Способ лечения или предупреждения заболеваний центральной нервной системы с использованием соединений, обладающих селективностью в отношении альфа-3-субъединицы бензодиазепинового рецептора

Изобретения относится к медицине, в частности к психиатрии, и могут быть использованы для лечения или предупреждения тревожного состояния или эпизода тревожного состояния. Фармацевтическая композиция включает эффективное количество ELB 139 (1-(4-хлорфенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-он) или 1-(4-метоксифенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-она, а способ включает введение пациенту эффективного количества ELB 139 (1-(4-хлорфенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-он) или 1-(4-метоксифенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-она. Введение ELB 139 (1-(4-хлорфенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-он) или 1-(4-метоксифенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-она для лечения или предупреждения тревожного состояния или эпизода тревожного состояния оказывает более сильный эффект по сравнению с другими соединениями со схожей химической формулой. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 10 ил.

 

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к применению 1-ар(алк)илимидазолин-2-онов, содержащих дизамещенный аминовый радикал в 4-м положении, для лечения или предупреждения расстройств центральной нервной системы, включая психотические расстройства, в частности шизофрению, депрессию, тревожные состояния и дистонию; а также к использованию этих и других агонистов, которые представляют собой подтип селективных лигандов для бензодиазепиновых рецепторов, содержащих альфа-3-субъединицу.

Предшествующий уровень техники

Расстройства центральной нервной системы представляют собой тяжелые психические расстройства, которые связаны исключительно с нарушением адаптации к условиям повседневной жизни. Так, например, шизофренией страдает примерно 1% населения во всем мире (Copuano et al., 2002), и в большинстве случаев это заболевание возникает у человека в возрасте до 30 лет и требует лечения на протяжении всей его жизни (Benes, 1993).

Психоз, особенно шизофрения, имеет гетерогенную симптоматическую картину (Американская Ассоциация психиатров, 1994). Его симптомы могут быть разделены на две фазы. В острой фазе шизофрения проявляется преимущественно галлюцинациями (сенсорное восприятие в отсутствие внешнего стимула) и бредом (т.е. бредовыми, навязчивыми и сверхценными идеями), например манией преследования. Такой пациент является крайне раздражительным и теряет чувство реальности. Эти проявления называются положительными симптомами (Davidson & Neale, 1988; Bailer et al., 1999). При ослаблении фазы раздражительности появляются так называемые негативные симптомы. Такими симптомами являются расстройство познавательной способности, пониженный тонус, нарушение способности к вербальному обучению и расстройство памяти, “беглость речи”, нарушение двигательных функций и оперативной памяти, а также безразличие и апатия. Пациенты ощущают неуверенность и беспокойство (Davidson & Neale, 1988; Bailer et al., 1999).

Хотя в настоящее время существует несколько антипсихотических лекарственных средств, однако современная терапия психозов не дает удовлетворительного результата. Классические антипсихотические средства, обладающие аффинностью к допаминовому рецептору D2, вызывают серьезное нарушение двигательной функции и оказывают побочное седативное действие (Nyberg et al., 2002). Наиболее известным прототипом классических антипсихотических средств, а также лекарственным средством первого ряда является галоперидол (Copuano et al., 2002). Поскольку это лекарственное средство вызывает негативные побочные эффекты и может ослаблять лишь позитивные острые симптомы, но не негативные симптомы шизофрении, то оно не способно вернуть пациента к нормальной повседневной жизни.

Установление этого факта было положено в основу разработки новых антипсихотических средств, так называемых атипичных антипсихотических средств. Эти средства обнаруживают более низкую аффинность к допаминовому рецептору D2 и имеют более широкий профиль аффинности в отношении рецепторов, в основном, серотонинового рецептора 5-НТ2 (Sawa & Snyder, 2002). Изменение профиля аффинности лекарственных средств к рецептору приводит к снижению побочного эффекта, проявляющегося нарушением двигательной функции, однако при этом оно приводит к появлению таких побочных эффектов как значительное увеличение массы тела, половые расстройства, расстройства познавательной способности и ангедония. Клозапин считается самым эффективным терапевтическим средством, способствующим ослаблению как позитивных, так и негативных симптомов шизофрении и не вызывающим побочных эффектов, связанных с нарушением двигательных функций, однако это лекарственное средство вызывает агранулоцитоз, который является его главным потенциально летальным побочным эффектом (Copuano et al., 2002). Все вышесказанное означает, что пока еще наблюдается большое число случаев, при которых современная терапия бессильна (Lindenmayer et al., 2002).

Причина развития шизофрении полностью не выяснена, а также неясен механизм действия антипсихотических лекарственных средств, в частности атипичных антипсихотических лекарственных средств. Это, очевидно, обусловлено полигенным наследованием, но при этом могут также играть определенную роль и негенетические факторы (Prasad et al., 2002). Все возрастающее число эпидемиологических, генетических и клинических данных указывает на то, что нарушение развития головного мозга играет определяющую роль в патофизиологии шизофрении (Arnold, 1999).

В основе главной гипотезы о причинах развития шизофрении лежит дисфункция допаминергической системы. Таким образом, острые психотические симптомы могут стимулироваться допаминергическими лекарственными средствами (Capuano et al., 2002), и как описано выше, классические антипсихотические средства, такие как галоперидол, обладают высокой аффинностью в отношении допаминового рецептора D2 (Nyberg et al., 2002). Однако механизм действия атипичных антипсихотических средств указывает на то, что в развитии шизофрении участвуют и другие нейротрансмиттерные системы. Клозапин - наиболее распространенное антипсихотическое средство и единственное лекарственное средство, которое ослабляет позитивные и негативные симптомы шизофрении, не обладает высокой аффинностью к допаминовым рецепторам D2 (Gerlach, 2002). Другим нейромедиатором в патофизиологии шизофрении является, например, серотонин (Sawa & Synder, 2002).

Очевидно, что глутаминергическая нейромедиаторная система также участвует в развитии шизофрении. Так, например, антагонисты NMDA, такие как фенциклидин и кетамин, способны стимулировать шизофренические симптомы у человека и грызунов (Abi-Saab et al., 1998; Lahti et al., 2001). Модели психоза у животных, полученные с использованием антагонистов NMDA, по сравнению с допаминергическими моделями, имеют то преимущество, что они не только имитируют возбужденное и импульсивное поведение позитивной фазы шизофрении, но также и негативные симптомы шизофрении, такие как нарушение познавательной способности (Abi-Saab et al., 1998; Jentsch & Roth, 1999). Таким образом, эта модель может быть использована для идентификации новых лекарственных средств с антипсихотическим действием.

Причины, вызывающие большинство расстройств центральной нервной системы, почти неизвестны, однако было обнаружено, что такой нейромедиатор как серотонин (5-НТ) играет важную роль во многих расстройствах центральной нервной системы. Хотя комплексный эмоциональный статус, такой как депрессия и тревожные состояния, не может быть сведен к нарушениям, индуцированным лишь одним нейромедиатором, однако известно, что дефицит нейромедиаторной системы 5-НТ в основном играет важную роль в развитии депрессии и тревожных состояний (Graeff et al., 1996).

Таким образом, независимо от различных клинических форм депрессии, таких как депрессивные расстройства и эпизоды, маниакальные, смешанные и гипоманиакальные эпизодические расстройства настроения, эпизоды депрессий с атипическими, кататоническими признаками или с признаками меланхолии, эпизоды депрессии после деторождения, внезапное предменструальное дисфорическое расстройство, легкое депрессивное расстройство, посттравматическое расстройство и острое расстройство, вызванное стрессом, у пациентов с депрессией наблюдается значительное снижение 5-НТ в цереброспинальной жидкости и другие изменения в их центральной 5-НТ-системе (Owens & Nemeroff, 1994). Хотя механизм, лежащий в основе депрессии, несомненно, является более сложным, чем просто снижение уровней 5-НТ или ослабление функций этой системы (Delgado & Moreno, 1999), однако участие серотонинергической системы в развитии депрессии со всей очевидностью подтверждается терапевтической эффективностью лекарственных средств, способствующих увеличению внеклеточной концентрации 5-НТ в головном мозге, таких как селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (SSRI). Таким образом, SSRI, такие как флуоксетин или циталопрам, описаны как средства, эффективные для лечения различных подгрупп депрессии, включая главное депрессивное расстройство, обсессивно-компульсивное навязчивое расстройство и нарушение питания у пациента (Stokes & Holtz, 1997). Важно отметить, что использование SSRI рассматривается как значительный прогресс в лечении расстройств центральной нервной системы по сравнению с использованием неселективных ингибиторов поглощения моноаминов, которые одновременно в различной степени увеличивают уровни серотонина, допамина и норадреналина, но вызывают, соответственно, больше побочных эффектов.

Кроме того, продолжительное увеличение концентрации внеклеточного 5-НТ в головном мозге под действием, например, SSRI может приводить к ослаблению тревожных состояний у животных и человека (Jones et al., 2002; Stokes & Holtz, 1997). Таким образом, флуоксетин, SSRI, представляет собой терапевтическое средство для лечения различных тревожных состояний (Nutt et al., 1999), что указывает на дополнительное модулирующее воздействие повышенных уровней 5-НТ на паническую атаку, агорафобию, специальные фобии, социальные фобии и генерализованное тревожное расстройство. Совершенно очевидно, что этот фармакологический эффект опосредован повышенными уровнями нейромедиаторов, что приводит к усилению активации соответствующего рецептора, но не специфическим блокированием поглощения переносчика. Однако позднее начало анксиолитического и антидепрессивного действия соединений, способствующих увеличению уровня 5-НТ в головном мозге, таких как SSRI, является фактором, ограничивающим терапевтическую эффективность этих лекарственных средств (Nutt et al., 1999). Человек с повышенной склонностью к суициду не будет ждать три недели, пока начнет проявляться антидепрессивное, антипсихотическое и/или анксиолитическое действие терапевтического лекарственного средства.

В противоположность SSRI, анксиолитическое действие бензодиазепинов проявляется довольно быстро (Costa & Guidotti, 1996). Однако спектр их терапевтического применения ограничен относительно коротким промежутком времени, поскольку развитие толерантности в отношении действия бензодиазепинов и риск появления зависимости от лекарственных средств ограничивает их использование при хронических расстройствах (Costa & Guidotti, 1996).

Таким образом, объединение терапевтических лекарственных средств, действующих посредством двух механизмов, таких как бензодиазепины, с быстрым проявлением их активности и SSRI, эффективные при хронических заболеваниях, должно привести к значительному прогрессу в терапии тревожных состояний, а также депрессии.

Другим расстройством центральной нервной системы является дистония. Дистония представляет собой нарушение двигательных функций, основанное на нарушении функции центральной нервной системы, заключающейся в регуляции двигательной активности; причем ранее такое состояние было известно как психовегетативный синдром. Этот синдром характеризуется непроизвольными повторяющимися движениями и аномальными позами, частично сочетающимися с болезненными судорогами мышц (Green 1992, Friedman & Standaert, 2001; Hamann & Richter, 2002). В зависимости от подтипа дистонии, ее симптомы начинаются с фокальной атаки и переходят в генерализованные дистонические атаки. Также наблюдаются и прогрессирующие формы, начинающиеся с фокальных атак в детском возрасте. Такими расстройствами могут страдать люди всех возрастов. В Германии дистоническими атаками страдает примерно 80000 человек (DDG eV, 2002).

По своим симптомам дистония может быть подразделена на несколько подтипов, таких как фокальная дистония, мультифокальная дистония или сегментарная дистония, а также торсионная дистония, полусферическая, генерализованная и поздняя дистонии (индуцированные психофармакологическими средствами). Фокальные дистонии включают в себя дистонию шеи (кривошея), блефароспазм (спазм глазного века), аппендикулярную дистонию (судороги конечностей, такие как писчий спазм), дистонию нижней челюсти рта и спастическую дистонию (судороги голосовых связок) (DDG eV, 2002; Friedman & Standaert, 2001).

В настоящее время в основе лечения дистонии, за исключением нескольких редких форм, лежит лишь симптоматическая терапия. Фокальные дистонии с большим успехом поддаются лечению ботулиническим токсином (Hsiung G.Y. et al., 2002). Ботулинический токсин местно вводят в пораженный участок, что приводит к релаксации мышцы в течение нескольких недель. Такое лечение повторяют регулярно. Недостаток такой терапии состоит в том, что у некоторых пациентов развивается резистентность к этому токсину в результате выработки антител против указанного токсина, а также в том, что он не может быть использован в тех случаях, когда данным заболеванием охвачены большие участки тела (Dressler et al., 2002; Hsiung et al., 2002).

Системные фармакотерапии сегментарной и генерализованной дистонии не дают удовлетворительных результатов. Такие терапии предусматривают использование антихолинергических лекарственных средств и баклофена, пресинаптического агониста ГАМК_B, который, как сообщалось, обладает благоприятным действием, направленным на ослабление симптомов дистонии (Fahn, 1987; Green, 1992; Rawicki, 1999). Действие противосудорожных лекарственных средств на дистонию является противоречивым, при этом предполагается, что фенобарбитал и ламотригин обладают про-дистоническим эффектом, а габапентин обладает антидистоническим эффектом (Richter & Loscher, 1999; Richter & Loscher, 2000; Siep et al., 2002).

Хирургическая терапия, например глубокая стимуляция бледного шара головного мозга, используемая для лечения тяжелой дистонии, пока еще находится только на самой первой стадии своего применения и дает положительные результаты только при лечении дистонии определенных типов. В большинстве случаев бывает необходимым проведение дополнительной системной фармакотерапии (Krack & Vercueil, 2001; Vercueil et al., 2002; Klein & Ozelius, 2002).

Механизм развития дистонии пока еще не полностью ясен. Однако имеется множество косвенных данных, указывающих на то, что в его основе лежит дисфункция базальных ядер (Gernert et al., 2002; Herrero et al., 2002). Предполагается, что причиной дистонии является нарушение механизма координации информации о соматосенсорной афферентации и поступления этой информации в двигательную систему (Herrero et al., 2002). Дистония может быть вызвана травмой головного мозга или инсультом, однако примерно в 80% случаев генерализованная дистония является идиопатической и, вероятно, может наследоваться с различной степенью пенетрантности (Pauls & Korczyn, 1990). В настоящее время 13 различных форм дистонии могут распознаваться по генетическим признакам (1-13 типов дистонии)(Klein & Ozelius, 2002). Генная мутация была идентифицирована для трех редких подтипов генерализованной дистонии, например дистонии, восприимчивой к L-дофа (Thyagarajan, 2001).

