Нейтрализующие антитела против gdf-8 и их применение

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине. В данном изобретении получены новые антитела и фрагменты антител человека, которые специфически связываются с GDF-8 и ингибируют его активность in vitro и/или in vivo. На основании данного изобретения создана фармацевтическая композиция, которая может быть использована для диагностики, профилактики или лечения дегенеративных нарушений мышцы или кости или нарушений метаболизма инсулина. Данное изобретение расширяет ассортимент арсенала технических средств, используемых при лечении заболеваний, связанных с мышечной, костной тканью или метаболизмом инсулина. 11 н. и 30 з.п. ф-лы, 12 ил., 3 табл.

 

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на выдачу патента Соединенных Штатов Америки №60/419964, поданной 22 октября 2002 года, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Область техники относится к антителам против фактора-8 роста и дифференцировки (GDF-8), в частности антителам человека и фрагментам антител, в частности к антителам и фрагментам антител, которые ингибируют активность GDF-8 in vitro и/или in vivo. Эта область дополнительно относится к диагностике, профилактике или лечению дегенеративных нарушений мышцы или кости или нарушений метаболизма инсулина.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Фактор-8 роста и дифференцировки (GDF-8), также известный как миостатин, является секретируемым белком и является членом надсемейства трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) структурно родственных факторов роста, каждый из которых имеет физиологически важные регулирующие рост и морфогенетические свойства (Kingsley et al. (1994) Genes Dev., 8:133-146; Hoodless et al. (1998 Curr. Topics Microbiol. Immunol., 228:235-272). Подобно TGF-β, GDF-8 человека синтезируется в виде белка-предшественника размером 375 аминокислот. Этот белок-предшественник GDF-8 образует гомодимер. Во время процессинга аминоконцевой пропептид отщепляется при Arg-266. Этот отщепленный пропептид, известный как «ассоциированный с латентностью пептид» (LAP), может оставаться нековалентно связанным с гомодимером, инактивируя посредством этого этот комплекс (Miyazono et al. (1988) J.Biol. Chem., 263:6407-6415; Wakefield et al. (1988) J.Biol. Chem., 263:7646-7654; Brown et al. (1990 Growth Factors, 3:35-43 и Thies et al. (2001) Growth Factors, 18: 251-259). Комплекс зрелого GDF-8 с пропептидом обычно называют «малым латентным комплексом» (Gentry et al. (1990) Biochemistry, 29:6851-6857; Derynck et al. (1995) Nature, 316:701-705 и Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol., 12:597-641). Известно, что другие белки также связывают зрелый GDF-8 и ингибируют его биологическую активность. Такие ингибиторные белки включают в себя фоллистатин и фоллистатин-родственные белки (Gamer et al. (1999) Dev. Biol., 208:222-232).

Сопоставление расшифрованных аминокислотных последовательностей из различных видов демонстрирует, что GDF-8 является высококонсервативным в ходе эволюции (McPherron et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12457-12461). Действительно, последовательности GDF-8 человека, мыши, крысы, свиньи и курицы являются на 100% идентичными в С-концевом районе, тогда как в случае павиана, коровы и овцы они различаются только 3 аминокислотами. GDF-8 зубастого карася является наиболее дивергентным; однако он идентичен на 88% GDF-8 человека.

Высокая степень сохранения предполагает, что GDF-8 имеет важную функцию. GDF-8 экспрессируется в высокой степени в развивающейся и зрелой скелетной мышце, и было обнаружено, что он участвует в регуляции критических биологических процессов в мышце и в остеогенезе. Например, трансгенные мыши с выключенным GDF-8 характеризуются ярко выраженной гипертрофией и гиперплазией скелетных мышц (McPherron et al. (1997) Nature, 387:83-90) и измененной структурой кортикального слоя костей (Hamrick et al. (2000) Bone, 27(3):343-349). Сходные увеличения массы скелетных мышц обнаруживаются в природно встречающихся мутациях GDF-8 у крупного рогатого скота (Ashmore et al. (1974) Growth, 38:501-507; Swatland et al. (1994) J.Anim. Sci., 38:752-757; McPherron et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12457-12461 и Kambadur et al. (1997) Genome Res., 7:910-915). Исследования показали, что мышечное истощение, ассоциированное с ВИЧ-инфекцией, сопровождается увеличением экспрессии GDF-8 (Gonzalez-Cadavid et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14938-14943). Предполагалось также, что GDF-8 участвует в продуцировании специфических для мышц ферментов (например, креатинкиназы) и пролиферации миобластных клеток (WO 00/43781). Считается, что кроме его регулирующих рост и морфогенетических свойств GDF-8 участвует также в ряде других физиологических процессов, в том числе гомеостазе глюкозы в развитии диабета типа 2, нарушенной толерантности к глюкозе, метаболических синдромах (например, синдроме Х), инсулинорезистентности, вызываемой травмой, такой как ожоги или нарушение азотного баланса, и нарушениях жировой ткани (например, ожирении) (Kim et al. (2001) BBRC, 281:902-906).

Ряд нарушений у человека и животных ассоциированы с функционально нарушенной мышечной тканью, например мышечная дистрофия (в том числе мышечная дистрофия Дюшенна), боковой амиотрофический склероз, мышечная атрофия, атрофия органов, хрупкость, хроническая обструктивная болезнь легких, саркопения, кахексия и синдромы мышечного истощения, вызываемые другими заболеваниями и состояниями. До настоящего времени очень мало надежных или эффективных способов терапии было разработано для лечения этих нарушений.

Имеется ряд состояний, ассоциированных с разрежением кости, которые включают в себя остеопороз и остеоартрит, в частности, у пожилых и/или постклимактерических женщин. Кроме того, метаболические костные заболевания и нарушения включают в себя низкую костную массу вследствие продолжительной глюкокортикоидной терапии, преждевременную недостаточность половых желез, супрессию андрогенов, недостаточность витамина D, вторичный гиперпаратиреоз, нарушения питания и нервно-психическую анорексию. Доступные в настоящее время терапии для этих состояний действуют посредством ингибирования резорбции кости. Желательной альтернативой этим терапиям была бы терапия, которая стимулирует новообразование кости.

Таким образом, существует потребность в разработке новых способов лечения, которые способствуют общему увеличению мышечной массы и/или прочности и/или плотности костей, в частности, человека.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одними объектами данного изобретения являются безопасные и эффективные способы лечения ассоциированных с мышцами и/или костями нарушений.

Другими объектами данного изобретения являются способы увеличения мышечной массы и/или прочности и/или плотности костей у позвоночных животных.

Еще одними объектами данного изобретения являются ингибиторы GDF-8, которые являются безопасными и эффективными in vivo.

Другими объектами данного изобретения являются антитела человека и их фрагменты, которые связывают GDF-8 с высокой специфичностью и аффинностью.

Таким образом, раскрыты способы лечения дегенеративных нарушений мышц и кости. Эти способы применимы также для увеличения мышечной массы и плотности костей у здоровых животных. Обеспечены также новые анти-GDF-8-антитела человека, названные Myo29, Myo28 и Myo22, и произведенные из них антитела и антигенсвязывающие фрагменты. Антитела данного изобретения имеют ряд полезных свойств. Во-первых, эти антитела способны связывать зрелый GDF-8 с высокой аффинностью. Во-вторых, описанные антитела ингибируют активность GDF-8 in vitro и in vivo, как показано, например, ингибированием связывания ActRIIB и анализами с использованием репортерных генов. В-третьих, описанные антитела могут ингибировать активность GDF-8, ассоциированную с отрицательной регуляцией массы скелетных мышц и плотности костей.

