Способ получения карбоксипептидазы b из поджелудочной железы свиньи

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в биотехнологии при получении генно-инженерных продуктов. Для выделения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи экстракцию, осаждение сульфатом аммония и очистку проводят в буферных растворах, содержащих 0,001-0,005 М хлорида цинка. При этом очистку проводят двукратной хроматографией на Q-сефарозе, а в процессе хроматографии используют элюцию 0,07-0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl буфере, рН 7,6. Изобретение обеспечивает упрощение способа получения карбоксипептидазы В при сохранении высокой удельной активности конечного препарата и стабильности карбоксипептидазы В.

 

Изобретение относится к биохимии, точнее к способу получения карбоксипептидазы В (кВ) из поджелудочной железы свиньи, и может быть использовано в биотехнологии при получении генно-инженерного инсулина, а также в научных исследованиях при сиквенировании белков и синтезе пептидов.

Известен способ получения кВ из поджелудочной железы свиньи, включающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, получение ацетонового порошка из автолизата, экстракцию, осаждение сульфатом аммония и последующую очистку целевого продукта двумя последовательными хроматографиями на ДЕАЕ-целлюлозе (А.с. №1551742 МКИ C12N 9/48, 1987).

Недостатком способа является использование на первом этапе органических растворителей (ацетон, диэтиловый эфир) и относительно низкая удельная активность конечного препарата (107-155 ед/мг белка).

Известен способ получения кВ из поджелудочной железы млекопитающих, предлагающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, экстракцию при 50-75°С и дробное осаждение сульфатом аммония 320-416 г/л и диализ (патент RU №1487817, МКИ C12N 9/48, 1989).

Недостатком способа является недостаточно высокий выход конечного препарата.

Известен способ получения кВ из поджелудочной железы северных оленей (патент SU №1833427, МКИ C12N 9/64, 1991), включающий гомогенизацию, экстракцию, двухступенчатое подкисление до рН 5,2-5,5, затем до рН 3,8-4,2, осаждение ацетоном, повторное осаждение этанолом, лиофилизацию.

Недостатком способа является сложность получения исходного сырья.

Известен способ получения кВ из поджелудочной железы свиньи (патент RU №2177997, МПК C12N 9/14, 2002), включающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, экстракцию при 60°С, двухступенчатое осаждение сульфатом аммония, повторную термообработку, хроматографию на оксиапатите, повторное осаждение сульфатом аммония, диализ, хроматографию на ДЕАЕ-сефарозе.

Недостатком способа является многоступенчатость (10 стадий) и длительность процесса.

Задача изобретения - упрощение способа получения карбоксипептидазы В при сохранении удельной активности конечного препарата на уровне от 200 ед/мг белка и выхода не менее 40%.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения карбоксипептидазы В из свиной поджелудочной железы, включающем гомогенизацию, автолиз, экстракцию исходного сырья, осаждение сульфатом аммония, диализ и очистку целевого продукта двукратной хроматографией на Q-сефарозе, все этапы очистки проводят в буферных растворах, содержащих 0,001-0,005 М хлорида цинка, при этом экстракцию проводят при 65°С в течение 15 минут, а в процессе хроматографии используют ступенчатую элюцию 0,07-0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6 буфере.

Отличием предлагаемого способа является, во-первых, применение экстракции при 65°С в течение 15 минут, позволяющей освободиться от значительного количества термолабильных белков и липидов; во-вторых, использование в процессе хроматографии на Q-сефарозе ступенчатой элюции 0,07-0,08 М хлорида натрия в 0,005 М трис HCl рН 7,6, позволяющей получать белковые пики с высокой концентрацией и, соответственно, высокой удельной активностью при минимальных трудозатратах; в-третьих, использование в качестве стабилизатора активности карбоксипептидазы В хлорида цинка, который добавляют в рабочий буфер до концентрации 0,001-0,005 М на всех этапах процесса.

Пример 1.

1. Гомогенизация и автолиз.

Одну железу (~0,3 кг) дважды гомогенизируют в бытовой мясорубке, помещают в пластиковую емкость и инкубируют в течение ночи на шейкере при комнатной температуре.

2. Экстракция.

К полученному автолизату добавляют 2 объема (600 мл) 0,01 М КН2PO4, рН 6,5, 0,001 М ZnCl2 и экстрагируют в предварительно нагретом до 65°С водном термостате в течение 15 минут при перемешивании механической мешалкой. Полученный экстракт охлаждают в ванне с проточной холодной водой и центрифугируют при 12000 об/мин, 4°С, 30 минут. Супернатант собирают, осадок отбрасывают.

3. Фракционирование сульфатом аммония.

К полученному супернатанту добавляют сульфат аммония из расчета 350 г на литр экстракта, поддерживая рН 6,5 с помощью сухого карбоната натрия.

