Способ выделения биолюминесцентных бактерий
Владельцы патента RU 2358009:
Федеральное Государственное унитарное предприятие Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и может быть использовано при конструировании питательных сред для выделения биолюминесцентных бактерий из морской воды. Способ предусматривает следующее. Определяют соленость морской воды в районе выделения биолюминесцентных бактерий. Готовят питательную среду на дистиллированной воде, в которую добавляют хлористый натрий в количестве, соответствующем определенному значению солености, а также сухой питательный агар в количестве 34,0-36,0 г/л дистиллированной воды. Из морской воды выделяют биолюминесцентные бактерии методом мембранных фильтров. Засевают этими бактериями питательную среду и выращивают их при комнатной температуре в течение 22-24 часов. Присутствие биолюминесцентных бактерий определяли по наличию биолюминесценции у бактерий. Изобретение позволяет повысить выход биолюминесцентых бактерий, удешевление питательной среды. 1 табл.
Предлагаемое изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при конструировании питательных сред для выделения биолюминесцентных бактерий из морской воды.
Известен способ выращивания штамма люминесцентных бактерий Photobacterium leiognathi, который используется при определении токсичности сред [1]. Для выращивания штамма люминесцентных бактерий Photobacterium leiognathi используют:
среду Егоровой: NaCl 30,0 г; КН2PO4 1,0 г; MgSO4 0,5 г; пептон 10,0 г; рыбная вытяжка 0,5 л; агар-агар 18,0 г; водопроводная вода 0,5 л; рН 7,4 (устанавливают 40%-ным NaOH);
полусинтетическую среду (г на 1 л дистиллированной воды): NaCl 30,0; КН2PO4 1,0; Na2HPO4·12Н2O 10,0; MgSO4·7Н2O 0,2; (NH4)2HPO4 0,5; пептон Chemapol 5,0 (пептон Difco 10,0); глицерин 3 мл; агар-агар 20,0; рН 7,0;
минимальную среду (г на 1 л дистиллированной воды): NaCl 30,0; КН2PO4 1,0; Na2HPO4·12Н2O 10,0; MgSO4·7Н2O 0,2; (NH4)2 HPO4 0,5; глицерин 3 мл или глюкоза 4 г; рН 7,0.
Недостатком известного способа является сложность изготовления питательных сред и относительно высокая стоимость составляющих ее компонентов.
Наиболее близким к предложенному способу является выбранный в качестве прототипа способ выделения и культивирования светящихся бактерий [2], включающий приготовление питательной среды, посев на нее светящихся бактерий и выращивание при комнатной температуре в течение 23-25 часов. Питательная среда содержит дистиллированную воду 1,0 л; гомогенат судака 500 г; NaCl 30,0 г; пептон 10,0 г; аспарагин 5,0 г; КН2PO4 1,0 г; MgSO4·7Н2О 0,5 г; агар-агар 20,0 г; рН 7,2-7,4.
Недостатком известного способа является низкий выход светящихся бактерий, а также сложность изготовления питательной среды и относительно высокая стоимость составляющих ее компонентов.
Задачей предлагаемого изобретения является повышение выхода биолюминесцентных бактерий при удешевлении питательной среды.
Указанная задача достигается тем, что в способе выделения биолюминесцентных бактерий, предусматривающем приготовление питательной среды, включающей дистиллированную воду, хлористый натрий, питательную основу, посев на нее культур бактерий, сконцентрированных из морской воды на мембранном фильтре, и выращивание при комнатной температуре в течение 22-24 часов, с последующим выделением чистых культур биолюминесцентных бактерий, согласно изобретению предварительно определяют концентрацию хлористого натрия в морской воде в районе выделения биолюминесцентных бактерий, и для приготовления питательной среды хлористый натрий в дистиллированную воду добавляют в концентрации, соответствующей значению концентрации его в морской воде, а в качестве питательной основы используют сухой питательный агар в количестве 34,0-36,0 г на 1 л дистиллированной воды.