Генетическая модель пароксизмальной дистонии, созданная у хомячка, является одной из нескольких хорошо разработанных животных моделей дистонии (Hamann & Richter, 2002).

Возрастание случаев возникновения тревожных состояний у людей наблюдается во всем мире. Бензодиазепины все еще рассматриваются как наиболее эффективные лекарственные средства для лечения тревожных состояний, обладающие быстро проявляющейся анксиолитической активностью. Однако они вызывают нежелательные побочные эффекты, такие как атаксия, седативный эффект, релаксация скелетной мышцы, амнезия, вызываемая взаимодействием этанола и барбитуратов. Множество проблем также возникает в связи с развитием толерантности к их терапевтическому действию и с возможным привыканием к лекарственным средствам (Costa & Guidotti, 1996; Atack, 2003).

Как было упомянуто выше, лекарственные средства, используемые для лечения тревожных состояний, составляют класс селективных ингибиторов поглощения серотонина (SSRI). Эти лекарственные средства с успехом применяются как антидепрессанты, которые не индуцируют главных побочных эффектов, присущих бензодиазепинам, таких как толерантность или привыкание к лекарственным средствам, однако позднее начало их анксиолитического и антидепрессивного действия является фактором, ограничивающим их терапевтическую эффективность (Nutt et al., 1999). Кроме того, их терапевтическое применение приводит к увеличению массы тела и к расстройству сексуальной функции, в результате чего пациенты вынуждены прерывать лечение (Perna et al., 2001). Комбинация позитивных эффектов лигандов бензодиазепинового рецептора и SSRI может служить основой для идеального анксиолитического средства. В заключение следует отметить, что необходимость в получении идеального анксиолитического средства остается крайне актуальной.

Одной из попыток снижения указанных основных побочных эффектов, а именно, седативного эффекта лекарственных средств, связывающихся с сайтом распознавания бензодиазепинового рецептора ГАМК_А, была попытка разработать лекарственные средства, которые обладали бы высокой селективностью к некоторым рецепторам подтипа ГАМК_А-рецепторов (Costa & Guidotti, 1996). Фармакологические и генетические исследования, проводимые за последние годы, выявили, что различные α-субъединицы рецепторов ответственны за возникновение различных поведенческих симптомов, индуцированных бензодиазепинами (Atack, 2003).

Так, например, сообщалось, что рецепторами, содержащими альфа-1-субъединицы, опосредован седативный и противосудорожный эффект бензодиазепинов (Costa & Guidotti, 1996; Crestani et al., 2000; Dubinsky et al., 2002). Рецепторы ГАМК_А, содержащие альфа-5-субъединицы, должны играть определенную роль в развитии амнезии, индуцированной бензодиазепинами, а рецепторы, содержащие альфа-2-субъединицы и альфа-3-субъединицы, очевидно, ответственны за анксиолитическую активность соединений этого класса (Costa & Guidotti, 1996; Low et al., 2000; Dubinsky et al., 2002). Однако конкретное действие бензодиазепинов данного подтипа пока еще полностью не установлено, и в настоящее время имеются противоречивые мнения относительно роли различных субъединиц, выявление которой еще более усложняется тем фактом, что помимо различных альфа-субъединиц также были обнаружены различные бета- и гамма-субъединицы, а также другие субъединицы, которые вносят свой вклад в гетерогенность таких рецепторов. Имеются некоторые данные, указывающие на то, что, например, седативный эффект бензодиазепинов опосредован не только подтипом рецептора, содержащего альфа-1-субъединицу, но и другими механизмами, и что доминирующую роль в атаксии играют лишь альфа-1-субъединицы (Platt et al., 2002). Tauber и др. (2003) обнаружили, что потеря выпрямительного рефлекса, обусловленная одновременным введением диазепама и этанола, не наблюдается у мышей, мутантных по альфа-2-субъединице (в сочетании с потерей рецепторной активности), и, кроме того, у мышей, мутантных по альфа-1-, альфа-2-, альфа-3- и альфа-5-субъединице, было обнаружено снижение двигательной активности (признак седативного эффекта), вызываемое введением обоих соединений. Отсутствие информации о функции бензодиазепиновых рецепторов различных подтипов, которые гетерогенно экспрессируются в головном мозге, вызвано главным образом отсутствием высокоселективных лигандов различных подтипов.

Тем не менее, исходя из вышеуказанных данных, полученных с использованием генетически модифицированных мышей с мутированными альфа-субъединицами, которые больше не способны опосредовать бензодиазепиновый эффект, несколько компаний разработали программы исследований по идентификации лигандов бензодиазепиновых рецепторов, которые были бы селективны к обеим, альфа-2- и альфа-3-субъединицам и которые обладали бы пониженной активностью в отношении альфа-1-субъединицы (Low et al., 2000; Griebel et al., 2001). Было описано несколько соединений этого типа, и очевидно, что степень их селективности в отношении рецепторов данного подтипа является довольно ограниченной. Функциональная селективность достигается различной степенью частичной агонистической активности в отношении отдельных рецепторов. Так, например, было обнаружено, что вещество SL651498 обладает приблизительно 40-50% частичной агонистической активностью в отношении альфа-1- и альфа-5-содержащих рецепторов, 100% частичной агонистической активностью в отношении альфа-2-содержащих рецепторов и 70% активностью в отношении альфа-3-содержащих рецепторов. Фактически, это может приводить к функциональной селективности в отношении рецептора данного подтипа, однако что касается фармакологических эффектов, то для их достижения требуется высокая степень активации рецепторов. Для достижения эффектов, требующих менее чем 50% активации, такие соединения могут действовать как неселективные агонисты, как это можно видеть на фигуре 2 в работе Griebel et al., 2001. Однако какая именно степень активации рецептора и для какого именно эффекта является необходимой, пока еще нигде не обсуждалось, но при этом было установлено, что даже частичные неселективные агонисты, такие как имидазенил, оказывают седативное действие на пациентов (Attack, 2003). Остается под вопросом, может ли стратегия функционального частичного агонизма обеспечить нужную селективность в отношении альфа-1-субъединицы, селективность к которой была утрачена. Несмотря на это тот же самый подход был использован и другими исследователями (Dawson, 1998; McKernan, 1998). NS2710 и новое соединение, которое ранее не фигурировало в клинических разработках, проводимых согласно программе исследования и развития Merck (Adis Data Information, 2003; Goodacre et al., 2002; Chambers et al., 2001), пока еще не дало ожидаемого клинического профиля активности, и было показано, что оно обладает седативным действием и не вызывает привыкания (Atack, 2003). Суммируя эти результаты, можно сказать, что со времени получения новых лигандов для бензодиазепиновых рецепторов не наблюдается какого-либо серьезного прогресса в разработке новых лекарственных средств, особенно средств, обладающих высокой степенью селективности в отношении рецепторов данного подтипа. Кроме того, сведения относительно роли различных субъединиц в физиологии и патофизиологии заболеваний пока еще очень ограничены, что также обусловлено отсутствием селективных соединений.

Получение сведений о роли субъединиц альфа 1 и альфа 2 явилось целью по крайней мере некоторых работ, а сведения, касающиеся субъединицы альфа 3, которая представляет собой субъединицу с достаточно селективным распределением в головном мозге, еще более скудны. В настоящее время пока еще не существует доступных лигандов с какой-либо селективностью в отношении альфа-3-субъединицы, причем все вышеупомянутые созданные лекарственные средства, в лучшем случае, обладают некоторой селективностью в отношении альфа-2-субъединицы в комбинации с селективностью в отношении альфа-3-субъединицы и обладают до некоторой степени пониженной селективностью в отношении альфа-1-субъединицы. Было проведено лишь несколько исследований, относящихся к рецептору, содержащему альфа-3-субъединицу. В иммуноцитохимическом исследовании было выявлено, что указанная альфа-3-субъединица сверхэкспрессируется в холинергических нейронах полосатого тела, перегородки и ядер ножки-моста, а также в допаминергических нейронах компактной части черного вещества, но эти клетки экспрессируют лишь незначительный уровень альфа-2-субъединиц (Rodriguez-Pallares et al., 2001). Что касается допаминергических нейронов компактной части черного вещества, то было выявлено, что в них альфа-3-субъединицы сопровождаются, главным образом, альфа-4-субъединицами (альфа-4-субъединицы не чувствительны к бензодиазепинам), а мРНК альфа-2-субъединицы вообще не были обнаружены (Guyon et al., 1999). Сообщалось, что норадренергические нейроны в голубоватом месте обнаруживают иммунореактивность с альфа-3- альфа-2-субъединицами. Все эти участки головного мозга были иммунонегативными по альфа-1-субъединице (Rodriguez-Pallares et al., 2001).

Аналогичным образом, серотонинергические нейроны шва обнаруживали высокий уровень мечения альфа-3-субъединицы, и лишь несколько нейронов экспрессировали альфа-2-субъединицу (Rodriguez-Pallares et al., 2001). Кроме того, Gao и др. (1993) обнаружили, что подавляющее большинство серотонинергических нейронов в шве экспрессировали высокий уровень иммунореактивности альфа-3-субъединицы, но не обнаруживали окрашивания альфа-1-субъединицы, и обе эти субъединицы присутствовали в нейронах ГАМК-ергических нейронах шва. Однако все эти исследования относились к мечению и не позволяли получить какое-либо представление о фармакологических эффектах, опосредуемых альфа-3-субъединицей.

В исследованиях, относящихся к микродиализу, было обнаружено, что в дорсальном и медиальном шве, при локальном введении мусцимола, ГАМК_А-агонист и бикукуллин, ГАМК_А-антагонист оказывают воздействие на внеклеточные уровни локального и прилежащего ядра (Tao & Auerbach, 2000). Это указывает на то, что ГАМК_А-рецепторы, содержащие альфа-3-субъединицы, могут участвовать в серотонинергической нейтротрансмиссии.

Описание согласно изобретению

Исходя из вышесказанного, очевидно, что современные методы и средства лечения расстройств центральной нервной системы, включая психотические расстройства, депрессию, тревожные состояния и нарушения двигательных функций, такие как дистония, являются недостаточными, и их применение по меньшей мере отчасти связано с серьезными побочными эффектами.

Поэтому целью согласно изобретению является разработка других возможных способов лечения или предупреждения указанных расстройств центральной нервной системы у млекопитающих, а в частности, разработка нового способа лечения человека.

В соответствии со своим первым аспектом, настоящее изобретение относится к разработке способа лечения или предупреждения расстройств центральной нервной системы, включая психотические расстройства, депрессию, тревожные состояния и нарушения двигательных функций, и/или психотические симптомы, ассоциированные с другими психическими расстройствами, где указанный способ предусматривает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества по меньшей мере одного 1-ар(алк)илимидазолин-2-она формулы (I):

,

где Х представляет собой водород, С_1-4алкильный, С_1-4алкокси-, трифторметильный или галогеновый остаток, R¹ и R², независимо друг от друга, представляют собой С_1-4алкильный, С_3-10циклоалкильный или С_3-10гетероалкильный остаток, либо R¹ и R², взятые вместе, образуют С_2-6алкиленовый остаток, в котором -СН₂-группа необязательно заменена кислородом, азотом или серой, n равно 0 или 1, а m равно 0 или кардинальное число от 1 до 5.

В соответствии с настоящим изобретением, было обнаружено, что соединения формулы I являются в высокой степени эффективными для лечения нижеследующих расстройств центральной нервной системы:

1. Психоз и психотические эпизоды

К таким расстройствам относятся различные типы шизофрении (например, параноидная, гебефреническая, кататоническая, недифференцированная или резидуальная) и биполярных расстройств настроения, таких как маниакальная депрессия и пост-психотические депрессивные расстройства, ассоциированные с шизофренией. Считается, что психотические эпизоды ассоциированы с расстройствами шизофренического типа, шизоаффективными расстройствами, бредовыми расстройствами, психотическими расстройствами, индуцированными чрезмерным употреблением лекарственных средств (например, индуцированными употреблением алкоголя, амфетамина, конопли, кокаина, галлюциногенов, ингаляторов, опиоидов или фенциклидина); расстройствами личности (такими как пограничное расстройство личности), импульсивными расстройствами, такими как неадекватная агрессия; биполярными расстройствами и дефицитом внимания, вызываемым гиперактивностью и импульсивностью/гиперактивностью (AD/HD), со злоупотреблением лекарственными средствами и с наркоманией (например, чрезмерным употреблением алкоголя, амфетамина, кокаина или опиатов).

2. Расстройства настроения и эпизоды расстройства настроения

К таким расстройствам относятся тяжелое депрессивное расстройство и его эпизоды, маниакальные, смешанные и гипоманиакальные эпизоды расстройства настроения, депрессивные эпизоды с атипическими или кататоническими признаками или с признаками меланхолии, депрессивные эпизоды после деторождения, внезапное предменструальное дисфорическое расстройство, легкое депрессивное расстройство, посттравматическое расстройство, острое стрессорное расстройство, обсессивно-компульсивные состояния и нарушение питания у пациентов.

3. Тревожные состояния и эпизоды тревожных состояний

К таким состояниям относятся хронические тревожные состояния, паническая атака, агорафобия, специальные фобии, социальные фобии и генерализованное тревожное расстройство.

4. Нарушения двигательных функций, ассоциированные главным образом с дисфункцией базальных ядер.

К таким нарушениям относятся дистонии различных подтипов, такие как фокальная дистония, мультифокальная дистония или сегментарная дистония, а также торсионная дистония, полусферическая, генерализованная и поздняя дистонии (индуцированные психофармакологическими средствами). Фокальные дистонии включают дистонию шеи (кривошея), блефароспазм (спазм глазного века), аппендикулярную дистонию (судороги конечностей, такие как писчий спазм), дистонию нижней челюсти рта и спастическую дисфонию (судороги голосовых связок), а также пароксизмальную дистонию.

Соединения формулы (I) в первый раз были описаны в WO 97/09314 как вещества, которые могут быть использованы для лечения эпилептических расстройств. Было обнаружено, что эти вещества могут быть также использованы для эффективного лечения или предупреждения расстройств центральной нервной системы, таких как, но не ограничивающихся ими, вышеупомянутые психические расстройства. Указанные соединения могут быть использованы для лечения млекопитающих, а в частности, человека.

