Профилактически-лечебное антимутагенное средство и способ его применения

Предложено применение в качестве антимутагенного средства «Эйкозавитола» - препарата, полученного особой обработкой внутреннего жира деликатесных пород рыб Обского бассейна (муксуна, нельмы, осетра). «Эйкозавитол» уникален по составу, содержит до 15% незаменимых высших жирных кислот семейства «Омега 3», витамины А, D, Е. Также предложен способ профилактически-лечебного воздействия. Показано, что препарат стимулирует синтез ДНК в 2-4 раза относительно контрольного уровня и вызывает изменение конформации ДНК, проявляющееся разделением полинуклеотидных цепей («плавлением» ДНК) и гиперхромизмом. 2 н.п. ф-лы, 5 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к генетической токсикологии, и касается средств, проявляющих антимутагенный эффект.

Профилактика мутагенных воздействий генотоксикантов окружающей среды является одной из наиболее актуальных задач в современной медицинской науке.

В связи с невозможностью ограничения воздействия факторов окружающей среды на человека возникает необходимость поиска средств, препятствующих проникновению мутагенов в клетки организма и элиминирующих уже возникшие генетические повреждения, тем самым снижая давление генетического груза в популяциях людей.

Антимутагенные свойства выявлены у многих природных и синтетических веществ: витаминов, аминокислот, флавоноидов. естественных метаболитов, лекарственных средств.

Известно применение препаратов: "Жир печени акулы" и "Супер Хрящ Акулы" для уменьшения негативного действия неблагоприятных биологических факторов ионизирующего излучения, последствий химио- и лучевой терапии (см. Зуева Е.А. Справочник по биодобавкам. Ростов н/Д: Феникс, 2003 г., с.242; 265). Хорошими результатами применения обладают препараты импортные, изготовляемые из дефицитного океанического сырья, имеющие высокую цену.

Известно также использование рыбьего жира с ламинарией в виде капсул (производства ЗАО "Био Контур" г.Мурманск) при лечении и профилактики патологических процессов, связанных с воздействием неблагоприятных экологических факторов, ионизирующего облучения. Состав включает натуральный рыбий жир - 93%, экстракт ламинарии - 7,0%, витамины А, D, Е и обладает антимутагенным действием. Дозировка взрослым по 5 капсул 3-4 раза в день (см. Зуева Е.А. Справочник по биодобавкам. Ростов н/Д: Феникс, 2003 г., с.283). К некоторым недостаткам такого состава относятся довольно большие дозы и курсы применения и использование в производстве жира океанических и морских рыб, что сужает сырьевую базу производства препарата.

Известен также "Лечебно-профилактический комплекс" с иммуностимулирующим и регулирующим метаболические процессы в организме действием, содержащий лососевый жир, включающий полиненасыщенные кислоты класса «Омега-3», масло примулы вечерней (онагра), ацетат альфа-токоферола, Coviox T70, помещенный в желатиновые капсулы по 475-525 мг. Рекомендуемый курс применения лечебно-профилактического комплекса до 3 месяцев (см. Патент РФ №2194522, А61К 35/78, опубл. 20.12.2002. Бюл. №35). Сложный состав комплекса сдерживает широкое производство и применение.

Задачей изобретения является расширение ассортимента и доступности препаратов, включающих жир гидробионтов, содержащий полиненасыщенные жирные кислоты класса «Омега 3» и используемых для профилактики, лечения мутагенных воздействий антропогенных факторов и для восстановления поражений ДНК, в частности, от ионизирующего излучения и повышенного радиационного фона, как природного так и техногенного характера.

Задача решается тем, что после уточнения и дополнительного изучения свойств в качестве профилактически-лечебного антимутагенного средства и для коррекции поражений ДНК предложено применение препарата "Эйкозавитол", ранее разработанного и известного как дополнительный источник полиненасыщенных жирных кислот «Омега 3», производства ОАО "Тюменский химико-фармацевтический завод" ТУ-9281-00134458166-2005 (свидетельство о государственной регистрации выдано ООО "Фарнавит»" №77.99.23.3У.9639.8.05. от 24.08.2005 г.; санитарно-эпидемиологическое заключение №77.99.03.003.Т.001588.08.05. от 24.08.2005 г.)

