Сухой бактериальный состав, упакованный бактериальный состав, дозированный состав, способ стабилизации сухого бактериального состава и способ лечения млекопитающего
Владельцы патента RU 2359027:
ДЗЕ ПРОКТЕР ЭНД ГЭМБЛ КОМПАНИ (US)
АЛИМЕНТЭРИ ХЭЛС ЛТД (IE)
Сухой бактериальный состав содержит по меньшей мере на 10% по весу итогового состава сухой бактериальный концентрат, имеющий концентрацию бактерий по меньшей мере 1×108 КОЕ/г и водную активность менее чем 0,5, и стабилизатор, имеющий водную активность менее чем 0,5 при водном содержании 10%. Также обеспечивается упакованный бактериальный состав, дозированный состав и способ стабилизации сухого бактериального состава смешиванием со стабилизатором, имеющим водную активность менее чем 0,5 при водном содержании 10%, причем итоговый бактериальный состав имеет водную активность менее чем 0,5. Способ лечения млекопитающего, нуждающегося в лечении, предусматривает введение дозированного состава по настоящему изобретению. Изобретение обеспечивает улучшенную стабильность продукта и более высокое количество бактерий на дозу продукта. 5 н. и 20 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.
Область техники
Настоящее изобретение относится к стабилизированным сухим бактериальным составам, имеющим низкую водную активность. Составы по настоящему изобретению имеют долгосрочную стабильность и пробиотическую активность.
Существующий уровень техники
В последнее время пробиотики и составы, содержащие эти материалы, становятся все более популярными для лечения множества заболеваний. Пробиотики могут быть бактериями или их очищенными фракциями, которые обеспечивают субъекту после употребления пользу, такую как помощь при заболевании или его профилактика. Хотя существует множество разновидностей пробиотических бактерий, составы, содержащие эти материалы - особенно жизнеспособные пробиотические бактериальные клетки - склонны к низкой стабильности. Например, сухие концентраты пробиотических бактерий вводились млекопитающим в молоке и других водных суспензиях. Однако, если эти составы не хранятся и не распространяются в охлажденных условиях, ранее было необходимо готовить суспензию непосредственно перед употреблением из сухого концентрата или употреблять сам сухой концентрат в форме порошка или капсулы, чтобы гарантировать, что достаточно большая доля полученных клеток останется жизнеспособной во время применения.
Хотя обнаруживается, что сухие бактериальные концентраты обеспечивают некоторую степень стабильности, это не обеспечивает полностью подходящую стабильность и простоту в употреблении. Основной проблемой, касающейся содержащих пробиотики составов, является уровень воды, имеющейся в составе. Уровни воды от умеренного до высокого в содержащих пробиотики составах с сухими концентратами бактерий позволяют сухим бактериям продолжать метаболизироваться во время хранения. Метаболизм приводит к выработке кислотных метаболитов и других молекул, а также к разложению и снижению жизнеспособности самих пробиотических бактерий, что приводит к порче или загниванию состава, делая его тем самым непригодным для употребления или неэффективным. Различные наполнители и подобные суспензионные материалы исследуются в попытке удержания воды в содержащих пробиотики составах, все в разной степени успешно. Например, патент США №4518696 описывает стабилизированный жидкий бактериальный состав, состоящий из комбинации сухих жизнеспособных клеток животных пробиотических лактобацилл (Lactobacilli) и плавленого кварца, причем смесь, диспергированная в безводном подсолнечном масле, имеет водную активность менее чем 0,20. Несмотря на эти достижения долгосрочная стабильность хранения сухих бактериальных составов еще далеко не оптимальна, даже для наиболее стабильных бактериальных штаммов. Несколько бактериальных штаммов все еще требуют хранения при 5°С или ниже, и даже в этом случае долгосрочная стабильность не гарантируется.
Таким образом, существует потребность в улучшенных пробиотических составах, имеющих улучшенную стабильность и увеличенную доставку жизнеспособных пробиотических бактерий. В частности, существует необходимость обеспечения стабильных пробиотических составов, содержащих бактериальные штаммы, которые раньше было сложно хранить долгосрочно при комнатной температуре.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает сухие бактериальные составы, содержащие по меньшей мере 10% сухого концентрата бактерий, имеющего по меньшей мере 1×108 cfu/g, где состав имеет водную активность менее чем 0,5. Составы имеют улучшенную долгосрочную стабильность и при 5°С, и при комнатной температуре в нерасфасованном порошке, в форме капсул и других подобных формах. Настоящее изобретение также обеспечивает расфасованные сухие бактериальные составы и способы производства составов по настоящему изобретению.
Краткое описание чертежей
На чертеже представлена зависимость стабильности хранения при 25°С во времени при начальной концентрации бактерий, измеренной как образующие колонии единицы на грамм (cfu/g) в смеси бактерий 50/50 при 2×1010, 2×108 и 2×104 cfu/g либо с Mannogem EZ (SDM), либо с Neosorb 20/60 (Neo).
Подробное описание изобретения
Все веса, измерения и концентрации здесь измеряются при 25°С на составе во всей полноте, если не указано иное.
Все документы, цитируемые в Подробном описании изобретения, включены в текст, в соответствующей части, посредством ссылки; цитирование любых документов не следует толковать как признание того, что они являются прототипами в отношении данного изобретения.
Если не указано иное, все указанные здесь процентные отношения составов являются весовыми процентными отношениями, и все соотношения являются весовыми соотношениями.
Если не указано иное, все молекулярные веса являются средними по весу молекулярными весами.
Если не представлены конкретные примеры фактических измеренных значений, указанные здесь численные значения нужно рассматривать как примерные значения.
Как используется здесь, сокращение «cfu/g» обозначает «образующие колонию элементы на грамм», как измерено с использованием способа, предложенного как часть European Pharmacopoeial Methods, 2003, Section 2.6.12.
Как используется здесь, выражение «сухие бактериальные составы» включает в себя составы, содержащие менее чем 20% материалов, которые являются жидкими при комнатной температуре, предпочтительно менее чем 10%, более предпочтительно менее чем 8%, еще более предпочтительно менее чем 6% по весу от общего состава.
Как используется здесь, выражение «связанная вода» обозначает молекулы воды, которые жестко удерживаются различными химическими группами в больших молекулах, таких как карбоксильные, гидроксильные и аминогруппы.