Некоторые варианты осуществления данного изобретения содержат V_H- и/или V_L-домен Fv-фрагмента Myo29, Myo28 или Myo22. Дополнительные варианты осуществления содержат один или несколько определяющих комплементарность районов (CDR) любого из этих V_H- и/или V_L-доменов Myo29, Myo28 или Myo22.

Другие аспекты обеспечивают композиции, содержащие антитела данного изобретения или их антигенсвязывающие фрагменты, и их применение в способах ингибирования или нейтрализации GDF-8, в том числе способах лечения человека или животных. Антитела данного изобретения могут быть использованы для лечения или предупреждения состояний, при которых желательным является увеличение мышечной ткани или плотности костей. Например, описанные здесь антитела могут быть использованы в способах лечения для восстановления поврежденной мышцы, например, миокарда, диафрагмы и т.д. Примеры заболеваний и нарушений включают в себя мышечные и нервно-мышечные нарушения, такие как мышечная дистрофия (в том числе мышечная дистрофия Дюшенна); боковой амиотрофический склероз; мышечную атрофию; атрофию органов; хрупкость; синдром канала запястья; хроническую обструктивную болезнь легких; саркопению, кахексию и другие синдромы мышечного истощения; нарушения жировой ткани (например, ожирение); диабет типа 2; нарушенную толерантность к глюкозе; метаболические синдромы (например, синдром Х); инсулинорезистентность, индуцированную травмой, такой как ожоги или нарушения азотного баланса; и костные дегенеративные заболевания (например, остеоартрит и остеопороз).

Кроме того, описанные в настоящее время антитела могут быть использованы в качестве диагностического инструмента для количественного или качественного детектирования GDF-8 или его фрагментов в биологическом образце. Детектированное присутствие или количество GDF-8 может коррелировать с одним или несколькими медицинскими состояниями, перечисленными выше.

Другой аспект относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая содержит последовательность, кодирующую V_H- или V_L-домен из Fv-фрагмента Myo29, Myo28 или Myo22. Описана также выделенная нуклеиновая кислота, которая содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере один CDR из любого из описанных в настоящее время V_H- и V_L-доменов. Другой аспект относится к клеткам-хозяевам, содержащим такую нуклеиновую кислоту.

Еще один аспект относится к способу получения новых V_H- и V_L-доменов и/или функциональных антител, содержащих все домены или часть таких доменов, произведенных из V_H- или V_L-доменов Myo29, Myo28 или Myo22.

Дополнительные цели данного изобретения будут изложены частично в следующем далее описании, а частично будут очевидными из данного описания, или могут быть определены при применении данного изобретения на практике. Различные цели, аспекты и преимущества данного изобретения будут поняты и достигнуты с использованием элементов и комбинаций, конкретно указанных в прилагаемой формуле изобретения.

Следует понимать, что как предыдущее общее описание, так и последующее подробное описание носят только примерный и разъясняющий характер и не ограничивают данное изобретение, которое заявлено в формуле изобретения.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 показано, что биотинилированные GDF-8 и ВМР-11 связывают рецептор ActRIIB с ED₅₀ 15 нг/мл и 40 нг/мл, соответственно.

На фиг.2 показано ингибирование связывания GDF-8 с рецептором ActRIIB scFv-фрагментами данного изобретения. Как показано, IC₅₀ для scFv Myo29, Myo28 и Myo22 равны 2,4 нМ, 1,7 нМ и 60 нМ, соответственно.

На фиг.3А и 3В показано, что предынкубация Myo29 с биотинилированным GDF-8 или ВМР-11 при 10 нг/мл ингибирует связывание GDF-8 или ВМР-11 с ActRIIB в анализе связывания ActRIIB с IC₅₀ 0,2-0,4 нМ.

На фиг.4В и 4С показаны результаты анализов с использованием репортерного гена pGL3(CAGA)₁₂, в которых испытывали Myo29. Фигура 4А демонстрирует условия базовой линии (фона), т.е. индукцию активности репортерного гена GDF-8, ВМР-11 и активином. Фиг.4В и 4С показывают, что Myo29 уменьшает активность GDF-8 зависимым от дозы образом с IC₅₀ 15-30 нг/мл и ингибирует биологическую активность ВМР-11 в той же самой степени. Фиг.4D иллюстрирует, что Myo29 не влияет на активность активина в этом анализе.

На фиг.5 показаны результаты картирования эпитопа для Myo22, Myo28 и Myo29. Эпитоп Myo29 был картирован от аминокислоты 72 до аминокислоты 88 зрелого GDF-8; для Myo22, от аминокислоты 1 до аминокислоты 44; для Myo28, от аминокислоты 1 до аминокислоты 98.

На фиг.6 показаны результаты анализа замен эпитопа Myo29. По-видимому, остатки Lys-78, Pro-81 и Asn-83 в зрелом GDF-8 являются важными для связывания Myo29 с GDF-8.

На фиг.7 показаны результаты эксперимента по иммунопреципитации, выполняемого с Myo29 и Myo28. Кондиционированную среду от клеток СНО, экспрессирующих GDF-8, которые были радиоактивно помечены ³⁵S-метионином/цистеином, подвергали иммунопреципитации с использованием Myo29 или Myo28. Затем иммунопреципитаты анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ при восстанавливающих условиях. Полосы на геле идентифицировали как зрелый GDF-8, пропептид GDF-8 и непроцессированный GDF-8.

На фиг.8 показаны результаты фармакокинетического исследования, в котором мыши С57В6/SCID получали дозу 1 мг/кг в виде единственного внутривенного (IV) или внутрибрюшинного (IP) введения Myo29. Myo29 показывает пролонгированный конечный полупериод существования около одной недели и низкий клиренс приблизительно 1 мл/час/кг. Фракция, абсорбированная после IP-инъекции, составляет приблизительно 77%.

На фиг.9 показаны сравнения массы четырехглавых мышц бедра у самцов мышей СВ17 SCID, получавших один раз в неделю различные дозы Myo29 (60, 10 и 1 мг/кг) или носитель (ЗФР). Лечение Myo29 при уровнях доз 10 и 60 мг/кг в течение четырех недель приводит к статистически значимому увеличению мышечной массы 19% и 23%, соответственно.

На фиг.10А и 10В показана масса икроножной и четырехглавой мышц у самок мышей СВ17 SCID, получавших один раз в неделю различные дозы Myo29 (10, 5, 2,5 и 1 мг/кг) или ЗФР в течение четырех недель. Мышечная масса увеличивается на 10-20% в мышах, получавших Myo29, в сравнении с контролем-носителем.

На фиг.11А и 11В показана соответственно масса икроножной и четырехглавой мышц у самок мышей СВ17 SCID, получавших один раз в неделю различные дозы Myo29 (10, 5, 2,5 и 1 мг/кг) или ЗФР в течение двенадцати недель. Мыши, получавшие Myo29, показывают увеличения мышечной массы в диапазоне 12-28%.

