подходящего фермента, и предпочтителен фермент рестрикции NlaIII. Причиной для этого является то, что кДНК имеет участки распознавания ферментом рестрикции NlaIII каждые 250 п.н., так что регулярно расположенная метка может быть легко получена расщеплением кДНК данным ферментом.

На стадии b два вида адаптеров, подлежащие соединению с участком расщепления метки, имеют последовательности длиной примерно 40 п.н., которые комплементарно связанных друг с другом. Адаптеры включают в себя участок распознавания ферментом рестрикции NlaIII (CATG) с одного конца, с которым связана метка и образуют свисания, которые упрощают связывание метки.

На стадии c метку, связанную с адаптером, расщепляли ферментом рестрикции типа IIS 2. Фермент рестрикции типа IIS 2 связан с участком фермента рестрикции адаптера для расщепления области, расположенной в 10-14 п.н. ниже участка расщепления фермента рестрикции, что приводило к отделению метки длиной примерно 50 п.н., содержащей конец размером 4 п.н., свисающий с 5′-конца. В качестве фермента рестрикции типа IIS 2 предпочтительно применяли BsmFI.

На стадии d метки соединяли друг с другом с образованием двойной метки. Точнее, образовывали свисающий конец на каждом 5'-конце меток, так что двойная метка могла легко образоваться соединением данных концов. Полученная в результате двойная метка составляла примерно 100 п.н. в длину.

На стадии e двойную метку расщепляли ферментом рестрикции типа IIS 1 для отщепления адаптера, что приводило только к образованию чистой двойной метки. Точнее, область связывания, в которой соединялись конец метки и адаптер, содержала участок распознавания фермента рестрикции типа IIS, так что адаптер мог отщепляться с использованием фермента рестрикции типа IIS 1. В результате получали чистую двойную метку длиной примерно 26 п.н.

Между тем на стадии 3, 10-20 фрагментов-меток, полученных на стадии 2, связывали, и исследовали их нуклеотидную последовательность. И процесс исследования состоял из следующих стадий:

a) клонирование двойной метки типа конкатемера, полученной путем связывания двойных меток, полученных на стадии 2, в вектор; и

b) исследование нуклеотидной последовательности метки вектора, использованного для клонирования на стадии a.

На стадии a двойные метки связывали с образованием конкатемера. Точнее, оба конца двойной метки включали в себя участок распознавания ферментом рестрикции типа IIS 1, что указывало на возможность образования свисания. Такие двойные метки могут легко связываться, и так примерно 20-50 меток соединяли с образованием конкатемера. Полученную метку типа конкатемера встраивали в обычный вектор для клонирования с целью исследования нуклеотидной ее последовательности. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для клонирования применяли вектор pZerO-1. Указанный экспрессирующий вектор включен в набор (Invitrogen Life Science), предоставленный для анализа SAGE, и он очень удобен.

На стадии 4 экспрессию подвергали количественному анализу, полученному путем исследования нуклеотидной последовательности, полученной выше, посредством программы анализа SAGE. Точнее, полученную нуклеотидную последовательность сравнивали с другими последовательностями генов, которые находятся в GenBank, для их идентификации. Затем программу анализа SAGE использовали для классификации последовательностей с высоким уровнем экспрессии и с низким уровнем экспрессии. Их отмечали красным, желтым, зеленым и синим цветом после кластеризации, что ясно показывало уровень экспрессии. И уровень экспрессии может оцениваться численным значением. Программа анализа SAGE может предоставляться компанией или являться одной из программ, предоставляемых через Интернет.Согласно изобретению применяли обычную программу (компьютерная программа кластеризации и построения «деревьев», http://rana.lbl.gov), широко используемую для кластеризации результатов SAGE.

Способ скрининга согласно изобретению основан на анализе SAGE. Каждую стадию способа проводили, отдавая предпочтение обычному анализу SAGE, или ее могли проводить модифицированными способами по инструкции производителя. План способа согласно изобретению показан на схематической диаграмме фиг.2.

Описание фигур

На фиг.1a - фиг.1c показано сравнение экспрессии поверхностных молекул в процессе дифференцировки из кроветворных стволовых клеток мыши (HSC) через ранние NK-клетки (pNK) в зрелые NK-клетки (mNK) в присутствии (+OP9) или в отсутствие (-OP9) интерстициальных клеток OP9.

Фиг.1a представляет собой набор графиков, на которых показана чистота клеток на каждой стадии дифференцировки NK-клеток, что представлено двумя разными цветами и определено путем проточной цитометрии. Числа в каждом квадранте указывают на процент соответствующих клеток.

Lin-c-kit+:(96%), CD122+NK1.1-: (95%),

CD122+NK1.1+: (94%, 95% соответственно)

Фиг.1b представляет собой набор графиков, на которых показана экспрессия связанных с NK-клетками поверхностных маркеров (NK1.1, DX5, CD94, NKG2A), индуцированных во время дифференцировки из ранних NK-клеток в зрелые NK-клетки, причем в культуру добавляли интерстициальные клетки OP9.

Фиг.1c представляет собой набор фотографий, на которых показаны результаты ОТ-ПЦР. Цельную цитоплазматическую РНК выделяли из клеток на каждой стадии дифференцировки NK-клеток для исследования того, экспрессировались ли CD122, представительно связанных с NK-клетками генов, и перфорин.

Фиг.2 представляет собой схематичную диаграмму, на которой показан процесс SAGE для выявления регулирующего дифференцировку гена согласно изобретению.

На фиг.3a - фиг.3f показана кластеризация профиля генной экспрессии, полученного во время дифференцировки NK-клеток, путем анализа SAGE.

На фиг.3a показана группа генов, наиболее экспрессированных в HSC-клетках, фиг.3b представляет группу генов, наиболее экспрессированных в pNK-клетках, на фиг.3c показана группа генов, наиболее экспрессированных в mNK(-OP9)-клетках, и фиг.3d представляет группу генов, наиболее экспрессированных в mNK(+OP9)-клетках.

На фиг.3e показаны гены, ингибирующие активацию NK-клеток, и на фиг.3f показаны гены, способствующие активации NK-клеток.