"Эйкозавитол" представляет собой особо обработанный внутренний жир деликатесных пород рыб Обского бассейна (муксуна, нельмы, осетра) уникален по составу, содержит до 15% незаменимых высших жирных кислот семейства «Омега 3», витамины А, D, Е, F. "Эйкозавитол" выделяется по запатентованной технологии, обеспечивающей природное качество липидов, и представляет экологически чистый продукт. Известно, что "Эйкозавитол" в лечебных дозах (по 1 столовой ложке 3 раза в день) снижает уровень холестерина, корректирует нарушение липидного обмена, уменьшает свертываемость крови, повышает иммунитет, проявляет гипоаллергенное действие, улучшает заживление ран (см. Аннотация. Биологически активная добавка к пицце "Эйкозавитол", ОАО "Тюменский химикофармацевтический завод", г.Тюмень). "Эйкозавитол" выпускают в жидком виде (флаконы до 1000 мл) и в виде капсул по 0,385 г. Применение препарата "Эйкозавитол" в качестве антимутагенного средства ранее неизвестно.

Настоящее изобретение направлено на обоснование способа антимутагенного воздействия на организм с использованием препарата "Эйкозавитол", который представляет собой еще недостаточно изученный комплекс, содержащий полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) класса «Омега 3», преимущественно в виде эйкозапенатаевой и докозагексаеновой кислот, являющихся предшественниками биологически активных веществ (простагландинов, тромбоксанов, простациклинов), полученный из деликатесных рыб: муксуна, осетра, нельмы, пеляди, обитающих в акватории р.Оби.

У ПНЖК в организме множество различных функций. Они используются для образования жира, который покрывает и защищает внутренние органы. Расщепляясь, жирные кислоты выделяют энергию и участвуют в синтезе эйкозаноидов: простагландинов, лейкотриенов и тромбоксанов. Эти соединения регулируют важные функции организма, такие как артериальное давление, сокращение отдельных мышц, температура тела, агрегация тромбоцитов и воспаление. Чтобы контролировать все эти функции, организм синтезирует указанные специфические соединения из жирных кислот, содержащихся в пищевых жирах, которые мы потребляем. Каждое из этих соединений (простаглатин, лейкотриен или тромбоксан) должно производится в нужном количестве, в нужное время и в нужном месте.

К «Омега 3» жирным кислотам относятся а-линоленовая, эйкозапентаеновая кислота и докозагексаеновая кислота, которые присутствуют в основном в рыбе, а также могут синтезироваться в организме из а-линоленовой кислоты. Эти вещества помогают также справится с воспалительными процессами, способствуют уменьшению содержания триглицеридов в крови, которые связаны напрямую с заболевание сердца и инсультом.

Известно, что в клетках из полиненасыщенных жирных кислот класса «Омега 3» синтезируется комплекс эйкозаноидов, воздействующий на процессы репликации и репарации в клетках организма.

Для обоснования антимутагенных свойств предложенного препарата были проведены исследования с использованием импортных приборов и аппаратов нового поколения.

I этап - лабораторные исследования воздействия эйкозаноидов на процессы репликации и репарации;

II этап - непосредственные исследования антимутагенных и репатогенных свойств предложенного препарата «Эйкозавитол».

Исследования проводились с использованием систем бесклеточного матричного синтеза ДНК в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя, эйкозаноидов, а также меченых нуклеотидов (Amersham PB). Показания регистрировались на жидкостном автоматическом сцинтилляционном счетчике «Бета-2». Результаты проведенных исследований в рамках первого этапа свидетельствуют о том, что:

1. Эйкозаноиды продемонстрировали способность стимулировать синтез ДНК в 2-4 раза относительно контрольного уровня

2. Впервые установлено, что эйкозаноиды в отношении ДНК демонстрируют гиперхромный эффект, сопровождающий денатурацию ДНК и обусловленный снижением взаимной маскировки нуклеотидных оснований, а это свидетельствует о том, что эйкозаноиды уже в первые минуты после внесения в раствор, содержащий ДНК, вызывают изменение конформации полинуклеотидной молекулы. Этот эффект снижается к 15-й минуте и полностью исчезает в дальнейшем (спустя 60 минут), а обратимость гиперхромизма особо отчетлива на фоне изменения показателя светопоглощения денатурированной ДНК.