Настоящее изобретение обеспечивает сухие бактериальные составы, имеющие водную активность (мера способности связанной воды десорбироваться из молекулы) менее чем 0,5. Предпочтительно, водная активность составов по настоящему изобретению составляет менее чем 0,4, более предпочтительно менее чем 0,25, еще более предпочтительно менее чем 0,15, еще более предпочтительно водная активность составов по настоящему изобретению составляет менее чем 0,1. Водная активность может определяться с использованием способов, известных среди специалистов. Здесь, водная активность определяется с использованием измерительного прибора NovaSina TH200 Water Activity Meter при 25°С. Вкратце, измерительный прибор калибруется с использованием калибровочных солей. Подлежащая измерению проба уравновешивается по температуре в приборе, после чего водная активность определяется как процентная относительная влажность (% RH), разделенная на 100, после достижения равновесия (обычно от 10 до 20 минут).
Обнаружено, что путем снижения водной активности сухих бактериальных составов их стабильность может быть улучшена. Без ограничения теорией, неожиданно обнаружено, что водная активность составов по настоящему изобретению может быть уменьшена, а тем самым повышена стабильность состава, путем увеличения концентрации (числа жизнеспособных клеток) сухого бактериального концентрата и доли (по весу итогового состава) сухого бактериального концентрата в составе по отношению к другим составляющим. Снова, без ограничения, считается, что в комбинации со стабилизатором, имеющим низкое содержание воды и низкую водную активность, составы по настоящему изобретению имеют меньшее содержание воды в целом, и та вода, что присутствует в составах, жестко привязана к своим молекулам-носителям.
Без ограничения теорией, считается, что сухой бактериальный концентрат может рассматриваться как аморфное сухое вещество, имеющее температуру стеклования (Tg), которая влияет на стабильность системы. Tg определяет фазовый переход состава от фазы кинетически стабильного стеклообразного сухого вещества к термодинамически стабильному жидкому / каучукообразному состоянию. Для стабильности хранения кинетически стабильная фаза (т.е. стекловидная фаза) предпочтительна, поскольку темпы реакции и темпы диффузии гораздо ниже, чем в жидкой / каучукообразной фазе. Более того, обнаружено, что связанные молекулы воды проще десорбируются и используются в биохимическом метаболизме в жидком / каучукообразном состоянии. Водная активность и содержание системы имеет обратное влияние на Tg; чем выше водная активность или содержание, тем ниже Tg. Таким образом, снижая водную активность или содержание системы, Tg повышается, и стабильность самой системы повышается. Поэтому регулирование вклада сухого бактериального концентрата и любых материалов-наполнителей в суммарную водную активность, и вследствие этого Tg состава, может улучшить стабильность состава в целом. Неожиданно обнаружено, что сами сухие бактерии имеют низкую водную активность. Следовательно, обнаружено, что использование высокого уровня (т.е. по меньшей мере 10% по весу сухого бактериального состава) сухого бактериального концентрата, где концентрат имеет высокую концентрацию бактерий (по меньшей мере 1×108 cfu/g), стабилизирует составы, удерживая водное содержание и водную активность на низком уровне по сравнению с составами, содержащими либо более низкие количества сухого бактериального концентрата, либо концентраты, имеющие более низкие количества бактерий.
Более того, предпочтительно, чтобы итоговый сухой бактериальный состав, содержащий сухой бактериальный состав, был безводным. Как используется здесь, «безводный» обозначает, что состав имеет водное содержание менее чем 20%. Без ограничения теорией, считается, что в связи с низкой водной активностью сухие бактериальные составы по настоящему изобретению, имеющие водное содержание менее 20%, имеют улучшенную стабильность благодаря низкому уровню воды, имеющейся в составе, и тому, что присутствующая в составе вода жестко привязана к своим молекулам-носителям. Водное содержание может определяться с использованием способов, известных специалистам. Здесь, водное содержание определяется с использованием анализатора TGA Thermal Gravimetric Analyse от компании ТА Instruments и сопутствующего программного обеспечения. Способ анализатора нацелен на уравновешение при комнатной температуре (25°С), за чем следует линейно-возрастающее повышение температуры темпом 20°С в минуту до итоговой температуры 105°С, за чем следует 20-минутное удержание при 105°С. Данные анализируются с использованием сопутствующей программы анализа, поставляемой вместе с анализатором, и водное содержание пробы определяется как процент массы пробы. Более предпочтительно, сухие бактериальные составы по настоящему изобретению имеют водное содержание менее чем 10%, еще более предпочтительно менее 8%.
Без ограничения теорией, считается, что путем использования высокого уровня сухого бактериального концентрата сухой бактериальный концентрат может действовать как большой резервуар для связывания любой воды, имеющейся в составе. При таком действии любая присутствующая в составе вода рассредоточивается по большому количеству сухого бактериального концентрата, при этом не снижая Tg состава достаточно, чтобы перейти к менее стабильному жидкому / каучукообразному состоянию при температуре хранения, тем самым поддерживая стабильность состава.
Составы по настоящему изобретению содержат по меньшей мере 10% по весу итогового состава сухого бактериального концентрата, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 50%.
Как используется здесь, термин «сухой бактериальный концентрат» включает в себя ферментационные культуры бактерий, сконцентрированные с помощью процесса, такого как центрифугирование, сублимационная сушка, распылительная сушка или их комбинаций, известных среди специалистов, для получения сухого концентрированного бактериального продукта, содержащего большое количество бактериальных клеток, которые могут быть добавлены к составу по настоящему изобретению. Сухой бактериальный концентрат содержит бактерии на уровнях по меньшей мере 1×108 cfu/g, предпочтительно от 1×108 до 1×1014 cfu/g, более предпочтительно от 1×1010 до 1×1014 cfu/g до добавления к составу по настоящему изобретению. Бактерии, присутствующие в сухом бактериальном концентрате, могут быть жизнеспособными (т.е. «живыми») или мертвыми культурами бактерий. Предпочтительно, бактерии, присутствующие в концентрате, являются жизнеспособными. Как используется здесь, термин «жизнеспособный» обозначает, что по меньшей мере 50% присутствующих бактерий способны образовывать колонии, используя стандартные способы бактериального плакирования, известные среди специалистов, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 75% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%.