На фиг.12 показана мышечная сила передней конечности, измеренная измерителем силы хватания, у самок мышей СВ17 SCID, получавших один раз в неделю Myo29 (10 и 5 мг/кг) или ЗФР в течение двенадцати недель. Сила передней конечности увеличивалась на 17% и 23% у мышей, получавших Myo29 при 5 мг/кг и 10 мг/кг, соответственно.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

I. Определения

Термин «антитело» в данном контексте относится к иммуноглобулину или его части и включает в себя любой полипептид, содержащий антигенсвязывающий сайт, независимо от источника, вида происхождения, способа получения и характеристик. В качестве неограничивающего примера, термин «антитело» включает в себя антитела человека, орангутанга, мыши, крысы, козы, овцы и курицы. Этот термин включает в себя, но не ограничивается ими, поликлональные, моноклональные, моноспецифические, полиспецифические, неспецифические, гуманизированные, одноцепочечные, химерные, синтетические, рекомбинантные, гибридные, мутированные и CDR-трансплантированные антитела. Для целей данного изобретения этот термин включает в себя также, если нет других указаний, фрагменты антител, такие как Fab, F(ab')₂, Fv, scFv, Fd, dAB и другие фрагменты антител, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию.

Антитела могут быть получены, например, посредством традиционных гибридомных способов (Kohler and Milstein (1975) Nature, 256:495-499), методами рекомбинантных ДНК (патент США №4816567) или способами фагового дисплея с использованием библиотек антител (Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al. (1991) J.Mol. Biol., 222:581-597). В отношении других способов получения антител см. Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Термин «антигенсвязывающий домен» относится к части молекулы антитела, которая содержит зону, специфически связывающуюся с частью антигена или со всем антигеном, или комплементарной части антигена или всему антигену. Если антиген является большим, антитело может связывать только конкретную часть этого антигена. «Эпитоп» или «антигенная детерминанта» является частью молекулы антигена, которая является ответственной за специфические взаимодействия с антигенсвязывающим доменом антитела. Антигенсвязывающий домен может быть обеспечен одним или несколькими вариабельными доменами антитела (например, так называемым Fd-фрагментом антитела, состоящим из V_H-домена). Антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи (V_L) и вариабельную область тяжелой цепи (V_H).

Термин «репертуар» относится к генетически различному набору нуклеотидов, например ДНК-последовательностей, происходящих полностью или частично из последовательностей, которые кодируют экспрессируемые иммуноглобулины. Эти последовательности генерируются реаранжировкой in vivo, например, V-, D- и J-сегментов для Н-цепей и, например, V- и J-сегмента для L-цепей. Альтернативно, эти последовательности могут быть генерированы из клеточной линии стимуляцией in vitro, в ответ на которую может происходить реаранжировка. Альтернативно, часть этих последовательностей или все эти последовательности могут быть получены объединением неаранжированных V-сегментов с D- и J-сегментами, посредством нуклеотидного синтеза, неспецифического мутагенеза и других способов, как описано в Патенте США №5565332.

Термин «специфическое взаимодействие” или “специфически связывается” или т.п. обозначает, что две молекулы образуют комплекс, который является относительно стабильным при физиологических условиях. Этот термин может быть также применим когда, например, антигенсвязывающий домен является специфическим в отношении конкретного эпитопа, который несут ряд антигенов, и в этом случае данное антитело несет антигенсвязывающий домен, который может быть способен связываться с различными антигенами, несущими этот эпитоп. Таким образом, антитело может специфически связывать, например, ВМР-11 и GDF-8, пока оно связывается с эпитопом, который несут оба эти фактора.

Специфическое связывание характеризуется высокой аффинностью и низкой - умеренной производительностью. Неспецифическое связывание обычно имеет низкую аффинность с умеренной - высокой производительностью. Обычно связывание считается специфическим, когда константа аффинности К_а выше, чем 10⁶ М^-1 или предпочтительно выше, чем 10⁸ М^-1. Если необходимо, неспецифическое связывание может быть уменьшено по существу без влияния на специфическое связывание варьированием условий связывания. Такие условия известны в данной области и специалист с квалификацией в данной области с использованием рутинных способов может выбрать подходящие условия. Эти условия обычно определяют в виде концентрации антител, ионной силы раствора, температуры, времени, позволяющего связывание, концентрации неродственных молекул (например, сывороточного альбумина, казеина молока) и т.д. Примеры условий представлены в примерах 4, 7 и 10.

Фраза “по существу, как представленные” означает, что релевантные CDR, V_H- или V_L-домен будут или идентичными, или в высокой степени сходными с указанными районами, последовательность которых представлена здесь. Например, такие замены включают в себя 1 или 2 из любых 5 аминокислот в последовательности CDR (Н1, Н2, Н3, L1, L2 или L3).

Термин “надсемейство TGF-β” относится к семейству структурно родственных факторов роста. Это семейство родственных факторов роста хорошо известно в данной области (Kingsley et al. (1994) Genes Dev., 8: 133-146; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol., 228: 235-72). Надсемейство TGF-β включает в себя костные морфогенетические белки (ВМР), активин, ингибин, ингибирующее вещество Мюллера, полученный из глии нейротрофический фактор и все время растущий ряд факторов роста и дифференцировки (GDF), таких как GDF-8 (миостатин). Многие из таких белков являются структурно и/или функционально родственными GDF-8. Например, ВМР-11 человека, также известный как GDF-11, на 90% идентичен GDF-8 по аминокислотной последовательности (Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208, 222-232; Nakshima et al. (1999) Mech. Dev. 80:185-189).

Термин «GDF-8» относится к специфическому фактору-8 роста и дифференцировки и, где это удобно, к факторам, которые структурно или функционально родственны GDF-8, например, ВМР-11 и другим факторам роста, принадлежащим к надсемейству TGF-β. Этот термин относится в полноразмерной непроцессированной форме-предшественнику GDF-8, а также к формам зрелого белка и пропептида, возникающим в результате посттрансляционного расщепления. Этот термин относится также к любым фрагментам и вариантам GDF-8, которые сохраняют по меньшей мере некоторые биологические активности, ассоциированные со зрелым GDF-8, как обсуждается здесь, в том числе последовательностям, которые могут быть модифицированы. Аминокислотная последовательность зрелого GDF-8 человека представлена в SEQ ID NO:49. Данное изобретение относится к GDF-8 из всех видов позвоночных, в том числе, но не только, человека, коровы, курицы, мыши, крысы, свиньи, овцы, индейки, павиана и рыбы (в отношении информации о последовательности см., например, McPherron et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12457-12461).

Термин «зрелый GDF-8» относится к белку, который отщеплен от карбоксиконцевого домена белка-предшественника GDF-8. Зрелый GDF-8 может присутствовать в виде мономера, гомодимера или в виде латентного комплекса GDF-8. В зависимости от условий зрелый GDF-8 может устанавливать равновесие между любыми или всеми из этих различных форм. В его биологически активной форме зрелый GDF-8 называют также «активным GDF-8».

Термин «пропептид GDF-8» относится к полипептиду, который отщеплен от аминоконцевого домена белка-предшественника GDF-8. Пропептид GDF-8 способен связываться с пропептидсвязывающим доменом на зрелом GDF-8.

Термин “латентный комплекс GDF-8” относится к комплексу белков, образованных между зрелым гомодимером GDF-8 и пропептидом GDF-8. Считается, что два пропептида GDF-8 связываются с двумя молекулами зрелого GDF-8 в гомодимере с образованием неактивного тетрамерного комплекса. Латентный комплекс может включать в себя другие ингибиторы GDF вместо одного или более пропептидов GDF-8 или наряду с одним или более пропептидами GDF-8.