Группы СН₂ соединений, используемых в соответствии с настоящим изобретением, обозначены 0 (1-арилимидазолин-2-оны) либо 1 (1-аралкилимидазолин-2-оны). Примерами соединений формулы (I) являются

1-фенил-4-морфолиноимидазолин-2-он,

1-(4-метоксифенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-он,

1-(4-хлорфенил)-4-морфолиноимидазолин-2-он,

1-(4-хлорфенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-он,

1-(4-хлорфенил)-4-диметиламиноимидазолин-2-он,

1-(4-бромфенил)-4-морфолиноимидазолин-2-он,

1-(3-хлорфенил)-4-морфолиноимидазолин-2-он,

1-(4-хлорфенил)-4-гексаметиленимидазолин-2-он,

1-(4-метилфенил)-4-морфолиноимидазолин-2-он,

1-(4-хлорфенил)-4-(циклогексилметиламино)имидазолин-2-он,

1-(4-фторфенил)-4-морфолиноимидазолин-2-он, и

1-бензил-4-морфолиноимидазолин-2-он.

Вещества, используемые в способе согласно изобретению, могут быть получены способом, описанным в патенте США №5869481.

Особенно предпочтительным соединением, используемым в качестве фармацевтического средства согласно изобретению, является 1-(4-хлорфенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-он (ELB139; IB-номенклатура: 1-(4-хлорфенил)-4-пиперидин-1-ил-2,5-дигидро-1Н-имидазолин-2-он).

Введение по меньшей мере одного соединения формулы (I), в частности 1-(4-хлорфенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-она, может быть осуществлено стандартным методом введения психотропных лекарственных средств.

Указанные соединения предпочтительно вводят в виде фармакологической композиции в количестве 1-100 мг/кг массы тела пациента в день. При введении лекарственного средства путем ингаляции или закапывания в нос предпочтительно, чтобы указанное средство было введено в количестве 0,05-5 мг/кг массы тела пациента. При использовании этого средства для лечения шизофрении и других психотических расстройств более предпочтительным является его введение в количестве 2-70 мг/кг массы тела, особенно предпочтительным в количестве 5-50 мг/кг массы тела, а при использовании этого средства для лечения дистонии более предпочтительным является введение его в количестве 1-20 мг/кг массы тела, особенно предпочтительным в количестве 5-15 мг/кг массы тела.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанные соединения вводят перорально или путем инъекции в виде подходящей композиции для парентерального введения, а также путем ингаляции, интраназально или в виде суппозиториев.

Кроме того, указанные соединения предпочтительно используют в комбинации со стандартными фармацевтическими носителями, наполнителями или добавками. Способы введения не играют решающей роли с точки зрения согласно изобретению при условии, что они будут гарантировать достаточную абсорбцию активного ингредиента.

Кроме того, для лечения описанных заболеваний и стадий таких заболеваний указанные соединения вводят либо отдельно, либо в комбинации с другими соединениями, которые могут быть использованы для лечения указанных заболеваний или их стадий. Такой комбинированный способ может быть осуществлен путем совместного введения или отдельного введения каждого лекарственного средства или путем введения фиксированной комбинации в виде смеси со стандартными фармацевтическими наполнителями или добавками. Способ введения таких комбинаций не играет решающей роли с точки зрения согласно изобретению при условии, что этот способ будет гарантировать достаточную абсорбцию активного ингредиента.

Представленные здесь примеры использования 1-ар(алк)илимидазолин-2-онов согласно изобретению ясно показывают, что способы согласно изобретению являются наиболее эффективными для лечения психотических заболеваний и практически не дают побочных эффектов. Соединения, используемые в настоящем изобретении, очень хорошо переносятся пациентами и могут быть с успехом использованы в целях приготовления композиций для лечения или профилактики.

Поэтому другим объектом согласно изобретению является фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения или профилактики расстройств центральной нервной системы у пациента, нуждающегося в этом, и содержащая эффективное количество по меньшей мере одного 1-ар(алк)илимидазолин-2-она формулы (I):

,

где Х представляет собой водород, С_1-4алкильный, С_1-4алкокси, трифторметильный или галогеновый остаток, R¹ и R², независимо друг от друга, представляют собой С_1-4алкильный, С_3-10циклоалкильный или С_3-10гетероалкильный остаток, либо R¹ и R², взятые вместе, образуют С_2-6алкиленовый остаток, в котором -СН₂-группа необязательно заменена кислородом, азотом или серой, n равно 0 или 1, а m равно 0 или кардинальное число от 1 до 5.

Более предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция содержала 1-(4-хлорфенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-он (ELB139) в качестве активного агента.

Кроме того, фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать подходящие носители, добавки или наполнители, и/или вещества, которые являются необходимыми или предпочтительными для получения препарата в форме, подходящей для ее введения. Фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит активный(е) ингредиент(ы), предпочтительно в количестве 1-100 мг/кг массы тела пациента, и предназначена для введения per os или для парентерального введения (например, внутривенного, внутримышечного или подкожного введения).

Более предпочтительно, указанная композиция, в зависимости от цели ее использования, содержит активный ингредиент в количестве 25-70 мг/кг массы тела или 5-15 мг/кг массы тела, соответственно.

В соответствии с другим аспектом согласно изобретению, целью согласно изобретению является разработка способа лечения или предупреждения расстройств центральной нервной системы, включая психотические расстройства, нарушения двигательных функций и/или психотические симптомы, ассоциированные с другими психическими расстройствами, в частности способа лечения тревожных состояний. Указанный способ предусматривает введение эффективного количества по меньшей мере одного вещества, которое является подтипом селективных агонистов бензодиазепиновых рецепторов, несущих альфа-3-субъединицу, однако оно не является активным, то есть не оказывает значимого позитивного эффекта на действие ГАМК, активирующее рецепторы, несущие альфа-2- и/или альфа-4-субъединицу рецептора ГАМК, независимо от того, связываются ли указанные вещества с этим рецептором или нет.

Можно предположить, что лиганды бензодиазепинового рецептора, которые селективны в отношении альфа-3-субъединицы бензодиазепиновых рецепторов, могут оказаться эффективными для лечения вышеупомянутых заболеваний ЦНС.

В соответствии с настоящим изобретением, термин “селективность” означает, что для выработки 50% от максимального ГАМК-потенцирующего ответа необходимо различие в концентрациях по меньшей мере в 20 раз, т.е. различие в ЕС50 должно составлять по меньшей мере в 20 раз, как описано в примерах согласно изобретению и в разделе “Методы”. Термин “селективность” может также означать, что различие в аффинности связывания должно составлять по меньшей мере в 20 раз (то есть аффинность должна быть выше по меньшей мере в 20 раз, как было определено в соответствии со стандартными экспериментальными процедурами по связыванию), если это связывание преобразуется в функциональное агонистическое действие на рецептор соответствующего подтипа. Особенно предпочтительными являются соединения, которые принадлежат к подтипу соединений, являющихся селективными в отношении рецепторов, несущих альфа-3-субъединицу ГАМК-рецептора. Предпочтительными также являются соединения, которые обладают селективностью в отношении подтипа рецепторов, содержащих альфа-3-субъединицу, но которые вообще не обладают активностью (то есть не обладают значительным позитивным ГАМК-активирующим действием в отношении ГАМК-рецепторов, несущих альфа-2- и альфа-4-субъединицу рецептора, независимо от того, связываются ли они с этим рецептором или нет. Особенно предпочтительными являются соединения, которые обладают вышеупомянутыми свойствами и, кроме того, действуют как частичные агонисты для ГАМК-рецепторов, несущих альфа-3-субъединицу, а также действуют как низкоаффинные агонисты или частичные агонисты (аффинность которых отличается по меньшей мере в 20 раз), при этом особенно предпочтительными являются частичные агонисты, обладающие низкой аффинностью в отношении альфа-1- и/или альфа-5-субъединицы. Соединениями 1-ар(алк)илимидазолин-2-она формулы I, определяемыми выше, являются соединения, обладающие нужной селективностью. Особенно предпочтительным примером соединения, удовлетворяющего указанным критериям селективности, как было определено выше, является 1-(4-хлорфенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-он (ELB139).

Было обнаружено, что ELB139 и другие вещества, входящие в объем согласно изобретению, действуют как агонисты рецептора данного подтипа, которые являются в высокой степени селективными в отношении бензодиазепиновых рецепторов, несущих альфа-3-субъединицу. Природа такого воздействия на эти рецепторы является частично агонистической, что указывает на то, что эти соединения, в частности ELB139, действуют как подтип селективных частичных агонистов рецепторов, несущих альфа-3-субъединицу. Кроме того, указанные соединения, в частности ELB139, являются активными в отношении рецепторов, несущих альфа-1- или альфа-5-субъединицу, но при концентрациях, которые в 20 раз превышают концентрации альфа-3-субъединицы. Кроме того, было обнаружено, что указанное соединение вообще не обладает активностью в отношении рецепторов, содержащих альфа-2-субъединицы. Подобно другим бензодиазепинам ELB139 также не обладает активностью в отношении рецепторов, несущих альфа-4-субъединицу. Таким образом, ELB139 действует как селективное соединение данного подтипа, которое активирует альфа-3-содержащие рецепторы и является более чем в 20 раз менее активным в отношении альфа-1- и 5-содержащих рецепторов, но которое не является селективным в отношении альфа-2- и 4-содержащих рецепторов. В отношении всех рецепторов, обнаруживающих восприимчивость к действию соединения ELB139, это соединение оказывает менее сильное потенцирование ГАМК-индуцируемого тока в отличие от диазепама, который обладает характерной частичной агонистической активностью. В связи с этим вывод о частичной агонистической активности можно сделать в том случае, если максимальное потенцирование ГАМК-индуцированного эффекта снижается при наиболее высокой тестируемой концентрации по сравнению с максимальным эффектом, индуцированным диазепамом, служащим в качестве позитивного эталонного соединения при сверхмаксимальной концентрации от 1 до 10 мкм. Относительное частично агонистическое действие составляет в пределах от 50 до 70%. Соединения согласно изобретению, благодаря своему подтипу селективности, особенно соединение ELB139, которое является селективным в отношении альфа-3-субъединицы, могут быть использованы для оценки роли альфа-3-субъединиц с физиологической и фармакологической точки зрения. Было обнаружено, что ELB139 индуцирует увеличение уровней серотонина в головном мозге крыс, однако механизм этого эффекта остается пока неясным. Для более ясного понимания этого эффекта был проведен анализ для того, чтобы определить является ли этот эффект родственным действию переносчиков серотонина, то есть родственным механизму лекарственных средств, ограничивающих функцию этого переносчика и обеспечивающих повышение уровня серотонина (селективных ингибиторов поглощения серотонина, SSRI), или родственным механизму уже известного селективного взаимодействия с бензодиазепиновым рецептором, содержащим альфа-3-субъединицу. Соединения согласно изобретению, а в частности ELB139, не оказывают влияния на поглощение серотонина в синаптосомном препарате. С другой стороны, влияние ELB139 на уровень внеклеточного серотонина может быть полностью блокировано и даже подвергнуто обратному процессу путем введения специфического блокатора бензодиазепинового рецептора, флумазинила, который блокирует взаимодействие бензодиазепинов со всеми чувствительными бензодиазепиновыми рецепторами, включая рецептор, содержащий альфа-3-субъединицу. Эти данные ясно показали, что благодаря селективности соединения ELB139 в отношении рецепторов данного подтипа его влияние на серотонинергическую систему опосредовано бензодиазепиновым рецептором, содержащим альфа-3-субъединицу. Сообщалось, что диазепам не оказывает влияния на уровни серотонина при его введении в аналогичных экспериментах, что указывает на то, что таким действием может обладать только соединение, селективное к рецептору данного подтипа. Таким образом, исходя из этих данных можно сделать вывод, что альфа-3-субъединица является уникальной и новой мишенью, которая может быть использована для лечения заболеваний, ассоциированных с пониженной функцией серотонинергической системы, или заболеваний, для лечения которых желательно увеличение функции серотонинергической системы, таких как расстройство настроения, включая депрессию и тревожные состояния.

Второй подход заключается в проведении анализа для того, чтобы определить, могут ли поведенческие психофармакологические эффекты ELB139, которые являются нетипичными для бензодиазепинов, подвергнуты обратному действию путем введения флумазенила. Может быть легко установлена связь антидепрессивного действия с повышением уровней серотонина в головном мозге. Все лекарственные средства, повышающие уровень серотонина, включая такие лекарственные средства как флуоксетин, SSRI, обладают антидепрессивным действием. Поскольку повышение уровня серотонина может быть предотвращено введением флумазенила, то антипсихотический эффект был выбран как наиболее подходящий для оценки роли альфа-3-субъединицы в психофармакологическом профиле ELB139. Известно, что бензодиазепины, не обладающие селективностью в отношении альфа-3-субъединицы, не обладают также и антипсихотическим действием. Было обнаружено, что при введении флумазенила в комбинации с ELB139 антипсихотический эффект ELB139 может быть ингибирован. Эти данные показали, что альфа-3-субъединица является идеальной мишенью для лечения не только заболеваний, в патогенезе которых участвует серотонинергическая система, как описано выше, но также и других заболеваний ЦНС, таких как психоз. Кроме того, эти данные показали, что ELB139 и другие вещества, которые являются селективными в отношении рецепторов, содержащих альфа-3-субъединицу, представляют собой сильные анксиолитические, противодистонические и противосудорожные средства. Такой широкий спектр активности контрастирует с селективностью к рецепторам данного подтипа и с обсуждаемой выше взаимосвязью других рецепторов, не являющихся рецепторами подтипа альфа-3, с различными заболеваниями. Так, например, противосудорожная активность ассоциирована, главным образом, с альфа-1-субъединицей, однако соединение ELB139 действует как очень сильный анксиолитик несмотря на свою низкую аффинность в отношении альфа-1-субъединицы. Аналогичным образом альфа-2-субъединица, очевидно, является главной мишенью для анксиолитической активности, а альфа-3-субъединица вносит лишь дополнительный вклад в развитие тревожного состояния. Однако ELB139 вообще не обладает активностью в отношении альфа-2-субъединиц, но при этом является селективным в отношении альфа-3-субъединицы. Эти данные, кроме того, показали, что альфа-3-субъединица и бензодиазепиновый рецептор, содержащий альфа-3-субъединицы, является идеальной мишенью, которая может быть использована для лечения указанных заболеваний, включая тревожные состояния и эпилепсию.

В целом набор данных, то есть данные, относящиеся к эффектам в in vivo-моделях психоза, депрессии, дистонии, эпилепсии и тревожного состояния, а также к воздействию на уровни серотонина, являющиеся показателями для антидепрессивной активности, в комбинации с селективностью к рецептору данного подтипа позволяют предположить, что все лиганды бензодиазепиновых рецепторов, которые являются селективными в отношении альфа-3-субъединицы бензодиазепиновых рецепторов, могут обладать активностью, необходимой для лечения вышеупомянутых заболеваний ЦНС.