На описанных выше фиг.3a - фиг.3f в кластеризации, основанной на анализе SAGE, когда частота кластера превышала 80, его маркировали красным, когда частота составляла 50-79, его маркировали желтым, когда частота составляла 30-49, его маркировали зеленым, а когда частота была ниже 29, его маркировали синим.

На фиг.4a - фиг.4d показаны результаты ОТ-ПЦР для исследования того, действительно ли экспрессируется ген, который, по данным SAGE, регулировал дифференцировку NK-клеток. Экспрессию подвергали количественному анализу по сравнению с контрольным геном бета-актина.

На фиг.4a показаны гены, специфично экспрессированные в HSC-клетках во время дифференцировки NK-клеток, фиг.4b представляет гены, специфично экспрессированные в pNK-клетках, на фиг.4c показаны гены, специфично экспрессированные в mNK-клетках, и на фиг.4d показано, как NK-клетки обрабатывали LPL в разных концентрациях (250 нг/мл и 500 нг/мл) для исследования эффекта LPL на дифференцировку NK-клеток, и в результате обеспечивалась дифференцировка в mNK-клетки.

Способ изобретения

Практические и предпочтительные в настоящее время варианты осуществления настоящего изобретения иллюстрируются следующими примерами.

Однако, понятно, что специалисты в данной области при рассмотрении данного описания могут сделать модификации и улучшения по сущности и в объеме настоящего изобретения.

Пример 1. Выделение стволовых клеток из костного мозга

Все кости, включая большеберцовые и бедренные кости, мыши C57BL/6 (Dae Han Biolink), в возрасте 6-9 недель, пульверизовали. Пульверизованные кусочки пропускали через 70-микронный клеточный фильтр, и эритроциты удаляли обработкой раствором для лизиса (Sigma, St.Louse, Миссури) для получения одних клеток костного мозга. Клетки костного мозга взаимодействовали с антителами-маркерами, меченными биотином, на предмет системных маркеров (CD11b: маркер макрофагов, Gr-1: маркер гранулоцитов, B220: маркер B-клеток, NK1.1: маркер NK-клеток, CD2: маркер T-клеток, TER-119: маркер эритроцитов), с последующей промывкой. Затем клетки взаимодействовали с меченными стрептавидином магнитными гранулами (Miltenyi Biotec, Auburn, Калифорния). Магнитно-меченные клетки Lin+выделяли пропусканием через колонку CS (Miltenyi Biotec) в магнитном поле MACS (Miltenyi Biotec). Остальные Lin-, пропущенные через колонку, взаимодействовали с магнитными гранулами, связанными с c-kit, и затем их пропускали через колонку MACS (Miltenyi Biotec), что приводило к задержке c-kit+клеток на колонке. Чистоту полученных Lin- c-kit+кроветворных стволовых клеток (обозначенных здесь и далее как "HSC-клетки") измеряли путем FACS (BD Bioscience, Mountainview, Калифорния). В результате подтверждали, что клетки характеризовались чистотой свыше 96%.

Пример 2. Индукция дифференцировки из стволовых клеток в NK-клетки

HSC-клетки, выделенные из костного мозга в примере 1, в полной среде RPMI, дополненной мышиным SCF (30 нг/мл, BioSource, Camarillo, Калифорния), мышиным Flt3L (50 нг/мл, PeproTech, Rocky Hill, Нью-Джерси), мышиным IL-7 (0,5 нг/мл, PeproTech), индометацином (2 мкг/мл, Sigma), гентамицином (20 мкг/мл) и 10% фетальной сывороткой теленка, инокулировали в 6-луночный планшет (Falcon) в концентрации 2×10⁶ клеток/лунку. Клетки культивировали при 37°C, 5% CO₂ в инкубаторе в течение 6 суток. После 3 суток культивирования половину надосадочной жидкости отбрасывали и добавляли свежую среду, дополненную цитокинами в той же композиции, как указано выше. Через 6 суток CD122+ранние NK-клетки (обозначенные здесь и далее как "pNK-клетки") отделяли посредством MACS с использованием меченного FITC антитела против CD122 и магнитных гранул, конъюгированных с антителом против FITC. Чистоту ранних NK-клеток измеряли путем FACS и в результате подтверждали, что клетки имели чистоту свыше 92%.

Для индукции дифференцировки в зрелые NK-клетки (обозначенные здесь и далее как mNK-клетки), HSC-клетки получали через 6 суток из культуры и затем культивировали их отдельно или со стромальными клетками OP9 (Science 1994, 265 (5175):1098-1101; Nakano T, Kodama H, Honjo T.: Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture) в присутствии мышиного IL-15 (20 нг/мл, PeproTech). Через 3 суток половину среды заменяли свежей с той же композицией. На 12 сутки NK1.1+клетки отделяли с использованием меченного FITC антитела против NK1.1 и магнитных гранул, конъюгированных с антителом против FITC. Зрелые NK-клетки исследовали путем проточной цитометрии с использованием антител против CD122, NK1.1, DX5 и антител против NK-клеточного рецептора.

Пример 3. Исследование фенотипа очищенных NK-клеток, специфичного в отношении стадий дифференцировки