Термин “активность GDF-8” относится к одной или нескольким физиологически регулирующим рост или морфогенетическим активностям, ассоциированным с активным белком GDF-8. Например, активный GDF-8 является отрицательным регулятором массы склетных мышц. Активный GDF-8 может также модулировать продуцирование специфических для мышц ферментов (например, креатинкиназы), стимулировать пролиферацию миобластов и модулировать дифференцировку пре-адипоцитов в адипоциты. Примеры процедур для измерения активности GDF-8 in vivo и in vitro приведены в примерах 2, 3, 6 и 13.

Термин “ингибитор GDF-8” включает в себя любой агент, способный ингибировать активность, экспрессию, процессинг или секрецию GDF-8. Такие ингибиторы включают в себя белки, антитела, пептиды, пептидомиметики, рибозимы, антисмысловые олигонуклеотиды, двухцепочечные РНК и другие малые молекулы, которые специфически ингибируют GDF-8. Говорят, что такие ингибиторы “ингибируют”, “нейтрализуют” или “уменьшают” биологическую активность GDF-8.

Термины “нейтрализуют”, “нейтрализующий”, “ингибиторный” и близкие им слова относятся к уменьшению активности GDF-8 ингибитором GDF-8 относительно активности GDF-8 в отсутствие того же самого ингибитора. Уменьшение активности составляет предпочтительно приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более.

Термин “лечение” используется здесь взаимозаменяемо с термином “терапевтический способ” и относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим/превентивным мероприятиям. Те, кто нуждается в лечении, могут включать в себя индивидуумов, уже имеющих конкретное медицинское нарушение, а также индивидуумов, которые могут в конечном счете приобрести это нарушение (т.е. индивидуумов, нуждающихся в превентивных мероприятиях).

Термин “выделенный” относится к молекуле, которая по существу не содержит ее природного окружения. Например, выделенный белок по существу не содержит клеточного материала или других белков из клеточного или тканевого источника, из которого он получен. Этот термин относится к препаратам, в которых выделенный белок является достаточно чистым для введения в качестве терапевтической композиции или по меньшей мере на 70 мас.%-80 мас.% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 80 мас.%-90 мас.% чистым, еще более предпочтительно на 90-95 мас.% чистым; и, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95 мас.%, 96 мас.%, 97 мас.%, 98 мас.%, 99 мас.% или 100 мас.% чистым.

Термин “млекопитающее” относится к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, в том числе людям, домашним и сельскохозяйственным животным, животным зоопарка, спортивным животным или комнатным животным, таким как собаки, лошади, кошки, овцы, свиньи, коровы и т.д.

Термин “эффективная доза” или “эффективное количество” относится к количеству соединения, которое приводит к ослаблению симптомов у пациента или желаемому биологическому результату (например, увеличенной массе скелетных мышц и/или плотности костей). Такое количество должно быть достаточным для уменьшения активности GDF-8, связанной с отрицательной регуляцией массы скелетных мышц и плотности кости. Это эффективное количество может быть определено, как описано в последующих разделах.

II. Антитела против GDF-8 и антигенсвязывающие фрагменты

А. Антитела Myo29, Myo28 или Myo22 человека

Данное изобретение относится к новым антителам против GDF-8 и их антигенсвязывающие фрагменты. Неограничивающие иллюстративные варианты таких антител названы Myo29, Myo28 или Myo22. Эти примеры вариантов данного изобретения обеспечены в форме IgG₁-антител человека.

Антитела данного изобретения обладают уникальными и полезными свойствами. Во-первых, эти антитела способны связывать с высокой аффинностью зрелый GDF-8. Во-вторых, антитела данного изобретения могут ингибировать активность GDF-8 in vitro и in vivo, как показано, например, ингибированием связывания ActRIIB и анализами с использованием репортерных генов. Антитела данного изобретения способны также специфически связывать и/или ингибировать активность ВМР-11, как показано, например, ингибированием связывания ActRIIB и анализами с использованием репортерных генов. В третьих, описанные антитела могут ингибировать активность GDF-8, ассоциированную с отрицательной регуляцией массы скелетных мышц и плотности костей.

В примерном варианте осуществления описанные в настоящее время антитела способны специфически связывать как GDF-8, так и ВМР-11. Предполагается, что эти антитела могут также взаимодействовать с другими белками, например с белками, принадлежащими к надсемейству TGF-β, такими как ингибирующее вещество Мюллера, полученный из глии нейротрофический фактор или факторы роста и дифференцировки, другие, чем GDF-8. В некоторых вариантах осуществления Myo29 взаимодействует с белком, который содержит последовательность, идентичную аминокислотам 72-88 SEQ ID NO:49. В дополнительных вариантах осуществления Myo29 связывается с белком, содержащим последовательность Lys-Xaa1-Xaa2-Pro-Xaa3-Asn (SEQ ID NO:54), где Xaa1, Xaa2 и Xaa3, каждый, обозначают любую аминокислоту. В дополнительных вариантах осуществления удовлетворяется по меньшей мере одно из следующих условий: (1) Хаа1 = Met, (2) Xaa2 = Ser и (3) Xaa3 = Ile; в каждом случае независимо один от другого. В других вариантах осуществления Myo22 узнает эпитоп в первых 44 N-концевых аминокислотах в последовательности зрелого GDF-8 (аминокислоты 1 - 44 SEQ ID NO:49).

Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что антитела данного изобретения могут быть использованы для обнаружения, измерения и ингибирования белков, которые отличаются от белков, указанных выше. В общем, антитела данного изобретения могут быть использованы с любым белком, который содержит последовательность, которая является по меньшей мере на приблизительно 70%, 80%, 90%, 95% или более идентичной любой последовательности из по меньшей мере 100, 80, 60, 40 или 20 смежных аминокислот в последовательности зрелой формы GDF-8, представленной SEQ ID NO:49. Неограничивающие примеры таких белков включают в себя последовательности GDF-8, полученные из разных видов, которые описаны в данном описании. Процентную идентичность определяют стандартными алгоритмами сопоставлений, такими как, например, Basic Local Alignment Tool (BLAST), описанный в Altschul et al. (1990) J. Vol. Biol., 215:403-410, алгоритм Needleman et al. (1970) J.Mol. Biol., 48:444-453 или алгоритм Meyers et al. (1988) Comput. Appl. Biosci., 4:11-17.

В. Вариабельные домены

Интактные антитела, также известные как иммуноглобулины, являются обычно тетрамерными гликозилированными белками, состоящими из двух легких (L) цепей массой приблизительно 25 кДа каждая и двух тяжелых (Н) цепей массой приблизительно 50 кДа каждая. Два типа легкой цепи, названные λ и κ, обнаружены в антителах. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей, иммуноглобулины могут быть отнесены к пяти основным классам: A, D, E, G и М, и некоторые из них могут быть дополнительно подразделены на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны в данной области. В отношении структуры антител см. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988. Вкратце, каждая легкая цепь состоит из N-концевого вариабельного (V) домена (V_L) и константного (С) домена (C_L). Каждая тяжелая цепь состоит из N-концевого V-домена, трех или четырех С-доменов и шарнирного участка. С_Н-домен, наиболее проксимальный относительно V_H, назван С_Н1. V_H- и V_L-домен состоят из четырех районов относительно консервативной последовательности, назваемых каркасными районами (FR1, FR2, FR3 и FR4), которые образуют каркас для трех районов гипервариабельной последовательности (определяющих комплементарность районов, CDR). CDR содержат большинство остатков, ответственных за специфические взаимодействия с антигеном. CDR называют CDR1, CDR2 и CDR3. Таким образом, CDR-компоненты на тяжелой цепи называют Н1, Н2 и Н3, тогда как CDR на легкой цепи называют L1, L2 и L3. CDR3 является самым важным участком молекулярного разнообразия в антигенсвязывающем сайте. Н3, например, может быть таким коротким, как два аминокислотных остатка, или большим, чем 26 аминокислотных остатков. Наименьшим антигенсвязывающим фрагментом является Fv, который состоит из доменов V_H и V_L. Fab-фрагмент (фрагмент связывания антигена) состоит из доменов V_H-С_Н1 и V_L-C_L, ковалентно связанных дисульфидной связью между константными областями. Для преодоления тенденции нековалентно связанных доменов V_H и V_L в Fv диссоциироваться в клетке-хозяине может быть сконструирован так называемый одноцепочечный (sc) Fv-фрагмент (scFv), в котором гибкий и достаточно длинный полипептид связывает или С-конец V_H с N-концом V_L, или С-конец V_L с N-концом V_H. Наиболее часто используемым линкером был пептид из 15 аминокислотных остатков (Gly₄Ser)₃, но в данной области известны также и другие линкеры.