Чтобы определить уровень сухого бактериального концентрата и концентрацию бактерий в нем, могут использоваться способы, известные среди специалистов. Например, чтобы определить количество сухого бактериального концентрата, присутствующего в сухом бактериальном составе, этот состав может быть растворен смешиванием в известном объеме подходящего растворителя, такого как фосфатный буферный соляной раствор. Затем может быть проведено первичное микроскопическое оценивание при приемлемом растворении для определения состояния материала. Могут использоваться способы установления количества бактерий, известные среди специалистов, такие как стандартный пластиночный способ счета, флуоресцентные методы, такие как проточная цитометрия и метод D-счета, счетное вычисление Neubauer (известное также как счетная камера или гемоцитометр) в сочетании с красителями, такими как кристаллический фиолетовый, или фазовоконтрастная микроскопия. Относительные пропорции сухого бактериального концентрата к другим материалам, присутствующим в сухом бактериальном составе, могут быть оценены путем вычитания массы наполнителя, стабилизатора или других материалов из общего сухого веса состава. Такие материалы (т.е. несухой бактериальный концентрат) могут быть отделены с использованием различных методов, известных среди специалистов. Например, растворимые материалы могут быть растворены и затем фильтрованы или центрифугированы, и надосадочная жидкость позже высушена, а сухая масса взвешена. Нерастворимые материалы могут быть отделены с помощью центрифугирования градиента плотности, которое известно среди специалистов. В зависимости от рецептуры специалист выберет такие способы, которые приведут к правильному и точному определению концентрации и уровня сухого бактериального концентрата, присутствующего в составе.
Сухой бактериальный концентрат может содержать другие материалы, такие как питательные вещества, бактериальные экскреции и другой растворимый материал, присутствующий в ферментационных культурах бактерий до сушки. Предпочтительно эти материалы присутствуют на уровнях менее чем 20%, более предпочтительно менее чем 10% по весу сухого бактериального концентрата. Более того, чтобы повысить концентрации бактерий в сухом бактериальном концентрате, может быть предпочтительно центрифугировать или фильтровать среды для выращивания, содержащие бактерии до сушки, чтобы отделить бактерии от этих сред. За счет удаления большей части жидкости до сушки большая часть растворимых питательных веществ и материалов будет удалена, а следовательно, не будет присутствовать в сухом бактериальном концентрате. Это желательно для повышения относительной пропорции бактерий в концентрате, а также для избежания избыточного загрязнения сухого бактериального концентрата любыми бактериальными токсинами или другими подобными материалами, которые могут быть непригодны для употребления млекопитающими.
Бактерии могут выращиваться как чистые (единичный штамм) или смешанные (множественные штаммы) культуры желаемых бактерий в жидкой среде, которая дает удовлетворительный рост участвующей культуры (культур). Такая среда может состоять из белка или фракций белка, различных способных к брожению углеводов, стимуляторов роста, неорганических солей, буферов и т.д.; или среда может быть стерильным цельным молоком, обезжиренным молоком, сывороткой или другими естественными субстратами или их комбинациями. После инокуляции культуре позволяют развиваться при обычных оптимизированных инкубационных условиях времени и температуры. В зависимости от выращиваемого организма (организмов) периоды инкубации могут длиться от 4 до 48 часов, и температуры могут варьироваться от 15°С до 50°С. Также может быть желательным контролировать рН и растворенный кислород. После достижения удовлетворительного роста культура в своей среде роста остужается до температуры от 0 до 15°С.
В общем, способ, используемый для получения сухого бактериального концентрата, выполняется в соответствии с известными процедурами культивирования таких бактерий. После достижения удовлетворительной бактериальной популяции в пригодной среде роста рН бульона может меньше, чем желаемый для приготовления сухого продукта. Как правило, окончательный рН будет составлять от 4,4 до 5,4. Перед сушкой ферментационного бульона полезно добавить щелочной реагент, такой как гидроксид натрия, для повышения рН до более благоприятного для стабильности бактерий уровня. В общем, как это уже известно, желательно повышать рН до нейтрального (рН 7), причем повышение происходит по меньшей мере до рН 5,8. Могут быть использованы любые годные в пищу щелочи (NaOH, КОН, NH4OH,
Ca(OH)2 и т.д.). Предпочтительно повышение до рН примерно от 6,0 до 6,5. Для конкретного примера рН может быть повышен путем добавления гидроксида натрия до рН примерно 6,2. Если в среду роста предстоит добавить другие добавки, которые повлияют на рН, такие как усиливающие стабильность средства по настоящему изобретению, повышение рН может быть для удобства осуществлено последним.
Если бактериальный концентрат сушится путем сублимационной сушки, может быть желательно включить криозащитное вещество в ферментационную культуру до сушки. Подходящие известные криозащитные вещества включают в себя инозит, сорбит, маннит, глюкозу, сахарозу, кукурузный сироп, DMSO, крахмалы и модифицированные крахмалы всех видов, PVP, мальтозу, или другие моно- и дисахариды. Уровень добавления может варьироваться от 1,0 до 300 граммов на литр культуры, в зависимости от конкретного агента. Эффективное количество должно использоваться для минимизации повреждения клеток при заморозке. Более того, сухой бактериальный концентрат должен быть высушен достаточно для понижения водного содержания до менее чем 20%, предпочтительно менее чем 10%, более предпочтительно менее чем 8%, еще более предпочтительно менее чем 6%. Желательно выбирать криозащитное вещество таким образом, чтобы сухой бактериальный концентрат имел низкую водную активность, предпочтительно менее чем 0,5. Если применяется другой способ сушки, такой как процедура тепловой сушки, криозащитное вещество не будет использоваться, и, в общем, любая из различных процедур сушки бактерий или служебных биологических материалов для порошка может быть использована. Эти процедуры включают в себя сублимационную сушку, распылительную сушку, вальцовую и (или) вакуум-выпарную сушку. В осуществлении настоящего изобретения предпочтительными процедурами сушки являются сублимационная сушка и (или) распылительная сушка.
