Одноцепочечные рекомбинантные т-клеточные рецепторы

Изобретение относится к биотехнологии. Описан одноцепочечный Т-клеточный рецептор (scTCR), содержащий α сегмент, образованный последовательностью вариабельной области α цепи TCR, соединенной с N-концом внеклеточной последовательности константной области α цепи TCR, β сегмент, образованный последовательностью вариабельной области β цепи TCR, соединенной с N-концом внеклеточной последовательности константной области β цепи TCR, и линкерную последовательность, связывающую С конец α сегмента с N концом β сегмента, или наоборот, при этом: внеклеточные последовательности константных областей α и β сегментов связаны дисульфидной связью, при этом возможно, что внеклеточные последовательности константных областей соответствуют константным областям α и β цепей нативного TCR, усеченным по их С-концам таким образом, что цистеиновые остатки, которые образуют межцепную нативную дисульфидную связь TCR, исключаются, или внеклеточные последовательности константных областей, имеющиеся в α и β сегментах, соответствуют константным областям α и β цепей нативного TCR, в которых цистеиновые остатки, которые образуют нативную межцепную дисульфидную связь, заменяются на другой аминокислотный остаток, или отсутствует неспаренный цистеиновый остаток, имеющийся в β цепи нативного TCR. Данное изобретение делает доступным новый класс альфа/бета - аналогов scTCR, в которых присутствует дисульфидная связь между остатками единичной аминокислотной цепи, вносящая вклад в стабильность соединения между альфа и бета областями молекулы. Такие TCR пригодны для скрининга или для целей терапии. 2 з.п. ф-лы, 11 ил.

 

Настоящее изобретение относится к одноцепочечным Т-клеточным рецепторам (TCR).

Как описывается, например, в Международной заявке WO 99/120, TCR опосредуют распознавание Т клетками специфических комплексов пептидов главного комплекса гистосовместимости (ГКГ, МНС) и, в качестве таковых, играют существенную роль в функционировании иммунной системы на клеточном уровне.

Антитела и TCR - это только два типа молекул, которые распознают антигены специфическим образом, и, следовательно, TCR является единственным рецептором для антигенов конкретных пептидов, присутствующих в МНС, причем чужеродный пептид очень часто является единственным признаком аномальности клетки. Т-клеточное распознавание происходит, когда Т клетка и антиген-презентирующая клетка (АРС) находятся в непосредственном физическом контакте, и инициируется лигированием антигенспецифических TCR с рМНС комплексами.

Нативный TCR представляет собой гетеродимерный белок клеточной поверхности, относящийся к суперсемейству иммуноглобулинов, который ассоциируется с инвариантными белками комплекса CD3, участвующего в опосредовании сигнальной трансдукции. TCR существует в αβ и γδ формах, которые сходны по структуре, но имеют совершенно различные анатомические расположения и, возможно, функции. Лиганды МНС класса I и класса II также являются белками суперсемейства иммуноглобулинов, но различающимися по специфической антигенной презентации, с высокополиморфным сайтом связывания пептида, который позволяет им презентировать различные наборы (матрицы) коротких пептидных фрагментов на клеточной поверхности АРС (антиген-презентирующей клетки).

Известно, что два других класса белков способны функционировать как TCR лиганды. (1) CD1 антигены представляют собой I - родственные молекулы МНС класса, гены которых локализованы на хромосоме, отличной от хромосомы классических антигенов МНС класса I и класса II. Молекулы CD1 способны презентировать пептидные и не пептидные (например, липидные, гликолипидные) частицы Т клеткам способом, аналогичным способам презентации обычных комплексов класса I и класса II. См., например, (Barclay et al, (1997) The Leucocyte Antigen Factsbook 2^nd Edition, Acadmeic Press) и (Bauer (1997) Eur J Immunol 27 (6) 1366-1373)). (2) Бактериальные суперантигены представляют собой растворимые токсины, способные связываться как с молекулами класса II МНС, так и с субпопуляцией TCR. (Fraser (1989) Nature 339221-223). Многие суперантигены проявляют специфичность в отношении одного или двух V бета сегментов, тогда как в случае других наблюдается более беспорядочное (менее избирательное) связывание. Во всяком случае (при любом событии) суперантигены способны проявлять повышенный иммунный ответ за счет их способности стимулировать субпопуляции Т клеток "поликлональным образом".

Внеклеточная часть нативного гетеродимерного αβTCR состоит из двух полипептидов, каждый из которых имеет мембранный проксимальный константный домен и мембранный дистальный вариабельный домен (см. Фигуру 1). Каждый из константного и вариабельного доменов включает внутрицепную дисульфидную связь. Вариабельные домены содержат высокополиморфные петли, аналогичные гипервариабельным областям (CDR) антител. CDR3 Т-клеточного рецептора (TCR) взаимодействует с пептидами, презентированными МНС, а CDR 1 и 2 взаимодействуют с пептидом и МНС. Многообразие TCR последовательностей возникает за счет соматической реаранжировки связанных вариабельного (V), дополнительного (D), соединительного (J) и константного генов. Функциональные полипептиды α цепи образуются реаранжировкой V-J-С областей, тогда как β цепи состоят из V-D-J-С областей. Внеклеточный константный домен содержит мембранную проксимальную область и область иммуноглобулина. Существует единственный константный домен α цепи, известный как TRAC, и два различных β константных домена, известных как TRBC1 и TRBC2 (номенклатура IMGT). Имеется четыре аминокислотных замены между этими β константными доменами, три из которых находятся в доменах, используемых для продуцирования одноцепочечных TCR по данному изобретению. Все эти замены находятся в экзоне 1 TRBC1 и TRBC2: N₄K₅→K₄N₅ и F₃₇→Y (номенклатура IMGT, разности TRBC1→TRBC2), конечная аминокислотная замена находится между двумя константными областями β цепи TCR в экзоне 3 TRBC1 и TRBC2: V₁→E. Протяженность каждого из TCR внеклеточных доменов является до некоторой степени переменчивой. Однако специалист в данной области техники определит положение границ домена, пользуясь ссылкой на The Т Cell Receptor Facts Book, Lefranc & Lefranc, Publ. Academic Press 2001,

Одноцепочечные TCR (Т-клеточные рецепторы)

Одноцепочечные TCR (scTCR) представляют собой искусственные конструкции, состоящие из единственной аминокислотной цепи (тяжа, нити), которые, подобно нативным гетеродермическим TCR, связываются с МНС-пептидными комплексами. К сожалению, попытки получить функциональные альфа/бета аналоги scTCR простым связыванием альфа и бета цепей таким образом, чтобы они обе экспрессировались в единой открытой рамке считывания, оказались неудачными, по-видимому, из-за естественной неустойчивости объединения альфа- и бета растворимых доменов.

Поэтому для получения scTCR требуются специальные методы с применением различных усечений любой или обеих альфа и бета цепей. По-видимому, эти форматы применимы только к очень ограниченному кругу scTCR последовательностей. Soo Hoo et al (1992) PNAS. 89 (10): 4759-63 сообщают об экспрессии мышиного TCR в одноцепочечном формате с помощью клона 2С Т клеток при использовании усеченной бета и альфа цепи, связанной с линкером из 25 аминокислот, и экспрессии бактериального периплазматического белка (см. также Schodin et al (1996) Mol. Immunol. 33 (9): 819-29). Такой дизайн также образует основу для m6 одноцепочечного TCR, о котором сообщают Holler et al (2000) PNAS. 97 (10): 5387-92, который образуется из 2С scTCR и связывается с тем же Н2-Ld - рестриктированным аллоэпитопом. Shusta et al, (2000) Nature Biotechnology 18: 754-759, сообщают о применении одноцепочечных 2 С TCR конструкций в экспериментах по визуализации дрожжей, в результате которых получают мутантные TCR с повышенной термической стабильностью и растворимостью. В этом сообщении также продемонстрирована способность этих визуализированных 2С TCR селективно связываться с клетками, экспрессирующими родственный им рМНС. Khandekar et al (1997) J. Biol. Chem. 272 (51): 32190-7 описывают такой же дизайн для мышиного D 10 TCR, однако этот scTCR слит с МВР и экспрессируется в бактериальной цитоплазме (см. также Hare et al (1999) Nat. Struct. Biol. 6 (6): 574-81). Hilyard et al (1994) PNAS. 91 (19): 9057-61 описывают человеческий scTCR, специфический в отношении матриксного белка вируса гриппа-HLA- А2, полученный с применением дизайна Vα-линкер-Vβ и экспрессированный в бактериальной периплазме.