Для сбора специфичных NK-клеток с каждой стадии дифференцировки Lin-c-kit+HSC (>95%) клетки, выделенные из костного мозга мыши, культивировали в присутствии SCF, Fit-3L и IL-7 в течение 6 суток. Затем CD122+pNK-клетки выделяли и анализировали путем проточной цитометрии. В случае mNK-клеток (-OP9 или+OP9) IL-15 клетки культивировали отдельно или со стромальными клетками OP9 в течение еще одних 6 суток. Полученные клетки анализировали путем проточной цитометрии (фиг.1a). Когда клетки культивировали вместе со стромальными клетками OP9, число mNK-клеток повышалось (-OP9; 94% и+OP9;>95%). Рецепторы Ly49 на поверхности mNK-клеток играют важную роль в функционировании mNK-клеток, и их экспрессия регулируется путем трансдукции сигнала за счет коммуникации с другими иммунными клетками. Для подтверждения того, является ли совместное культивирование HSC-клеток, происходящих из костного мозга и стромальных клеток, существенным для экспрессии Ly49-рецепторов mNK-клеток, mNK-клетки культивировали отдельно или вместе с клетками OP9 в присутствии IL-15 и затем исследовали экспрессию Ly49 (фиг.1b). Когда клетки культивировали вместе с клетками ОР9 (+OP9), в mNK-клетках экспрессировались Ly49C/I и Ly49G2. С другой стороны, когда клетки культивировали независимо (-OP9), ни Ly49C/I, ни Ly49G2 не экспрессировались. Данные результаты показывают, что совместное культивирование HSC-клеток и OP9-клеток существенно для созревания NK-клеток. После исследования экспрессии генов CD122 и перфорина по стадиям дифференцировки NK-клеток доказывали, что HSC-клетки созревали в NK-клетки во время дифференцировки (фиг.1c).

Пример 3. SAGE (серийный анализ генной экспрессии)

Цельную РНК выделяли из HSC-клеток, полученных в примере 2 и из NK-клеток, специфичных для стадий дифференцировки (pNK и mNK). мРНК выделяли и очищали из 5 мкг цельной РНК с использованием магнитных гранул (dT)25 (Dynal A.S., Осло, Норвегия). мРНК, выделенную и очищенную олиго-dT-гранулами, использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК посредством набора для синтеза кДНК (Invitrogen, Life Technologies) с использованием олиго-(dT)-праймера, который был 5′-биотинилирован и связан с 3′-конца. По инструкциям производителя (Invitrogen, Life Technologies) метку для SAGE получали из кДНК способом, который объясняется на схематической диаграмме фиг.2. кДНК расщепляли ферментом рестрикции NIaIII и 3′-область связывали с магнитными гранулами (Dynal), покрытыми стрептавидином. Метку разделяли на две фракции, которые связывали с линкерами (Invitrogen, Life Technologies), имеющими участок распознавании NIaIII, соответственно. Связывающуюся с линкером метку расщепляли BsmFI. Выделенную метку и линкер обрабатывали ДНК-полимеразой Pfu для получения тупого конца. Тупые концы связывали вместе с образованием двойной метки. Проводили ПЦР для амплификации двойной метки с использованием меченного биотином праймера для SAGE (Invitrogen, Life Technologies). Затем двойную метку расщепляли NIaIII для отделения от линкера. Ее обрабатывали ДНК-лигазой T4 с образованием конкатемера.

Полученный конкатемер клонировали в предварительно расщепленный SphI вектор pZero-1 (Invitrogen, Carlsbad, Калифорния) (фиг.2). Затем продукт клонирования амплифицировали путем ПЦР с использованием прямого праймера M13, представленного SEQ ID NO:1, и обратного праймера M13, представленного SEQ ID NO:2. Амплифицированную позитивную колонию собирали и затем последовательность исследовали с использованием набора для секвенирования (набор для секвенирования Big-Dye) и нуклеотидного секвенатора (секвенатор ABI377, Perkin-Elmer Applied Biosystems, Branchburg, Нью-Джерси). Последовательность метки идентифицировали посредством программного обеспечения SAGE 300.

Пример 4. Анализ данных SAGE

4-1. Биоинформационный анализ

Базу данных сравнения SAGE-меток получали из мышиной базы данных UniGene, содержащей большую часть последовательностей, экспрессированных в мыши, которую подавали в GenBank. Метку SAGE определяли по (i) направлению каждого транскрипта, (ii) наличию или отсутствию поли(A)-сигнала (AATAAA или ATTAAA), (iii) наличию или отсутствию поли-A-хвоста, и (iv) наличию или отсутствию последнего участка расщепления CATG в последовательности. Все метки SAGE, полученные из последовательностей сравнения, использовали для конструирования базы данных сравнения SAGE. Экспериментальная метка SAGE совпадала с базой данных сравнения SAGE (http://www.hpc1.cs. uchicago. edu/gist). Для идентификации гена, соответствующего каждой метке SAGE, использовали компьютерную программу SAGEmap (Lash A. E et al., 2000).

4-2. Анализ кластеров согласно количественному распределению профиля SAGE

Компьютерную программу кластеризации (компьютерная программа кластеризации и визуализации деревьев, http://rana.lbl.gov) использовали для исследования кластеризации данных SAGE, полученных в примере 4-1, основываясь на других профилях экспрессии и функциональных профилях, показанных во время процессов дифференцировки NK-клеток. Коротко, на каждой стадии различными цветами, такими как синий, зеленый, желтый и красный, метки маркировали по частоте (скрипт PERL доступен по запросу). Среднюю точку включали в соответствующее значение RGB. По данным цветным результатам некоторые метки, характеризовавшиеся четкой и высокой экспрессией, выбирали и помещали их на панели отдельно друг от друга. Остальные метки пересортировали, помещая линии, показывающую сходные профили экспрессии, рядом друг с другом упорядоченно, для получения постепенного изменения цвета в целом.

Повышение или снижение генной экспрессии во время дифференцировки NK-клеток исследовали на основе профилей SAGE HSC-, pNK-, mNK(-OP9)- и mNK (+OP9)-клеток. В результате, как показано на фиг.3a - фиг.3f, гены-мишени были классифицированы на 4 группы. Точнее, фиг.3a представляет группу генов, экспрессия которых повышена в HSC, но снижена при дифференцировке NK-клеток, на фиг.3b показана группа генов, экспрессия которых была высокой в pNK-клетках, а фиг.3c представляет группу генов, экспрессия которых была высокой в mNK(-OP9). На фиг.3d показана группа генов, экспрессия которых постепенно повышалась до достижения максимума в mNK(+OP9)-клетках. В частности, группа генов (фиг.3b), показывающая наилучшую экспрессию в pNK-клеток, включает в себя много генов регуляции иммунитета, таких как антитело дифференцировки лимфоцитов, C-C-хемокиновый рецептор, фактор некроза опухолей и интерлейкин-18-связывающий белок, и т.д., и это указывает на то, что регулирующие иммунитет факторы играют важную роль в дифференцировке pNK-клеток. Далее, основываясь на информационной базе данных, гены классифицировали по функции регуляции активности NK-клеток. На фиг.3e и фиг.3f показаны гены, ингибирующие и стимулирующие активность NK-клетки, соответственно. В большинстве случаев данные гены экспрессированы на поздней стадии дифференцировки. Гены, вовлеченные в активацию клетки, включают в себя многие сигнальные факторы, такие как митоген-активированная протеинкиназа, фосфолипаза A2, рецептор IL-2, хемокиновый рецептор, и т.д.