Сухой бактериальный концентрат может содержать любое семейство, род, вид или штамм бактерий, который не приносит вреда животному субъекту при оральном употреблении, предпочтительно такие бактериальные штаммы, которые не являются вредными, предпочтительно пробиотик, после орального употребления млекопитающими, более предпочтительно после орального употребления людьми или домашними животными. Как указано выше, бактерии могут производить токсины и другие молекулы, которые могут быть вредны млекопитающим, особенно людям. Хотя бактерии могут быть стабилизированы в составах настоящего изобретения, предпочтительно, чтобы состав был пригоден для употребления млекопитающими. Предпочтительно, бактерии содержат бактерии молочной кислоты. Не ограничивающие примеры бактерий молочной кислоты, пригодной для использования в настоящем изобретении, включают в себя штаммы Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetylactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbruekii, Lactobacillus thermophilus, Lactobacillus fermentii, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacteriumbifidum и Pedioccus cerevisiae или их комбинации, предпочтительно Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium infantis или их комбинации.
Как неограничивающий пример, штаммы Bifidobacterium, изолированные из резецированного и промытого человеческого желудочно-кишечного тракта, как описано в международной заявке WO 00/42168, являются предпочтительными. Более предпочтительным является штамм Bifidobacterium infantis, обозначенный UCC35624, описанный как хранящийся в National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd (NCIMB) с 13 января 1999 года, получивший номер поступления NCIMB 41003.
Как еще один неограничивающий пример штаммы Lactobacillus salivarius, изолированные из резецированного и промытого человеческого желудочно-кишечного тракта, как описано в международной заявке WO 98/35014, являются предпочтительными. Более предпочтительными являются штаммы Lactobacillus salivarius, обозначенные UCC 1 и UCC 118, описанные как хранящиеся в National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd (NCIMB) с 27 ноября 1996 года и получившие номера поступления NCIMB 40830 и 40829 соответственно.
Опциональные компоненты
Сухие бактериальные составы по настоящему изобретению могут также содержать стабилизатор. Предпочтительно, сухой бактериальный состав содержит комбинацию высоких уровней сухого бактериального концентрата и стабилизатора, который имеет и низкое водное содержание, и низкую водную активность, всеобщий Tg системы поддерживается как можно более высоким, делая тем самым состав более стабильным. Стабилизаторы используются в настоящем изобретении для действия в качестве стабилизирующих наполнителей или увеличивающих объем агентов, не повышая водную активность или содержание системы в достаточной степени для снижения стабильности системы. Предпочтительно, стабилизатор по настоящему изобретению содержит материал или материалы, имеющие водную активность менее чем 0,5 при водном содержании 10%. Предпочтительно, стабилизатор имеет водную активность менее чем 0,4, более предпочтительно менее чем 0,25, еще более предпочтительно менее чем 0,15. Предпочтительно водное содержание стабилизатора составляет менее чем 10%, более предпочтительно менее чем 8%, еще более предпочтительно менее чем 6%. Если состав подлежит заключению в капсулы, стабилизатор предпочтительно имеет водную активность менее чем 0,4, более предпочтительно менее чем 0,15 и водное содержание менее 8%, более предпочтительно менее чем 6%. Не желая ограничиваться теорией, предполагается, что это из-за того, что процесс заключения в капсулы может ввести дополнительную воду в состав по сравнению с одним лишь сухим объемным составом, состав до заключения в капсулы должен быть как можно суше.
Составы по настоящему изобретению предпочтительно содержат от 1% до 90% стабилизатора по весу состава, более предпочтительно от 10% до 70% стабилизатора, еще более предпочтительно от 20% до 50% стабилизатора.
Стабилизатор по настоящему изобретению может содержать любой материал, который имеет водное содержание и водную активность такие, как определено выше. Предпочтительно, стабилизатор является сыпучим сухим веществом. Под сыпучим сухим веществом имеется в виду материал, т.е. порошковое сухое вещество, имеющее индекс Карра менее чем 20%, предпочтительно менее чем 15%. Как используется здесь, индекс Карра определяется с использованием ASTM Designation D6393-99; "Standard Test Method for Bulk Solids Characterization by Carr Indices" (2002). Предпочтительно, по меньшей мере один стабилизатор выбирается из группы, содержащей полисахариды, олигосахариды, дисахариды, основанные на целлюлозе материалы, полиоли, полигидридные спирты, кремнеземы, цеолиты, глины, глиноземы, крахмалы, сахара или их комбинации, более предпочтительно полисахариды, олигосахариды, основанные на целлюлозе материалы, кремнеземы, цеолиты, глины, глиноземы, крахмалы, сахара или их комбинации. Еще более предпочтительно, по меньшей мере одни стабилизатор выбирается из группы, содержащей полисахариды, основанные на целлюлозе материалы, крахмалы или их комбинации. Неограничивающие примеры материалов, подходящих для использования в настоящем изобретении, приведены в таблице 1.
| Таблица 1 | |||
| Неограничивающие примеры материалов, подходящих для использования в качестве стабилизатора в составах настоящего изобретения | |||
| Материал | Торговая марка / поставщик | Водная активность | Водное содержание (%) |
| Микрокристаллическая целлюлоза | Avicel ph 112 - FMC | 0,04 | 1,5 |
| Блошничная гемицеллюлоза | Psyllium | 0,05 | 8 |
| Картофельный крахмал | Поставщик Avebe America inc | 0,09 | 4 |
| Мальтодекстрин | Maltodextrin - A.E. Stanley | 0,25 | 5 |
| Высушенный распылением маннит | Mannogen EZ - SPI Pharma | 0,36 | <0,5 |
| Сахароза | Поставщик Particel Control Inc. | 0,36 | <0,1 |
| Сорбит | Neosorb 20/60 - Roquette | 0,39 | <2,0 |
| Стеарат магния | Поставщик Peter Greven | 0,41 | <6,0 |
| Маннит | Pearlitol 500DC - Stobec Inc. | 0,42 | <0,5 |
| Сукралоза | Поставщик McNeil | 0,42 | <2,0 |
| Сорбит | Neosorb P35/60 - Roquette | 0,43 | <2,0 |
| Ксилитол | Xylitol - Roquette | 0,44 | <1,0 |
| Микрокристаллическая целлюлоза | Avicel ph 302 - FMC | 0,44 | <5,0 |
| Малтитол | Maltisorb p90 - Roquette | 0,46 | <1,0 |
| Изомальт | Isomalt DC 100 - Palatinit | 0,48 | <1,5 |
Предпочтительно, сам стабилизатор имеет температуру стеклования (Tg) при водном содержании 10% более чем 273К, предпочтительно более чем 288К, более предпочтительно более чем 293К. Как используется здесь, температура стеклования определяется с использованием ASTM Е 1356-98 "Standard Test Method for Assignment of the Glass Transition Temperatures by Differential Scanning Calorimetry or Differential Thermal Analysis" (2003).