Chung et al (1994) PNAS. 91 (26) 12654-8 сообщают о получении человеческого scTCR с применением дизайна Vα - линкер - Vβ - Сβ и экспрессии на поверхности клеточной линии млекопитающих. Это сообщение не содержит никаких ссылок на специфическое связывание TCR в отношении пептида - HLA. Plaksin et al (1997) J. Immunol. 158 (5): 2218-27 описывают подобный дизайн Vα- линкер- Vβ- Cβ для получения мышиного scTCR, специфического в отношений эпитопа ВИЧ sp120-H-2D^d. Этот scTCR экспрессируется в виде бактериальных тел включения и вновь скручивается in vitro.

Терапевтическое применение

Существует необходимость в нацеливании частиц, способных локализоваться на клетках (конъюгирование частиц с клетками), пораженных (-ми) болезненным процессом. Такие нацеленные частицы можно использовать либо для непосредственного блокирования "ошибочно направленного" действия иммунной системы, ответственного за аутоиммунное заболевание, либо в качестве средства доставки цитотоксических агентов к раковым клеткам.

В идеале молекулы, пригодные для такого применения, должны обладать специфическим сродством к клеточному маркеру, непосредственно участвующему в релевантном болезненном процессе. Для этой цели можно использовать антитела.

Применение для скрининга

Ряд важных клеточных взаимодействий и клеточных ответов (реакций), включающих TCR-опосредованный иммунный синапс, регулируется контактами между рецепторами клеточной поверхности и лигандами, находящимися на поверхности других клеток. Эти типы специфических молекулярных контактов являются решающими для правильной биохимической регуляции в человеческом организме и поэтому изучаются очень интенсивно. Во многих случаях целью таких исследований является разработка способа модулирования клеточных ответов для предупреждения заболевания или с ним.

Следовательно, методы, с помощью которых можно идентифицировать соединения, связывающиеся с некоторой степенью специфичности с человеческим рецептором или с молекулами лиганда, важны, так как ведут к открытию и разработке новых способов лечения заболевания. В частности, соединения, которые вмешиваются во взаимодействия рецептор - лиганд, можно применять непосредственно в качестве терапевтических агентов или носителей.

Успехи комбинаторной химии, позволяющие сравнительно легко и недорого получать очень большие библиотеки соединений, резко повысили количество тестируемых соединений. В настоящее время ограничения программ скрининга наиболее часто вызваны природой методов анализа, которые можно применять, получением подходящих молекул рецептора и лиганда и тем, насколько эти методы анализа можно адаптировать к высокопродуктивным методам скрининга.

Краткое описание изобретения

Данное изобретение делает доступным новый класс альфа/бета - аналогов scTCR, которые характеризуются присутствием дисульфидной связи между остатками единичной аминокислотной цепи, причем эта связь вносит вклад в стабильность соединения между альфа и бета областями молекулы. Такие TCR пригодны для скрининга или для целей терапии.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение охватывает одноцепочечный Т-клеточный рецептор (scTCR), содержащий α сегмент, составленный последовательностью вариабельной области α цепи TCR, слитой с N концом внеклеточной последовательности константной области α цепи TCR, β сегмент, составленный последовательностью вариабельной области β цепи TCR, слитой с N концом внеклеточной последовательности константной области β цепи TCR, и линкерную последовательность, связывающую С-конец α сегмента с N- концом β сегмента, или наоборот, причем внеклеточные последовательности константной области α или β сегментов связаны дисульфидной связью, а протяженность линкерной последовательности и положение дисульфидной связи таковы, что последовательности вариабельных областей α и β сегментов взаимно ориентированы относительно друг друга практически как в нативных αβ Т-клеточных рецепторах.

В scTCR по изобретению требование, чтобы последовательности вариабельных областей α и β сегментов были взаимно ориентированы относительно друг друга практически как в нативных αβ Т-клеточных рецепторах, проверяют, убеждаясь, что молекула связывается с релевантным TCR лигандом (комплекс рМНС, комплекс CD1-антигена, комплекс суперантигена или комплекс суперантигена/МНС) - если он связывается, тогда условие выполняется. Взаимодействие с комплексами рМНС можно измерять на приборе BIAcore 3000™ или BIAcore 2000™. В Примере 3 по данному описанию или в Международной заявке WO 099/6120 соответственно дано подробное описание методов, необходимых для анализа связывания TCR с МНС- пептидными комплексами. Эти методы одинаково применимы к изучению взаимодействий TCR/CD1 и TCR/суперантиген. Для того чтобы применить эти методы к исследованию взаимодействий TCR/CD1, требуются растворимые формы CD1, получение которых описано в (Bauer (1997) Eur J Immunol 27 (6) 1366-1373).

α и β Сегменты

Внеклеточные последовательности константных областей α и β сегментов, предпочтительно, соответствуют внеклеточным последовательностям константных областей человеческого TCR, то же относится к последовательностям вариабельных областей, присутствующих в α и β сегментах. Однако соотношение между такими последовательностями на уровне аминокислот не обязательно составляет 1:1. Приемлемы усечение N- или С-конца и/или аминокислотная делеция и/или замена в сравнении с соответствующими человеческими последовательностями, при условии, что общим результатом являются такая же взаимная ориентация последовательностей вариабельных доменов α и β сегментов, что и в нативных αβ Т-клеточных рецепторах, и сохранение функциональности связывания пептид - МНС. В частности, вследствие того, что внеклеточные последовательности константных областей в α и β сегментах не находятся в непосредственном контакте с комплексом МНС, с которым связывается scTCR, они могут быть короче, чем внеклеточные последовательности константного домена нативных TCR, или могут содержать замены или делеции по сравнению с внеклеточными последовательностями константного домена нативных TCR.

Внеклеточная последовательность константной области в α сегменте может включать последовательность, соответствующую внеклеточному константному Ig домену α цепи TCR, и/или внеклеточная последовательность константной области в β сегменте может включать последовательность, соответствующую внеклеточному константному Ig домену β цепи TCR.

В одном варианте изобретения α сегмент соответствует практически всей вариабельной области α цепи TCR, слитой с N-концом практически всего внеклеточного домена константной области α цепи TCR; и/или β сегмент соответствует практически всему внеклеточному домену константной области β цепи TCR.

В другом варианте изобретения внеклеточные последовательности константной области в α и β сегментах соответствуют константным областям α и β цепей нативного TCR, усеченным по С-концам таким образом, что исключаются цистеиновые остатки, которые образуют межцепную дисульфидную связь TCR. Или же эти цистеиновые остатки можно заменить на другой аминокислотный остаток, такой как серии или аланин, так что утрачивается (делегируется) нативная дисульфидная связь. Кроме того, нативная β цепь TCR содержит неспаренный цистеиновый остаток и этот остаток можно удалить (делегировать) из β последовательности scTCR по изобретению или заменить на не- цистеиновый остаток в этой последовательности.

В одном особом варианте изобретения последовательности вариабельной области α и β цепей TCR, присутствующие в α и β сегментах, могут вместе соответствовать функциональному вариабельному домену первого TCR, а внеклеточные последовательности константной области α и β цепей TCR, присутствующие в α и β сегментах, могут соответствовать внеклеточным последовательностям константной области α и β цепей второго TCR, при этом первый и второй TCR принадлежат к одному и тому же виду. Таким образом, последовательности вариабельных областей α и β цепей, присутствующие в α и β сегментах, могут соответствовать последовательностям вариабельных областей α и β цепей первого человеческого TCR, a внеклеточные последовательности константной области α и β цепей могут соответствовать внеклеточным последовательностям константной области α и β цепей второго человеческого TCR. Например, внеклеточные последовательности константной области А6 Tax sTCR можно использовать в качестве остова, по которому могут быть слиты гетерологические вариабельные домены.