Разнообразие антител создается с использованием множественных генов зародышевой линии клеток, кодирующих вариабельные области, и различных соматических событий. Эти соматические события включают в себя рекомбинацию сегментов вариабельных генных сегментов с генными сегментами разнообразия (D-сегментами) и соединительными генными сегментами (J-сегментами) с образованием полной V_H-области и рекомбинацию вариабельного и соединительного генных сегментов с образованием полной V_L-области. Сам процесс рекомбинации является неточным, что приводит к потере или добавлению аминокислот в этих V(D)J-областях соединений. Эти механизмы разнообразия встречаются в развивающейся В-клетке перед подверганием действию антигена. После стимуляции антигеном экспрессируемые гены антител в В-клетках подвергаются соматической мутации. На основании приближенно определенного количества генных сегментов зародышевого типа, случайной рекомбинации этих сегментов и случайного спаривания V_H-V_L могут быть образованы до 1,6×10⁷ различных антител (Fundamental Immunology, 3^rd ed., ed. Paul, Raven Press, New York, NY, 1993). С учетом других процессов, способствующих разнообразию антител (таких как соматическая мутация), считается, что могут генерироваться до 1×10¹⁰ различных антител (Immunoglobulin Genes, 2^nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Вследствие этих многих процессов, участвующих в генерировании разнообразия антител, вряд ли вероятно, что независимо полученные моноклональные антитела со специфичностью в отношении одного и того же антигена будут иметь идентичные аминокислотные последовательности.

Таким образом, данное изобретение дополнительно относится к новым CDR, полученных из библиотек генов иммуноглобулинов человека. Структурой для несения CDR данного изобретения будет обычно последовательность тяжелой или легкой цепи антитела или ее существенная часть, в которой CDR находится в положении, соответствующем CDR природно встречающихся V_H и V_L. Структуры и местоположения вариабельных доменов иммуноглобулина могут быть определены, как описано в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, eds. Kabat et al., 1991.

ДНК-последовательности и аминокислотные (АА) последовательности описанных здесь антител, их scFv-фрагмент, домены V_H и V_L и CDR приведены в Списке последовательностей и имеют нумерацию, показанную в таблице 1. Для удобства положения для каждого CDR в доменах V_H и V_L приведены в таблице 2. Последовательности тяжелой и легкой цепей, включающие в себя домены V_H и V_L, являются идентичными в Myo29, Myo28 или Myo22.

ТАБЛИЦА 1
ДНК-последовательности и аминокислотные последовательности scFv, доменов VH и VL и CDR
	Myo29	Myo28	Myo22
ДНК-последовательность scFv	SEQ ID NO:13	SEQ ID NO:7	SEQ ID NO:1
АА-последовательность scFv	SEQ ID NO:14	SEQ ID NO:8	SEQ ID NO:2
ДНК-последовательность VH	SEQ ID NO:15	SEQ ID NO:9	SEQ ID NO:3
АА-последовательность VH	SEQ ID NO:16	SEQ ID NO:10	SEQ ID NO:4
ДНК-последовательность VL	SEQ ID NO:17	SEQ ID NO:11	SEQ ID NO:5
АА-последовательность VL	SEQ ID NO:18	SEQ ID NO:12	SEQ ID NO:6
ДНК-последовательность scFv зародышевого типа	SEQ ID NO:25	SEQ ID NO:19
АА-последовательность scFv зародышевого типа	SEQ ID NO:26	SEQ ID NO:20
ДНК-последовательность VH зародышевого типа	SEQ ID NO:27	SEQ ID NO:21
АА-последовательность VH зародышевого типа	SEQ ID NO:28	SEQ ID NO:22
ДНК-последовательность VL зародышевого типа	SEQ ID NO:29	SEQ ID NO:23
АА-последовательность VL зародышевого типа	SEQ ID NO:30	SEQ ID NO:24
АА-последовательность Н1	SEQ ID NO:31	SEQ ID NO:37	SEQ ID NO:43
АА-последовательность Н2	SEQ ID NO:32	SEQ ID NO:38	SEQ ID NO:44
АА-последовательность Н3	SEQ ID NO:33	SEQ ID NO:39	SEQ ID NO:45
АА-последовательность L1	SEQ ID NO:34	SEQ ID NO:40	SEQ ID NO:46
АА-последовательность L2	SEQ ID NO:35	SEQ ID NO:41	SEQ ID NO:47
АА-последовательность L3	SEQ ID NO:36	SEQ ID NO:42	SEQ ID NO:48

Таблица 2 Положения CDR в scFv
CDR	Myo29(SEQ ID NO:26)	Myo28(SEQ ID NO:20)	Myo22(SEQ ID NO:2)
Н1	31-35	31-35	31-35
Н2	50-66	50-66	50-66
Н3	99-106	99-110	99-113
L1	157-167	160-173	163-176
L2	183-189	189-195	192-198
L3	222-226	228-233	231-242

Заявляемые здесь антитела могут дополнительно содержать константные области антител или их части. Например, домен V_L может быть присоединен к С-концевой стороне константных областей легкой цепи антитела, в том числе цепей Сκ или Сλ, предпочтительно цепей Сλ. Подобным образом, специфический антигенсвязывающий фрагмент на основе домена V_H может быть присоединен на его С-концевой стороне ко всей тяжелой цепи иммуноглобулина или к части тяжелой цепи иммуноглобулина, полученной из любого изотипа антител, например, IgG, IgA, IgE и IgM, и любых подклассов антител, в частности IgG₁ и IgG₄. В примерах вариантов осуществления антитела содержат С-концевые фрагменты тяжелой и легкой цепей IgG_1λ человека. ДНК-последовательности и аминокислотные последовательности для С-концевого фрагмента легкой цепи λ изображены в SEQ ID NO:50 и SEQ ID NO:51, соответственно. ДНК-последовательности и аминокислотные последовательности для С-концевого фрагмента тяжелой цепи IgG₁ изображены в SEQ ID NO:52 и SEQ ID NO:53, соответственно.