Поэтому в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей лиганд бензодиазепинового рецептора, который является селективным в отношении альфа-3-субъединицы бензодиазепиновых рецепторов. Такие вещества с высокой селективностью в отношении альфа-3-субъединицы могут быть легко детектированы с использованием хорошо известных и описанных систем скрининга. Такие системы скрининга могут включать анализы на связывание с рецептором, проводимые в качестве первой стадии, однако в таких анализах на связывание предусматривается использование мембранных фракций, содержащих соответствующие субъединицы ГАМК-рецептора. Такие препараты могут быть получены из клеточных линий, в которых после стабильной и временной трансфекции происходит экспрессия и осуществляется сборка функционального ГАМК-рецепторного комплекса, состоящего из исследуемых альфа-субъединиц, то есть из альфа-1, -2, -3, -4 или -5-субъединиц, в комбинации с одной бета-субъединицей (предпочтительно, бета-2-субъединицей) и одной гамма-субъединицей, а предпочтительно, гамма-2-субъединицей. Другой источник рецепторов подтипа ГАМК-рецептора может быть получен из экспрессионных систем, экспрессирующих рекомбинантные белки, состоящие из различных субъединиц. Такими экспрессионными системами могут быть бактерии, дрожжи или эукариотические клетки. С помощью указанных анализов на связывание могут быть легко идентифицированы соединения с высокой аффинностью в отношении альфа-3-субъединицы и с высокой селективностью в отношении других ГАМК-рецепторов, содержащих альфа-1-, 2-, 4- или 5-субъединицы. Радиоактивным лигандом может быть 3(Н)-флунитразепам или другие описанные радиоактивные лиганды, не обладающие селективностью в отношении отдельных субъединиц ГАМК-рецепторов.

Поскольку лиганды бензодиазепиновых рецепторов могут действовать как агонисты, нейтральные лиганды (антагонисты) и обратные агонисты, то необходимо проводить функциональный анализ для идентификации агонистов, а также частичных агонистов. Такими анализами могут быть анализы на связывание, модифицированные в соответствии с данными о связывании 3(Н)-мусцимола, поскольку агонисты, а также антагонисты и обратные агонисты оказывают влияние на связывающие свойства мусцимола.

Различные функциональные анализы, которые могут быть использованы для идентификации активности бензодиазепиновых лигандов, осуществляют электрофизиологическими методами с использованием в качестве экспрессионных систем либо ооцитов лягушки (Xenopus), либо трансфицированных клеточных линий, таких как клетки СНО, трансфицированные соответствующими альфа-, бета- и гамма-субъединицами, описанными в настоящей заявке. Кроме того, другой функциональный анализ может быть осуществлен с использованием трансфицированных клеточных линий, которые могут быть подвергнуты воздействию ГАМК и тестируемого соединения, а также с использованием величин мембранного потенциала, полученных исходя из взаимодействия с рецептором. Результатом такого постадийного скрининга является выявление соединения, которое является в высокой степени селективным в отношении альфа-3-субъединицы и которое может действовать как полный или частичный агонист в отношении альфа-3-субъединицы.

Такое соединение-лиганд для данного рецептора может также действовать как частичный агонист с аффинностью в отношении альфа-1 и -5-содержащему ГАМК-рецептору, которая в 20 раз ниже аффинности в отношении альфа-3-содержащему ГАМК-рецептору. Указанная фармацевтическая композиция, предпочтительно, содержит 1-ар(алк)илимидазолин-2-он формулы I, описанный выше и обладающий нужной селективностью. Указанная фармацевтическая композиция, предпочтительно, содержит соединение 1-(4-хлорфенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-он (ELB139). Кроме того, возможно, а иногда и предпочтительно, чтобы указанная фармацевтическая композиция содержала другие наполнители или добавки, и такая композиция может быть получена либо для парентерального, либо для перорального введения. Как описано выше, было обнаружено, что доза 1-100 мг/кг массы тела пациента является эффективной дозой активного соединения. Другими предпочтительными дозами, содержащимися в фармацевтической композиции, являются дозы 2-70 мг/кг массы тела или 5-50 мг/кг массы тела для лечения шизофрении и других психотических заболеваний и 1-20 мг/кг или 5-15 мг/кг массы тела для лечения дистонии.

Указанная фармацевтическая композиция может быть использована для лечения расстройств центральной нервной системы, а предпочтительно, для лечения психоза, депрессии, дистонии, эпилепсии и тревожного состояния, более подробно описанных выше.

Было также заявлено, что соединения или композиции, включающие ELB139, обладают селективным позитивным действием на расстройства ЦНС, которые в настоящее время не поддаются лечению с использованием имеющихся лигандов бензодиазепиновых рецепторов, то есть такие расстройства как депрессия, психозы, дистония и родственные заболевания ЦНС, при этом указанное действие конкретно направлено на заболевания, включая депрессию, которые могут быть подвергнуты лечению соединениями, оказывающими воздействие на уровни серотонина в головном мозге. Было также заявлено, что такие соединения являются эффективными при лечении заболеваний, которые в настоящее время не поддаются лечению с использованием имеющихся лигандов бензодиазепиновых рецепторов, но которые обнаруживают лучший профиль побочных эффектов, а именно ослабление амнестического, седативного и гипнотического эффектов, эффекта привыкания, релаксации скелетной мышцы и ЦНС-депрессивного эффекта, вызываемых лигандами бензодиазепиновых рецепторов, и развитие толерантности. Такими заболеваниями являются тревожные состояния, эпилепсия, расстройство сна и другие заболевания, восприимчивые к лечению бензодиазепином.

Настоящее изобретение более подробно проиллюстрировано в нижеследующих примерах и на нижеследующем графическом материале.

Описание графического материала

Фигура 1: Активность, общее проходимое расстояние, стереотипное обнюхивание, другие стереотипии и атаксия, стимулированные введением в/б 0,2 мг/кг МК-801 самкам крыс за 10 минут до проведения теста.

Галоперидол вводили в/б, а ELB139 вводили р.о. за 1 час до проведения теста. * значимый по сравнению с контролем, р<0,05, ** значимый по сравнению с контролем, р<0,01, *** значимый по сравнению с контролем р<0,001, # значимое различие по сравнению друг с другом, р<0,05.

Фигура 2: Противодистоническая активность ELB139.

При более низкой дозе, то есть при 5 мг/кг в/б, еще сохранялась значимая противодистоническая активность.

Фигура 3: Действие ELB139 на высвобождение 5-НТ в полосатом теле крыс. Было введено в/б 30 мг/кг ELB139. Данные выражены в процентах от среднего базального уровня 5-НТ (среднее ср. кв. от.); * = значимый для тилозы, р<0,05.

Фигура 4: Действие ELB139 на высвобождение 5-НТ в полосатом теле крыс. Было введено в/б 30 мг/кг ELB139. Данные выражены в процентах от среднего базального уровня допамина (среднее ср. кв. от.).

Фигура 5: Регистрация всех клеток НЕК 293, экспрессирующих рекомбинантные крысиные αiβ2γ2 (i=1-5) ГАМК_A-рецепторы. Токи нормализовали по концентрациям ГАМК, используемым при отсутствии всех других лекарственных средств. Возрастающие концентрации диазепама (▲), диазепама + 10 мкМ Ro15-1788 (Δ), Е131-139 (■) или Е131-139+10 мкМ Ro15-1788 были внесены вместе с концентрациями ГАМК, составляющими примерно ЕС₂₀. Величина ошибки указывает на стандартную ошибку среднего (± ср. кв. от.) для каждой из 4 клеток.

Фигура 6: Влияние ELB139 (= Е131-139, 10+30 мг/кг) на время, за которое животное оставалось неподвижным, на продолжительность плавания и на время, затрачиваемое животным на карабканье, в тесте на принудительное плавание крыс, по сравнению с контролем, обработанным носителем (*р<0,05, проведение одностороннего ANOVA, а затем метода Хольма-Сидака). Данные представлены как среднее ± ср. кв. от. (n=10).

Фигура 7: Влияние флуоксетина (10+30 мг/кг) на время, за которое животное оставалось неподвижным, на продолжительность плавания, и на время, затрачиваемое животным на карабканье, в тесте на принудительное плавание крыс по сравнению с контролем, обработанным носителем (*р<0,05, проведение одностороннего ANOVA, а затем метода Хольма-Сидака). Данные представлены как среднее ± ср. кв. от. (n=10).

Фигура 8: Влияние галоперидола на МК-801-индуцированное и ассоциированное с психозом поведение самок крыс.

Было проведено два отдельных испытания. Галоперидол (Н) вводили отдельно в/б в количестве 0,5 мг/кг за 60 минут до проведения теста и за 30 минут до проведения теста в комбинации с флумазенилом (F). Флумазенил вводили в/б в концентрации 5 мг/кг за 20 минут до проведения теста. МК-801 вводили в/б в концентрации 0,1 мг/кг за 10 минут до проведения теста. Данные представлены как среднее ± ср. кв. от. Значимость в отношении контроля (С): *р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001.

Фигура 9: Влияние ELB139 на МК-801-индуцированное и ассоциированное с психозом поведение самок крыс и его обратимость под действием флумазенила.

ELB139 вводили р.о. в концентрации 30 мг/кг за 1 час до проведения теста. Флумазенил вводили в/б в концентрации 5 мг/кг за 20 минут до проведения теста. МК-801 вводили в/б в концентрации 0,1 мг/кг за 10 минут до проведения теста. Воздействие на МК-801-индуцированное стереотипное обнюхивание и на другие МК-801-индуцированные стереотипии и атаксию выражали как среднее ± ср. кв. от. Значимость в отношении контроля: *р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001; значимость в отношении группы ELB139: # р<0,05.

Фигура 10а: Влияние ELB139 на МК-801-индуцированное и ассоциированное с психозом поведение самок крыс и его обратимость под действием флумазенила.

ELB139 вводили р.о. в концентрации 30 мг/кг за 1 час до проведения теста. Флумазенил вводили в/б в концентрации 5 мг/кг за 20 минут до проведения теста. МК-801 вводили в/б в концентрации 0,1 мг/кг за 10 минут до проведения теста. Влияние на МК-801-индуцированную активность и проходимое расстояние выражали как среднее ± ср. кв. от. Значимость в отношении контроля: *р<0,05; значимость в отношении группе ELB139: # р<0,05.

Фигура 10b: Влияние ELB139 на МК-801-индуцированное и ассоциированное с психозом поведение самок крыс и его обратимость под действием флумазенила.

ELB139 вводили р.о. в концентрации 30 мг/кг за 1 час до проведения теста. Флумазенил вводили в/б в концентрации 5 мг/кг за 20 минут до проведения теста. МК-801 вводили в/б в концентрации 0,1 мг/кг за 10 минут до проведения теста. Влияние на МК-801-индуцированную активность и на расстояние, проходимое через 5-минутные интервалы, выражали как среднее ± ср. кв. от. Значимость в отношении контроля: *р<0,05; значимость в отношении группе ELB139: # р<0,05.

Примеры

1. Лечение психотических расстройств

1.1. Животные

В этом эксперименте использовали самок крыс Wistar (Crl: (WI) BR, Charles River, Sulzfeld, Germany) весом 150-180 г. Этих крыс разделяли на группы по 5 животных и помещали в клетки в стандартные условия при суточном цикле 12 ч - день/12 ч - ночь (свет включали в 6.00) и обеспечивали свободный доступ к корму (Pellets, ssniff М/К 15, Spezialdiat GmbH, Soest/Westfalen) и к воде.

1.2. Химические вещества

ELB139 (1-(4-хлорфенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-он, MW 277,75) был изготовлен ELBion AG. Галоперидол (4-(4-[4-хлорфенил]-4-гидрокси-1-пиперидинил)-1-(4-фторфенил)-1-бутанон, MW 375,9) получали от RatioPharm GmbH, Ulm, Germany, МК-801 (дизоклипин, МИ 337,37), получали от Tocris, фирмы-распространителя Biotrend Chemikalien GmbH, Koln, Cermany. Все другие используемые химические вещества получали от фирмы Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany или от Merck, Germany.

1.3. Протокол введения лекарственного средства/доза

Объем введения: 0,5 мл/100 г

Вещество	Число животных [n]	Доза [мг/кг]	Предварительная обработка [мин]	Число введений [n]	Способ введения
МК-801	17	0,2	10	1	в/б
ELB139	6	30,60	60	1	р.о.
галоперидол	10	0,5	60	1	в/б

1.4. Получение соединений

ELB139 в свежем виде суспендировали в 0,5% гидроксиэтилцеллюлозе так, чтобы для каждого вещества и дозы объем введения составлял 0,5 мл/100 г. Раствор галоперидола для инъекций разбавляли физиологическим раствором так, чтобы объем введения составлял 0,5 мл/100 г. До и во время проведения процедур приготовления доз суспензии помещали в сосуд с магнитной мешалкой. Гидроксиэтилцеллюлозу растворяли в дистиллированной воде.

1.5. Экспериментальная процедура

Поведенческие эффекты, индуцированный антагонистом NMDA MK-801, в общих чертах могут рассматриваться как крысиная модель психоза. МК-801, после его внутрибрюшинного введения, индуцирует стереотипии, гиперактивность и атаксию у крыс.

Двигательная активность у крыс была зарегистрирована с помощью устройства MotiTest Apparatus (TSE, Bad Homburg, Germany). Тестируемая площадь состояла из квадратной площадки (45×45 см) с защитными стенками из плексигласа (высотой - 20 см), по которой крысы могли свободно передвигаться. Горизонтальные движения регистрировались 32 инфракрасными фотоэлементами, расположенными вдоль нижней части каждой стенки площадки. Вертикальные движения (вертикальную стойку) регистрировали с помощью 32 инфракрасных фотоэлементов, расположенных горизонтально в ряд на высоте 12 см от пола. Нижеследующие параметры, такие как время активности [с] и общее проходимое расстояние [м], измеряли с помощью компьютерной программы “ActiMot” (TSE, Bad Homburg, Germany).

Стереотипии, подразделяемые на стереотипное обнюхивание и другие стереотипии, а также атаксия оценивалась экспериментатором через каждые пять минут в течение одного часа (с 12-ю перерывами) методом, описанным Andine et al. (1999). Для каждого параметра добавляли значения, полученные с 12-тью перерывами.