В другом варианте изобретения последовательности вариабельной области α и β цепей TCR, присутствующие в α и β сегментах, могут вместе соответствовать функциональному вариабельному домену первого TCR, а внеклеточные последовательности константной области α и β цепей TCR, присутствующие в α и β сегментах, могут соответствовать внеклеточным последовательностям константной области α и β цепей второго TCR, при этом первый и второй TCR принадлежат к разным видам. В этом варианте изобретения предпочтительно, чтобы последовательности вариабельных областей α и β цепей TCR, присутствующие в α и β сегментах, вместе соответствовали функциональному вариабельному домену человеческого TCR, a внеклеточные последовательности константной области α и β цепей TCR, присутствующие в α и β сегментах, соответствовали внеклеточным последовательностям константной области α и β цепей мышиного TCR. Такие варианты настоящего изобретения имеют то преимущество, что scTCR содержат последовательности константных областей не человеческого происхождения, которые, по-видимому, являются иммуногенными и, вероятно, таким образом, они повышают общий иммунный ответ на TCR, локализуясь на его клетках-мишенях. Таким образом, можно повысить иммунный ответ на аберрантные клетки, такие как раковые клетки.

Линкер

В настоящем изобретении линкерная последовательность связывает α и β сегменты с образованием единой полипептидной цепи. Линкерная последовательность может, например, иметь формулу - Р-АА-Р-, где Р обозначает пролин, а АА обозначает аминокислотную последовательность, в которой аминокислоты представляют собой глицин и серин.

Для того чтобы scTCR связывался с МНС-пептидным комплексом, α и β сегменты должны соединяться таким образом, чтобы последовательности вариабельных областей этих сегментов были ориентированы для этого связывания. Следовательно, линкер должен иметь длину, достаточную для того, чтобы заполнить расстояние между С-концом α сегмента и N-концом β сегмента, или наоборот. С другой стороны, следует избегать избыточной длины, иначе в этом случае конец линкера в N-концевой последовательности вариабельной области блокирует или ослабляет связывание scTCR с целевым комплексом пептид - МНС.

Например, в том случае, когда внеклеточные последовательности константной области, присутствующие в α и β сегментах, соответствуют константным областям α и β цепей нативного TCR, усеченным по С концам таким образом, что цистеиновые остатки, которые образуют нативную межцепную дисульфидную связь TCR, исключаются, а линкерная последовательность связывает С-конец α сегмента с N-концом β сегмента, линкер может состоять из 26-41, например, 29, 30, 31 или 32 аминокислот, а конкретный линкер имеет формулу - PGGG-(SGGGG)₅-Р-, где Р обозначает пролин, G обозначает глицин, a S обозначает серин.

Дисульфидная связь

Основным характерным признаком scTCR по настоящему изобретению является дисульфидная связь между внеклеточными последовательностями α и β сегментов. Эта связь может соответствовать нативной межцепной дисульфидной связи, имеющейся в нативных димерных αβ TCR, или может не иметь аналога в нативных TCR, располагаясь между цистеиновыми остатками, специфически введенными во внеклеточные последовательности константных областей α и β сегментов. В некоторых случаях как нативная, так и не нативная дисульфидная связь может быть желательна в присутствующих scTCR.

Положение дисульфидной связи подчиняется требованию, что последовательности α и β сегментов взаимно ориентированы практически так, как в нативных αβ Т-клеточных рецепторах.

Дисульфидная связь может образовываться при мутации не- цистеиновых остатков на α и β сегментах в цистеин, что побуждает к образованию связи между мутаитными остатками. Предпочтительными являются остатки, соответствующие β-углеродные атомы которых в нативном TCR находятся на расстоянии, примерно, 6 Å (0.6 нм) или менее, предпочтительно, в интервале 3.5 Å (0.35 нм) - 5.9 Å (0.59 нм), так что между цистеиновыми остатками, введенными на место нативных остатков, может образовываться дисульфидная связь. Предпочтительными сайтами, в которые могут быть введены цистеиновые остатки, образующие дисульфидную связь, являются следующие остатки в экзоне 1 TRAC*01 для α цепи TCR и TRBC1*01 или TRBC2*01 для β цепи TCR:

α цепь TCR	α цепь TCR	Расстояние между нативными β углеродными атомами (нм)
Thr 48	Ser 57	0.473
Thr 45	Ser 77	0.533
Tyr 10	Ser 17	0.359
Thr 45	Asp 59	0.560
Ser 15	Glu 15	0.59

Теперь, когда идентифицированы остатки в человеческих TCR, которые можно заменить на цистеиновые остатки для образования новой межцепной дисульфидной связи в scTCR по данному изобретению, специалисты в данной области техники смогут таким же образом осуществить мутации в TCR других видов, чтобы получить scTCR этих видов. Для последовательностей человеческого происхождения специалисту в данной области техники требуется лишь поискать следующие мотивы в соответствующих цепях TCR для идентификации остатка, который следует заменить (выделенный остаток представляет собой остаток, заменяемый на цистеин).

α Цепь Thr 48:	DSDVYITDKTVLDMRSMDFK (аминокислоты 39-58 экзона 1 гена ТРАС*01)
α Цепь Thr 45:	QSKDSDVYITDKTVLDMRSM (аминокислоты 36-55 экзона 1 гена ТКАС*01)
α Цепь Tyr 10:	DIQNPDPAVYQLRDSKSSDK (аминокислоты 1-20 экзона 1 гена ТКАС*01)
α Цепь Ser 15:	DPAVYQLRDSKSSDKSVCLF (аминокислоты 6-25 экзона 1 гена ТКАС*01)
β Цепь Ser 57:	NGKEVHSGVSTDPQPLKEQP (аминокислоты 48-67 экзона 1 генов TRBC1*01 & TRBC2*01)
β Цепь Ser 77:	ALNDSRYALSSRLRVSATFW (аминокислоты 68-87 экзона 1 генов TRBC1*01 & TRBC2*01)
β Цепь Ser 17:	PPEVAVFEPSEAEISHTQKA (аминокислоты 8-27 экзона 1 генов TRBC1*01 & TRBC2*01)
β Цепь Asp 59:	KEVHSGVSTDPQPLKEQPAL (аминокислоты 50-69 экзона 1 генов TRBC1*01 & TRBC2*01)
β Цепь Glu 15:	VFPPEVAVFEPSEAEISHTQ (аминокислоты 6-25 экзона 1 генов TRBC1*01 & TRBC2*01)

В других видах цепи TCR могут не содержать области, которая на 100% идентична вышеприведенным мотивам. Однако специалист в данной области техники способен использовать вышеприведенные мотивы для идентификации эквивалентной части α или β цепи TCR и, следовательно, остаток, который следует заменить на цистеин. Для этого можно использовать методы выравнивания последовательностей. Например, ClustalW, доступный в Интернете на сайте European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk/index.html), можно использовать для сравнения вышеприведенных мотивов с последовательностью цепи конкретного TCR, чтобы локализировать релевантный участок TCR последовательности для мутации.

В объем настоящего изобретения входят αβ аналоги scTCR, а также scTCR других млекопитающих, включая, но без ограничения, мышь, крысу, свинью, козу и овцу. Также настоящее изобретение включает обсуждавшиеся выше химерные человеческие/не человеческие scTCR. Как упоминается выше, специалист в данной области техники сможет определить сайты, эквивалентные вышеописанным сайтам последовательностей человеческого происхождения, в которые можно ввести цистеиновые остатки с образованием межцепной дисульфидной связи. Например, ниже показаны аминокислотные последовательности мышиных Сα и Сβ растворимых доменов вместе с мотивами, показывающими мышиные остатки, эквивалентные остаткам последовательностей человеческого происхождения, упомянутым выше, которые могут заменяться на цистеиновые остатки с целью образования TCR межцепной дисульфидной связи (в которой релевантные остатки выделены (заштрихованы)):

Мышиный Сα растворимый домен:

PYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMK

AMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVP

Мышиный Сβ растворимый домен:

EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGREV

HSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDK

WPTGSPKPVTQNISAEAWGRAD

Мышиный эквивалент человеческой α цепи Thr 48: ESGTFITDKTVLDMKAMDSK

Мышиный эквивалент человеческой α цепи Thr 45: KTMESGTFITDKTVLDMKAM

Мышиный эквивалент человеческой α цепи Tyr 10: YIQNPEPAVYQLKDPRSQDS

Мышиный эквивалент человеческой α цепи Ser 15: AVYQLKDPRSQDSTLCLFTD

Мышиный эквивалент человеческой α цепи Ser 57: NGREVHSGVSTDPQAYKESN

Мышиный эквивалент человеческой β цепи Ser 77: KESNYSYCLSSRLRVSATFW

Мышиный эквивалент человеческой β цепи Ser 17: PPKVSLFEPSKAEIANKQKA

Мышиный эквивалент человеческой β цепи Asp 59: REVHSGVSTDPQAYKESNYS

Мышиный эквивалент человеческой β цепи Glu 15: VTPPKVSLFEPSKAEIANKQ

Как обсуждается выше, А6Тах sTCR внеклеточные константные области можно использовать в качестве каркаса, по которому могут быть слиты гетерологические вариабельные домены. Предпочтительно, чтобы гетерологические последовательности вариабельной области были связаны с последовательностями константной области в любой точке между дисульфидной связью и N-концами последовательностей константной области. В случае последовательностей α и β константных областей А6 Tax TCR дисульфидная связь может образовываться между цистеиновыми остатками, введенными в аминокислотные положения 158 и 172 соответственно. Следовательно, предпочтительно, когда точки присоединения гетерологической последовательности вариабельной области α и β цепей находится между остатками 159 и 173 и N-концом последовательностей α и β константных областей соответственно.

Дополнительные аспекты

scTCR (который, предпочтительно, является человеческим) по настоящему изобретению может быть получен в практически чистой форме или в виде очищенного или выделенного препарата. Например, его можно получать практически не содержащим другие белки.

Многие scTCR по настоящему изобретению можно получать в виде поливалентного комплекса. Так, настоящее изобретение в одном аспекте включает поливалентный комплекс Т-клеточного рецептора (TCR), который содержит множество растворимых Т-клеточных рецепторов по данному описанию. Предпочтительно, каждый из множества растворимых TCR является идентичным другим TCR.

В поливалентном комплексе по настоящему изобретению scTCR могут быть в виде мультимеров и/или могут присутствовать на липидном бислое, например, липосомы, либо могут быть ассоциированы с этим бислоем.

В своей простейшей форме поливалентный комплекс scTCR по данному изобретению содержит мультимер из двух, или трех, или четырех, или более молекул Т-клеточных рецепторов, ассоциированных (например, связанных ковалентной или другой связью) друг с другом, предпочтительно, с помощью линкерной молекулы. Подходящие линкерные молекулы включают, но без ограничения, молекулы мульти(поли)валентного связывания (такие как авидин, стрептавидин, нейтравидин (neutravidin) и экстравидин), которые имеют четыре сайта связывания с биотином). Так, биотинилированные молекулы TCR могут образовывать мультимеры Т-клеточных рецепторов, имеющие множество TCR сайтов связывания. Число TCR молекул в мультимере зависит от количества TCR, связанных с числом линкерных молекул, применяемых для получения мультимера, и также от присутствия или отсутствия любых других биотинилированных молекул. Предпочтительными мультимерами являются димерные, гримерные или тетрамерные TCR комплексы.

Структуры, намного более длинные, чем тетрамеры TCR, можно использовать для слежения или нацеливания клеток, экспрессирующих специфический МНС-пептидный комплекс. Предпочтительно, структуры имеют в диаметре от 10 нм до 10 мкм. Каждая структура может визуализировать множество scTCR молекул на достаточном расстоянии друг от друга, чтобы две или более молекулы TCR на структуре смогли связываться одновременно с двумя или более МНС-пептидными комплексами на клетке и, тем самым, повысить авидность мультимерной связующей частицы по отношению к клетке.

Подходящие структуры для применения по изобретению, для образования комплексов с одним или более scTCR, включают мембранные структуры, такие как липосомы и твердые структуры, которые, предпочтительно, представляют собой, частицы, такие как гранулы (бусы, шарики, сферы), например латексные гранулы. Также пригодны другие структуры, на которые сверху могут быть нанесены молекулы Т-клеточного рецептора. Предпочтительно, структуры покрыты скорее мультимерами Т-клеточного рецептора, нежели индивидуальными молекулами Т-клеточного рецептора.

В случае липосом молекулы Т-клеточных рецепторов или их мультимеры могут связываться с мембраной или иным образом ассоциироваться с ней. Специалистам в данной области техники хорошо известны методы связывания или ассоциации с мембраной.

В мультивалентный scTCR комплекс по настоящему изобретению можно включать метку или другую частицу, такую как токсическая или терапевтическая частица. Например, метку или другую частицу можно включать в смешанную мультимерную молекулу. Примером такой мультимерной молекулы является тетрамер, содержащий три молекулы scTCR и одну молекулу пероксидазы. Этого можно достичь, смешивая TCR и фермент в молярном соотношении 3:1 для получения тетрамерных комплексов и отделяя нужный комплекс от любых комплексов, не содержащих корректное соотношение молекул. Эти смешанные молекулы могут содержать любые комбинации молекул при условии, что пространственные затруднения не угрожают или практически не угрожают заданной функции молекул. Позиционирование сайтов связывания на молекуле стрептавидина пригодно для смешанных тетрамеров, так как пространственные затруднения, по-видимому, отсутствуют.

В другом аспекте изобретение включает способ детектирования МНС-пептидных комплексов, включающий:

а. получение scTCR по настоящему изобретению

б. контактирование scTCR с МНС-пептидными комплексами; и

детектирование связывания scTCR с МНС-пептидными комплексами.

Терапевтическое применение

scTCR (или его мультивалентный комплекс) по настоящему изобретению может альтернативно или дополнительно ассоциироваться с (например, за счет ковалентного или иного связывания) терапевтическим агентом, который может представлять собой, например, токсическую частицу для киллинга клеток, или иммуностимулятор, такой как интерлейкин или цитокин. Мультивалентный scTCR комплекс по настоящему изобретению может иметь повышенную связывающую способность в отношении TCR лиганда, такого как комплекс рМНС или молекула CD1, по сравнению с немультимерным гетеродимером Т-клеточного рецептора. Так, мультивалентные scTCR комплексы по изобретению особенно применимы для слежения за клетками или нацеливания клеток, презентирующих конкретные антигены in vitro или in vivo, и также применимы в качестве интермедиатов для получения других мультивалентных TCR комплексов, применяющихся для тех же целей. Следовательно, scTCR или мультивалентный scTCR комплекс можно получать в виде фармацевтически приемлемого препарата для применения in vivo.

Данное изобретение также включает способ доставки терапевтического агента к клетке-мишени, и этот метод заключается в контактировании потенциальных клеток-мишеней с scTCR или мультивалентным scTCR комплексом по изобретению в условиях, допускающих связывание scTCR или мультивалентного scTCR комплекса с клеткой-мишенью, причем указанный scTCR или мультивалентный scTCR комплекс является специфическим в отношении комплексов МНС-пептид и содержит ассоциированный с ним терапевтический агент.

В частности, растворимый scTCR или мультивалентный scTCR комплекс можно использовать для доставки терапевтических агентов к клеткам (к расположению клеток), презентирующим конкретный ген. Это может применяться во многих ситуациях, в частности, против опухолей. Терапевтический агент можно доставлять таким образом, что при этом его действие проявляется локально, но не только в отношении клетки, с которой он связывается. Так, один особый способ рассматривает (намечает) противоопухолевые молекулы, связанные с Т-клеточными рецепторами, или мультивалентные scTCR комплексы, специфические в отношении опухолевых антигенов.

Многие терапевтические антигены можно использовать для такого применения, например, радиоактивные соединения, ферменты (например, перфорин) или химиотерапевтические агенты (например, цисплатин). Чтобы гарантировать, что токсические эффекты осуществляются в заданном месте, токсин внутри липосомы можно связывать со стрептавидином таким образом, что соединение высвобождается медленно. Это предупреждает повреждения в организме в процессе транспорта и гарантирует, что токсин оказывает максимальное действие после связывания scTCR с релевантной антиген-презентирующими клетками.