На чертеже видно, что начальная концентрация сухого бактериального концентрата сильно влияет на стабильность сухого состава во времени при комнатной температуре (25°С). Стабильность хранения составов, содержащих 50% 1×104 cfu/g сухого бактериального концентрата, чрезвычайно ограничена по сравнению с составами, содержащими 50% либо 1×108, либо 1×1010 сухого бактериального концентрата. Более того, воздействие водной активности и водного содержания стабилизатора очевидно демонстрируется данными стабильности. Манногем EZ (SDM) имеет водную активность 0,36 и водное содержание менее чем 0,5% по сравнению с водной активностью и содержанием Neosorb 20/60 (0,39 и менее чем 2,0% соответственно).
Составы по настоящему изобретению могут быть в форме упакованного состава. Стабилизатор может быть добавлен к составу по необходимости в любое время во время обработки до упаковки. Стабилизатор может быть добавлен к ферментационному бульону до сушки или смешан с сухим бактериальным концентратом в виде порошка, вслед за чем состав позже упаковывается. Если стабилизатор добавляется к ферментационному бульону, он может быть добавлен во время ферментации, непосредственно перед сушкой или после концентрирующего процесса, такого как центрифугирование, или на множестве этих стадий во время обработки. Предпочтительно, стабилизатор смешивается сухим в виде порошка с сухим бактериальным концентратом.
Если сухой бактериальный состав имеется в форме упакованного состава, этот состав может быть в форме нерасфасованного порошка, упакованного в запечатанные емкости, такие как банки или пакеты-саше, или может быть заключен в капсулы с помощью способов, известных среди специалистов. Если состав заключается в капсулы, покрытие предпочтительно содержит материалы с низким водным содержанием. Неограничивающие примеры подходящих для инкапсулирования материалов включают в себя гидроксипропилметилцеллюлозу, желатин, крахмалы, альгинаты или их комбинации, предпочтительно гидроксипропилметилцеллюлозу. Типы и способы инкапсулирования общеизвестны среди специалистов. Другие способы описаны в находящейся в совместном рассмотрении патентной заявке США №10/263516.
Составы по настоящему изобретению могут, независимо, содержать дополнительные опциональные компоненты, чтобы повысить их действенность. Например, один или более витаминов, ферментов, пластификаторов, красителей, вкусовых добавок, подсластителей, антиоксидантов, буферных агентов, облегчающие проскальзывание агентов, других наполнителей и тому подобное, могут быть опционально включены в составы по настоящему изобретению. Неограничивающие примеры опциональных компонентов приведены ниже.
Опциональный ингредиент, подходящий для использования в настоящем изобретении, включает в себя витамины. Например, могут быть использованы витамин А, витамин В2, витамин В6, витамин В12, ниацин, фолиевая кислота, биотин, витамин С, витамин D, витамин Е, витамин К и их комбинации. Жирорастворимые витамины, например бета-каротин и другие источники витамина А, могут быть особенно подходящими для включения благодаря их чувствительности к влаге. Витамин С, витамин Е и их комбинации также являются особенно подходящими.
Еще один пример опциональных компонентов включает в себя один или более ферментов. Например, может быть использован протеолитический фермент (напр., панкреатин).
Один или более пигментов или других подходящих красителей, таких как краски и краплаки, могут быть включены в составы. Краски U.S. FD&С (напр., желтая №5, синяя №2, красная №40) и (или) краплаки U.S. FD&С могут использоваться. Предпочтительные для использования в настоящем изобретении краплаки включают в себя, например, красный лак №40, желтый №6, синий №1 и тому подобные. Дополнительно, может быть использована комбинация U.S. FD&С красок и (или) U.S. FD&С краплаков в комбинации с другой обычной пищей и пищевыми красителями. В качестве дальнейших примеров Рибофлавин и бета-каротин также могут использоваться.
Дополнительно, могут использоваться другие натуральные красящие агенты, включающие в себя, например, фруктовые, овощные и (или) растительные экстракты, такие как виноград, черная смородина, арония, морковь, свекла, красная капуста и гибискус. Количество используемого красящего агента будет варьироваться в зависимости от используемых агентов и желаемого характера или интенсивности в законченном составе. Обычный специалист без труда определит это.
Один или более вкусовых агентов могут быть включены в составы по настоящему изобретению, для того чтобы повысить их аппетитность. Любой натуральный или синтетический вкусовой агент может использоваться в настоящем изобретении. Как используется здесь, такие вкусовые агенты могут быть синтетическими или натуральными вкусовыми агентами.
Например, здесь могут использоваться один или несколько растительных и (или) фруктовых вкусовых агентов. Особенно предпочтительными фруктовыми вкусовыми агентами являются экзотические и лактонные вкусовые агенты, такие как, например, вкусовые агенты маракуйи, вкусовые агенты манго, вкусовые агенты ананаса, вкусовые агенты купуаку, вкусовые агенты гуавы, вкусовые агенты какао, вкусовые агенты папайи, вкусовые агенты персика и вкусовые агенты абрикоса. Помимо этих вкусовых агентов может использоваться множество других вкусовых агентов, таких как, например, вкусовые агенты яблока, цитрусовые вкусовые агенты, вкусовые агенты винограда, вкусовые агенты малины, вкусовые агенты клюквы, вкусовые агенты вишни, вкусовые агенты грейпфрута и тому подобные.
Эти фруктовые вкусовые агенты могут быть получены из натуральных источников, таких как фруктовые соки и ароматические масла, или альтернативно могут быть приготовлены синтетически. Количество используемого вкусового агента будет варьироваться в зависимости от используемых агентов и желаемого характера или интенсивности в законченном составе. Обычный специалист без труда определит это.