Оценка	Стереотипное обнюхивание	Другие стереотипии	Атаксия
0	отсутствие стереотипного обнюхивания	Отсутствие стереотипий	Нормальная регуляция организма
1	Обнюхивание с перерывами (пауза >5 с)	Стереотипии с перерывами (паузы >5 с)	Тенденция к двигательной активности
2	Постоянное обнюхивание	Постоянные стереотипии	Спад двигательной активности
3	-	-	Почти полное отсутствие способности двигаться

В день проведения эксперимента самок крыс переносили в лабораторию и этим крысам перед тестированием через соответствующие промежутки времени вводили тестируемое соединение, эталонное соединение или носитель. За 10 минут до тестирования крысам внутрибрюшинно вводили 0,2 мг/кг МК-801.

В начале проведения теста крыс помещали в центр квадратной площадки аппарата MotiTest. Поведение крыс регистрировали в течение одного часа. После каждого проведения эксперимента животных удаляли и боксы тщательно очищали и сушили.

1.6. Статистика

Данные анализировали путем проведения одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Для отдельного сравнения использовали критерий Тьюки. Величина Р<0,05 рассматривалась как статистически значимая.

1.7. Результаты

Результаты этого теста представлены на фигуре 1. Введение галоперидола приводило к значительному ослаблению всех симптомов, индуцированных МК-801 [р<0,001], как описано Andine et al. (1999).

Пероральное (р.о.) введение 30 мг/кг ELB139 приводило к значимому подавлению стереотипного обнюхивания, других стереотипий и атаксии, индуцированных МК-801, и к явному снижению общего проходимого расстояния, увеличение которого было индуцировано МК-801. При этой дозе не наблюдалось снижения МК-801-стимулированной активности.

Пероральное введение ELB139 в дозе 60 мг/кг приводило к значимому уменьшению всех параметров, индуцированных МК-801.

Стереотипное обнюхивание подавлялось в зависимости от дозы [р<0,05].

2. Лечение дистонии

2.1. Животные

В этом эксперименте использовали самцов и самок dt^sz-мутантных сирийских золотистых хомячков, которые были выращены путем селективного скрещивания, как было подробно описано ранее (Fredow & Loscher, 1991). Этих хомячков разделяли на группы по 3-5 животных в каждой и помещали в клетки в стандартные условия при суточном цикле 12 ч - день/12 ч - ночь (свет включали в 6.00) и обеспечивали свободный доступ к корму (стандартный корм Altromin 1320, Altromin, Lage, Germany) и к воде.

2.2. Химические вещества

ELB139 (1-(4-хлорфенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-он, MW 277,75) был изготовлен ELBion AG. Все другие используемые химические вещества получали от Sigma-Aldrich Chemie CmbH, Germany или от Merck, Germany.

2.3. Протокол введения лекарственного средства/доза

Объем введения: 0,2 мл/20 г

Вещество	Число животных [n]	Доза [мг/кг]	Время наблюдения после введения [мин]	Число введений [n]	Способ введения
ELB139	8	5	180	1	в/б
ELB139	8	10	180	1	i.p

2.4. Получение соединений

ELB139 в свежем виде суспендировали в 0,5% гидроксиэтилцеллюлозе так, чтобы для каждого вещества и дозы объем введения составлял 0,2 мл/20 г. До и во время проведения процедур приготовления доз суспензии помещали в сосуд с магнитной мешалкой. Гидроксиэтилцеллюлозу разбавляли в дистиллированной воде.

2.5. Экспериментальная процедура

Тестирование лекарственного средства проводили при максимальной чувствительности хомячков к индуцированию у них дистонической атаки, т.е. у хомячков в возрасте 30 и 40 дней. Дистонические атаки индуцировали методом тройной стимуляции: хомячков вынимали из их жилых клеток и взвешивали (для определения массы тела), а затем им инъецировали в/б физиологический раствор (контроль) или лекарственное средство и сразу помещали по отдельности в новые и пустые пластиковые клетки. Дистонические атаки начинались через несколько минут после помещения хомячков в новые пластиковые клетки. Животных в этой клетке наблюдали в течение 3 часов, и характер дистонических движений оценивали в течение периода времени 0-1 часа, 1-2 часов и 2-3 часов, как описано ниже; причем во всех случаях регистрировали максимальный уровень, достигаемый в данный период наблюдения:

Стадия 1: прижатые уши и припадание к полу во время движения.

Стадия 2: лицевые искажения, подъем на задние лапы со скрещенными передними лапами, нарушение походки с замедленным выбрасыванием передних лап.

Стадия 3: ригидность задних конечностей, в результате чего животное движется как бы “на цыпочках” быстрой походкой с нарушенной координацией.

Стадия 4: потеря равновесия.

Стадия 5: задние конечности чрезмерно и каудально вытянуты, при этом животное продолжает двигаться на функционирующих передних конечностях.

Стадия 6: животные неподвижны и находятся в скрюченной, сгорбленной позе, где как задние, так и передние конечности явно вытянуты вперед, хвост выпрямлен (как бы стоит “торчком”), при этом наблюдается поочередное одностороннее поднимание передних конечностей, качание головой и опистотонус (тетанический спазм).

Конечная стадия продолжалась от двух до пяти часов, а затем наступало быстрое восстановление. У всех мутантных хомячков не наблюдалось прогрессирования нарушений за весь описываемый период наблюдений; при этом индивидуальная максимальная стадия обычно достигалась через 45-170 минут.

2.6. Статистика

Результаты анализировали с помощью критерия Фридмана, а затем критерия Уилкоксона. Значение Р<0,05 рассматривалось как значимое.

2.7. Результаты

Первую группу животных (n=8) в возрасте 32-33 дней тестировали на присутствие и тяжесть дистонических атак после введения носителя (в/б), а также после проведения процедуры тройной стимуляции, описанной выше. Через два или три дня тем же самым животным в/б вводили ELB139, и этих животных снова исследовали в течение трех часов, а через 2-3 дня этих животных повторно исследовали после введения носителя, который служил пост-дозовым контролем. Результаты этого теста представлены на фигуре 2. На этом графике представлены три диаграммы, каждая по три столбика. Первый столбик соответствует первому часу наблюдения, начиная с введения лекарственного средства, второй столбик диаграммы соответствует второму часу наблюдения, а третий столбик соответствует третьему часу наблюдения.

В каждой диаграмме представлены 3 столбика. Первый (незаштрихованный) столбик представляет контрольный ответ у животных, регистрируемый за 2-3 дня до проведения тестирования лекарственного средства, черный столбик представляет результаты, полученные после введения лекарственного средства, а третий (серый) столбик представляет пост-дозовый контроль, тестируемый через 2-3 дня после введения лекарственного средства. Пре- и пост-тест проводили для того, чтобы исключить вариант, где ослабление тяжести заболеваний вызвано лишь возрастным снижением чувствительности к индуцированию дистонических атак.

В настоящем эксперименте было показано, что ELB139 обладает сильным антидистоническим эффектом. При тестируемой дозе, т.е. при введении 10 мг/кг в/б, указанное соединение хорошо переносилось животным и не вызывало седативного эффекта. За весь период наблюдения тяжесть дистонической атаки значительно снижалась, что указывало на продолжительное действие указанного соединения. Остаточные симптомы, т.е. в среднем стадия 2,3-2,4, представляют собой стадии, которые достигались через несколько минут после начала эксперимента, то есть во время, когда в плазме не обнаруживалось каких-либо уровней соединения ELB139 либо оно присутствовало в минимальном количестве.

3. Анксиолитическая и антидепрессивная активность

Для дополнительной характеризации ELB139 это соединение исследовали с помощью микродиализа. В полосатом теле определяли внеклеточную концентрацию двух нейромедиаторов, серотонина (5НТ) и допамина и их метаболитов.

3.1. Животные

В этом эксперименте использовали самцов крыс Wistar (Crl: (WI) BR, Charles River, Sulzfeld, Germany) весом 200-260 г. Этих крыс разделяли на группы по 5 животных и помещали в клетки в стандартные условия при суточном цикле 12 ч - день/12 ч - ночь (свет включали в 6.00) и обеспечивали свободный доступ к корму (Pellets, ssniff М/R 15, Spezialdiat GmbH, Soest/Westfalen) и к воде.

3.2. Химические вещества

ELB139 (1-(4-хлорфенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-он, MW 277,75) было изготовлено ELBion AG. Все другие используемые химические вещества получали от фирмы Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany или от Merck, Germany.

3.3. Протокол введения лекарственного средства/доза

Способ введения: в/б

Объем введения: 0,5 мл/100 г

Вещество	Доза [мг/кг]	Время предварительной обработки [мин]	Число введений [n]
ELB139	30	0	1

3.4. Получение соединений, суспендированных в 0,5% гидроксиэтилцеллюлозе, содержащей 10% полиэтиленгликоль 300 (ПЭГ300)

ELB139 в свежем виде суспендировали в 0,5% гидроксиэтилцеллюлозе так, чтобы для каждой дозы объем введения составлял 0,5 мл/100 г. До и во время проведения процедур приготовления доз суспензии помещали в сосуд с магнитной мешалкой. Гидроксиэтилцеллюлозу разбавляли в дистиллированной воде.

3.5. Экспериментальная процедура

Хирургическая операция

За день до начала эксперимента крыс-самцов анестезировали хлоралгидратом (3,6%, 1 мл/100 г, в/б) и помещали в камеру для стереотаксиса в целях имплантации управляемой канюли для микродиализа (СМА/12, Carnegie Medicine, Sweden). Скальп вскрывали путем срединного переднезаднего разреза между лямбда-участком и брегмой, и в черепе просверливали небольшую дырочку. Стереотаксические координаты имели следующие значения: АР=+1,0 мм, L=-3,0 мм от брегмы и 1,5 мм от поверхности черепа в области полосатого тела в соответствии с атласом Паксиноса и Уотсона (1986)(1). Управляемую канюлю фиксировали с помощью зубного цемента (Sinfony(2)) и прикручивали к черепу фиксирующими винтами. Во время проведения хирургической процедуры температуру прямой кишки поддерживали при 37°С с помощью нагревательного элемента.

Микродиализ

За день до начала эксперимента зонд для микродиализа (СМА/12, мембрану длиной 4 мм, Carnegie Medicin, Sweden) вводили в полосатое тело через управляемую канюлю. На день эксперимента через этот зонд вливали раствор Рингера (148 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 2,4 мМ CaCl₂, рН 6,0). Через каждые 20 минут из потока (со скоростью 1 мкл/мин) брали 20 мкл-образцы и собирали в микрососуды. Микрососуды хранили в сборнике для фракций (СМА/170) при температуре 8°С до проведения анализа. Благодаря использованию шарнирного сустава перфузионное устройство позволяло животному свободно передвигаться в полусферической камере. По истечении примерно одного часа через каждые 20 минут брали 3 фракции для определения стабильного базального уровня высвобождения нейромедиатора. После этого вводили 30 мг/кг ELB139 или эквивалентный объем 0,5% тилозы/ПЭГ300, 9:1, соответственно. Затем сбор образцов продолжали в течение по меньшей мере 220 минут.

Анализ диализатов

Диализаты непосредственно анализировали с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ-ЭД). Образцы разделяли на колонке ZORBAX SB-Aq с внутренним диаметром 2,1 мм × 100 мм (Agilent Technologies). К 20-минутной фракции добавляли 1 мкл 1% перхлорной кислоты и в эту ВЭЖХ-систему инжектировали 10 мкл полученной смеси. Подвижная фаза содержала:

КН2PO4	50 мМ
Натриевая соль октан-1-сульфоновой кислоты (NOS)	2,2 мМ
EDTA	0,086 мМ
2МН3PO4	5 мл
Метанол (МеОН)	83 мл
Ацетонитрил	10 мл
при рН	3,5

Указанный способ (с использованием серотонина) проводили при скорости потока 0,23 мл/мин, при температуре колонки 38°С и при температуре образца 8°С, поддерживаемой с помощью термостата. В течение ночи скорость потока снижали до 0,1 мл/мин. Катехоламины окисляли при 500 мВ (в ячейке для микродиализа, модель 5014 В, ESA). Измерения проводили при концентрациях:

Dopac - 200 нА, допамин - 2 нА, HIAA - 100 нА, HVA - 2 нА и серотонин - 500 пА.

Для калибровки регулярно проводили оценку с использованием системы внешних стандартов, каждый при 5 концентрациях:

DOPAC (3,4-дигидрофенилуксусная кислота)	1000, 500, 250, 125, 62,5 нМ
Допамин (гидрохлорид 3-гидрокситирамина)	8, 4, 2, 1, 0,5 нМ
HIAA (5-гидрокси-3-индолуксусная кислота)	200, 100, 50, 25, 12,5 нМ
HVA (гомованилиновая кислота)	800, 400, 200, 100, 50 нМ
Серотонин (сульфат 5-гидрокситриптаминакреатинина)	0,15, 0,075, 0,0375, 0,01875, 0,009375 нМ

Перед имплантацией и после удаления зонда для микродиализа проводили курс восстановления с использованием раствора, содержащего 2000 нМ DOPAC, 40 нМ допамина, 1000 нМ HIAA, 2000 нМ HVA и 0,8 нМ серотонина. Скорость восстановления после удаления зондов составляла в пределах 5-20%.

Гистология

После завершения эксперимента головной мозг крыс удаляли и фиксировали в формалине (10%) в течение примерно 10 дней. Затем головной мозг разрезали с помощью виброшлифа (TSE) и окрашивали толуидиновым синим для подтверждения того, что указанные зонды находятся в нужном положении.

Статистика

Различные индивидуумы обнаруживали различные базальные уровни высвобождения 5-НТ. Данные для каждого животного выражали в процентах. Перед введением указанных веществ данные, полученные для диализатов, усредняли, и среднее значение принимали за 100%, при этом, соответственно, вычисляли все величины по отдельности.

Результаты анализировали с помощью двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием двух факторов, таких как время и лекарственное средство. Для индивидуального сравнения использовали критерий Тьюки. Величину Р<0,05 рассматривали как значимую.

3.6. Результаты

Введение в/б ELB139 в количестве 30 мг/кг приводило к значительному и неожиданному увеличению концентрации 5-НТ в полосатом теле крыс в течение 1 часа 40 минут (фигура 3), независимо от концентрации Н1АА, метаболита 5-НАТ (данные не приводятся). Но такое увеличение также не влияло на одновременно измеряемую концентрацию допамина в полосатом теле крыс (фигура 4). Изменение уровней 5-НТ служило показателем анксиолитического и антидепрессивного эффекта.