В предложенном способе благодаря предварительному определению концентрации хлористого натрия в морской воде в районе выделения биолюминесцентных бактерий и добавлению хлористого натрия в дистиллированную воду в концентрации, соответствующей концентрации его в морской воде, создается соленость питательной среды, которая оптимальна для максимального роста выделенных в этом районе моря биолюминесцентных бактерий.
При этом использование в питательной среде в качестве питательной основы сухого питательного агара и уменьшение количества компонентов значительно упрощает и удешевляет способ выделения биолюминесцентных бактерий по сравнению с прототипом.
Совокупность отличительных признаков описываемого способа обеспечивает достижение поставленной задачи.
Сравнение прототипа с заявляемым решением показало, что указанные выше признаки являются отличительными, в связи с чем заявляемый способ соответствует критерию "новизны".
Способ осуществляется следующим образом.
Определяют концентрацию хлористого натрия в морской воде в районе выделения биолюминесцентных бактерий. Готовят питательную среду на дистиллированной воде. В нее добавляют хлористый натрий в количестве, соответствующем определенному значению солености, а также сухой питательный агар в количестве 34-36 г на 1 л дистиллированной воды. На среду производят посев бактерий, сконцентрированных из морской воды на мембранном фильтре, и выращивают при комнатной температуре в течение 22-24 часов, с последующим выделением чистых культур биолюминесцентных бактерий.
Пример 1. Контрольную питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили следующим образом: в 1 л дистиллированной воды добавляли измельченного судака - 500 г; NaCl - 30,0 г; пептона - 10,0 г; аспарагина - 5,0 г; КН2PO4 - 1,0 г; MgSO4·7Н2O - 0,5 г; агар-агара - 20,0 г; рН среды 7,4.
Питательную среду стерилизовали при 111°С в течение 20 мин. Охлажденную до 45°С среду разливали в стерильные чашки Петри, рН среды 7,4±0,1.
Проводили концентрирование бактерий из морской воды (Черного и Азовского морей) методом мембранных фильтров и выращивали их на контрольной питательной среде при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Данные приведены в таблице 1.
Пример 2. Для приготовления питательной среды использовали питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой, который готовят из сухого препарата промышленного производства.
В предлагаемом способе использовался сухой питательный агар производства ФГУП «НПО «МИКРОГЕН» МЗ РФ следующего состава (в г)
| Панкреатический гидролизат кильки | 17,9 |
| Агар микробиологический | 11,2±1,2 |
| Натрия хлорид | 7,7±0,2 |
| рН | 7,3±0,2 |
Приготовили его следующим образом:
32 г сухого питательного агара размешали в 1 л дистиллированной воды, прокипятили 1-2 мин до полного расплавления агара. Профильтровали через ватно-марлевый фильтр, разлили в стерильные емкости.
Затем добавили NaCl - 30,0 г, т.е. концентрация хлористого натрия или соленость воды составила 30‰. Простерилизовали автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин. Охлажденную до 45°С среду разливали в стерильные чашки Петри слоем 3-4 мм, рН среды 7,4±0,1.
Готовая среда в чашках Петри прозрачная, желтого цвета.
Проводили концентрирование бактерий из воды Черного и Азовского морей методом мембранных фильтров. Дополнительно измеряли соленость, т.е. концентрацию хлористого натрия в этой воде, которая для данных районов Азовского моря составила 10‰, а Черного моря - 17‰. Фильтры с бактериями помещали на поверхность приготовленной питательной среды и выращивали при комнатной температуре в течение 22 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Данные приведены в таблице 1.
Пример 3. Питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили по примеру 2. Сухой питательный агар добавляли в количестве 33,0 г на 1 л дистиллированной воды, NaCl добавляли в количестве 22,0 г на 1 л дистиллированной воды, т.е. концентрация хлористого натрия или соленость воды составила 22‰. Проводили концентрирование бактерий из воды Черного и Азовского морей методом мембранных фильтров. Фильтры с бактериями помещали на поверхность приготовленной питательной среды и выращивали при комнатной температуре в течение 23 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Данные приведены в таблице 1.
Пример 4. Методом мембранных фильтров проводили концентрирование бактерий из воды, отобранной в Азовском и Черном морей. Дополнительно измеряли соленость этой воды, которая для этих районов Азовского моря составила 10‰, а Черного моря - 17‰.
Питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили по примеру 2, 3, сухой питательный агар - 34,0 г на 1 л дистиллированной воды, NaCl добавляли в количестве 17,0 г на 1 л дистиллированной воды, т.е. соленость воды составляла 17‰.
Фильтры с бактериями помещали на питательную среду и выращивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет.
Данные приведены в таблице 1.
Пример 5. Проводили концентрирование бактерий из воды Черного и Азовского морей методом мембранных фильтров. Дополнительно измеряли соленость этих вод, которая для этих районов морей составила 17‰ и 10‰ соответственно.
Питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили по примерам 2-4, но NaCl добавляли в количестве 10,0 г на 1 л дистиллированной воды, т.е. соленость воды устанавливали 10‰; сухой питательный агар добавляли в количестве 36,0 г на 1 л дистиллированной воды.
Фильтры с бактериями помещали на поверхность приготовленной питательной среды и выращивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет.
Данные приведены в таблице 1.
Пример 6. Питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили по примерам 2-5, но NaCl добавляли в количестве 5 г, т.е. соленость воды устанавливали 5‰; сухой питательный агар добавляли в количестве 37,0 г на 1 л дистиллированной воды.
Проводили концентрирование бактерий из воды Черного и Азовского морей методом мембранных фильтров. Фильтры с бактериями помещали на поверхность приготовленной питательной среды и выращивали при комнатной температуре в течение 23 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет.
Данные приведены в таблице 1.
Количество колоний биолюминесцентных бактерий, выросших на фильтрах, помещенных на питательные среды с различной концентрацией хлористого натрия, представлено в таблице 1.
| Таблица 1 | |||
| Пример | Содержание NaCl в дистиллированной воде в % | Выход колоний биолюминесцентных бактерий, выделенных из разных морских сред | |
| Черного моря | Азовского моря | ||
| 1 | Контрольная | 2-3 | 1-3 |
| 2 | 30 | 3-4 | 1-2 |
| 3 | 22 | 5-6 | 2-3 |
| 4 | 17 | 8-9 | 3-4 |
| 5 | 10 | 2-3 | 6-8 |
| 6 | 5 | 0-1 | 2-3 |
Как видно из таблицы 1, наибольшее количество колоний биолюминесцентных бактерий, выделенных из Черного моря, выросло на питательной среде, где концентрация хлористого натрия составляет 17‰, т.е. 17 г на 1 л дистиллированной воды, что соответствует солености 17‰ района Черного моря, откуда выделены аборигенные биолюминесцентные бактерии (пример 4); а наибольшее количество биолюминесцентных бактерий, выделенных из Азовского моря, выросло на питательной среде, в которой концентрация хлористого натрия составляет 10‰, т.е. 10,0 г на 1 л дистиллированной воды, что соответствует концентрации хлористого натрия или солености 10‰ воды в районе Азовского моря, откуда выделены аборигенные биолюминесцентные бактерии (пример 5).
Таким образом, предложенный способ, используя более простую и дешевую питательную среду, в 2,5-4,0 раза повышает выход колоний биолюминесцентных бактерий по сравнению со средой-прототипом.
Источники информации
1. Авт. свид. №1484829 МКИ C12N 1/20.
2. Родина А.Г. Методы водной микробиологии» Ленинград: Наука 1965 г., стр.297-298 (прототип).
Способ выделения биолюминесцентных бактерий, предусматривающий приготовление питательной среды, включающей дистиллированную воду, хлористый натрий, питательную основу, посев на нее культур бактерий, сконцентрированных из морской воды на мембранном фильтре, и выращивание при комнатной температуре в течение 22-24 ч, с последующим выделением чистых культур биолюминесцентных бактерий, отличающийся тем, что предварительно определяют концентрацию хлористого натрия в морской воде в районе выделения биолюминесцентных бактерий, и для приготовления питательной среды хлористый натрий в дистиллированную воду добавляют в концентрации соответствующей значению концентрации его в морской воде, а в качестве питательной основы используют сухой питательный агар в количестве 34,0-36,0 г на 1 л дистиллированной воды.