Другие подходящие терапевтические агенты включают:

- цитотоксические низкомолекулярные агенты (цитотоксические агенты - малые молекулы), например соединения, способные убивать клетки млекопитающих, имеющие молекулярную массу менее 700 Да. Такие соединения могут также содержать токсические металлы, способные оказывать цитотоксический эффект. Кроме того, следует понимать, что эти низкомолекулярные цитотоксические агенты также включают пролекарства, т.е. соединения, которые распадаются или превращаются в физиологических условиях с выделением цитотоксических агентов. Примеры таких агентов включают цисплатин, производные майтанзина, рахелмицин (рейчелмицин, rachelmycin), калихеамицин, доцетаксел, этопозид, гемцитабин, ифосфамид, иринотекан, мелфалан, митоксантрон, "сорфимер" (sorfimer) натрий фотофрин II, темозолмид, топотекан, триметреат (trimetreate) глюкуронат, ауристатин Е, винкристин и доксорубицин;

- пептидные цитотоксины, т.е. белки или их фрагменты, способные убивать клетки млекопитающих. Примеры включают рицин, дифтерийный токсин, бактериальный экзотоксин А псевдомонад, ДНК-азу и РНК-азу;

- радионуклиды, т.е. нестабильные изотопы элементов, которые распадаются с конкурентной эмиссией одной или более α или β частиц или γ-лучей. Примеры включают йод 131, рений 186, индий 111, иттрий 90, висмут 210 и 213, актиний 225 и астатин 213;

- пролекарства, такие как направляемые антителом ферментные пролекарства;

- иммуностимуляторы, т.е. частицы, которые стимулируют иммунный ответ. Примеры включают цитокины, такие как IL-2, хемокины, такие как IL8, фактор тромбоцитов - 4, белок - стимулятор роста меланомы и т.д., антитела или их фрагменты, активаторы комплемента, домены ксеногенных белков, домены аллогенных белков, домены вирусных/бактериальных белков и вирусные/бактериальные пептиды.

Растворимые scTCR или поливалентные комплексы scTCR по изобретению могут быть связаны с ферментом, способным превращать пролекарство в лекарственное соединение. Это позволяет превращать пролекарство в лекарственное соединение лишь в месте, где оно необходимо (т.е. нацеленном с помощью scTCR).

Примеры подходящих мишеней МНС-пептид для scTCR по изобретению включают, но без ограничения, вирусные эпитопы, такие как эпитопы HTLV - 1 (например, пептид Tax, разрезанный с помощью рестриктазы HLA - A2; HTLV - 1, ассоциированный с лейкозом), эпитопы ВИЧ, эпитопы EBV (вируса Эпштейна - Барр, ЭБВ), эпитопы CMV (питомегаловируса); эпитопы меланомы (например, эпитоп MAGE, разрезанный рестриктазой HLA - A1) и другие специфические в отношении рака эпитопы (например, антиген G250, ассоциированный с раком почки, разрезанный рестриктазой HLA - A2); и эпитопы, ассоциированные с аутоиммунными нарушениями, такими как ревматоидный артрит. Другие рМНС-мишени, ассоциированные с заболеваниями, пригодные для применения по данному изобретению, перечислены в HLA Factbook (Barklay (Ed) Academic Press), идентифицированы также многие другие.

Доставка лекарственных веществ с локализацией (локализирующая) за счет специфичности scTCR потенциально может увеличить число способов лечения заболеваний.

Лечение вирусных заболеваний, для которых существуют лекарственные средства, например ВИЧ, SIV (вирус иммунодефицита у обезьян), EBV (ЭБВ), CMV, станет более эффективным, если лекарственное вещество высвобождается или активируется в непосредственной близости от инфицированных клеток. При раке локализация вблизи опухолей или метастаз повысит эффект токсинов или иммуностимуляторов. При аутоиммунных заболеваниях иммуносупрессоры (иммунодепрессанты) могут высвобождаться медленно, оказывая более локальное действие в течение более длительного промежутка времени при минимальном влиянии на общий иммунитет субъекта. Для предупреждения отторжения трансплантата действие иммуносупрессоров можно оптимизировать таким же образом. Для доставки вакцин антиген вакцин можно локализовать вблизи антиген-презентирующих клеток, тем самым повышая эффективность антигена. Метод также можно применять для целей получения изображения (визуализации).

scTCR по настоящему изобретению можно использовать для модуляции Т-клеточной активации путем связывания со специфическими лигандами, такими как рМНС, и тем самым подавляя Т-клеточную активацию. Аутоиммунные заболевания, включающие опосредованное Т клетками воспаление и/или поражение тканей, поддаются такому способу лечения, например диабет типа I. Для такого применения требуется знание специфического пептидного эпитопа, предоставляемого релевантным рМНС.

Лекарственные вещества по данному изобретению, как правило, поставляются как часть стерильной фармацевтической композиции, которая обычно содержит фармацевтически приемлемый носитель. Эта фармацевтическая композиция может находиться в любой подходящей форме (в зависимости от нужного метода введения ее пациенту). Она может поставляться в виде разовой (однократной) лекарственной формы, как правило, она поставляется в плотно закрытом контейнере и может быть частью набора. Такой набор обычно (хотя не обязательно) включает инструкции для пользования. Он может включать множество разовых лекарственных форм.

Фармацевтическую композицию можно приспособить для введения любым подходящим методом, например пероральным (включая трансбуккальный или подъязычный), ректальным, назальным, местным (включая трансбуккальный, подъязычный или чрескожный (трансдермальный)), вагинальным или парентеральным (включая подкожный, внутримышечный, внутривенный или внутрикожный (интрадермальный)) методом. Такие композиции можно приготовить любым методом, известным в технике фармации, например, смешивая активный ингредиент с носителем (носителями) или эксципиентом (эксципиентами) в стерильных условиях.

Применение для скрининга

scTCR по настоящему изобретению можно применять в методах скрининга, предназначенных для идентификации модуляторов, включая ингибиторы, опосредованного TCR клеточного иммунного синапса.

Системы гомогенного амплифицированного за счет эффекта близости люминесцентного анализа (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay), такие как AlphaScreen™, основаны на применении "донорных" и "акцепторных" сфер (гранул, бус), покрытых слоем гидрогеля, с которым могут быть связаны рецептор и белки лиганда. Взаимодействие между этими молекулами рецептора и лиганда приводит к сближению сфер. Когда эти сферы подвергаются лазерному облучению, фотосенсибилизатор в "донорной" сфере переводит обычный кислород в более возбужденное синглетное состояние. Молекулы синглетного кислорода диффундируют и реагируют с хемилюминесцентной меткой на сфере "акцептора", что дополнительно активирует флуорофоры в той же сфере. Флуорофоры затем излучают свет с длиной волны 520-620 нм, это является сигналом того, что произошло взаимодействие рецептора с лигандом. Присутствие ингибитора взаимодействия рецептор-лиганд ведет к ослаблению сигнала.

Метод поверхностного плазменного резонанса (SPR) представляет собой метод анализа оптического интерфейса, в котором один партнер связывания (обычно рецептор) иммобилизуется на "чипе" (сенсорной поверхности), а детектируют связывание другого связывающего партнера (обычно лиганда), который является растворимым и вынужден "стекать" с чипа ("переливаться" через чип). Связывание лиганда приводит к повышению концентрации белка близ поверхности чипа, что вызывает изменение показателя преломления в этой области. Поверхность чипа составлена таким образом, что изменение показателя преломления можно обнаружить с помощью поверхностного плазменного резонанса, оптического явления, при котором свет, падающий под определенным углом на тонкую металлическую пленку, дает отраженный луч меньшей интенсивности вследствие резонансного возбуждения волн с осциллирующей поверхностной плотностью заряда (поверхностные плазмоны). Резонанс очень чувствителен к изменениям показателя преломления на дальней стороне пленки металла, и это представляет собой сигнал, который используют для обнаружения связывания между иммобилизованным и растворимым белками. Системы, которые делают возможным удобное применение SPR детекции молекулярных взаимодействий и анализ данных, являются доступными. Примерами являются установки Iasys™ (Fisons) и Biacore™.