Механизм такого увеличения пока не ясен. Этот механизм не может быть объяснен ни бензодиазепин-подобной активностью указанного соединения, поскольку бензодиазепины, такие как диазепам, не повышают, а скорее снижают высвобождение 5-НТ в головном мозге (Pei et al., 1989), ни нейтрализацией эффекта SSRI. Кроме того, увеличение уровней 5-НТ в полосатом теле не является главным и типичным механизмом антиэпилептических лекарственных средств, поскольку действие антиэпилептиков на высвобождение 5-НТ в головном мозге варьируется в зависимости от противосудорожных средств. Карбамазепин также способствует увеличению базального уровня высвобождения 5-НТ, вероятно, путем воздействия на Са²⁺-каналы N-типа (Kawata et al., 2001). Валпроат также повышает уровень внеклеточного 5-НТ (Murakami et al., 2001), а фенитоин и габапентин снижают его уровень (Okada et al., 1997; Taylor et al., 1998).

Влияние ELB139 на концентрацию внеклеточного 5-НТ может быть сравнимо с влиянием флуоксетина и других селективных ингибиторов поглощения серотонина (SSRI) (Li et al., 1996). Таким образом, ELB139 открывает новые перспективы для лечения расстройств центральной нервной системы, поскольку соединение этого класса может быть объединено с лекарственными средствами с длительной, но поздно проявляющейся активностью, что может приводить к увеличению концентрации внеклеточного 5-НТ в головном мозге, а также с бензодиазепинами, обладающими прямой и быстро проявляющейся анксиолитической активностью, которая является хорошо известным свойством соединений класса 1-ар(алк)ил-имидазолин-2-онов. В целом, преимущественный профиль агониста бензодиазепина и профиль SSRI, не приводящие к какому-либо риску ослабления влияния на уровень серотонина благодаря бензодиазепин-опосредуемому действию соединения ELB139, дает исключительные и новые возможности для лечения хронических тревожных состояний, панической атаки, агорафобии, специфических фобий, социальных фобий, генерализованного тревожного расстройства, депрессивных расстройств, таких как основное депрессивное расстройство и его эпизоды, эпизоды маниакального, смешанного и гипоманиакального расстройства настроения, эпизоды депрессий с атипическими, кататоническими признаками или с признаками меланхолии, эпизоды депрессии после деторождения, внезапное предменструальное дисфорическое расстройство, легкое депрессивное расстройство, посттравматическое расстройство и расстройство, вызванное сильным стрессом.

Пример 4

В качестве предпочтительного примера частичного агониста, селективного в отношении данного подтипа рецептора, является соединение ELB139 с селективным и частичным агонистическим действием.

Лиганд-зависимые ионные каналы, открываемые γ-аминомасляной кислотой (ГАМК_А-рецепторы), представляют собой пентамеры, собранные из двух-трех различных субъединиц из набора, состоящего из шести α, трех β, трех γ, одной δ, одной ε, одной π и θ-субъединиц (см., Hevers et al., 1998). По всей вероятности, ГАМК_А-рецепторы обладают структурной гетерогенностью, которая лежит в основе их функционального разнообразия. Большинство бензодиазепинов (BZ), распознающих ГАМК_А-рецепторы, модулирует Cl^--поток посредством этих рецепторных каналов, что оказывает влияние на синаптическую передачу в ЦНС. Так, например, диазепам BZ с седативным и гипнотическим действием, используемый в настоящем исследовании в качестве стандартного соединения, оказывает различное действие на функцию ЦНС, что приводит к формированию спектра клинического действия от седативного эффекта, при низких дозах, до индуцирования анестезирующего эффекта при значительно более высоких дозах. Таким образом, было предпринято множество попыток повысить специфичность таких лекарственных средств как BZ в отношении ГАМК_Аергических рецепторов для ослабления их воздействия на такие системы нейронов, которые не участвуют в терапевтических эффектах.

Состав субъединицы ГАМК_А-рецептора определяет как аффинность, так и эффективность эндогенного лиганда, а также лекарственных средств, таких как BZ. Изменения в α-субъединицах оказывают значительное влияние на аффинность и эффективность отдельных классов лигандов BZ, тогда как другие классы не обнаруживают никаких изменений (Pritchett et al., 1989, Wisden et al., 1991). Так, например, ранее было показано, что диазепам, подобно большинству таких соединений, кроме 1,4-BZ, не обнаруживает дифференцируемого связывания с рецептором подтипа, имеющего общую формулу αiβjγ2 (i=1-3, 5; j=1-3)(Luddens, 1995, Benavides, 1992, Pritchett, 1990).

Настоящие эксперименты проводили для более точной оценки активности и эффективности предполагаемого лиганда ELB139 для BZ-рецептора в присутствии или в отсутствии BZ-антагониста флумазенила (Ro15-1788) в отношении ГАМК_А-рецепторов, экспрессируемых в гетерологичной системе клеток почек эмбриона человека (НЕК 293). Выбранный рецептор подтипа αiβjγ2 (i=1-5), вероятно, составляет основную часть нативных ГАМК_А/BZ-рецепторов. Новое соединение сравнивали с диазепамом в отношении их эффективности, активности и специфичности к α-субъединице нового соединения.

4.1. Экспериментальная часть

Материалы

Все соединения, за исключением ELB139 (Е131-00139), были коммерчески доступными и имели аналитическую чистоту.

4.2. Культивирование и трансфекция клеток

Для электрофизиологического анализа клетки НЕК-293 пассировали и пересевали на покровные 12 мм-стекла, находящиеся в пластиковых 9,6 см-чашках, наполненных 10 мл минимальной поддерживающей среды (МЕМ, Gibco), в которую были добавлены 158 мг/л бикарбоната натрия, 2 мМ глутамина (Gibco), 10 ед/мл пенициллина-стрептомицина (Gibco) и 10%-ная фетальная телячья сыворотка (Gibco). Культуры поддерживали в течение 2-3 дней при 37°С в атмосфере с повышенной влажностью, содержащей 95% О₂ и 5% СО₂.

Трансфекцию рекомбинантными крысиными ГАМК_А-рецепторами проводили способом, подробно описанным в литературе (Korpi & Luddens, 1993, Luddens & Korpi, 1995b). Клетки HEK 293 трансфицировали крысиными кДНК ГАМК_А-рецептора, присутствующими в эукариотических экспрессирующих векторах (Pritchett, 1990), где указанный рецептор содержал α-, β- и γ-субъединицы, и где указанную трансфекцию осуществляли в тройных комбинациях фосфатным методом преципитации. Для оптимальной экспрессии рецептора использовали следующие конечные концентрации (мкг векторной ДНК на 9,6 см-планшет для культивирования тканей): α1, 2; α2 4,8; α3, 1,2; α4, 10; α5 0,8; β2, 0,4 и γ2S, 0,3. Далее, в описании согласно изобретению, вариант γ2S будет сокращенно обозначаться γ2. Для идентификации трансфицированных клеток все комбинации субъединиц ко-трансфицировали 1 мкг pNI-EGFP на планшет.

4.3. Электрофизиология

Через два дня после трансфекции одиночные покровные стекла, содержащие клетки HEK 293, помещали в камеру для анализа, смонтированную на передвижном столике для флуоресцентного микроскопа (Olympus IX70), и на эти стекла выливали определенное количество физиологического раствора, содержащего 130 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 2 мМ CaCl₂, 2 мМ MgSO₄, 10 мМ глюкозы, 5 мМ сахарозы и 10 мМ HEPES (свободная кислота) при рН, доведенном до 7,35 путем добавления примерно 35 мМ NaOH. Трансфицированные клетки идентифицировали по их флуоресценции в зеленом диапазоне спектра, индуцированной экспрессией вектора pNI-EGFP, и лиганд-опосредуемые мембранные токи в этих клетках исследовали методом “пэтч-клэмп” в конфигурации “целая клетка” (Hamil et al., 1981). Пипетки, используемые в методе “пэтч-клэмп”, выдували из твердого боросиликатного капиллярного стекла (внутренний диаметр = 0,5 мм, внешний диаметр = 1,5 мм, Vitrex, Science Products GmbH, Hofheim, Germany) многостадийным способом с помощью устройства для горизонтальной вытяжки (Sutter Instruments, CA, Model P-97). Эти пипетки имели начальное сопротивление 2-4 МΩ при заполнении раствором, содержащим 90 мМ KCl, 50 мМ КОН, 2 мМ CaCl₂, 2 мМ MgCl₂, 10 мМ EGTA, 3,1 мМ АТР (дикалиевая соль), 0,4 мМ GTP (тринатриевая соль) и 10 мМ HEPES (свободная кислота) при рН 7,35.

Контактный потенциал между пипеткой и внешним раствором составлял менее чем 2,3 мВ, а поэтому им можно пренебречь. Сопротивление в месте контакта, составляющее >1 ГΩ, было измерено рутинным способом путем легкого всасывания в пипетку. Был также проведен электрический мониторинг разрушения мембраны по увеличению емкости. Электрическая емкость пипетки и мембраны и последовательное сопротивление цепи подвергали электронной компенсации до минимизации емкостных переходных процессов. Компенсация последовательного сопротивления обычно составляла >60%.

С использованием быстрой постадийной перфузионной системы (SF-77B, Perfusion Fast Step, Warner Instruments, Inc., Midwest, USA) тестировали растворы, содержащие приблизительные концентрации ЕС₂₀ специфического рецептора ГАМК-подтипа, EC₂₀ ГАМК, плюс возрастающие концентрации диазепама (в мкМ): 0,01; 0,1; 1; 10; и EC₂₀ ГАМК плюс возрастающие концентрации ELB139 (в мкМ): 0,01; 0,03 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30. В случае диазепама и ELB139 тестировали экспериментальный набор всех концентраций с добавлением 10 мкМ Ro15-1788. Перед проведением анализа экспериментальных лекарственных средств все клетки, в которых было зарегистрировано присутствие γ2-субъединицы в гетеропентамере, подвергали мониторингу с использованием 1 мМ золпидема плюс EC₂₀ ГАМК.

Ответы клеток регистрировали с помощью пэтч-кламп-усилителя (ЕРС-8, HEKA-Electronic, Lambrecht, Germany), подсоединеного к стандартному персональному компьютеру с инсталлированным пакетом программ pClamp 8.1 (Axon Instruments, Foster City, CA). Стандартный потенциал задержки для этих клеток составлял ~40 мВ. Токи от всех клеток были отфильтрованы на восьмиполюсном фильтре нижних частот Bessel при 5 или 3 кГц, а затем их оцифровывали с помощью интерфейса Digidata 1322A (Axon Instruments, Foster City, CA) и регистрировали на компьютере при частоте отбора образцов, составляющей, по меньшей мере, 1 кГц.

4.4. Результаты и обсуждение

Новое соединение ELB139 тестировали на эффективность, активность и специфичность в отношении α-субъединицы ГАМК_А-рецептора методом “пэтч-кламп” в конфигурации “целая клетка” путем введения в клетки, флуоресцирующие в зеленом диапазоне спектра, возрастающей концентрации лекарственного средства вместе с ГАМК примерно при ЕС₂₀. Специфичность нового соединения в отношении сайта связывания с BZ тестировали на тех же самых клетках в идентичных условиях проведения эксперимента, но с дополнительным введением 10 мкМ Ro15-1788.

В α1, α3 и α5-содержащих рецепторах, ко-экспрессированных вместе с β2- и γ2-субъединицами, ELB139 усиливает ГАМК_А-индуцированные токи, но является менее активным и менее эффективным, чем диазепам (таблица 1). 10 мкМ Ro15-1788 полностью отменяло действие ELB139 при всех трех комбинациях ГАМК_А-рецепторов. В α1-содержащих рецепторах позитивная модуляция тока под действием соединения ELB139 при 30 мкМ наблюдалась при 0,3 мкМ и достигала своей максимальной величины потенцирования, а именно в 1,6±0,08 раз (фиг.5А), которая составляла половину от максимального эффекта диазепама (2,1±0,9 при 1 мкм диазепама). В α5β2γ2-рецепторах позитивная модуляция тока под действием соединения ELB139 первоначально наблюдалась при 1 мкМ и достигала своего максимума при 30 мкМ, а именно 1,4±0,06, то есть эффективность и активность соединения ELB139 были значительно ниже, чем у диазепама, который усиливал ток при дозе 10 нМ и достигал своего максимального агонистического эффекта в усилении тока до величины в 2±0,05 раз, при 1 мкМ (фиг.5Е). Новое соединение ELB139 позитивно модулировало ГАМК-индуцированные токи в α3-содержащих рецепторах при концентрациях выше 30 нМ, при этом значения, соответствующие самой высокой эффективности, составляли 1,3±0,07 при концентрациях выше 0,3 мкМ. В противоположность этому, для диазепама позитивная модуляция тока наблюдалась при концентрациях ниже 10 нм, а максимальная стимуляция достигала значения 1,8±0,11 при 1 мкМ.

По сравнению с прототипом диазепама BZ, соединение ELB139 продемонстрировало специфичность к α-субъединице на α2-содержащих рецепторах. На этом ГАМК_А-рецепторе диазепам обнаруживал высокую эффективность и активность в отношении позитивной модуляции тока, измеренной сначала при концентрациях ниже 0,1 мкМ, и максимальную агонистическую активность при 1 мкМ с потенцированием в 1,8 раз (фиг.5В, таблица 1). В противоположность этому, ELB139 не приводило к агонистической или обратно-агонистической модуляции ГАМК-индуцированных токов в рекомбинантных α2β2γ2-содержащих ГАМК_А-рецепторах.

Для α4-содержащих рецепторов диазепам не давал какой-либо значимой модуляции ГАМК-индуцированных токов при концентрациях до 1 мкМ (фиг.5D). Аналогичным образом, Cl^--ток не изменялся под действием ELB139 при всех тестируемых концентрациях.

Активности ELB139 в отношении α1β2γ2- и α5β2γ2-рецепторов были аналогичными, то есть в обоих случаях, значимые агонистические эффекты наблюдались при концентрации примерно 1 мкМ ELB139, а эффективность этого лекарственного средства в отношении α1-содержащих рецепторов была немного выше, чем в отношении α5β2γ2-рецепторов (в 1,6 раза для α1-рецептора и в 1,4 раза для α5β2γ2-рецепторов, см. таблицу 1). Интересно отметить, что соединение ELB139 обнаруживало самую высокую активность в отношении α3β2γ2-рецепторов, причем его потенцирующее действие наблюдалось уже при концентрациях выше 30 нМ, но при этом оно обнаруживало самую низкую эффективность с усилением тока на этих рецепторах лишь в 1,3 раза.