Пример 5. Анализ генов, регулирующих каждую стадию дифференцировки NK-клетки

5-1. Конструкция SAGE библиотеки, в соответствии с каждой стадией дифференцировки NK-клетки

На основании результатов SAGE в примере 4, сконструировали 4 различные SAGE библиотеки, в соответствии с каждой стадией дифференцировки NK-клетки (HSC, pNK, mNK(-OP9), mNK(+OP9)). Из SAGE библиотеки HSC идентифицировали 19830 уникальных транскриптов из общего количества меток 44998 и, из них, идентифицировали 12899 специфичных генов. Из SAGE библиотеки pNK идентифицировали 17745 уникальных транскриптов из общего количества меток 40771 и, из них, идентифицировали 11684 специфичных генов. Аналогично, из SAGE библиотеки mNK идентифицировали, соответственно, 20803 и 20791 уникальных транскриптов из 42160 (mNK(-OP9)) и 42535 (mNK(+OP9)) меток и, из них, идентифицировали 3650 и 14335 специфичных генов. В целом, 170464 меток идентифицировали из указанных выше четырех SAGE библиотек, из которых идентифицировали 59657 уникальных транскриптов и 35385 специфичных генов. Из 59657 уникальных транскриптов 77,9% были единичными копиями, 16,8% имели 2-4 копии, 3,2% имели 5-9 копий, 1,9% имели 10-99 копий и только 0,2% имели более 100 копий (таблица 1).

Таблица 1
Результат SAGE, в соответствии с каждой стадией дифференцировки NK-клетки
Клетки, в соответствии с каждой стадией дифференцировки	Количество меток	Количество уникальных транскриптов	Количество специфичных генов
HSC	44998	19830	12899
pNK	40771	17745	11684
mNK(-OP9)	42160	20803	13650
mNK(+OP9)	42535	20791	14335
Всего	170464	59657	35385

Также изучали, на основании приведенного выше результата SAGE, отражение экспрессии участков генов, известных, как имеющих эффект на дифференцировку NK-клетки. В результате, как и ожидали, количества рецепторов mNK-клетки, таких как гранзим (GenBank ID NM_013542), NKG2A (GenBank ID AF106008), 2B4 (GenBank ID L19057), Ly49Q (GenBank ID AB033769) и CD94 (GenBank ID AF057714), были велики в mNK-клетках, но не подсчитывались ни в HSC, ни в pNK-клетках. IL-15 (GenBank ID U14332) определяли только в HSC и pNK-клетках. Экспрессия ID2 (GenBank ID BC006951) начиналась со стадии pNK-клеток (таблица 2).

Таблица 2
SAGE результат дифференцировки соответствующих генов
Ген	HSC	pNK	mNK(-OP9)	mNK(+OP9)
Гранзим	0	0	508	664
NKG2A	0	0	6	3
NK рецептор 2B4	1	0	17	17
NK рецептор Ly-49Q	0	1	2	6
CD94	0	0	3	1
IL-15	3	3	0	0
Ly49G2	0	0	1	0
ID-2	0	7	5	9

5-2. Анализ генов, специфичных для стадии дифференцировки, экспрессируемых на каждой стадии дифференцировки NK-клетки

Сообщалось, что различные гены экспрессировались в соответствии со стадиями дифференцировки NK-клетки, так что в настоящем изобретении идентифицировали гены, специфичные для стадии дифференцировки. Для статистической достоверности гены, по меньшей мере, с 4-кратным увеличением экспрессии, группировали и представили в таблице.

В результате 15 генов признали имеющими высокую экспрессию в HSC (таблица 3). В частности, интерлейкин-1-рецептор-связанная киназа (IRAK), вовлечена в активацию и передачу сигнала NK-клетки. В соответствии с сообщением, что способность индуцировать цитотоксичность в NK-клетке вызвана IL-18 и образование IFN-y активированной NK-клеткой серьезно нарушается и снижается у IRAK-дефицитных мышей, анализ согласно изобретению был проведен корректно.

Таблица 3
Ген	GenBank ID	HSC	pNK	mNK(-ОP9)	mNK(+ОP9)
Гомеобокс-белок MIX	AF154573	28	0	0	0
Пре-про-протеиназа 3	U97073	28	0	0	0
Онкоген миелобластоза (Myb)	М16449	11	1	0	1
Комплекс 1 кератина, кислый, ген 13	NM_010662	9	0	0	0
РА-фосфатаза-ассоциированная фосфоэстераза	АК002966	8	0	1	1
Интерлейкин-1-рецептор-связанная киназа	АК009132	7	0	0	0
Гамма-парвин	ВС011200	6	0	0	0
Forkhead-ассоциированный фактор транскрипции 1С	AF339105	4	1	1	0
Ген RIKEN кДНК 5730501N20	АК017744	4	1	0	0
Белок с-myc	Х01023	4	0	0	1
Рибосомный белок L10A	АК002613	4	0	1	0
Ген oct 2b	Х53654	4	0	0	0
Микролит	АК015601	4	0	0	0
Дигидролипоамид дигидрогеназа	ВС003368	4	0	0	0
Тракл	U81030	4	0	0	0

Также, 30 других генов были в значительной степени экспрессированы на клеточной стадии pNK (таблица 4). Среди них, лиганд c-kit признали специфичным для полной дифференцировки в mNK-клетки и, таким образом, развитие от незрелых NK-клеток в зрелые NK-клетки подавлялся в отсутствие передачи сигнала c-kit. Также сообщалось, что 2-микроглобулин вовлечен в начальные стадии экспрессии рецептора Ly49 и в некоторые рецепторы NK-клеток, которые являются важными регуляторами дифференцировки NK-клеток. Экспрессия трансформированного рецептора Fc отрицательно влияет на развитие и функционирование NK-клеток, приводя к снижению количества CD56+CD3- NK-клеток и, в дальнейшем, к цитопении и другим критически иммунодефицитным синдромам. В соответствии с полученными данными о том, что гены, известные как регулирующие дифференцировку NK-клеток, были экспрессированы в определенных, ожидавшихся, стадиях, анализ согласно изобретению был проведен корректно.