Другие методы анализа оптического интерфейса включают флуоресценцию полного внутреннего отражения (TIFR), резонансное зеркало (RM) и оптический сенсор (optical grating coupler sensor, GCS) и более подробно обсуждаются в обзоре Woodbury and Venton (J. Chromatog. В. 725 113-137 (1999)). Метод сцинтилляций при сближении (SPA) используют для скрининга библиотек соединений на ингибиторы низкоаффинного взаимодействия между CD28 и В7 (величина K_d, вероятно, в области 4 мкМ (Van der Merwe et al J. Exp. Med. 185: 393-403 (1997), Jehn et al. Anal Biochem 165(2) 287-93 (1998). SPA представляет собой радиоактивный метод анализа, использующий эмиссию бета-частиц из некоторых радиоактивных изотопов, которые переносят энергию на сцинтиллятор, иммобилизованный на поверхности индикатора. Короткий интервал бета-частиц в растворе гарантирует, что сцинтилляция происходит только тогда, когда бета-частицы излучаются в непосредственной близости к сцинтиллятору. При применении для обнаружения белок-белковых взаимодействий один партнер взаимодействия метят радиоизотопом, тогда как другой либо связан с гранулами (сферами, бусами), содержащими сцинтиллятор, либо иммобилизован на поверхности вместе со сцинтиллятором. Если анализ можно осуществить оптимальным образом, радиоизотоп помещают достаточно близко к сцинтиллятору для того, чтобы фотонная эмиссия активировалась только тогда, когда происходит процесс связывания двух белков.

Другим аспектом изобретения является способ идентификации ингибитора взаимодействия между scTCR и лигандом TCR, выбранным из МНС-пептидных комплексов, комплексов CD1-антигена, суперантигенов и комплексов МНС-пептид/суперантиген, заключающийся в контактировании scTCR с партнером связывания scTCR-лиганд в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения и в определении, уменьшает ли присутствие тестируемого соединения связывание scTCR с лигандом, причем такое уменьшение принимают как идентифицирующее ингибитор.

Конечным аспектом изобретения является способ идентификации потенциального ингибитора взаимодействия между scTCR и лигандом TCR, выбранным из МНС-пептидных комплексов, комплексов CD1-антигена, суперантигенов и комплексов МНС-пептид/суперантиген, заключающийся в контактировании scTCR или scTCR-лигандсвязывающего партнера с тестируемым соединением и в определении, действительно ли тестируемое соединение связывается с scTCR и/или с лигандом, причем такое уменьшение принимают как идентифицирующее потенциальный ингибитор.

Этот аспект изобретения может найти применение, в частности, в анализах с участием оптического интерфейса (межповерхностный оптический анализ), таких как анализы, проводимые с применением системы BIAcore™.

Предпочтительные признаки каждого аспекта изобретения применимы для любого другого аспекта с соответствующими изменениями. Документы предыдущей техники, упоминаемые в данном описании, вводятся наиболее во всей полноте, допускаемой законодательством.

Примеры

Далее изобретение описывается с помощью нижеприведенных примеров, которые никоим образом не ограничивают объем изобретения.

Приводятся ссылки на следующие прилагающиеся рисунки, где:

На Фигурах 1a и 1b соответственно показаны нуклеотидные последовательности α и β цепей растворимого А6 TCR, мутировавшего таким образом, чтобы ввести цистеиновые кодоны;

На Фигуре 2а показана внеклеточная аминокислотная последовательность α цепи А6 TCR, включающая мутацию T₄₈→С (подчеркнута), использованную для получения новой дисульфидной межцепной связи, а на Фигуре 2b показана внеклеточная аминокислотная последовательность β цепи А6 TCR, включающая мутацию S₅₇→С (подчеркнута), использованную для получения новой дисульфидной межцепной связи;

На Фигуре 3 показаны ДНК и аминокислотная последовательность линкера Gly/Ser (30- мер)

На Фигуре 4 суммарно показана стратегия клонирования, применяемая для получения scDiS А6 TCR.

На Фигуре 5 показана последовательность ДНК scDiS A6TCR.

На Фигуре 5b показана аминокислотная последовательность scDiS A6TCR.

На Фигуре 6 иллюстрируется элюция scDiS A6 TCR белка с ионообменной колонки POROS 50HQ в градиенте Nad 0-500 мМ, как изображено прямой линией;

На Фигуре 7 показаны результаты электрофореза как в восстанавливающем SDS-PAGE (окрашен Кумасси) и в невосстанавливающем SDS-PAGE (окрашен Кумасси) геле для фракций А15, В10, В9 и В3, отбираемых с колонки, проиллюстрированных на Фигуре 6. Четко видно, что фракции В9 и В 10 содержат белок, соответствующий ожидаемому размеру scDiS А6 TCR.

На Фигуре 8 иллюстрируется элюция scDiS A6 TCR с колонки Superdex 200 для гель-фильтрации для фракций В 10-В7, отобранных с ионообменной колонки, показанных на Фигуре 6;

На Фигуре 9 показаны результаты электрофореза как в восстанавливающем SDS-PAGE (окрашен Кумасси) и в невосстанавливающем SDS-PAGE (окрашен Кумасси) геле для фракций В8, В7, В3 и В2, отбираемых с колонки для гель-фильтрации, как проиллюстрировано на Фигуре 8. Четко видно, что фракция В7 содержит белок, соответствующий ожидаемому размеру scDiS A6 TCR.

На Фигуре 10 показан результат конечной гель-фильтрации в буфер BIAcore концентрированных фракций В9-В6, отобранных с колонки для гель-фильтрации, как показано на Фигуре 8. scDiS А6 TCR выходит в виде одного основного пика.

На Фигуре 11 приведены данные BIAcore для связывания scDiS A6 TCR с HLA-А2Тах;

Пример 1 - Дизайн праймеров и мутагенеза α и β цепей A6 Tax TCR с целью введения цистеиновых остатков, необходимых для образования новой межцепной дисульфидной связи

Для осуществления мутации треонина 48 экзона 1 A6 Tax в TRAC*01 в цистеин создают следующие праймеры (мутация показана строчными буквами):

5' - С АСА GAC ААА tgT GTG СТА GAC AT

5' - АТ GTC TAG САС Аса ТТТ GTC TGT G

Для осуществления мутации серина 57 экзона 1 А6 Tax как в TRBC1*01, так и and в TRBC2*01 в цистеин создают следующие праймеры (мутация показана строчными буквами):

5' - С AGT GGG GTC tGC АСА GAC СС

5' - GG GTC TGT GCa GAC CCC ACT G

PCR (ПЦР) мутагенез:

Мутацию плазмид экспрессии, содержащих гены α или β цепи А6 Tax TCR осуществляют с применением праймеров α цепи и праймеров β цепи соответственно следующим образом. 100 нг смешивают с 5 мкл 10 мМ dNTP, 25 мкл буфера 10х Pfu (Stratagene), 10 ед. Pfu полимеразы (Stratagene) и конечный объем доводят до 240 мкл, добавляя Н₂O. 48 мкл этой смеси дополняют праймерами, разведенными до конечной концентрации 0.2 мкМ в 50 мкл конечного объема реакционной смеси. После начальной стадии денатурации 30 секунд при 95°С реакционную смесь подвергают 15 циклам денатурации (95°С, 30 сек.), отжига (55°С, 60 сек.) и элонгации (73°С, 8 мин.) на приборе Hybaid PCR для экспресс - ПЦР. Затем продукт расщепляют в течение 5 часов при 37°С с помощью 10 Единиц рестриктазы DpnI (New England Biolabs). 10 мкл расщепленной реакционной смеси трансформируют в XL1 - Голубые бактерии и выращивают в течение 18 часов при 37°С. Отбирают единичную колонию и выращивают в течение ночи в 5 мл TYP + ампициллин (16 г/л Бакто-Триптон, 16 г/л дрожжевой экстракт, 5 г/л Nad, 2.5 г/л K₂HPO₄, 100 мг/л ампициллина). Плазмидную ДНК очищают на минипрепаративной колонке Qiagen в соответствии с рекомендациями производителя и последовательность подтверждают автоматическим секвенированием на установке Department of Biochemistry (отделения биохимии), oxford University). Соответствующие мутантные нуклеотидная и аминокислотная последовательности представлены на Фигурах 1а и 2а для α цепи и на Фигурах 1b и 2b для β цепи.