В настоящее время известно, что молекула ДНК может находиться в нескольких конформационных состояниях, различающихся шагом спирали, углами поворота между соседними парами оснований, наклоном плоскости пар к оси спирали, а также правой и левой формами. В частности, показано, что при внешних воздействиях ДНК способна из В-формы (правая) переходить в Z-форму (левая), причем переход в Z-форму играет большую регуляторную роль в связи с облегчением взаимодействия молекулы с ферментами (ДНК-полимеразой). В то же время можно считать доказанным, что эйкозаноиды уже в первые минуты изменяют конформационное состояние ДНК, проявляющееся разделением полинуклеотидных цепей («плавлением» ДНК) и гиперхромизмом.

3. На ДНК определяются участки связывания эйкозаноидов, обладающие выраженным аффинитетом. Оказалось, что нативная молекула ДНК имеет значительное число специфических сайтов связывания с высоким аффинитетом ко всем исследованным эйкозаноидам. В то же время температурная денатурация, сопровождающаяся лишь расхождением цепей ДНК, приводила к исчезновению сайтов связывания (хотя для ПГ Е1, PC 12 и Lt C4 эти участки сохраняются, но в значительно меньшем количестве - таблица 1).

Таблица 1.
Число (n) и аффинитет (Kac) рецепторов к эйкозаноидам на нативной и денатурированной ДНК
	Единицы измерения	Нативная ДНК	Денатурированная ДНК
ПГ А1	n/10-12 М/мг	4.40±0.88	0.00±0.00*
	Kac 109 М	70.00±14.00	0.00±0.00*
ПГ А2	n/10-12 М/мг	7.93±1.59	0.00±0.00*
	Kac 109 М	29.00±6.00	0.00±0.00*
ПГ Е1	n/10-12 М/мг	36.79±5.36	2.46±0.49*
	Kac 109 М	34.00±7.00	35.90±720*
ПГ Е2	n/10-12 М/мг	10.57±2.11	0.00±0.00*
	Kac 109 М	39.00±8,00	0.00±0.00*
ПГ F2а	n/10-12 М/мг	4.09±0.82	0.00±0.00*
	Kac 109 М	156.00±31.00	0.00±0.00*
Рс 12	n/10-12 М/мг	8.03±1.61	0.85±0.17*
	Kac 109 М	27.00±5.00	25.0±5.00
ТхВ2	n/10-12 М/мг	113±0.23	0.00±0.00*
	Kac 109 М	242.00±48.00	0.00±0.00*
LtC4	n/10-12 М/мг	6.33±1.27	0.46±0.09*
	Kac 109 М	3100±6.00	39.00±8.00
* - здесь и далее, достоверность отличий показателя (р<0,05) по отношению к соответствующему контролю

В свою очередь, обратимость гиперхромизма и отсутствие высокочувствительных сайтов связывания на термически денатурированной молекуле позволяет с известной долей допущения определиться с областью связывания эйкозаноидов с молекулой нативной ДНК: аденин-тиминовые пары полинуклеотидных цепей. Это обусловлено большей прочностью гуанин-цитидиновых пар ввиду наличия у них сразу трех водородных связей, а гиперхромный эффект, регистрируемый до полного расхождения цепей молекулы, и его обратимость свидетельствует о сохранении гуанин-цитидиновых пар, являющихся формообразующими как для В, так и для Z-конформаций ДНК.

Приведенные данные дают возможность изложить общие моменты участия эйкозаноидов в индукции репликации ДНК, позволяющие описать их участие в репарации повреждений (мутагенеза) ДНК.