4.5. Выводы

В заключение следует отметить, что новое лекарственное средство ELB139 позитивно модулирует ГАМК-индуцированные токи на α1-, α3- и α5β2γ2-рецепторах ГАМК_А посредством BZ-связывающего сайта с более низкой активностью и эффективностью по сравнению с диазепамом. Однако ELB139 обладает примерно в 50 раз большей селективностью в отношении α3-содержащих рецепторов ГАМК_А, чем в отношении α1 и α5. Кроме того, в отличие от диазепама, ELB139 не обнаруживало агонистического действия на α2-содержащие рецепторы. Эти результаты показали, что в основе различия в селективности соединения ELB139 и диазепама ко многим рецепторам ГАМК_А-подтипа может лежать различие в их in vivo активностях.

Пример 5

Антидепрессантная активность ELB139 in vivo как пример селективной частичной агонистической активности соединения, специфичного рецептора альфа 3-подтипа у грызунов с моделью депрессии

Эффект ELB139 оценивали в тесте на принудительное плаванье крыс (FST). Депрессивные расстройства, включая тяжелую депрессию, являются серьезными расстройствами и приводят к потере трудоспособности. Селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (SSRI) являются достаточно безопасными и обладают толерантностью к лечению антидепрессантами. Однако побочные эффекты, которые возникают, главным образом, во время начальной стадии лечения, часто приводят к нарушению режима приема лекарственных средств. Антидепрессантная эффективность SSRI, а в частности, у пациентов с тяжелой депрессией, не превышает эффективность трициклических антидепрессантов (примерно у 30% пациентов не наблюдается улучшения)(Anderson and Thomenson, 1994; Blier, 2001 Anderson and Tomenson, 1994; Burke & Preskorn, 1995). Поэтому в настоящее время появился особый интерес к разработке новых терапевтических методов лечения депрессии.

Было проведено приблизительно двенадцать тестов на действие антидепрессантов у животных (Cryan et al., 2002, Cryan et al., 2002). Тест принудительного плавания, проводимый в целях определения неспецифической устойчивости к стрессу, был описан и разработан Porsolt и сотрудниками (Porsolt et al., 1977) для его применения на крысах и мышах (Porsolt, 2000). В тесте принудительного плавания оценивается поведение животного, которое принуждается к плаванию почти до полного изнеможения (примерно 15 минут). Вначале, по истечении периода высокой активности, грызун быстро принимает неподвижную позу, совершая лишь минимальные движения для удерживания на поверхности воды (Porsolt et al., 1977). Точность теста принудительного плавания (тест Porsolt) и ее корреляция с депрессией хорошо описаны в литературе (Cryan et al., 2002; Willner, 1984; Willner, 1990), и этот тест представляет собой хорошо разработанный скрининг-тест на антидепрессанты. Хотя различные лаборатории вносят технические модификации в специальную аппаратуру, однако по существу, этот тест остается неизменным. В стандартном тесте принудительного плавания детекция селективных ингибиторов поглощения серотонина (SSRI), несмотря не ее клиническую эффективность, является ненадежной (Borsini & Meli, 1988; Detke et al., 1995; Cryan, 2002). Модификация FST, сделанная на основе детального анализа поведения, позволяет осуществлять более точную детекцию и идентификацию серотонинергических и норадренергических антидепрессантов (Lucki, 1997, Detke et al., 1995).

5.1. Материалы и методы

Животные

В этом эксперименте использовали самцов крыс Wistar (Shoe: Wist, Dimed Schonwalde GmbH, Germany) весом 180-200 г. Этих крыс разделяли на группы по 5 животных на клетку (45×60×25 см) при комнатной температуре (22±2°С), при суточном цикле 12 ч - день/12 ч - ночь (свет включали в 6.00) и при освещении 170 люкс. Животные имели свободный доступ к стандартному гранулированному корму (Altromin 1326) и к воде. Для адаптации к новым условиям крыс за две недели до проведения испытания помещали в камеры для обычного содержания животных с отделениями. После доставки крыс произвольно распределяли по группам обработки. Эксперименты осуществляли в звуконепроницаемом и ярко освещенном помещении, в котором освещение подавалось в период от 14.00 до 17.00 часов.

Химические соединения

Тест-соединение:	ELB139
Химическое название:	1-(п-хлорфенил)-4-пиперидин-1-ил-1,5-дигидроимидазо-2-он
Молекулярная масса:	277,75
Партия:	S306767
Производитель:	ELBion AG
Стандартное соединение:	флуоксетин
Химическое название:	N-метил-γ-[4-(трифторметил)-фенокси]бензолпропанамин
Молекулярная масса:	345,8

Носитель 1:	Тилоза
Химическое название:	Гидроксиэтилцеллюлоза
Партия:	S22341743
Производитель:	Merck Eurolab GmBH
Носитель 2	ПЭГ 300
Партия:	Lot53616433
Производитель:	Merck Eurolab GmBH

Протокол введения лекарственного средства/доза

Перед проведением экспериментов ELB139 (10, 30 мг/кг) в свежем виде суспендировали в 10% ПЭГ+90% гидроксиэтилцеллюлозе. Для проверки надежности экспериментальных процедур использовали стандартный антидепрессант, SSRI, а именно флуоксетин (10, 30 мг/кг), а в качестве контроля использовали носитель (10% ПЭГ+90% 0,5% гидроксиэтилцеллюлоза).

Всех животных три раза обрабатывали Verum или носителем, а именно сразу после периода аклиматизации (23 ч), а затем за 5 часов и 1 час до начала испытаний. Все лекарственные средства вводили перорально дозой в объеме 1 мл/кг.

5.2. Экспериментальная процедура

Животных тестировали в стеклянном резервуаре (23×30 см, высота 40 см), наполненном водой до глубины 28 см, при 22°С (так, чтобы животные не могли касаться дна). Стеклянный резервуар освещался рассеянным светом и был окружен тонированными темно-коричневые стенками (на расстоянии 20 см от резервуара) для того, чтобы экспериментатор не мог наблюдать за происходящим в резервуаре. Эксперименты осуществляли в период времени от 14:00 и до 17:00 часов, в соответствии с методикой, которая, в общих чертах, описана в литературе (Porsolt et al., 1979, Lucki, 1997).

На первый день эксперимента крыс осторожно помещали в воду на 15 минут для привыкания. После удаления из воды их помещали в стандартный бокс из плексигласа, пол которого был покрыт бумажными полотенцами и нагревался инфракрасным обогревателем в течение 30 минут для осушки. На следующий день животных еще раз осторожно помещали в стеклянный резервуар и наблюдали в течение 5 минут. Поведение животных записывали на видеокамеру.

Через 5-минут крыс переносили в бокс, подогреваемый инфракрасным обогревателем, и оставляли для высыхания.

После проведения эксперимента видеопленки анализировали вручную и регистрировали продолжительность следующих поведенческих ситуаций: неподвижность - животное держалось на воде и делало лишь те движения, которые были необходимы для удерживания носа над водой; плаванье - животное совершало активные круговые движения по резервуару, включая ныряние; карабканье - крысы совершали активные движения своими передними лапами в воде и пытались вылезти из воды, обычно по стенкам.

5.3. Статистика

Данные представлены как среднее ± ср. кв. от., а группа содержала 10 крыс. Сравнение между группами проводили с помощью одностороннего анализа ANOVA, а затем проводили межгрупповое сравнение с помощью метода Хольма-Сидака. Результаты рассматривались как значимые для величин Р<0,05. Все статистические анализы проводили с использованием программы SigmaStat Version 3.0.

5.4. Результаты

Соединение ELB139 не влияло на время нахождения животного в неподвижном состоянии во время теста принудительного плавания, но при дозе 30 мг/кг, р.о., оно способствовало увеличению продолжительности плавания, однако продолжительность карабканья не изменялась (фиг.6). Субъективные наблюдения позволяют сделать вывод об умеренной гипоактивности животных после их возвращения в "жилую" клетку, при введении им дозы 30 мг/кг, р.о.

Стандартный антидепрессант, флуоксетин, снижал время нахождения животного в неподвижном состоянии и увеличивал продолжительность фазы плавания при дозе 10 и 30 мг/кг, тогда как продолжительность фазы карабканья не изменялась (фиг.7).

5.5. Обсуждение

В проводимом авторами исследовании было установлено, что соединение ELB139 давало определенный эффект в тесте принудительного плавания. Для получения большей информации относительно предполагаемых антидепрессант-подобных эффектов поведение животных во время теста принудительного плавания анализировали более сложным методом, позволяющим выявить отличия у различных классов антидепрессантов (Lopez-Rubalcava & Lucki, 2000; Lucki, 1997). В соответствии с проводимыми ранее исследованиями селективный ингибитор поглощения серотонина флуоксетин резко увеличивал продолжительность фазы плавания, но не увеличивал продолжительности фазы карабканья.

Воздействие ELB139 на измеренные параметры в тесте принудительного плавания было аналогичным воздействию флуоксетина (изменение продолжительности плавания, но при меньшем воздействии на продолжительность фазы неподвижности), но отличалось от действия дезипрамина (изменения продолжительности фаз неподвижности и карабканья)(Rex et al., в печати). Поэтому можно предположить, что действие ELB139 может быть составной частью серотонинергической системы. Было высказано предположение, что снижение серотонинергической нейротрансмиссии играет ключевую роль в этиологии депрессии. Это было установлено, главным образом, по клинической эффективности антидепрессантов третьего поколения, а именно SSRI, которые усиливают серотонинергическую трансмиссию (Beique et al., 2000; Blier, 2001). ELB139 хорошо переносился в обеих дозах 10 и 30 мг/кг.

Во время сеансов испытаний у крыс, которым вводили 10 или 30 мг/кг ELB139, не наблюдалось увеличения продолжительности фазы неподвижности, а у крыс, которым вводили именно 30 мг/кг ELB139, наблюдалось легкое, но незначимое уменьшение продолжительности фазы карабканья. Это может быть обусловлено снижением влияния ELB139 на двигательную активность. Очевидно, что у крыс после их возвращения в “жилые” клетки наблюдалось также небольшое снижение активности. Однако указанное уменьшение времени карабканья наблюдалось при одновременном значимом увеличении времени плавания, из чего следует, что общая активность крыс оставалась неизменной. Поэтому соединение ELB139 не давало значимого снижения двигательной активности в тесте “открытое поле” и у других животных с моделями тревожных состояний (Langen, 2002; Langen, 2003a+b). Кроме того, в противоположность флуоксетину, ELB139 не давало увеличения общей активности у крыс.

Суммируя вышесказанное и принимая во внимание значимое увеличение времени плавания крыс при введении им ELB139 в дозе 30 мг/кг, р.о., можно утверждать, что ELB139 следует рассматривать как кандидат на его использование для лечения депрессии.

Пример 6

Отмена действия ELB139 на уровни серотонина с использованием флумазенила, антагониста бензодиазепина

6.1. Материалы и методы

Животные

В этом эксперименте использовали самцов крыс Wistar (Crl: (WI) BR, Charles River, Sulzfeld, Germany) весом 200-260 г. Этих крыс разделяли на группы по 5 животных, а затем помещали в клетки в стандартные условия при суточном цикле 12 ч - день/12 ч - ночь (свет включали в 6.00) и обеспечивали свободный доступ к корму (Pellets, ssniff M/R 15, Spezialdiat GmbH, Soest/Westfalen) и к воде.

Химические вещества

ELB139 1-(п-хлорфенил)-4-пиперидин-1-ил-1,5-дигидроимидазо-2-он MW 277,75) был изготовлен фирмой Elbion AG. Флумазенил (этиловый эфир 8-фтор-5-метил-6-оксо-5,6-дигидро-4Н-2,5,10b-триаза-бензо[e]азулен-3-карбоновой кислоты) был изготовлен фирмой Tocris и поставлялся фирмы-дистрибьютером Biotrend Chemikalien GmbH, Koln, Germany. Все другие используемые химические вещества получали от Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany или Merck, Germany.

Протокол введения лекарственного средства/доза

Способ введения: в/б

Объем введения: 0,5 мл/100 г

Вещество	Доза [мг/кг]	Время предварительной обработки [мин]	Число введений [n]
Флумазенил	10	через 40 минут после введения ELB139	1
ELB139	30	0	1

6.2. Получение соединений

ELB139 в свежем виде суспендировали в 90% 0,5% гидроксиэтилцеллюлозе и 10% ПЭГ-300 так, чтобы для каждого вещества и дозы объем введения составлял 0,5 мл/100 г. Раствор галоперидола для инъекций разводили физиологическим раствором так, чтобы объем введения составлял 0,5 мл/100 г. Флумазенил разводили физиологическим раствором так, чтобы объем введения составлял 0,5 мл/100 г. До и во время проведения процедур введения доз раствор и суспензию помещали в сосуд с магнитной мешалкой. Гидроксиэтилцеллюлозу растворяли в дистиллированной воде.

6.3. Экспериментальная процедура

Хирургическая операция

За день до начала эксперимента самцов крыс анестезировали хлоралгидратом (3,6%, 1 мл/100 г, в/б) и помещали в камеру для стереотаксиса в целях имплантации управляемой канюли для микродиализа (СМА/12, Carnegie Medicine, Sweden). Скальп вскрывали путем срединного переднезаднего разреза между лямбда-участком и брегмой, и в черепе просверливали небольшую дырочку. Стереотаксические координаты имели следующие значения: АР=+1,0 мм, L=-3,0 мм от брегмы и 1,5 мм от поверхности черепа в области полосатого тела в соответствии с атласом Паксиноса и Уотсона (1986)(1). Управляемую канюлю фиксировали с использованием зубного цемента (Sinfony(2)) и прикручивали к черепу фиксирующими винтами. Во время проведения хирургической процедуры температуру прямой кишки поддерживали при 37°С с помощью нагревательного элемента.

Микродиализ

За день до начала эксперимента зонд для микродиализа (СМА/12, мембрана длиной 4 мм, Carnegie Medicin, Sweden) вводили в полосатое тело через управляемую канюлю. На день эксперимента через этот зонд вливали раствор Рингера (148 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 2,4 мМ CaCl₂, рН 6,0). Через каждые 20 минут из потока (со скоростью 1 мкл/мин) брали 20 мкл-образцы и собирали в микрососуды. Микрососуды хранили в сборнике для фракций (СМА/170) при температуре 8°С до проведения анализа. Благодаря использованию шарнирного сустава перфузионное устройство позволяло животному свободно передвигаться в полусферической камере. По истечении примерно одного часа, через каждые 20 минут брали 3 фракции для определения стабильного базального уровня высвобождения нейромедиатора.