Пример 2 - Дизайн, экспрессия и тестирование одноцепочечного А6 TCR, вводящего новую дисульфидную межцепную связь.

Векторы экспрессии, содержащие последовательности ДНК α и β цепей мутантного А6 TCR, вводящие дополнительные цистеиновые остатки, необходимые для образования новой дисульфидной связи, полученные в Примере 1 и показанные на Фигурах 1а и 1b, используют как основу для получения одноцепочечного А6 TCR за исключением того, что удаляют стоп-кодон (ТАА) на конце последовательности α цепи следующим образом:

scDiS А6 TCR содержит линкерную последовательность из 30 аминокислот между С-концом α цепи TCR и N- концом β цепи. На Фигуре 3 показаны последовательность ДНК и аминокислотная последовательность этого линкера. Стратегия клонирования, примененная для получения scDiS A6 TCR, суммарно показана на Фигуре 4.

Коротко говоря, альфа и бета цепи А6 ds (двухцепочечного) TCR амплифицируют методом ПЦР, используя праймеры, содержащие сайты рестрикции, как показано на Фигуре 4, т.е.:

Альфа 5': ccaaggccatatgcagaaggaagtggagcagaactct

Альфа 3' праймер: ttgggcccgccggatccgcccccgggggaactttctgggctgggg

Бета 5' праймер: tcccccgggggcggatccggcgggcccaacgctggtgtactcag

Бета 3' праймер: gggaagcttagtctgctctaccccaggcctcg

Два фрагмента, полученные таким образом, сшивают с помощью ПЦР (PCR), применяя 5' альфа и 3' бета праймеры для образования одноцепочечного TCR, с коротким линкером, содержащим сайты Xmal- BamHI- Apal. Этот фрагмент клонируют в pGMT7. Затем, полноразмерный линкер вводят в виде инсерции в две стадии, сначала вводят фрагмент 42 п.о., используя сайты Xmal и BamHI:

5' - СС GGG GGT GGC ТСТ GGC GGT GGC GGT TCA GGC GGT GGC G -3'

3' - С ССА CCG AGA CCG ССА CCG ССА AGT CCG ССА CCG ССТ АС -5'

Во-вторых, фрагмент 48 п.о. встраивают, используя сайты BamHI и Apal для создания линкера 90 п.о. между 3' концом альфа цепи и 5' концом бета цепи. Фрагмент 48 п.о. получают PCR элонгацией смеси следующих олигомеров:

5' - GC GGA ТСС GGC GGT GGC GGT TCG GGT GGC GGT GGC ТС - 3'

3' - ССА AGC ССА CCG ССА CCG AGT CCG ССА CCG CCC GGG TG - 5'

Продукт этого удлинения расщепляют с помощью BamHI и ApaI и лигируют в расщепленную плазмиду, содержащую фрагмент линкера 42 п.о.

Полная последовательность ДНК и полная аминокислотная последовательность scDiS А6 TCR показаны на Фигурах 5а и 5b соответственно.

Экспрессия А6 TCR:

Плазмиду экспрессии, содержащую одноцепочечный связанный дисульфидной связью А6 TCR, трансформируют в штамм E.coli BL21pLysS и одиночные резистентные к ампициллину колонии выращивают при 37°С в среде TYP (ампициллин 100 мкг/мл) до оптической плотности OD₆₀₀ 0.4 перед тем, как индуцировать экспрессию белка с помощью 0.5 mM IPTG. Клетки собирают через три часа после индукции центрифугированием в течение 30 минут при 4000 об/мин в центрифуге Beckman J-6B. Клеточный осадок ресуспендируют в буфере, содержащем 50 мМ Tris - HCl, 25% (вес/об) сахарозы, 1 мМ NaEDTA, 0.1% (вес/об) NaAzide (NaN₃), 10 мМ DTT, pH 8.0. После стадии замораживания-оттаивания в течение ночи ресуспендированные клетки подвергают ультрафильтрации в виде 1-минутных "пучков импульсов" в течение 10 минут на ультразвуковом дезинтеграторе Milsonix XL2020, используя стандартные зонды диаметром 12 мм. Осадок (пеллеты) тел включения регенерируют центрифугированием в течение 30 мин при скорости 13000 об/мин на центрифуге Beckman J2- 21. Затем трижды отмывают детергентом для удаления клеточного дебриса и компонентов мембраны. Каждый раз пеллеты тел включения гомогенизируют в буфере Triton (50 мМ Tris - HCl, 0.5% Triton - X100, 200 мМ NaCl, 10 мМ NaEDTA, 0.1% (вес/об) NaAzide, 2 мМ DTT, pH 8.0) перед тем, как осадить центрифугированием в течение 15 минут при 13000 об/мин на центрифуге Beckman J2-21. Детергент и соль удаляют затем аналогичной отмывкой в следующем буфере: 50 мМ Tris - HCl, 1 мМ NaEDTA, 0.1% (вес/об) NaAzide, 2 мМ DTT, pH 8.0. Наконец, тельца включения делят на аликвоты по 30 мг и замораживают при -70°С. Выход белка тел включения количественно определяют солюбилизацией с помощью 6М гуанидин - HCl и измерением связыванием с красителем по методу Бредфорд (PerBio).

Около 15 мг солюбилизированной цепи тел включения оттаивают из замороженных исходных растворов. Тела включения разводят до конечной концентрации 5 мг/мл в 6М растворе гуанидина и DTT (2 М исходный раствор) прибавляют до конечной концентрации 10 мМ. Смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Готовят 1 литр следующего буфера для рефолдинга: 100 мМ Трис pH 8.5, 400 мМ L - аргинина, 2 мМ EDTA, 5 мМ восстановленного глутатиона, 0.5 мМ окисленного глутатиона, 5 М мочевины, 0.2 мм PMSF и энергично перемешивают при 5°С±3°С. Редокс пару (пару окислитель - восстановитель) (2-меркаптоэтиламин и цистамин (до конечных концентраций 6.6 мМ и 3.7 мМ, соответственно) прибавляют, примерно, за 5 минут перед добавлением денатурированных цепей TCR. Затем белок оставляют раскручиваться (рефолдинг) в течение 5 часов ±15 минут при перемешивании при температуре 5°С±3°С. Затем продукт, полученный при рефолдинге, дважды диализуют, сначала против 10 литров 100 мМ мочевины, потом против 10 литров 100 мМ мочевины, 10 мМ Tris (Трис) pH 8.0. Обе стадии, как рефолдинг, так и диализ, проводят при 6-8°С.

scTCR отделяют от продуктов разложения и примесей, нанося диализованный продукт рефолдинга на анионообменную колонку POROS 50HQ и элюируя связанный белок в градиенте 0-500 мМ NaCl в 50 объемах колонки, используя очиститель Akta (Pharmacia), как показано на фигуре 6. Фракции, соответствующие пикам, хранят при 4°С и перед тем, как собрать и концентрировать, анализируют SDS-РАСЕ с окрашиванием Кумасси (Фигура 7). Затем sTCR очищают и характеризуют, используя колонку для гель-фильтрации (гель-хроматографии) Superdex 200HR (Фигура 8), предварительно уравновешенную буфером HBS-ЕР (10 мМ HEPES pH 7.4, 150 мМ NaCl, 3.5 мМ EDTA, 0.05% Нонидет Р40). Фракции, соответствующие пикам, хранят при 4°С и перед тем, как собрать и концентрировать, анализируют SDS-РАСЕ с окрашиванием Кумасси (Фигура 9). Наконец, концентрированные (упаренные) фракции В9-В6 пускают снова на колонку для гель-хроматографии, чтобы получить очищенный белок в буфере BIAcore (Фигура 10). Объединяют фракции, соответствующие пику с примерной молекулярной массой 50 кДа. Этот пул упаривают перед тем, как характеризовать методом поверхностного плазменного резонанса на приборе BIAcore.