Один или более подсластителей, включающих в себя, например, углеводные подсластители и натуральные и (или) искусственные некалорийные / низкокалорийные подсластители, могут опционально использоваться здесь. Например, составы по настоящему изобретению могут быть подслащены любым из углеводных подсластителей, предпочтительно моносахаридами и (или) дисахаридами. Предпочтительными сахарными подсластителями для использования в составах по настоящему изобретению являются сахароза, фруктоза, глюкоза, мальтоза и их комбинации.
Могут быть использованы один или более высокоинтенсивных подсластителей. Например, один или более из следующих подсластителей могут быть использованы: сахарин, цикламаты, L-аспартил-L-фенилаланин низшие алкилные сложноэфирные подсластители (напр., аспартам); L-аспартил-D-аланин амиды, описанные в патенте США №4411925; L-аспартил-D-серин амиды, описанные в патенте США №4399163; L-аспартил-1-гидроксиметилалканамидные подсластители, описанные в патенте США №4338346; L-аспартил-1-гидроксиэтилалканамидные подсластители, описанные в патенте США №4423029; L-аспартил-D-фенилглицин сложноэфирные и амидные подсластители, описанные в европейской патентной заявке №168112; N-[N-3,3-диметилбутил)-L-альфа-аспартил]-L-фенилаланин 1-метил сложноэфирные подсластители, описанные в международной заявке №99/30576; тауматин; дигидрохальконы; цикламаты; стевиозиды; глицирризины; синтетические алкоксиловые ароматические агенты; сукралоза; суозан; миракулин; монеллин; сорбит; ксилитол; талин; циклогексилсульфаматы; замещенные имидазолины; синтетические сульфамовые кислоты, такие как ацесульфам, ацесульфам К и n-замещенные сульфамовые кислоты; оксимы, такие как перилартин; пептиды, такие как аспартиловые малонаты и сукканиловые кислоты; дипептиды; основанные на аминокислотах подсластители, такие как гем-диаминоалканы, мета-аминобензойная кислота, алканы L-аминодикарбоксильной кислоты, и амиды некоторых альфа-аминодикарбоксильных кислот и гем-диамины; 3-гидрокси-4-алкилоксифениловые алифатические карбоксилаты, гетероциклические ароматические карбоксилаты; эритритол; и их комбинации.
Аспартам является особенно предпочтительным. Количество используемого подсластителя будет варьироваться в зависимости от используемых агентов и желаемого характера или интенсивности в законченном составе. Обычный специалист без труда определит это.
Один или более антиоксидантов могут быть использованы в составах по настоящему изобретению. Могут быть использованы антиоксиданты натурального происхождения, равно как и синтетические антиоксиданты. Неограничивающие примеры натуральных антиоксидантов включают в себя токоферолы (напр., витамин Е), аскорбиновую кислоту (напр., витамин С), витамин А (напр., бета-каротин), экстракт семян винограда, селен и коэнзим Q10. Неограничивающие примеры синтетических антиоксидантов включают в себя бутилированный гидрокситолуэн (ВНТ), бутилированный гидроксианизол (ВНА) и пропил галлат.
Другие неограничивающие примеры опциональных компонентов, использующихся в составах по настоящему изобретению, включают в себя диклофенак, напроксен, аспирин, индометацин, омепразол, сердечные гликозиды, электролитные препараты с натриевыми, калиевыми или магниевыми солями, а также препараты кальция и железа, препараты бисакодила, вальпроивая кислота, 5-ASA, стероиды, такие как гидрокортизон, будезонид, слабительные, октреотиды, цизаприд, антихолинергии, блокаторы кальциевых каналов, 5НТ3-антагонисты, такие как ондансетрон и пептиды, такие как инсулин.
Неограничивающие примеры наполнителей включают в себя подсластители (такие, как описанные здесь ниже); твердые смазочные агенты, такие как стеариновая кислота и стеарат магния; сульфат кальция; растительные масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и масло теобромы; эмульгаторы, такие как TWEENS; увлажняющие агенты, такие как лаурил сульфат натрия; таблетирующие агенты, такие как связующие агенты, антиоксиданты; консерванты.
Способы изготовления
Ввиду чувствительности составов по настоящему изобретению к уровням воды и кислороду предпочтительно контролировать уровни этих материалов во время процесса изготовления. По существу, обнаружено, что атмосфера, в которой составы по настоящему изобретению высушиваются, перемалываются, смешиваются и упаковываются, предпочтительно должна иметь относительную влажность (RH) менее чем 50%, предпочтительно менее 40%, более предпочтительно менее 36%. Помимо этого предпочтительно, чтобы составы приготавливались при атмосфере с низким содержанием кислорода. Как используется здесь, «атмосфера с низким содержанием кислорода» включает в себя атмосферы, содержащие менее чем 10% кислорода, предпочтительно менее чем 8% кислорода. Атмосферы с низким содержанием кислорода могут быть созданы с использованием инертной атмосферы, такой как азот, таким образом, чтобы вытеснить любой кислород, присутствующий в конечном составе. Атмосферы с низким содержанием кислорода желательны, поскольку любой кислород, присутствующий в составах, может привести к окислительной деградации и последующей потере бактериальной жизнеспособности и к загниванию или порче состава.
Более того, может быть желательным заранее обеспечить коммерчески доступные стабилизаторы, чтобы снизить их водное содержание еще сильнее, до смешивания с бактериями. Неограничивающие примеры того, как этого можно достичь, включают в себя печную сушку при пониженном давлении (в вакууме), сублимационную сушку, извлечение воды осушителями и сушку в псевдоожиженном слое.