Некоторые варианты осуществления данного изобретения включают в себя домен

V_H и/или V_L Fv-фрагмента Myo29, Myo28 или Myo22. Дополнительные варианты осуществления включают в себя один или более определяющих комплементарность районов (CDR) любого из этих доменов V_H и V_L. Один вариант осуществления включает в себя Н3-фрагмент домена V_H Myo29, Myo28 или Myo22. Домены V_H и V_L данного изобретения в некоторых вариантах сделаны доменами зародышевого типа, т.е. каркасные области (FR) этих доменов изменены с использованием общепринятых способов молекулярной биологии таким образом, что они соответствуют консенсусным аминокислотным последовательностям генных продуктов зародышевого типа человека. В других вариантах эти каркасные области остаются отличающимися от каркасных областей зародышевого типа.

С. Модифицированные антитела и их фрагменты

Следующий аспект данного изобретения относится к способу получения антигенсвязывающего домена антитела, специфического в отношении GDF-8. Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что антитела данного изобретения не ограничиваются специфическими последовательностями V_H и V_L, показанными в Таблице 1, но включают в себя также варианты этих последовательностей, которые сохраняют антигенсвязывающую способность. Такие варианты могут быть произведены из обеспеченных последовательностей с использованием способов, известных в данной области. Аминокислотные замены, делеции или добавления могут быть произведены или в FR, или в CDR. В то время как изменения в каркасных областях обычно предназначены для улучшения стабильности и уменьшения иммуногенности антитела, изменения в CDR обычно предназначены для увеличения аффинности антитела в отношении его мишени. Такие увеличивающие аффинность изменения обычно определяются эмпирически изменением района CDR и испытанием этого антитела. Такие изменения могут быть произведены способами, описанными в Antibody Engineering, 2^nd ed., ed. Borrebaeck, Oxford University Press, 1995.

Способ получения V_H-домена, который является вариантом аминокислотной последовательности V_H-домена, представленного здесь, предусматривает стадию добавления, делеции, замены или инсерции одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности заявленного здесь V_H-домена, необязательно объединения обеспеченного таким образом V_H-домена с одним или несколькими V_L-доменами и испытания этого V_H-домена или V_H/V_L-комбинации или комбинаций на специфическое связывание с GDF-8, необязательно испытания способности такого антигенсвязывающего домена нейтрализовать активность GDF-8. V_L-домен может иметь аминокислотную последовательность, которая по существу представлена здесь.

Может быть использован аналогичный способ, в котором один или несколько вариантов последовательности V_L-домена, описанной здесь, объединяют с одним или несколькими V_H-доменами.

Следующий аспект данного изобретения относится к способу получения антигенсвязывающего фрагмента, который специфически взаимодействует с GDF-8. Этот способ предусматривает:

(а) обеспечение исходного спектра нуклеиновых кислот, кодирующих V_H-домен, который или включает в себя CDR3, который должен быть заменен, или не содержит кодирующего CDR3 района;

(b) объединение этого спектра с донорной нуклеиновой кислотой, кодирующей аминокислотную последовательность, по существу такую, как представленная здесь для CDR3 V_H (т.е. Н3), таким образом, что эта донорная последовательность встраивается в район CDR3 в этом спектре таким образом, чтобы обеспечить в качестве продукта спектр нуклеиновых кислот, кодирующих V_H-домен;

(с) экспрессию нуклеиновых кислот полученного спектра;

(d) отбор специфического антигенсвязывающего фрагмента, специфического в отношении GDF-8; и

(е) извлечение специфического антигенсвязывающего фрагмента или нуклеиновой кислоты, кодирующей его.

Опять может быть использован аналогичный способ, в котором CDR3 (т.е. L3) V_L данного изобретения объединяют со спектром нуклеиновых кислот, кодирующих V_L-домен, которые или включают в себя CDR3, который должен быть заменен, или не содержат кодирующего CDR3 района.

Кодирующая последовательность CDR данного изобретения (например, CDR3) может быть введена в спектр вариабельных доменов, не содержащих CDR (например, CDR3) с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Например, Marks et al., (Bio/Technology (1992) 10: 779-783) описывают способы получения спектров вариабельных доменов антител, в которых консенсусные праймеры, направленные на 5'-конец или смежную с ним последовательность участка вариабельного домена, используют вместе с консенсусными праймерами для третьего каркасного района генов V_H человека для обеспечения спектра вариабельных доменов V_H, лишенных CDR3. Этот спектр может комбинироваться с CDR3 конкретного антитела. С использованием аналогичных способов полученные из CDR3 последовательности данного изобретения могут быть перетасованы со спектрами V_H- или V_L-доменов, лишенных CDR3, и эти перетасованные полные V_H- или V_L-домены комбинируют с родственным V_L- или V_H-доменом с получением специфических антигенсвязывающих фрагментов данного изобретения. Затем этот спектр может быть представлен в подходящей системе-хозяине, такой как система фагового дисплея WO 92/01047, таким образом, что могут быть отобраны подходящие антигенсвязывающие фрагменты.

Аналогичные способы перетасовки или комбинаторные способы описаны также Stemmer (Nature (1994) 370:389-391), который описывает этот способ в отношении гена β-лактамазы, но наблюдает, что этот подход может быть использован для генерирования антител.

Следующей альтернативой является генерирование новых V_H- или V_L-районов, несущих полученные из CDR последовательности данного изобретения, с использованием беспорядочного (случайного) мутагенеза одного или нескольких выбранных V_H- и/или V_L-генов для генерирования мутаций в целом вариабельном домене. Такой способ описан Gram et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:3576-3580), которые использовали склонную к ошибкам ПЦР.

Другим способом, который может быть использован, является направление мутагенеза на районы CDR генов V_H и V_L. Такие способы описаны Barbas et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:3809-3813) и Schier et al. (J. Mol. Biol. (1996) 263:551-567).

Подобным образом, один или более, или все три CDR могут быть трансплантированы в спектр V_H- и V_L-доменов, которые затем подвергают скринингу на специфический партнер связывания или фрагменты связывания, специфические в отношении GDF-8.

Существенная часть вариабельного домена иммуноглобулина будет содержать по меньшей мере районы CDR и, необязательно, их промежуточные каркасные районы из scFv-фрагментов, как представлено здесь. Эта часть будет также включать в себя по меньшей мере приблизительно 50% любого или обоих из FR1 и FR4, причем эти 50% являются С-концевыми 50% FR1 и N-концевыми 50% FR4. Дополнительные остатки на N-концевой или С-концевой стороне существенной части вариабельного домена могут быть остатками, обычно ассоциированными с природно встречающимися районами вариабельных доменов. Например, конструирование специфических антигенсвязывающих фрагментов данного изобретения, произведенное с использованием способов рекомбинантных ДНК, может приводить к введению N-концевых или С-концевых остатков, кодируемых линкерами, введенными для облегчения клонирования или других стадий манипулирования. Другие стадии манипулирования включают в себя введение линкеров для присоединения вариабельных доменов данного изобретения к дополнительным белковым последовательностям, в том числе тяжелым цепям иммуноглобулина, другим вариабельным доменам (например, при получении диантител) или белковым меткам, как обсуждается более подробно ниже.

Хотя варианты, иллюстрированные в примерах, содержат “совместимую” пару V_H- и V_L-доменов, данное изобретение включает в себя также связывающие фрагменты, содержащие единственный вариабельный домен, происходящий из последовательностей или V_H-, или V_L-доменов, в частности V_H-доменов. В случае любого из этих специфических в отношении единственной цепи связывающих доменов, эти домены могут быть использованы для скрининга на комплементарные домены, способные образовывать специфический в отношении двух доменов антигенсвязывающий домен, способный связывать GDF-8. Это может быть достигнуто способами скрининга с применением фагового дисплея, использующими так называемый иерархический двойной комбинаторный подход, как описано в WO 92/01047, в котором отдельную колонию, содержащую клон либо Н-, либо L-цепи, используют для инфицирования полной библиотеки клонов, кодирующих другую цепь (L или Н), и полученный специфический в отношении двух цепей антигенсвязывающий домен отбирают в соответствии со способами фагового дисплея, такими, как описанные в этой ссылке. Этот способ описан также в Marks et al., supra.