Осадок формируют при +4°С в течение ночи. Затем осаждают центрифугированием при 8000 об/мин 30 минут и растворяют в 100 мл 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2.

Полученный осадок диализуют против частых смен 0,005 М трис HCl, рН 7,6 до полного удаления сульфата аммония. Не растворившийся осадок осаждают центрифугированием, супернатант используют для хроматографии.

4. Хроматография на Q-сефарозе.

Супернатант, полученный на предыдущем этапе, наносят на колонку с Q-сефарозой объемом 50 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2 со скоростью 100 мл/ч. Колонку промывают последовательно тремя объемами стартового буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005 М NaCl и элюируют целевой белок раствором 0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 100 ед./мг белка, помещают в диализный мешок и диализуют в течение ночи против 2-х смен 10-кратных объемов 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2.

5. Повторная хроматография на Q-сефарозе.

Отдиализованную фракцию целевого фермента наносят на колонку объемом 10 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Промывают 3 колоночными объемами рабочего буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005М NaCl. Элюируют целевой белок 0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 170 ед./мг. Готовый препарат хранят замороженным при - 20°С.

Выход составляет 143 мг фермента с удельной активностью 235 ед./мг белка.

Пример 2.

1. Гомогенизация и автолиз.

Одну железу (~0,3 кг) дважды гомогенизируют в бытовой мясорубке, помещают в пластиковую емкость и инкубируют в течение ночи на шейкере при комнатной температуре.

2. Экстракция.

К полученному автолизату добавляют 2 объема (600 мл) 0,01 М КН2PO4, рН 6,5, 0,001 М ZnCl2 и экстрагируют в предварительно нагретом до 65°С водном термостате в течение 15 минут при перемешивании механической мешалкой. Полученный экстракт охлаждают в ванне с проточной холодной водой и центрифугируют при 12000 об/мин, 4°С, 30 минут. Супернатант собирают, осадок отбрасывают.

3. Фракционирование сульфатом аммония.

К полученному супернатанту добавляют сульфат аммония из расчета 350 г на литр экстракта, поддерживая рН 6,5 с помощью сухого карбоната натрия.

Осадок формируют при +4°С в течение ночи. Затем осаждают центрифугированием при 8000 об/мин 30 минут и растворяют в 100 мл 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Полученный осадок диализуют против частых смен 0,005 М трис HCl, рН 7,6 до полного удаления сульфата аммония. Нерастворившийся осадок осаждают центрифугированием, супернатант используют для хроматографии.

4. Хроматография на Q-сефарозе.

Супернатант, полученный на предыдущем этапе, наносят на колонку с Q-сефарозой объемом 50 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2 со скоростью 100 мл/ч. Колонку последовательно промывают тремя объемами стартового буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005 М NaCl и элюируют целевой белок 0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 100 ед./мг белка, помещают в диализный мешок и диализуют в течение ночи против двух смен 10-кратных объемов 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2.

5. Повторная хроматография на Q-сефарозе.

Отдиализованную фракцию целевого фермента наносят на колонку объемом 10 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Промывают тремя колоночными объемами рабочего буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005М NaCl. Элюируют целевой белок 0,07 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 170 ед./мг. Готовый препарат хранят замороженным на - 20°С.

Выход составляет 133 мг фермента с удельной активностью 245 ед./мг белка.

Пример 3.

1. Гомогенизация и автолиз.

Одну железу (~0,3 кг) дважды гомогенизируют в бытовой мясорубке, помещают в пластиковую емкость и инкубируют в течение ночи на шейкере при комнатной температуре.

2. Экстракция.

К полученному автолизату добавляют 2 объема (600 мл) 0,01 М КН2PO4, рН 6,5, 0,001 М ZnCl2 и экстрагируют в предварительно нагретом до 65°С водном термостате в течение 15 минут при перемешивании механической мешалкой. Полученный экстракт охлаждают в ванне с проточной холодной водой и центрифугируют при 12000 об/мин, 4°С, 30 минут. Супернатант собирают, осадок отбрасывают.

3. Фракционирование сульфатом аммония.

К полученному супернатанту добавляют сульфат аммония из расчета 350 г на литр экстракта, поддерживая рН 6,5 с помощью сухого карбоната натрия.

Осадок формируют при +4°С в течение ночи. Затем осаждают центрифугированием при 8000 об/мин 30 минут и растворяют в 100 мл 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Полученный осадок диализуют против частых смен 0,005 М трис HCl, рН 7,6 до полного удаления сульфата аммония. Не растворившийся осадок осаждают центрифугированием, супернатант используют для хроматографии.

4. Хроматография на Q-сефарозе.

Супернатант, полученный на предыдущем этапе, наносят на колонку с Q-сефарозой объемом 50 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2 со скоростью 100 мл/ч. Колонку последовательно промывают тремя объемами стартового буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005 М NaCl и элюируют целевой белок 0,07 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 100 ед./мг белка, помещают в диализный мешок и диализуют в течение ночи против 2-х смен 10-кратных объемов 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2.