Эйкозаноиды взаимодействуют с высокочувствительными сайтами связывания двунитевой молекулы ДНК, что приводит к ее плавлению по аденин-тиминовым парам нуклеотидов, которое сопровождается обратимым гиперхромизмом, конформационным переходом ДНК, а новое конформационное состояние молекулы ДНК отличается от предыдущего новыми свойствами. Последнее выражается в потере способности ДНК реагировать на эйкозаноиды дальнейшим изменением конформации, облегчении присоединения праймера и ДНК-полимеразы и активации репликации ДНК. По мере образования двойной цепи при наличии эйкозаноидов в среде процесс повторяется.

Серией проведенных экспериментов установлено, что двойная спираль ДНК способна к непрерывному изменению конформации, в пределах двойной спирали переходить из В-формы в Z-форму, подвергаться локальному плавлению с образованием доступных участков однонитевой молекулы ДНК с последующим присоединением фермента и началом репликации ДНК. Изменение конформации и активация репликации ДНК может происходить при взаимодействии нуклеиновых оснований с эйкозаноидами. Подобная активация способна привести либо к интенсификации деления клеток, либо к увеличению клеточной популяции.

Обнаруженная неспецифическая стимуляция репликации ДНК посредством эйкозаноидов является одним из компонентов репарационных систем клетки, что указывает на антимутагенный эффект данного класса соединений.

В то же время применение эйкозаноидов для введения в организм нецелесообразно, так как срок их полужизни при парентеральном введении не превышает пяти минут. Еще одним аргументом в пользу применения препарата ПНЖК является то, что эйкозаноиды - внутриклеточные месседжеры и эффективны внутри клетки. Поэтому используя данные первого этапа исследований, для практического использования был предложен препарат «Эйкозавитол», включающий в свой состав доступные для эйкозаноидообразования ПНЖК.

На втором этапе исследований проводился плацебо-контролируемый эксперимент в группе людей (102 человека), проживающих в МО «г.Карпинск» Свердловской области, где наблюдается повышенный радиационный фон и высокое содержание генотоксикантов в воздухе, воде и почве.

Дозы и схема введения препарата «Эйкозавитол» определены на основании обзора по аналогам лабораторных опытов на животных и исследованиях на добровольцах и приняты из расчета 1-3 капсулы 3-4 раза в день при курсе приема 30-60 дней (по показаниям).

Медицинский контроль обследования отобранных пациентов в начале и в конце курса приема предложенного препарата, взятие и обработку необходимых анализов проводили сотрудники лаборатории молекулярных медицинских технологий Средне-Уральского Научного центра РАМН и Правительства Свердловской области при Уральской Государственной медицинской академии (г.Екатеринбург).

Испытуемые были разделены на 2 группы:

1. Испытуемые, принимавшие предложенный препарат, содержащий ПНЖК «Эйкозавитол», - 82 человека;

2. Контрольная группа испытуемых, не принимавших препарат - 20 человек.

Материалом для исследования послужили лейкоциты периферической крови, которые выделялись к градиенте фиколл-верографин (1,077).

Для оценки генотоксичности и состояния репарационных систем клетки применялся RAPD-анализ (анализ длин случайно амплифицированных последовательностей), в основе которого лежит полимеразная цепная реакция, по стандартным протоколам с применением меченных радионуклидами нуклеотидов (³H-dTTP, ³H-dCTP, ³H-dATP).

ДНК из ядер лейкоцитов выделялась по методу фенольной депротеинизации. Перед постановкой полимеразной цепной реакции материал подвергался обработке лизирующим буфером для направленного расщепления цепей ДНК в щелочно-лабильных сайтах и местах одноцепочечных разрывов. В дальнейшем производилась отмывка фрагментов от лизирующего буфера и дополнительное их переосаждение. После чего материал ДНК вносился в реакционную ПЦР-смесь («НПО СибЭнзим»)

По окончании амплификации материал разделялся в агарозном геле с последующим переносом фрагментов на нитроцеллюлозные фильтры. Детекция результатов проводилась посредством регистрации сигнала на жидкостном автоматическом сцинтилляционном счетчике «Бета-2».