Антитела могут быть конъюгированы химическими способами с радионуклидами, лекарственными средствами, макромолекулами или другими агентами или могут быть изготовлены в виде слитых белков, содержащих один или несколько CDR данного изобретения.

Слитый белок антител содержит V_H-V_L-пару, в которой одна из этих цепей (обычно V_H) и другой белок синтезированы в виде единой полипептидной цепи. Эти типы продуктов отличаются от антител тем, что они обычно имеют дополнительный функциональный элемент; активную часть малой молекулы или главный молекулярный структурный признак этой конъюгированной или слитой макромолекулы.

Кроме изменений аминокислотной последовательности, описанных выше, антитела могут быть гликозилированы, пэгилированы или связаны с альбумином или небелковым полимером. Например, заявленные теперь антитела могут быть связаны с одним из множества небелковых полимеров, например полиэтиленгликолем, полипропленгликолем или полиоксиалкиленами, способом, описанным в Патентах США с номерами 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337. Эти антитела химически модифицируют ковалентной конъюгацией с полимером, например, для увеличения их полупериода существования в кровотоке. Примеры полимеров и способы их присоединения к пептидам описаны также в Патентах США с номерами 4766106; 4179337; 4495285 и 4609546.

В других вариантах антитело может быть модифицировано таким образом, чтобы оно имело измененную картину гликозилирования (т.е. измененную в сравнении с исходной или нативной картиной гликозилирования). В данном контексте, “измененная” означает наличие делетированных одной или нескольких углеводных частей молекулы и наличие одного или нескольких сайтов гликозилирования, добавленных к исходному антителу. Добавление сайтов гликозилирования к заявленным здесь антителам, выполняемое изменением аминокислотной последовательности таким образом, что она содержит консенсусные последовательности сайтов гликозилирования, хорошо известно в данной области. Другим способом увеличения количеств углеводных частей молекул на антителах является химическое или ферментативное связывание гликозидов с аминокислотными остатками антитела. Эти способы описаны в WO 87/05330 и в Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306. Удаление любых углеводных частей молекул на антителах может выполняться химически или ферментативно, как описано Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259:52; и Edge et al. (1981) Anal. Biochem., 118:131 и Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol., 138:350.

Антитела данного изобретения могут быть также помечены детектируемой или функциональной меткой. Детектируемые метки включают в себя радиоактивные метки, такие как ¹³¹I или ⁹⁹Tc, которые могут быть присоединены к антителам данного изобретения с использованием общепринятых химических способов, известных в данной области. Метки включают в себя также ферментные метки, такие как пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза. Далее, метки включают в себя химические части молекул, такие как биотин, который может быть детектирован через связывание со специфической родственной детектируемой частью молекулы, такой как, например, меченый авидин.

Антитела, в которых последовательности CDR отличаются только несущественно от последовательностей, представленных в SEQ ID NO:n, где n равно 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или 48, включены в рамки данного изобретения. Несущественные различия включают в себя минорные изменения аминокислот, такие как замены 1 или 2 из любых 5 аминокислот в последовательности CDR. Обычно аминокислоту заменяют родственной аминокислотой, имеющей сходные заряд, гидрофобные или стереохимические свойства. Такие замены находятся в рамках обычной квалификации специалиста. В отличие от этого в CDR более существенные изменения в структурных каркасных районах (FR) могут быть произведены без вредного влияния на связывающие свойства антитела. Изменения в FR включают в себя, но не ограничиваются ими, гуманизирование полученной не из человека каркасной области или конструирование некоторых каркасных остатков, которые являются важными для контакта с антигеном или для стабилизации сайта связывания, например, изменением класса или подкласса константной области, изменением специфических аминокислотных остатков, которые могут изменять эффекторную функцию, такую как связывание Fc-рецептора (Lund et al. (1991) J.Immun. 147:2657-2662 и Morgan et al. (1995) Immunology 86:319-324), или изменением вида, из которого получают эту константную область. Антитела могут иметь мутации в районе С_Н2 тяжелой цепи, которые уменьшают или изменяют эффекторную функцию, например связывание Fc-рецептора и активацию комплемента. Например, антитела могут иметь мутации, такие как описанные в Патентах США с номерами 5624821 и 5648260. В тяжелой цепи IgG₁ или IgG₂, например, такие мутации могут быть получены при аминокислотых остатках 117 и 120 SEQ ID NO:53, которая представляет Fc-часть IgG₁ (эти остатки соответствуют аминокислотам 234 и 237 в полноразмерной последовательности IgG₁ или IgG₂). Антитела могут также иметь мутации, которые стабилизируют дисульфидную связь между двумя тяжелыми цепями иммуноглобулина, такие как мутации в шарнирной области IgG₄, описанные в Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-108.

D. Нуклеиновые кислоты, системы клонирования и экспрессии

Данное изобретение относится также к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей антитела или связывающей фрагменты данного изобретения. Нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением может содержать ДНК или РНК и может быть полностью или частично синтетической. Ссылка на нуклеотидную последовательность, представленную здесь, включает в себя молекулу ДНК с указанной последовательностью и включает в себя молекулу РНК с указанной последовательностью, в которой Т заменен U, если в контексте нет иного указания.

Нуклеиновая кислота данного изобретения содержит кодирующую последовательность для CDR или V_H- или V_L-домена данного изобретения, представленную здесь.

Данное изобретение относится также к конструкции в форме плазмид, векторов, транскрипционных или экспрессионных кассет, которые содержат по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту данного изобретения, описанную выше.

Данное изобретение относится к также клетке-хозяину, которая содержит одну или более конструкций, описанных выше. Нуклеиновая кислота, кодирующая любой CDR (Н1, Н2, Н3, L1, L2 или L3), V_H- или V_L-домен или специфический антигенсвязывающий фрагмент, обеспеченные здесь, образует аспект данного изобретения, как и способ получения кодируемого продукта. Этот способ включает в себя экспрессию из кодирующей нуклеиновой кислоты. Экспрессия может достигаться культивированием при подходящих условиях рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих данную нуклеиновую кислоту. После продуцирования экспрессией V_H- или V_L-домен или специфический антигенсвязывающий фрагмент может быть выделен и/или очищен с использованием любого подходящего способа и затем использован соответствующим образом.

Специфические антигенсвязывающие фрагменты, V_H- и/или V_L-домены и кодирующие молекулы нуклеиновых кислот и векторы в соответствии с данным изобретением могут быть обеспечены в выделенном и/или очищенном виде, например, из их природного окружения в по существу чистой или гомогенной форме или, в случае нуклеиновой кислоты, в форме, не содержащей или по существу не содержащей нуклеиновой кислоты или генов другого происхождения, чем происхождение последовательности, кодирующей полипептид с требуемой функцией.