Таблица 4
Ген	GenBank ID	HSC	pNK	mNK(-OP9)	mNK(+OP9)
Лизоцим	BC002069	14	1321	2	3
Ферритина Н цепь	BC012314	25	962	7	18
Бревикан	X87096	7	259	1	1
Матричная металлопротеиназа 12	BC019135	0	69	0	0
EIA-стимулируемый генный клеточный ингибитор	AF084524	5	45	7	1
Лиганд c-kit	M64262	0	62	0	0
S100 кальций-связывающий белок А9	BC027635	1	42	0	1
Белок MPS1	L20315	1	35	0	0
Трансглютаминаза 2	BC016492	0	25	1	1
Сывороточная и глюкокортикоид-регулируемая протеинкиназа	AF139639	0	20	0	0
RIKEN кДНК 5830413L19	BC027496	0	18	0	0
Бета 2-микроглобулин мРНК	M10416	0	17	0	0
Интерферон-индуцируемый белок	BC003804	0	17	0	0
Глобулярный мембранный белок молочного жира фактора EGF 8	BC018577	3	16	0	1
Fc гамма рецептор	M14215	3	15	1	1
Клеточный поверхностный гликопротеин р91	U83172	0	13	0	1
Аргиназа 1	BC050005	0	12	0	0
Рецептор 1 фактора некроза опухолей	M59378	1	12	0	2
Ретиноид-индуцируемая сериновая карбоксипептидаза	AF330052	2	11	0	0
Неидентифицированный гомолог белка FLJ11000	BC023802	0	11	2	0
Предшественник интерлейкин-18 связывающего белка d	AF110803	0	10	0	0
Хлоридный канал 7	AK009435	0	9	1	0
Антиген CD36	BC010262	0	8	0	0
Гомолог цинкосодержащего белка	BC030186	1	8	1	0
Углевод-связывающий белок 35	J03723	0	7	3	0
Кальций-зависимый углевод С-типа	BC003218	0	7	0	0
Липопротеинлипаза	NM_008509	0	7	0	0
Онкоген фибросаркомы v-maf lacertus	BC038256	0	6	0	0
Рецептор интерлейкина 7	NM_008372	0	5	0	0
Рецептор 1 хемокина (С-С)	BC011092	0	5	0	0
Нейрофиллин (MGD| MGI:106206)	AK002673	0	5	0	0

Между тем, 27 генов идентифицировали на клеточной стадии mNK (таблица 5). Среди них - тирозинкиназа `Fyn' семейства Src, о которой известно, что она вовлечена в активацию NK-клетки.

Таблица 5
Ген	GenBank ID	HSC	pNK	mNK(-OP9)	mNK(+OP9)
1	2	3	4	5	6
SERPINA3G	XM_127137	2	0	29	45
Субъединица 6 рецептора GABA-A	X51986	0	0	16	44
LAPTm5	U51239	5	4	18	25
Регулятор сигнала G-белка	BC049968	0	0	0	17
мРНК стимулирующего приманку фактора, фиксированного на GPI	L41366	0	0	0	12
Y-бокс-белок 3	AK019465	0	0	10	17
Предшественник остеопонтина	J04806	0	1	2	14
Представитель семейства, связывающего белок-предшественник бета-амилоида (А4)	AK021331	2	0	5	12
Аналог бета субъединицы Т-клеточного рецептора	U63547	0	0	8	11
Иммуноассоциированный нуклеотид 1	BC005577	0	0	9	0
Фактор транскрипции 1 высокой стадии дифференцировки	NM_009480	0	1	0	8
Обонятельный рецептор MOR267-7	NM_146714	0	0	0	8

продолжение Таблицы 5
1	2	3	4	5	6
Лимфоцит-специфичная протеинтирозинкиназа	М12056	0	0	7	1
Ингибитор рака остеокластов	АВ013898	1	1	0	7
Гомолог активного рецептора тромбоцитов	ВС024054	0	1	3	7
Белок 2-А1 клеток-природных киллеров	AF106008	0	0	3	6
Неидентифицированный белок MGC36662	ВС023851	0	1	2	6
Гомолог предшественника семафорина 6А	АК004390	0	0	6	2
Протоонкоген Fyn	ВС032149	0	0	5	5
Полипептид, гомолог нейрофиламента	ВС025872	0	0	2	5
Гомолог корнина, актин-связывающий белок 2А	ВС026634	1	1	б	2
Белок семейства переносчиков растворимых веществ 6	ВС015245	1	1	6	5
Гомолог временного пуринового рецептора P2Y10	АК020001	0	0	5	4
Гамма цепь рецептора Т клетки	Х03802	0	1	5	4
Поли А полимераза альфа	NM_011112	0	0	5	3
Аналог ОРА-ассоциированного белка 0IP5	АК017825	0	0	5	1
Аналог митоген-активируемой протеинкиназы 1	ВС006708	1	0	5	4

Пример 6. Исследование участков экспрессии генов с помощью OT- ПЦР

Полуколичественную ОТ-ПЦР использовали для изучения участков экспрессии других генов, на основе данных SAGE. Праймеры для ОТ-ПЦР получали в соответствии с генами-мишенями. Все смеси подвергали тепловой обработке при 95°С в течение 1 минуты, а другие условия ПЦР были следующими; ПЦР с клетками HSC и mNK проводили при 95°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а ПЦР с незрелыми NK-клетками проводили при 95°С в течение 1 минуты, при 60°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, которые повторяли 28 или 32 цикла, с последующим удлинением при 72°С в течение 10 минут. Амплифицированные продукты ПЦР разделяли электрофорезом и окрашивали этидия бромидом.