Пример 3 - Характеристика связывания scTCR с HLA-A2 Tax методом поверхностного плазменного резонанса с биосенсором Biacore

Для анализа связывания А6 scTCR с лигандом пептид-МНС (HLA- A2 Tax) используют биосенсор поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore 3000™). Этот анализ становится более простым, когда получают одиночные комплексы рМНС (описанные ниже), полуориентированная иммобилизация которых на поверхности связывания, покрытой пленкой стрептавидина, делает возможным тестирование связывания с растворимым Т-клеточным рецептором до четырех различных рМНС (иммобилизованных на различных проточных кюветах) одновременно. Инъекция комплекса HLA вручную позволяет легко устанавливать точный уровень иммобилизованных молекул класса А.

Такие иммобилизованные комплексы способны связывать как Т-клеточные рецепторы, так и корецептор CD8αα, каждый из которых можно инъецировать в растворимой фазе.

Биотинилированные HLA-A2 - Tax комплексы класса I подвергают рефолдингу in vitro, используя экспрессированные тела включения, содержащие составные из субъединиц белки и синтетический пептид, с последующими очисткой и in vitro ферментативным биотинилированием (O'Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). Тяжелую цепь HLA экспрессируют с С-концевой биотиновой меткой, она заменяет трансмембранный и цитоплазматический домены белка в соответствующей конструкции. Легкую цепь HLA или β2-микроглобулин также экспрессируют в виде тел включения в Е. coli при использовании соответствующей конструкции, уровень составляет ~500 мг/литр бактериальной культуры.

Клетки Е. coli лизируют и тела включения очищают до примерной степени чистоты 80%. Белок тел включения денатурируют в растворе 6 М гуанидин - HCl, 50 мМ Tris рН 8.1, 100 мМ NaCl, 10 мМ DTT, 10 мМ EDTA и подвергают рефолдингу при концентрации 30 мг/литр тяжелой цепи, 30 мг/литр β2m в 0,4 М L - Аргинин - HCl, 100 мМ Tris рН 8.1, 3.7 мМ цистеамина, 4 мг/мл пептида (например, tax 11-19), добавляя единичный импульс денатурированного белка в буфер для рефолдинга при <5°С. Рефолдинг оставляют до завершения при 4°С, по меньшей мере, на 1 час.

Буфер заменяют буфером для диализа - 10 объемов 10 мМ Tris рН 8.1. Для достаточного восстановления ионной силы раствора необходимо два раза заменять буфер. Затем раствор белка фильтруют через 1.5 мкм фильтр из ацетата целлюлозы и наносят на анионообменную колонку POROS 50HQ (объем насадки (носителя) 8 мл). Белок элюируют в линейном градиенте 0-500 мМ NaCl. HLA- A2- пептидный комплекс элюируют, примерно, при 250 мМ NaCl и фракции, соответствующие пику, собирают, прибавляют коктейль ингибиторов протеаз (Calbiochem) и фракции охлаждают льдом.

Буферы для комплексов HLA, меченных биотиновой меткой, заменяют на 10 мМ Tris рН 8.1, 5 мМ NaCl, используя колонку Pharmacia для быстрого удаления солей, уравновешенную в том же буфере. Сразу же после элюции фракции, содержащие белок, охлаждают льдом и прибавляют коктейль ингибиторов протеаз (Calbiochem). Затем добавляют реагенты для биотинилирования: 1 мМ биотина, 5 мМ АТР (забуференный до рН 8), 7.5 мМ MgCl₂ и 5 мкг/мл фермента BirA (очищенного по O'Callaghan et at. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). Затем смесь инкубируют при комнатной температуре в течение ночи.

Биотинилированные комплексы HLA очищают методом гель-хроматографии. Предварительно колонку Pharmacia Superdex 75 HR 10/30 уравновешивают профильтрованным PBS и 1 мл биотинилированной реакционной смеси наносят на колонку и вымывают PBS со скоростью 0.5 мл/мин. Биотинилированные комплексы HLA выходят в виде одного пика (примерно, 15 мл). Собирают фракции, содержащие белок, охлаждают их льдом и добавляют коктейль ингибиторов протеаз. Концентрацию белка определяют методом связывания с Кумасси (PerBio) и аликвоты биотинилированных комплексов HLA хранят в замороженном виде при - 20°С. Стрептавидин иммобилизуют стандартными методами связывания с амином.

Взаимодействие между А6 Tax scTCR, содержащим новую межцепную связь, и его комплексом лиганд/МНС или нерелевантной комбинацией HLA-пептид, получение которой описано выше, анализируют с помощью биосенсора BIAcore 3000™ поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Метод SPR измеряет изменения показателей преломления, выраженные в единицах отклика (RU), близ сенсорной поверхности в малой проточной кювете, принцип, который можно использовать для обнаружения взаимодействия рецептор - лиганд и для анализа их аффинности и кинетических параметров. Проточные кюветы для зондов готовят иммобилизацией отдельных комплексов HLA-пептид в раздельных проточных кюветах путем связывания между биотином, сшитым по β2m, и стрептавидином, химически связанным с активированной поверхностью проточных кювет. Затем анализ осуществляют, пропуская scTCR через поверхности различных проточных кювет с постоянной скоростью, измеряя при этом SPR отклик. Введение (инъекции) растворимого sTCR в комплекс пептид-HLA с постоянной скоростью потока и в различных концентрациях используют для определения фонового (базового) резонанса. Величины этих контрольных измерений вычитают из величин, полученных со специфическим комплексом пептид-HLA, и используют для расчета аффинности связывания, выражаемой в виде константы диссоциации, Kd (Price & Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (2^nd Edition) 1979, Clarendon Press, Oxford).

BIAcore анализ scDiS A6 TCR показывает, что эта молекула специфически связывается с родственным лигандом (HLA-A2 Tax) с kd 12.4±1.62 мкМ.

1. Одноцепочечный Т-клеточный рецептор (scTCR), содержащий
α сегмент, образованный последовательностью вариабельной области а цепи TCR, соединенной с N-концом внеклеточной последовательности константной области α цепи TCR,
β сегмент, образованный последовательностью вариабельной области β цепи TCR, соединенной с N-концом внеклеточной последовательности константной области β цепи TCR, и
линкерную последовательность, связывающую С конец α сегмента с N концом β сегмента, или наоборот,
при этом:
внеклеточные последовательности константных областей α и β сегментов связаны дисульфидной связью, которая связывает цистеиновые остатки, являющиеся заменами остатков, выбранных из группы, включающей
Thr 48 экзона 1 TRAC*01 и Ser 15 экзона 1 TRBC1*01 или TRBC2*01;
Thr 45 экзона 1 TRAC*01 и Ser 77 экзона 1 TRBC1*01 или TRBC2*01;
Tyr 10 экзона 1 TRAC*01 и Ser 17 экзона 1 TRBC1*01 или TRBC2*01;
Thr 45 экзона 1 TRAC*01 и Asp 59 экзона 1 TRBC1*01 или TRBC2*01;
и
Ser 15 экзона 1 TRAC*01 и Glu 15 экзона 1 TRBC1*01 или TRBC2*01;
причем расстояние между β углеродными атомами этих замен в соответствующих последовательностях внеклеточных константных lg доменов α и β цепей TCR составляет менее 0.6 нм,
при этом возможно, что внеклеточные последовательности константных областей, имеющиеся в α и β сегментах, соответствуют константным областям α и β цепей нативного TCR, усеченным по их С-концам таким образом, что цистеиновые остатки, которые образуют межцепную нативную дисульфидную связь TCR, исключаются, или
внеклеточные последовательности константных областей, имеющиеся в α и β сегментах, соответствуют константным областям α и β цепей нативного TCR, в которых цистеиновые остатки, которые образуют нативную межцепную дисульфидную связь, заменяются на другой аминокислотный остаток, или
отсутствует неспаренный цистеиновый остаток, имеющийся в β цепи нативного TCR.

2. scTCR по п.1, отличающийся тем, что внеклеточная последовательность константного домена α сегмента включает последовательность, соответствующую TRAC*01, а β сегмент включает последовательность, соответствующую TRBC1*01 или TRBC2*01, и указанная не нативная дисульфидная связь находится между цистеиновыми остатками, заменившими Thr 48 экзона 1 TRAC*01 и Ser 57 экзона 1 TRBC1*01 или TPBC2*01.

3. scTCR по п.1 или 2, который связывается ковалентной связью с терапевтическим агентом.