Затем вводили 30 мг/кг ELB139 или эквивалентный объем 0,5% тилозы, соответственно. Сбор образцов продолжали в течение по меньшей мере 220 минут.

Анализ диализатов

Диализаты непосредственно анализировали с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ-ЭД). Образцы разделяли на колонке ZORBAX SB-Aq с внутренним диаметром 2,1 мм ·100 мм (Agilent Technologies). К 20-минутной фракции добавляли 1 мкл 1% перхлорной кислоты и в эту ВЭЖХ-систему инжектировали 10 мкл полученной смеси. Подвижная фаза содержала:

КН2РО4	50 мМ
Натриевая соль октан-1-сульфоновой кислоты (NOS)	2,2 мМ
EDTA	0,086 мМ
2МН3РО4	5 мл
Метанол (МеОН)	83 мл
Ацетонитрил	10 мл
	при рН 3,5

Указанный способ (с использованием серотонина) проводили при скорости потока 0,23 мл/мин, при температуре колонки 38°С и при температуре образца 8°С, поддерживаемой с помощью термостата.

В течение ночи скорость потока снижали до 0,1 мл/мин. Катехоламины окисляли при 500 мВ (в ячейке для микродиализа, модель 5014 В, ESA). Измерения проводили при концентрациях: Dopac - 200 нА, допамин - при 2 нА, HIAA - при 100 нА, HVA - при 2 нА и серотонин - при 500 пА.

Для калибровки регулярно проводили оценку с использованием внешних стандартов систему, каждый при 5 концентрациях:

DOPAC (3,4-дигидрофенилуксусная кислота)	1000, 500, 250, 125, 62,5 нМ
Допамин (гидрохлорид 3-гидрокситирамина)	8, 4, 2, 1, 0,5 нМ
HIAA (5-гидрокси-3-индолуксусная кислота)	200, 100, 50, 25, 12,5 нМ
HVA (гомованилиновая кислота)	800, 400, 200, 100, 50 нМ
Серотонин (сульфат 5-гидрокситриптамина-креатинина)	0,15, 0,075, 0,0375, 0,01875, 0,009375 нМ

Перед имплантацией и после удаления зонда для микродиализа проводили курс восстановления с использованием раствора, содержащего 2000 нМ DOPAC, 40 нМ допамина, 1000 нМ HIAA, 2000 нМ HVA и 0,8 нМ серотонина. Скорость восстановления после удаления зондов составляла в пределах 5-20%.

Гистология

После завершения эксперимента головной мозг крыс удаляли и фиксировали в формалине (10%) в течение примерно 10 дней. Затем головной мозг разрезали с помощью виброшлифа (TSE) и окрашивали толуидиновым синим для подтверждения того, что указанные зонды находятся в нужном положении.

6.4. Статистика

Различные индивидуумы обнаруживали различные базальные уровни высвобождения 5-НТ. Поэтому данные для каждого животного выражали в процентах. Перед введением указанных веществ данные, полученные для диализатов, усредняли и среднее значение принимали за 100%, при этом, соответственно, вычисляли все величины по отдельности.

Результаты анализировали с помощью двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием двух факторов, таких как период времени и лекарственное средство. Для индивидуального сравнения использовали критерий Тьюки. Величину Р<0,05 принимали как значимую.

6.5. Результаты

Соединение ELB139 индуцировало заметное увеличение уровня внеклеточного серотонина в полосатом теле крыс по сравнению со средним базальным уровнем. Через 40 минут после введения ELB139, в/б, в дозе 30 мг/кг крысам вводили флумазенил, в/б, в дозе 10 мг/кг, в результате чего уровень внеклеточного серотонина не только не увеличивался, а даже снижался до уровня ниже среднего базального уровня. По истечении времени регистрации (3 ч) уровень серотонина снова достигал до среднего базального уровня.

Пример 7

Отмена антипсихотического эффекта ELB139 с использованием флумазенила, антагониста бензодиазепина

6.1. Материалы и методы

Животные

В этом эксперименте использовали самок крыс Wistar (Crl: (WI) BR, Charles River, Sulzfeld, Germany) весом 168-217 г. Этих крыс разделяли на группы по 5 животных, а затем помещали в клетки в стандартные условия при суточном цикле 12 ч - день/12 ч - ночь (свет включали в 6.00) и обеспечивали свободный доступ к корму (Pellets, ssniff M/R 15, Spezialdiat GmbH, Soest/Westfalen) и к воде.

1.2. Химические вещества

ELB139 (1-(п-хлорфенил)-4-пиперидин-1-ил-1,5-дигидроимидазо-2-он, MW 277,75) был изготовлен Elbion AG. Галоперидол (4-(4-[4-хлорфенил]-4-гидрокси-1-пиперидинил)-1-(4-фторфенил)-1-бутанон, MW 375,9) был получен RatioPharm GmbH, Ulm, Germany, а MK-801 (дизоцилпин, MW 337,37) и флумазенил (этиловый эфир 8-фтор-5-метил-6-оксо-5,6-дигидро-4Н-2,5,10b-триаза-бензо[e]азулен-3-карбоновой кислоты) был получен Tocris и поставлялся фирмой-дистрибьютером Biotrend Chemikalien GmbH, Koln, Germany. Все другие используемые химические вещества были получены от Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany или от Merck, Germany.

7.2. Протокол введения лекарственного средства и доза

Объем введения: 0,5 мл/100 г

Вещество	Число животных [n]	Доза [мг/кг]	Предварительная обработка [мин]	Число введений [n]	Способ введения
МК-801	6	0,1	10	1	в/б
ELB139	6	30	60	1	p.o.
ELB139 + флумазенил	6	30 5	60 20	1 1	р.о в/б
галоперидол	9	0,5	30	1	в/б
галоперидол+флумазенил	4	0,5 5	60 20	1 1	в/б в/б

7.3. Получение соединений.

ELB139 в свежем виде суспендировали в 90% 0,5% гидроксиэтилцеллюлозе и 10% ПЭГ 300, так, чтобы для каждого вещества и дозы объем введения составлял 0,5 мл/100 г. Раствор галоперидола для инъекций разбавляли физиологическим раствором так, чтобы объем введения составлял 0,5 мл/100 г. Флумазенил и МК-801 разбавляли физиологическим раствором так, чтобы объем введения составлял 0,5 мл/100 г. До и во время проведения процедур получения доз суспензии помещали в сосуд с магнитной мешалкой. Гидроксиэтилцеллюлозу растворяли в дистиллированной воде.

Крысам галоперидоловой группы галоперидол вводили за 30 минут до проведения теста, а МК-801 вводили за 10 минут до проведения теста, а крысам других тест-групп вводили галоперидол, ELB139 или носитель вводили за 60 минут до проведения теста; физиологический раствор или флумазенил вводили за 20 минут до проведения теста; а МК-801 вводили за 10 минут до проведения теста.

7.4. Экспериментальная процедура

Поведенческие эффекты, индуцированные антагонистом NMDA, MK-801, в общих чертах, могут рассматриваться как крысиная модель психоза. МК-801, после его внутрибрюшинного введения крысам, индуцировал у них стереотипии, гиперактивность и атаксию.

Двигательная активность у крыс была зарегистрирована с помощью устройства MotiTest Apparatus (TSE, Bad Homburg, Germany). Тестируемая площадь состояла из квадратной площадки (45×45 см) с защитными стенками из плексигласа (высотой - 20 см), на которой крысы могли свободно передвигаться. Горизонтальные движения регистрировались 32 инфракрасными фотоэлементами, расположенными вдоль нижней части каждой стенки площадки. Вертикальные движения (вертикальная стойка) регистрировались 32 инфракрасными фотоэлементами, расположенными горизонтально в ряд на высоте 12 см от пола. Нижеследующие параметры измеряли с помощью компьютерной программы “ActiMot” (TSE, Bad Homburg, Germany):

1. время активности [с],

2. общее проходимое расстояние [м].

Стереотипии, подразделяемые на стереотипное обнюхивание и другие стереотипии и атаксию, оценивались экспериментатором через каждые пять минут в течение одного часа (с 12-ю перерывами) методом, описанным Andine et al. (1999). Для каждого параметра добавляли значения, полученные с 12-тью перерывами.

Оценка	Стереотипное обнюхивание	Другие стереотипии	Атаксия
0	отсутствие стереотипного обнюхивания	Отсутствие стереотипий	Нормальная регуляция организма
1	Обнюхивание с перерывами (пауза >5 с)	Стереотипии с перерывами (пауза >5 с)	Тенденция к спаду двигательной активности
2	Постоянное обнюхивание	Постоянные стереотипии	Спад двигательной активности
3	-	-	Почти полное отсутствие способности двигаться

В день проведения эксперимента самок крыс переносили в лабораторию, и перед тестированием таким крысам через соответствующие промежутки времени вводили тестируемое соединение, стандартное соединение или носитель. За 10 минут до тестирования крысам внутрибрюшинно вводили 0,2 мг/кг МК-801.

В начале проведения теста крыс помещали в центр квадратной площадки в аппарате MotiTest. Поведение крыс регистрировали в течение одного часа. После проведения каждого эксперимента животных удаляли и боксы тщательно очищали и сушили.

7.5. Статистика

Результаты испытаний на стереотипное обнюхивание, другие стереотипии и атаксию были проанализированы с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Для индивидуального сравнения использовали критерий Тьюки. Результаты испытаний на активность и общее проходимое расстояние анализировали с помощью двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) (соединение ·время). Для индивидуального сравнения использовали критерий Стьюдента-Ньюмана-Кейлса. Величина Р<0,05 рассматривалась как статистически значимая.

7.6. Результаты

Галоперидол в дозе 0,5 мг/кг, в/б, оказывал значимое обратное действие, отменяющее увеличение активности, увеличение проходимого расстояния и стереотипии обнюхивания, индуцированные МК-801 (фигура 1). Другие стереотипии, индуцированные МК-801, слегка снижались под действием галоперидола при 0,5 мг/кг. Эти эффекты галоперидола не изменялись под действием флумазенила, вводимого при 5 мг/кг. МК-801-индуцированная атаксия снижалась под действием галоперидола лишь на маргинальном уровне, но значительно подавлялась при введении комбинации галоперидола и флумазенила (фигура 8).

Данные для ELB139 были получены в двух отдельных испытаниях, проводимых двумя разными лаборантами (нояб. 2003 и янв. 2004). Эти два отдельных испытания и результаты обоих испытаний описаны и представлены на фигурах 9 и 10а и b.

Исходя из дискретных испытаний и суммарных данных обоих испытаний, было установлено, что ELB139 при дозе 30 мг/кг, р.о., значительно подавляло стереотипное обнюхивание. Во втором испытании действие ELB139 заметно ингибировалось флумазенилом и подвергалось значимой реверсии в первом испытании и по данным обоих испытаний (фигура 9).

При введении ELB139 при 30 мг/кг, р.о., другие стереотипии, индуцированные МК-801, слегка снижались в первом испытании и значимо подавлялись во втором испытании, на что также указывают суммарные данные обоих испытаний. В первом испытании этот эффект ELB139 значительно усиливался флумазенилом, вводимом в дозе 5 мг/кг, и заметно подавлялся во втором испытании, а в итоге при совместном действии вместе с флумазенилом эффект ELB139 не подвергался изменению. Эти противоречивые результаты, вероятно, обусловлены неточным определением термина “другие стереотипии” в первом испытании (фигура 9).

В первом испытании (ноябрь 2003) ELB139 при дозе 30 мг/кг, р.о., почти не оказывало влияния на атаксию, индуцированную МК-801. Во втором испытании (янв. 2004) этот эффект был более выраженным, но еще не был значимым, а суммарный результат обоих испытаний давал лишь незначительное уменьшение атаксии. Подавляющее атаксию действие ELB139, наблюдаемое во втором испытании, отменялось при введении флумазенила в дозе 5 мг/кг, в/б. Суммарный результат обоих испытаний указывал на то, что обратное действие флумазенила в итоге приводило к маргинальному эффекту (фигура 9).

МК-801-индуцированную гиперактивность выражали в виде величин активности и проходимого расстояния и регистрировали с 5-минутными интервалами. При рассмотрении всех кривых зависимости от времени можно отметить, что соединение ELB139, вводимое в дозе 30 мг/кг, p.o., заметно снижало МК-801-индуцированную активность во втором испытании, и это снижение активности было значимым в первом испытании и по суммарным результатам обоих испытаний (двухсторонний ANOVA, фигура 10а). В обоих испытаниях и в соответствии с суммарным результатом обоих испытаний было установлено, что влияние ELB139 на активность подвергалось значимой реверсии под действием флумазенила, вводимого в дозе 5 мг/кг, в/б (фигура 10а).

МК-801-индуцироввнное увеличение проходимого расстояния значительно снижалось под действием ELB139 в обоих испытаниях и по суммарным результатам обоих испытаний, на что указывают все кривые в зависимости от времени (двусторонний ANOVA, фигура 10а). Все испытания и суммарные данные обоих испытаний показали, что этот эффект подвергался значимой реверсии под действием флумазенила (фигура 10а).

При рассмотрении данных в отдельные моменты времени можно видеть, что влияние ELB139 на активность и проходимое расстояние было более явно выражено в первые полчаса (фигура 10b).

1. Способ лечения или предупреждения тревожного состояния или эпизода тревожного состояния путем введения пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества ELB 139 (1-(4-хлорфенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-он) или 1-(4-метоксифенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-она.

2. Способ по п.1, в котором ELB 139 вводят парентерально или перорально.

3. Способ по п.1, в котором ELB 139 вводят в количестве 1-100 мг/кг массы тела пациента.

4. Способ по п.1, в котором к тревожному состоянию или эпизоду тревожного состояния относятся хроническое тревожное состояние, паническая атака, агорафобия, социальная фобия и генерализованное тревожное состояние.

5. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения тревожного состояния или эпизода тревожного состояния, где композиция включает эффективное количество ELB 139 (1-(4-хлорфенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-он) или 1-(4-метоксифенил)-4-пиперидиноимидазолин-2-она и один или более наполнителей или добавок.

6. Фармацевтическая композиция по п.5 для парентерального или перорального введения.

7. Фармацевтическая композиция по п.5, содержащая ELB 139 в количестве 1-100 мг/кг массы тела пациента.

8. Фармацевтическая композиция по п.5, в которой к тревожному состоянию или эпизоду тревожного состояния относятся хроническое тревожное состояние, паническая атака, агорафобия, социальная фобия и генерализованное тревожное состояние.