Гамма-парвин: SEQ ID NO:3 и NO:4,

Forkhead-ассоциированный фактор транскрипции 1c (Foxp1c): SEQ ID NO:5 и NO:6,

Белок c-myc: SEQ ID NO:7 и NO:8,

Комплекс кератина (KC) 1: SEQ ID NO:9 и NO:10,

РА-фосфатаза-ассоциированная фосфоэстераза (PA-PRP): SEQ ID NO:11 и NO:12,

Интерлейкин-1-рецептор-связанная киназа (IPAK): SEQ ID NO:13 и NO:14,

Рибосомный белок L10A: SEQ ID NO:15 и NO:16,

Пре-про-протеиназа 3: SEQ ID NO:17 и NO:18,

Онкоген миелобластоза: SEQ ID NO:19 и NO:20,

Углевод-связывающий белок (CBP) 35: SEQ ID NO:21 и NO:22,

IL-7 рецептор: SEQ ID NO:23 и NO:24,

Липопротеинлипаза (LPL): SEQ ID NO:25 и NO:26,

Ферритина Н цепь: SEQ ID NO:27 и NO:28,

Матричная металлопротеиназа (MMP) 12: SEQ ID NO:29 и NO:30,

Регулятор G-белковых сигналов (RGS): SEQ ID NO:31 и NO:32,

Серпин 3G: SEQ ID NO:33 и NO:34,

Пуринэргический рецептор P2Y: SEQ ID NO:35 и NO:36,

Лимфоцит-специфичная протеинтирозинкиназа (PTK): SEQ ID NO:37 и NO:38,

Предшественник семафорина 6А: SEQ ID NO:39 и NO:40,

CD122: SEQ ID NO:41 и NO:42,

Перфорин: SEQ ID NO:43 и NO:44,

Бета-актин: SEQ ID NO:45 и NO:46

В результате 9 генов, например, гамма-парвин, forkhead-ассоциированный фактор транскрипции 1c (Foxp1c), c-myc, пре-про-протеиназа 3 и др., были специфично экспрессированы в HSC (фиг.4а). IL-7R и матричная металлопротеиназа 12 (MMP12) были экспрессированы исключительно в клетках pNK (фиг.4b). Пуринэргический рецептор P2Y10 и лимфоцит-специфичная протеинтирозинкиназа (PTK) были необычно экспрессированы в клетках mNK (фиг.4c).

Пример 7. Эффект LPL на стадии дифференцировки NK-клетки

В приведенном выше примере 4 было подтверждено, что липопротеинлипаза (обозначенная здесь и далее «LPL»), представленная SEQ ID NO:47, была суперэкспрессирована в клетках pNK в продолжении дифференцировки NK-клетки, в числе многих других генов, специфичных для стадии дифференцировки. LPL способствовала пролиферации NK-клетки, но подавляла спонтанную цитотоксичность и активность лимфокин-активируемых киллеров (LAK). С целью уточнить, была ли pNK-специфичная экспрессия LPL необходима для дифференцировки в mNK-клетки, HSC-клетки культивировали в течение 6 дней, а затем обрабатывали IL-15 и LPL в отсутствии ОР9 стромальных клеток, с последующим измерением процента NK-клеток.

В результате, процент NK-клеток возрастал в большей степени, когда HSC обрабатывали IL-15 и LPL вместе, чем когда HSC обрабатывали только IL-15 (NK1.1+NKG2A/C/E+клетка; 50%, когда HSC обрабатывали только IL-15 против 71% и 86%, когда HSC обрабатывали IL-15 вместе с 250 нг/мл LPL и когда HSC обрабатывали IL-15 вместе с 500 нг/мл LPL, соответственно) (фиг.4d). Приведенные выше результаты показывают, что LPL играет важную роль в дифференцировки от pNK-клеток в mNK-клетки, и поиск генов, регулирующих дифференцировку NK-клеток, был корректно проведен в настоящем изобретении.

Промышленная применимость

Как объяснялось здесь выше, способ согласно изобретению для поиска генов, вовлеченных в регуляцию дифференцировки из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в дополнение к SAGE, может использоваться для идентификации нового гена, имеющего необычные функции.

Описание списка последовательностей

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:1 и NO:2, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ПЦР в примере 3.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:3 и NO:4, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с гамма-парвином в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:5 и NO:6, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с forkhead-родственным фактором транскрипции 1 с в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:7 и NO:8, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с белком c-myc в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:9 и NO:10, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с кератиновым комплексом 1 (КС) в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:11 и NO:12, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с родственной РА-фосфатазой фосфоэстеразой (PA-PRP) в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:13 и NO:14, представляют собой праймерные последовательности, использованные для ОТ-ПЦР с ассоциированной с рецептором интерлейкина-1 киназой (IRAK) в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:15 и NO:16, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с рибосомным белком L10A в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:17 и NO:18, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР пре-про-протеиназой 3 в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:19 и NO:20, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с онкогеном миелобластоза в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:21 и NO:22, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с углевод-связывающим белком (CBP) 35 в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:23 и NO:24, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с рецептором IL-7 в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:25 и NO:26, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с липопротеинлипазой (LPL) в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:27 и NO:28, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с H-цепью ферритина в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:29 и NO:30, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с матриксной металлопротеиназой (MMP) 12 в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:31 и NO:32, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с регулятором передачи сигнала G-белком (RGS) в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:33 и NO:34, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с серпином 3G в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:35 и NO:36, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с пуринергическим рецептором P2Y в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:37 и NO:38, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с лимфоцит-специфичной протеинтирозинкиназой (PTK) в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:39 и NO:40, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с предшественником семафорина 6A в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:41 и NO:42, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с CD122 в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:43 и NO:44, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с перфорином в примере 6.

Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:45 и NO:46, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с бета-актином в примере 6.

Нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:47, представляет собой нуклеотидную последовательность липопротеинлипазы.

Нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:48, представляет собой аминокислотную последовательность белка мыши.

Специалистам в данной области понятно, что концепции и конкретные варианты осуществления, приведенные в последующем описании, могут легко использоваться в качестве основы для модификации или конструирования других вариантов осуществления для воплощения тех же целей настоящего изобретения. Специалистам в данной области также понятно, что такие эквивалентные варианты осуществления не уклоняются от сущности и объема изобретения, как указано в прилагаемой формуле изобретения.

1. Средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров, содержащее в качестве эффективного ингредиента один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из белка гомеобокса MIX (AF154573, SEQ ID NO:49), пре-про-протеиназы 3 (U97073, SEQ ID NO:50), онкогена миелобластоза (Myb) (М16449, SEQ ID NO:51), гена 13 кислого кератинового комплекса 1 (NM-010662, SEQ ID NO:52), родственной РА-фосфатазе фосфоэстеразы (АК002966, SEQ ID NO:53), гамма-парвина (ВС011200, SEQ ID NO:54), родственного forkhead фактора транскрипции 1С (AF339105, SEQ ID NO:55), гена кДНК RIKEN 5730501N20 (АК017744, SEQ ID NO:56), белка c-myc (Х01023, SEQ ID NO:57), рибосомного белка L10A (АК002613, SEQ ID NO:58), гена Oct 2b (Х53654, SEQ ID NO:59), микролита (AK015601, SEQ ID NO:60), дигидролипоамиддегидрогеназы (BC003368, SEQ ID NO:61), трикла (U81030, SEQ ID NO:62), лизоцима (BC002069, SEQ ID NO:63), цепи H ферритина (BC012314, SEQ ID NO:64), бревикана (X87096, SEQ ID NO:65), матриксной металлопротеиназы 12 (BC019135, SEQ ID NO:66), клеточного ингибитора EIA-стимулируемого гена (AF084524, SEQ ID NO:67), S100 кальций-связывающего белка A9 (BC027635, SEQ ID NO:68), белка MPS1 (L20315, SEQ ID NO:69), трансглутаминазы 2 (BC016492, SEQ ID NO:70), сывороточной и регулируемой глюкортикоидами протеинкиназы (AF139639, SEQ ID NO:71), кДНК RIKEN 5830413L19 (BC027496, SEQ ID NO:72), индуцируемого интерфероном белка (BC003804, SEQ ID NO:73), глобулярного мембранного белка молочного жира фактора EGF 8 (ВС018577, SEQ ID NO:74), гликопротеина клеточной поверхности р91 (U83172, SEQ ID NO:75), аргиназы 1 (BC050005, SEQ ID NO:76), рецептора фактора некроза опухолей 1 (М59378, SEQ ID NO:77), индуцируемой ретиноидами сериновой карбоксипептидазы (AF330052, SEQ ID NO:78), гомолога FLJ11000 (ВС023802, SEQ ID NO:79), предшественника связывающего интерлейкин-18 белка d (AF110803, SEQ ID NO:80), канала ионов хлора 7 (АК009435, SEQ ID NO:81), антигена CD36 (ВС010262, SEQ ID NO:82), гомолога белка цинковых пальцев (ВС030186, SEQ ID NO:83), связывающего углевод белка 35 (J03723, SEQ ID NO:84), кальций-зависимого углевода С-типа (ВС003218, SEQ ID NO:85), липопротеинлипазы (NM-008509, SEQ ID NO:47), онкогена фибросаркомы двуглавой мышцы плеча v-maf (ВС038256, SEQ ID NO:86), рецептора интерлейкина 7 (NM-008372, SEQ ID NO:87), рецептора хемокина (С-С) 1 (ВС011092, SEQ ID NO:88), нейрофиллина (MGDlMGI: 106206) (АК002673, SEQ ID NO:89), серпина A3G (ХМ-127137, SEQ ID NO:90), субъединицы 6 рецептора GABA-A (Х51986, SEQ ID NO:91), LAPTm5 (U51239, SEQ ID NO:92), регулятора сигнала G-белка (BC049968, SEQ ID NO: 93), мРНК стимулирующего приманку фактора, фиксированного на GPI (L41366, SEQ ID NO:94), белка Y-бокса 3 (АКО19465, SEQ ID NO:95), предшественника остеопонтина (J04806, SEQ ID NO:96), представителя семейства, связывающего белок-предшественник бета-амилоида (А4) (АК021331, SEQ ID NO:97), аналога бета-субъединицы Т-клеточного рецептора (U63547, SEQ ID NO:98), имеющего отношение к иммунитету нуклеотида 1 (ВС005577, SEQ ID NO:99), фактора транскрипции 1 высокой стадии дифференцировки (NM-009480, SEQ ID NO:100), обонятельного рецептора MOR267-7 (NM-146714, SEQ ID NO:101), специфичной для лимфоцитов протеинтирозинкиназы (M12056, SEQ ID NO:102), ингибитора рака остеокластов (АВ013898, SEQ ID NO:103), гомолога активного рецептора тромбоцитов (ВС024054, SEQ ID NO:104), белка клеток-природных киллеров 2-А1 (AF106008, SEQ ID NO:105), неидентифицированного белка MGC36662 (ВС023851, SEQ ID NO:106), гомолога предшественника семафорина 6А (АК004390, SEQ ID NO:107), полипептида-гомолога нейрофиламента (ВС025872, SEQ ID NO:108), актинсвязывающего белка-гомолога корнина 2А (ВС026634, SEQ ID NO:109), белка семейства переносчиков растворимых веществ 6 (ВСО15245, SEQ ID NO:110), гомолога временного рецептора пурина P2Y10 (АК020001, SEQ ID NO:111), гамма-цепи Т-клеточного рецептора (Х03802, SEQ ID NO:112), поли-А-полимеразы альфа (NM-011112, SEQ ID NO:113), родственного ОРА белка-аналога OIP5 (АК017825, SEQ ID NO:114) и аналога митогенактивируемой протеинкиназы 1 (ВС006708, SEQ ID NO:115).

2. Средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров, по п.1, которое регулирует дифференцировку из стволовых клеток в ранние клетки-природные киллеры, где ген выбран из группы, состоящей из белка гомеобокса MIX (AF 154573, SEQ ID NO:49), пре-про-протеиназы 3 (U97073, SEQ ID NO:50), онкогена миелобластоза (Myb) (Ml6449, SEQ ID NO:51), гена 13 кислого комплекса кератина 1 (NM-010662, SEQ ID NO:52), родственной РА-фосфатазе фосфоэстеразы (АК002966, SEQ ID NO:53), гамма-парвина (BC011200, SEQ ID NO:54), родственного forkhead фактора транскрипции 1С (AF339105, SEQ ID NO:55), гена кДНК RIKEN 5730501N20 (AK017744, SEQ ID NO:56), белка c-myc (X01023, SEQ ID NO:57), рибосомного белка L10A (AK002613, SEQ ID NO:58), гена Oct 2b (X53654, SEQ ID NO:59), микролита (AK015601, SEQ ID NO:60), дигидролипоамиддегидрогеназы (BC003368, SEQ ID NO:61) и трикла (U81030, SEQ ID NO:62).

3. Средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров, по п.1, которое регулирует дифференцировку из ранних клеток-природных киллеров в зрелые клетки-природные киллеры, где ген выбран из группы, состоящей из лизоцима (ВС002069, SEQ ID NO:63), цепи ферритина Н (ВС012314, SEQ ID NO:64), бревикана (Х87096, SEQ ID NO:65), матриксной металлопротеиназы 12 (ВС019135, SEQ ID NO:66), клеточного ингибитора EIA-стимулируемого гена (AF084524, SEQ ID NO:67), S100 кальций-связывающего белка A9 (BC027635, SEQ ID NO:68), белка MPS1 (L20315, SEQ ID NO:69), трансглутаминазы 2 (BC016492, SEQ ID NO:70), сывороточной и регулируемой глюкортикоидами протеинкиназы (AF139639, SEQ ID NO:71), кДНК RIKEN 5830413L19 (BC027496, SEQ ID NO:72), индуцируемого интерфероном белка (BC003804, SEQ ID NO:73), глобулярного мембранного белка молочного жира фактора EGF 8 (ВС018577, SEQ ID NO:74), гликопротеина клеточной поверхности р91 (U83172, SEQ ID NO:75), аргиназы 1 (ВС050005, SEQ ID NO:76), рецептора фактора некроза опухолей 1 (М59378, SEQ ID NO:77), индуцируемой ретиноидами сериновой карбоксипептидазы (AF330052, SEQ ID NO:78), гомолога FLJ11000 (ВС023802, SEQ ID NO:79), предшественника связывающего интерлейкин-18 белка d (AF 110803, SEQ ID NO:80), канала ионов хлора 7 (АК009435, SEQ ID NO:81), антигена CD36 (ВС010262, SEQ ID NO:82), гомолога белка цинковых пальцев (ВС030186, SEQ ID NO:83), связывающего углевод белка 35 (J03723, SEQ ID NO:84), кальций-зависимого углевода С-типа (ВС003218, SEQ ID NO:85), липопротеинлипазы (NM_008509, SEQ ID NO:47), онкогена фибросаркомы двуглавой мышцы плеча v-maf (ВС038256, SEQ ID NO:86), рецептора интерлейкина 7 (NM-008372, SEQ ID NO:87), рецептора хемокина (C-C) 1 (BC011092, SEQ ID NO:88) и нейрофиллина (MGDlMGI: 106206, SEQ ID NO:89).

4. Средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров, по п.1, которое регулирует дифференцировку зрелых клеток-природных киллеров, где ген выбран из группы, состоящей из серпина A3G (XM_-27137, SEQ ID NO:90), субъединицы 6 рецептора GABA-A (Х51986, SEQ ID NO:91), LAPTm5 (U51239, SEQ ID NO:92), регулятора сигнала G-белка (BC049968, SEQ ID NO:93), мРНК стимулирующего приманку фактора, фиксированного на GPI (L41366, SEQ ID NO:94), белка Y-бокса 3 (АК019465, SEQ ID NO:95), предшественника остеопонтина (J04806, SEQ ID NO:96), представителя семейства, связывающего белок-предшественник бета-амилоида (А4) (АК021331, SEQ ID NO:97), аналога бета-субъединицы Т-клеточного рецептора (U63547, SEQ ID NO:98), имеющего отношение к иммунитету нуклеотида 1 (ВС005577, SEQ ID NO:99), фактора транскрипции 1 высокой стадии дифференцировки (NM-009480, SEQ ID NO:100), обонятельного рецептора MOR267-7 (NM-146714, SEQ ID NO:101), специфичной для лимфоцитов протеинтирозинкиназы (М12056, SEQ ID NO:102), ингибитора рака остеокластов (АВ013898, SEQ ID NO:103), гомолога активного рецептора тромбоцитов (ВС024054, SEQ ID NO:104), белка клеток-природных киллеров 2-А1 (AF106008, SEQ ID NO:105), неидентифицированного белка MGC36662 (ВС023851, SEQ ID NO:106), гомолога предшественника семафорина 6А (АК004390, SEQ ID NO:107), полипептида-гомолога нейрофиламента (ВС025872, SEQ ID NO:108), актин-связывающего белка-гомолога корнина 2А (ВС026634, SEQ ID NO:109), белка семейства переносчиков растворимых веществ 6 (ВСО15245, SEQ ID NO:110), гомолога временного рецептора пурина P2Y10 (АК020001, SEQ ID NO:111), гамма-цепи Т-клеточного рецептора (Х03802, SEQ ID NO: 112), поли-А-полимеразы альфа (NM-011112, SEQ ID NO:113), родственного ОРА белка-аналога OIP5 (АК017825, SEQ ID NO:114) и аналога митогенактивируемой протеинкиназы 1 (ВС006708, SEQ ID NO:115).

5. Средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров, по любому из пп.1-4, где регулирующее дифференцировку средство используют для лечения злокачественных опухолей.

6. Средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров, по п.5, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, меланомы и рака легких.