Способы использования
Составы по настоящему изобретению предназначены для использования в качестве профилактики, терапевтического лечения или нетерапевтического лечения для облегчения заболевания и состояний, которым подвержены животные, предпочтительно млекопитающие, предпочтительно люди. Неограничивающие элементы здоровья и физиологии животных, которым приносится польза, либо при терапевтическом облегчении симптомов, либо при предотвращении заболевания путем профилактики, включают в себя воспалительные расстройства, иммунодефицит, воспалительные заболевания кишечника, синдром повышенной раздражимости кишечника, рак (особенно рак желудочно-кишечной и иммунной систем), диарейные заболевания, связанная с антибиотиками диарея, аппендицит, аутоиммунные расстройства, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, ревматоидный артрит, сахарный диабет, бактериальные инфекции, вирусные инфекции, грибковые инфекции, периодонтальная болезнь, мочеполовая болезнь, требующие хирургию травмы, вызванное хирургией метастазирование, сепсис, потеря веса, анорексия, понижение жара, кахексия, заживление ран, язвы, кишечная барьерная инфекция, аллергия, астма, респираторные расстройства, кровеносные расстройства, коронарная болезнь, анемия, расстройства системы свертывания крови, почечная болезнь, расстройства центральной нервной системы, заболевание печени, ишемия, пищевые расстройства, остеопороз, расстройства желез внутренней секреции и эпидемические расстройства. Предпочтительными являются лечение желудочно-кишечного тракта, включающее в себя лечение или предотвращение диареи; регулирование иммунной системы, предпочтительно лечение или предотвращение аутоиммунного заболевания и воспаления; поддержание или улучшение здоровья кожи, предпочтительно лечение или предотвращение атопического кожного заболевания; смягчение или снижение эффектов старения, включающее в себя психическое сознание и уровни активности; и предотвращение потери веса во время и после инфекции. Диарейные заболевания могут ассоциироваться с желудочно-кишечной воспалительной активностью.
Как правило, составы по настоящему изобретению даются индивиду как часть дозового режима. Дозовый режим зависит от используемого формата дозировки, в который включен сухой бактериальный состав. Дозированные формы описаны выше как формы либо капсулы, либо пакета-саше. Как правило, единичная доза обеспечивает индивида бактериями на уровне от 1×105 cfu на дозу до 1×1015 cfu на дозу, предпочтительно от 1×107 cfu до 1×1014 cfu на дозу. Единичная доза, если она представлена как капсула, может проглатываться непосредственно. Если она представлена как пакет-саше с сухим бактериальным составом, порошок может проглатываться непосредственно или смешанным с молоком, йогуртом или другими жидкими материалами-носителями. Как правило, капсулы могут обеспечивать более низкие объемы доз, чем пакеты-саше, поскольку размер капсулы и ее относительная легкость глотания ограничат количество сухого бактериального состава, которым можно ее наполнить. Предпочтительно, единичная доза принимается индивидом по меньшей мере один раз в месяц, предпочтительно по меньшей мере один раз в неделю, более предпочтительно по меньшей мере один раз в день.
Примеры
Нижеследующие примеры дальше описывают и демонстрируют варианты осуществления в рамках объема настоящего изобретения. Они даны в целях иллюстрации и не должны толковаться как ограничения настоящего изобретения. Где это применимо, ингредиенты даны с названием CTFA.
| Пр. | Материал | Водная активность | Водное содержание (%) | Вес(%) |
| 1 | Сублимационно высушенный В. Infantis (5×1012 CFU/g) | 0,04 | 6 | 50 |
| Микрокристаллическая целлюлоза | 0,04 | <1,5 | 50 | |
| 2 | Сублимационно высушенный В. Infantis (1×1010 CFU/g) | 0,04 | 6 | 25 |
| Картофельный крахмал | 0,09 | <6 | 75 | |
| 3 | Сублимационно высушенный В. Infantis (1×1011 CFU/g) | 0,04 | 6 | 40 |
| Блошничная гемицеллюлоза | 0,05 | <8 | 60 | |
| 4 | Сублимационно высушенный L. Salivarius (5×1012 CFU/g) | 0,04 | 5 | 80 |
| Микрокристаллическая целлюлоза | 0,04 | 1 | 20 | |
| 5 | Сублимационно высушенный L. Acidophilus (3×1011 CFU/g) | 0,04 | 5 | 60 |
| Мальтодекстрин | 0,25 | 5 | 39,5 | |
| Стеарат магния | 0,41 | <6 | 0,5 | |
| 6 | Сублимационно высушенный В. Infantis (1×1011 CFU/g) | 0,04 | 6 | 45 |
| Картофельный крахмал | 0,09 | <6 | 39,25 | |
| Стеарат магния | 0,41 | <6 | 0,75 | |
| Аскорбиновая кислота | - | - | 15 | |
| 7 | Сублимационно высушенный В. Infantis (2×1012 CFU/g) | 0,04 | 6 | 15 |
| Сублимационно высушенный L. Salivarius (2×1012 CFU/g) | 0,04 | 5 | 15 | |
| Микрокристаллическая целлюлоза | 0,04 | <1,5 | 27 | |
| Плавленый кварц | - | - | 2 | |
| Стеарат магния | 0,41 | <6 | 1 | |
| Аскорбиновая кислота | - | - | 20 | |
| Цитрат кальция 3 | - | - | 20 | |
| 8 | Сублимационно высушенный В. Infantis (5×1011 CFU/g) | 0,04 | 6 | 30 |
| Сублимационно высушенный L. Salivarius (5×1011 CFU/g) | 0,04 | 5 | 30 | |
| Микрокристаллическая целлюлоза | 0,04 | <1,5 | 23 | |
| Плавленый кварц | - | - | 1 | |
| Стеарат магния | 0,41 | <6 | 1 | |
| Аскорбиновая кислота | - | - | 5 | |
| Лактат глюконат кальция | - | - | 10 |
Приведенные выше примеры являются сухими бактериальными составами, приготовленными согласно следующей процедуре. Все операции производятся в среде с контролируемой влажностью, где RH поддерживается между 30 и 36%. Соответствующее количество бактерий, высушенных сублимационной сушкой (предварительно концентрированные до желаемого CFU/g), добавляется в смесительную полость миксера Pharamatech вместе с соответствующим количеством стабилизатора, такого как микрокристаллическая целлюлоза, картофельный крахмал или подобного им. Бактерии и стабилизаторы выбраны благодаря их низкой водной активности и низкому водному содержанию, а также сходному размеру частиц и плотностям, что обеспечивает более эффективное смешивание. Свободное пространство внутри смесительной полости продувается сухим азотным газом, так что газы первоначального свободного пространства замещаются в совокупности десятикратно или до уменьшения RH в смесительной полости ниже 20%. Смесительная полость затем запечатывается герметичной крышкой, и порошки смешиваются вместе в течение 20 минут при скорости вращения 60 об/мин. После окончания смешивания стабильность порошковой смеси может поддерживаться путем обеспечения неподверженности порошков высоким уровням RH (выше 36% RH) и средам с обильным содержанием воды. Сухие смешанные порошки могут быть упакованы в желатиновые капсулы в азотной среде / среде с низким RH и храниться в запечатанных контейнерах или как сухие порошки в пакетах-саше или контейнерах. Получившиеся капсулы и содержащиеся в них порошки имеют улучшенную долгосрочную стабильность и при низких температурах (4°С) и при комнатной температуре (25°С).