5. Повторная хроматография на Q-сефарозе.

Отдиализованную фракцию целевого фермента наносят на колонку объемом 10 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2.

Промывают 3-колоночными объемами рабочего буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005М NaCl. Элюируют целевой белок 0,07 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl2. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 170 ед./мг белка. Готовый препарат хранят замороженным при - 20°С.

Выход составляет 123 мг фермента с удельной активностью 250 ед./мг белка.

Пример 4.

Все делают как в примере 3, но хлорид цинка добавляют до концентрации 0,005 М.

Выход целевого белка составляет 120 мг с удельной активностью 242 ед./мг белка.

Пример 5.

Все делают как в примере 3, но хлорид цинка не добавляют.

Выход целевого белка составляет 123 мг с удельной активностью 193 ед./мг белка.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать 410-476 мг препарата карбоксипептидазы В с удельной активностью 235-250 ед/мг (в прототипе 220 ед./мг) или 111860-102500 единиц с 1 кг исходного сырья при сокращении числа стадий очистки до 7 по сравнению с 10 в прототипе. Это достигается за счет применения ступенчатой элюции в процессе хроматографии на Q-сефарозе и использования 0,001-0,005 М хлорида цинка в качестве стабилизатора.

Способ получения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи, включающий гомогенизацию животного сырья, автолиз и экстракцию в присутствии буферного раствора, осаждение сульфатом аммония и последующую очистку целевого продукта двукратной хроматографией, отличающийся тем, что экстракцию, осаждение и очистку проводят в буферных растворах, содержащих 0,001-0,005 М хлорида цинка, при этом экстракцию проводят при 65°С, а очистку проводят хроматографией в два этапа на Q-сефарозе, применяя элюцию 0,07-0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6 буфере.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой олигопептид, способный блокировать инвазию и метастазирование раковых клеток, содержащий олигопептидную последовательность (приведена в заявке) или ее фрагмент, также представляет собой фармацевтическую композицию для предупреждения или лечения дегенеративных заболеваний, или патологических состояний, обусловленных разрушением внеклеточного матрикса (ЕСМ) металлопротеиназами матрикса (ММР), диагностическую композицию для выявления дегенеративных заболеваний или патологических состояний, обусловленных разрушением внеклеточного матрикса (ЕСМ) металлопротеиназами матрикса (ММР).
Изобретение относится к области медицины и касается гликоформ фактора VII и к композициям, содержащим фактор VII, имеющим измененные конфигурации на основе аспарагинсвязанных олигосахаридных цепей.

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в производстве медицинских препаратов - рибонуклеазы панкреатической, дезоксирибонуклеазы панкреатической, трипсина, а также холестеролэстеразы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ингибиторов коллагеназы, и может быть использовано в ветеринарии, пищевой промышленности, а также для исследовательских целей.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ферментного препарата, и может быть использовано в производстве пищевых продуктов из слабосозревающих объектов промысла Волго-Каспийского района.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в парфюмерно-косметической промышленности, кожевенном производстве, меховом производстве, химико-фармацевтической промышленности.
Изобретение относится к полиферментным препаратам из морского животного сырья и способам их получения и может найти применение в биотехнологии, медицине, косметологии, ветеринарии, сельском хозяйстве, в научных исследованиях и производстве биохимических реактивов.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в фармакологии и медицине. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой фермент, который катализирует реакцию образования пептида из карбоксильного компонента и аминного компонента.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый фермент, способный катализировать реакцию пептидного синтеза из карбоксильного компонента и аминокомпонента.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ингибиторов коллагеназы, и может быть использовано в ветеринарии, пищевой промышленности, а также для исследовательских целей.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. .
Изобретение относится к полиферментным препаратам из морского животного сырья и способам их получения и может найти применение в биотехнологии, медицине, косметологии, ветеринарии, сельском хозяйстве, в научных исследованиях и производстве биохимических реактивов.
Изобретение относится к биотехнологии и направлено на получение высокоочищенного и высокоактивного ферментного препарата коллагеназы, который может быть использован в медицине, ветеринарии, биохимии и пищевой промышленности, а также для исследовательских целей.
Изобретение относится к медицине и касается сохранения активности сырья для изготовления реактива тромбопластина полного растворимого. .

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в медицине, косметологии, дерматологии, биохимии и пищевой промышленности, а также для исследовательских целей.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных, высокоактивных ферментных препаратов, которые могут быть использованы в медицине, биохимии и пищевой промышленности, а также для исследовательских целей.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано для защиты от инфекций, вызываемых микроорганизмами. .

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в биотехнологии при получении генно-инженерных продуктов

Наверх