Указанный метод является достаточно информативным и позволяет получать количественные результаты для обоснования действия препарата. В основе его лежит то, что неповрежденная ДНК, имея размеры порядка 3-4 тыс. пар нуклеотидов, имеет крайне низкую подвижность в агарозном геле и соответственно проходит незначительное расстояние от места внесения в называемое образно «ядро». В отличие от нее участки ДНК, называемые «хвост», имеющие щелочно-лабильные сайты и места одноцепочечных разрывов, при обработке лизирующим буфером и амплификации дают фрагменты размером от 50 до 500 нуклеотидных пар и распределяются в геле на некотором расстоянии от «ядерной» ДНК. Таким образом, рассчитывая соотношение между «ядерной» и «хвостовой» ДНК (коэффициент фрагментации), можно в количественном выражении дать оценку степени повреждения ДНК клетки.

Для подтверждения эффективности предложенного препарата на втором этапе исследования до приема препарата «Эйкозавитол» у всех испытуемых был произведен забор периферической крови, которая была исследована на предмет уже имеющихся повреждений генома клеток.

Таблица 2
Показатели фрагментации ДНК до приема препарата «Эйкозавитол».
Группа	Активность «ядра». Бк/нг ДНК	Активность «хвоста», Бк/нг ДНК	Коэффициент фрагментации
Испытуемые	1056,74±97,23	803, 82±69,42	0,76
Контроль	921,51±86,5	681,92±46,85	0,74

Полученные результаты (Таблица 2) свидетельствуют о том, что степень повреждения генетического аппарата в группах испытуемых практически равны и составляют 0,76 и 0,74 соответственно, что позволило перейти непосредственно к проверке гипотезы об антимутагенных свойствах препарата «Эйкозавитол».

Первая группа испытуемых принимала препарат «Эйкозавитол» производства ООО «Тюменский химикофармацевтический завод" в течение месяца (30 дней) в количестве по 1 капсуле 3 раза в день (минимум по курсу), в то время как контрольная группа принимала плацебо, представляющее собой желатиновые капсулы, в том же количестве.

После окончания эксперимента был произведен вторичный забор периферической крови у всех испытуемых с последующим проведением RAPD-анализа.

Таблица 3
Показатели фрагментации ДНК после приема препарата «Эйкозавитол».
Группа	Активность «ядра», Бк/нг ДНК	Активность «хвоста», Бк/нг ДНК	Коэффициент фрагментации
Испытуемые	749,63±52,95	442,28±35,71	0,59*
Контроль	872,38±78,28	663,12±44,67	0,76

Исходя из представленных данных (Таблица 3) следует, что в группе контрольных лиц, принимавших обычные желатиновые капсулы (плацебо), коэффициент фрагментации значимо не изменился по сравнению с показателем до исследования. В группе испытуемых, принимавших препарат «Эйкозавитол», в указанных дозах (по минимуму) коэффициент фрагментации достоверно снизился по сравнению с К_фр до исследования на 22.3% (p≥0,05) и на 22,4% (р>≥0,05) по сравнению с К_фр в контрольной группе лиц.

Таким образом, в эксперименте на людях была практически доказана возможность и эффективность применения препарата «Эйкозавитол» в качестве средства, обладающего антимутагенными свойствами, за счет стимуляции репликативной активности в клетке посредством своих метаболитов - эйкозаноидов, и возможной активации репаративных механизмов защиты генома клетки, обоснованная на первом этапе исследований.

В отношении подтверждения предположения об активации репарации в клетках организма был проведен дополнительный эксперимент, в котором были совмещены RAPD-анализ и моделирование воздействия малых доз ионизирующего излучения.