В еще одном варианте осуществления сухие бактериальные составы примеров с 1 по 8 могут быть упакованы в дозированные формы, такие как капсулы или пакеты-саше в азотной среде / среде с низкой (<36%) относительной влажностью (RH). Примеры с 9 по 11 демонстрируют неограничивающие примеры дозированных составов, упакованных в капсулы. Капсулы предназначены для приема в качестве единичной дозы и заглатывания целиком. Примеры с 12 по 14 являются неограничивающими примерами дозированных составов, упакованных в пакеты-саше, обеспечивающих более высокое количество бактерий на дозу по сравнению с капсулами.
| Пример | Формат упаковки | Сухой бактериальный состав | CFU на дозу |
| 9 | Желатиновая капсула | 100мг Пр.1 | 2,5×1011 |
| 10 | Капсула НРМС | 180мг Пр.2 | 4,5×108 |
| 11 | Желатиновая капсула | 250 мг Пр.5 | 1×1012 |
| 12 | Пакет-саше | 2 г Пр.7 | 1,2×1012 |
| 13 | Пакет-саше | 5г Пр.8 | 1,5×1012 |
| 14 | Пакет-саше | 1г Пр.4 | 4×1012 |
Хотя проиллюстрированы и описаны конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, для специалиста очевидно, что различные иные изменения и модификации могут быть произведены без отхода от существа и объема изобретения. Поэтому оно предназначено для охвата в прилагаемой формуле изобретения всех подобных изменений и модификаций, находящихся в пределах объема данного изобретения.
1. Сухой бактериальный состав, содержащий по меньшей мере на 10% по весу итогового состава сухой бактериальный концентрат, имеющий концентрацию бактерий по меньшей мере 1·108 КОЕ/г, и стабилизатор, имеющий водную активность менее чем 0,5 при водном содержании 10%, при этом итоговый сухой бактериальный состав имеет водную активность менее чем 0,5.
2. Сухой бактериальный состав по п.1, отличающийся тем, что имеет водную активность менее чем 0,4, предпочтительно менее чем 0,25.
3. Сухой бактериальный состав по п.1, отличающийся тем, что имеет бактериальную концентрацию от 1·108 до 1·1014 КОЕ/г.
4. Сухой бактериальный состав по п.1, отличающийся тем, что содержит по меньшей мере 30% упомянутого бактериального концентрата.
5. Сухой бактериальный состав по п.1, отличающийся тем, что бактерии являются жизнеспособными.
6. Сухой бактериальный состав по п.1, отличающийся тем, что имеет общее водное содержание менее чем 20%.
7. Сухой бактериальный состав по п.1, отличающийся тем, что содержит от 1 до 90% стабилизатора.
8. Сухой бактериальный состав по п.7, отличающийся тем, что стабилизатор имеет температуру стеклования при водном содержании 10% выше чем 273К.
9. Сухой бактериальный состав по п.7, отличающийся тем, что содержит по меньшей мере один стабилизатор, выбираемый из группы, состоящей из полисахаридов, олигосахаридов, дисахаридов, основанных на целлюлозе материалов, полиолей, полигидридных спиртов, кремнеземов, цеолитов, глин, глиноземов, крахмалов, сахаров, или их комбинаций.
10. Сухой бактериальный состав по п.1, отличающийся тем, что сухой бактериальный концентрат содержит бактерии, продуцирующие молочную кислоту.
11. Сухой бактериальный состав по п.10, отличающийся тем, что содержит бактерии рода Streptococci, Lactobacillus, Bifidobacteria и их комбинации.
12. Сухой бактериальный состав по п.11, отличающийся тем, что содержит бактерии вида Lactobacillus salivarius, Bifidobacteria infantis и их комбинации.
13. Сухой бактериальный состав по п.1, отличающийся тем, что пригоден для употребления млекопитающими.
14. Упакованный сухой бактериальный состав, содержащий:
сухой бактериальный состав по п.1 и упаковку, включающую упомянутый сухой бактериальный состав.
15. Упакованный сухой бактериальный состав по п.14, отличающийся тем, что упаковка представляет собой пакет-саше или капсулу.
16. Упакованный сухой бактериальный состав по п.15, отличающийся тем, что упаковка представляет собой капсулу.
17. Упакованный состав по п.16, отличающийся тем, что капсула содержит гидроксипропилметилцеллюлозу, желатин, крахмал, альгинаты или их комбинации.
18. Дозированный состав, включающий сухой бактериальный состав по п.1 и упаковку, содержащую сухой бактериальный состав, причем упомянутый дозированный состав обеспечивает от 1·105 до 1·1015 КОЕ/г бактерий на дозу.
19. Способ стабилизации сухого бактериального состава, предусматривающий смешивание сухого бактериального концентрата, имеющего бактериальную концентрацию по меньшей мере 1·108 КОЕ/г на уровне по меньшей мере 10% по весу итогового сухого бактериального состава, со стабилизатором, имеющим водную активность менее чем 0,5 при водном содержании 10%, при этом итоговый сухой бактериальный состав имеет водную активность менее чем 0,5.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что сухой бактериальный состав готовят в атмосфере с низким содержанием кислорода.
21. Способ по п.19, отличающийся тем, что сухой бактериальный состав готовят в атмосфере, имеющей относительную влажность менее чем 50%.
22. Способ по п.19, отличающийся тем, что сухой бактериальный концентрат высушивают сублимационной сушкой.
23. Способ лечения млекопитающего, нуждающегося в лечении, предусматривающий введение состава по п.18 указанному млекопитающему, нуждающемуся в лечении.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что упомянутому млекопитающему вводят упомянутый состав по меньшей мере один раз в месяц.
25. Способ по п.24, отличающийся тем, что упомянутое млекопитающее является человеком.