Отобранную часть выделенной лейкоцитарной фракции испытуемых после окончания эксперимента, подвергали воздействию ионизирующего излучения (портативной рентгеновской установкой) в суммарной дозе, близкой к годовой дозе для «группы риска» (5 сГр). После облучения часть лейкоцитарной фракции исследовалась по методике RAPD-анализа, а другую в течение 2 часов культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением плазмы испытуемых с целью стимуляции репаративных процессов в ядросодержащих клетках крови. ДНК из клеток выделяли методом фенольной депротеинизации и проводили RAPD-анализ с использованной ранее группой праймеров в стандартных условиях.

Таблица 4
Показатели фрагментации ДНК облученных лейкоцитов периферической крови до культивирования
Группа	Активность «ядра», Бк/нг ДНК	Активность «хвоста», Бк/нг ДНК	Коэффициент фрагментации
Испытуемые	428,52±41,24	1251,28±94,26	2,92
Контроль	271,47±28,69	1009,87±95,94	3,72

Из полученных результатов (Таблица 4) следует, что ионизирующее излучение наносит достаточно серьезные повреждения ядерной ДНК, а доля наносимого им повреждения в 4,9 раза превышает уровень повреждений в ДНК без облучения (исследованные образцы после проведения эксперимента).

Таблица 5.
Показатели фрагментации ДНК облученных лейкоцитов периферической крови после культивирования
Группа	Активность «ядра», Бк/нг ДНК	Активность «хвоста», Бк/нг ДНК	Коэффициент фрагментации
Испытуемые	665,56±52,39	1457,58±98,65	2,19*
Контроль	342,39±37,57	1242,89±94,94	3,63

В то время как после проведения культивации облученных лейкоцитов (Таблица 5) с целью стимуляции репаративной активности показатель К_фр контрольной группы снизился на 2,4% по сравнению с облученными образцами без культивации, К_фр ядерной ДНК лейкоцитов испытуемых первой группы после культивации достоверно снизился (р≤0,05) на 25,1%.

Полученные результаты можно объяснить с привлечением двух механизмов:

1. Стимуляцией репаративной активности в клетках испытуемых, принимавших препарат «Эйкозавитол» по заданной схеме в профилактических целях.

2. Присутствием в сыворотке крови испытуемых первой группы «факторов, репарации», представляющих собой метаболиты препарата - эйкозаноиды, проявляющие выраженную активность в отношении стимуляции репликативных процессов в клетках.

Таким образом, представленные материалы исследований убедительно свидетельствуют о том, что предложенный препарат полиненасыщенных жирных кислот «Эйкозавитол» обладает выраженным новым неочевидным антимутагенным эффектом за счет способности его метаболитов стимулировать репликативную активность и соответственно репаративные процессы в клетках. Проведенные эксперименты на жителях МО «г.Карпинск» позволяют сделать вывод о том, что названный препарат в указанных дозах может быть эффективно использован в качестве нового антимутагенного средства для защиты генома человека от вредного воздействия факторов окружающий среды и может рассматриваться по новому назначению как профилактически-лечебное антимутагенное средство, расширяя ассортимент препаратов антимутагенного действия, полученных из оригинального сырья.

Новизной изобретения является то, что, основываясь на исследованиях действий эйкозаноидов на ДНК, в результате дополнительного изучения и детального исследования свойств препарата "Эйкозавитол" установлены его новые уникальные антимутагенные свойства и неизвестная раннее способность восстанавливать ДНК, поврежденную вследствие воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды, в частности, ионизирующим излучением природного или техногенного характера, причем эффективность выявленных новых свойств подтверждена в широкомасштабных производственных опытах на добровольцах в зоне экологического неблагополучия, а предложенные дозы применения препарата по новому назначению отличаются от ранее рекомендованных курсов приема по ранее известному назначению.

1. Использование препарата "Эйкозавитол", содержащего жир гидробионтов, включающий полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) класса «Омега 3» в качестве профилактически-лечебного антимутагенного средства для восстановления поражений ДНК от мутагенных воздействий факторов природного и техногенного происхождения.

2. Способ профилактически-лечебного воздействия для восстановления поражений ДНК от мутагенных воздействий, отличающийся тем, что используют "Эйкозавитол" в виде капсул по 1-3 капсула 3-4 раза в день при курсе приема 30-60 дней.