Известны системы для клонирования и экспрессии полипептида во множестве различных клеток-хозяев. Подходящие клетки-хозяева включают в себя бактерии, клетки млекопитающих и дрожжевые и бакуловирусные системы. Линии клеток млекопитающих, доступные в данной области для экспрессии гетерологичного полипептида, включают в себя клетки яичника китайского хомячка, клетки HeLa, клетки почки детеныша хомячка, клетки мышиной меланомы NS0 и многие другие. Обычным бактериальным хозяином является E. coli. В отношении клеток, подходящих для получения антител, см. Gene Expression Systems, eds. Fernandez et al., Academic Press, 1999. Любая клетка, совместимая с данным изобретением, может быть использована для получения заявленных здесь антител.

Могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие подходящие регуляторные последовательности, в том числе промоторные последовательности, терминаторные последовательности, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие соответствующие последовательности. Векторами могут быть плазмиды или вирусы, например, фаг или фагмида, по мере необходимости. В отношении дополнительных подробностей см., например, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2^nd ed., Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Многочисленные известные способы и протоколы для манипулирования нуклеиновыми кислотами, например, при получении конструкций нуклеиновых кислот, мутагенезе, секвенировании, введении ДНК в клетки и экспрессии генов и анализе белков, описаны подробно в Current Protocols in Molecular Biology, 2^nd ed., Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

Таким образом, следующий аспект данного изобретения относится к клетке-хозяину, содержащему нуклеиновую кислоту, описанную здесь. Еще один аспект относится к способу, предусматривающему введение такой нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Это введение можно выполнять любым доступным способом. Для эукариотических клеток подходящие способы могут включать в себя трансфекцию с использованием фосфата кальция, ДЭАЭ-декстрана, электропорацию, опосредованную липосомами трансфекцию и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса, например вируса коровьей оспы, или, для клеток насекомых, бакуловируса. Для бактериальных клеток подходящие способы могут включать в себя трансформацию с использованием хлорида кальция, электропорацию и трансфекцию с использованием бактериофага.

Введение может сопровождаться вызыванием или созданием возможности экспрессии из этой нуклеиновой кислоты, например культивированием клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии рассматриваемого гена.

Е. Биологические депозиты

Культуры E. coli, индивидуально трансформированные фагмидным вектором pCANTAB6, кодирующим scFv Myo29, Myo28 или Myo22, не модифицированные с получением продуктов зародышевого типа, были депонированы 2 октября 2002 года в Американской Коллекции Культур Ткани (АТТС) под соответствующими номерами обозначения депозитов РТА-4741, РТА-4740 и РТА-4739. Адрес депозитария: 10801 University Blvd, Manassas, VA 20110, USA.

II. Способы лечения заболевания и другие применения

Антитела данного изобретения применимы для предотвращения, диагностики или лечения различных медицинских нарушений в человеке или животных. Антитела могут быть использованы для ингибирования или уменьшения одной или нескольких активностей, ассоциированных с GDF-8 или родственным белком. Наиболее предпочтительно, эти антитела ингибируют или уменьшают одну или несколько активностей GDF-8 относительно GDF-8, который не связан антителом. В некоторых вариантах осуществления активность GDF-8, при связывании одним или несколькими из заявленных здесь антител, ингибируется по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 76, 78, 80, 82, 84, 86 или 88%, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 91, 92, 93 или 94% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%-100% относительно зрелого белка GDF-8, который не связан одним или несколькими заявленными здесь антителами. Ингибирование активности GDF-8 может быть измерено в анализах с использованием репортерного гена pGL3(CAGA)₁₂ (RGA), как описано в Thies et al. (Growth Factors (2001) 18:251-259) и как иллюстрировано в примерах 2 и 9, или в анализах с использованием рецептора ActRIIB, как иллюстрировано в примерах 3 и 6.

Медицинским нарушением, которое диагностируют, лечат или предотвращают описанным здесь антителами, является мышечное или нервно-мышечное нарушение; нарушение жировой ткани, такое как ожирение; диабет типа 2; нарушенная толерантность к глюкозе; метаболические синдромы (например, синдром Х); инсулинорезистентность, индуцированная травмой, такой как ожоги или нарушение азотного баланса; или костное дегенеративное заболевание, такое как остеопороз.

Другими медицинскими нарушениями, которые диагностируют, лечат или предотвращают описанными здесь антителами, являются нарушения, связанные с разрежением кости, которые включают в себя остеопороз, особенно у пожилых и/или постклимактерических женщин, индуцированный глюкокортикоидами остеопороз, остеопению, остеоартрит и связанные с остеопорозом переломы. Другие метаболические костные заболевания и нарушения-мишени включают в себя низкую костную массу вследствие продолжительной глюкокортикоидной терапии, преждевременную гонадную недостаточность, супрессию андрогена, недостаточность витамина D, вторичный гиперпаратиреоз, пищевые недостаточности и нервно-психическую анорексию. Эти антитела предпочтительно используют для профилактики, диагностики или лечения таких медицинских нарушений у млекопитающих, в частности у людей.

Антитела или композиции антител данного изобретения вводят в терапевтически эффективных количествах. Обычно терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от возраста, состояния и пола субъекта, а также тяжести медицинского состояния в этом субъекте. Доза может быть определена врачом и скорректирована, если необходимо, для получения наблюдаемых эффектов лечения. Токсичность и терапевтическая эффективность таких соединений может быть определена стандартными фармацевтическими процедурами в культурах клеток или экспериментальных животных, например, определением LD₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) и ED₅₀ (дозы, терапевтически эффективной в 50% популяции). Соотношение дозы между токсическим и терапевтическим эффектами является терапевтическим индексом, и он может быть выражен в виде отношения LD₅₀/ED₅₀. Предпочтительными являются антитела, которые обнаруживают высокие терапевтические индексы.

Данные, полученные из анализов на клеточных культурах и исследований на животных, могут быть использованы в определении диапазона дозы для применения в случае людей. Доза таких соединений лежит предпочтительно в диапазоне концентраций в кровотоке, которые включают в себя ED₅₀ с малой токсичностью или с отсутствием токсичности. Эта доза может варьироваться в пределах этого диапазона в зависимости от используемой дозированной формы и используемого способа введения. Для любого антитела, используемого в данном изобретении, терапевтически эффективная доза может быть определена первоначально из анализов на культурах клеток. В моделях животных может быть определена доза, подходящая для достижения диапазона концентрации циркуляции в плазме, который включает в себя

IC₅₀ (т.е. концентрацию тестируемого антитела, которая дает полумаксимальное ингибирование симптомов), например, высокоэффективной жидкостной хроматографией. Действия любой конкретной дозы могут быть подвергнуты мониторингу посредством подходящего биоанализа. Примеры подходящих биоанализов включают в себя анализы репликации ДНК, анализы на основе транскрипции, анализы связывания белок GDF-8/рецептор, анализы креатинкиназы, анализы на основе дифференцировки пре-адипоцитов, анализы на основе поглощения глюкозы в адипоцитах и иммунологические анализы.

Обычно эти композиции вводят таким образом, что антитела или их связывающие фрагменты предоставляются в дозе 1 мкг/кг-150 мг/кг, 1 мкг/кг-100 мг/кг, 1 мкг/кг-50 мг/кг, 1 мкг/кг-20 мг/кг, 1 мкг/кг-10 мг/кг, 1 мкг/кг-1 мг/кг, 10 мкг/кг-1 мг/кг, 10 мкг/кг-100 мг/кг, 100 мкг/кг-1 мг/кг и 500 мкг/кг-1 мг/кг. Предпочтительно, эти антитела предоставляются в виде болюсной дозы для максимизации уровней антител в кровотоке в течение наибольшей продолжительности после введения этой дозы. После болюсной дозы может быть также использована непрерывная инфузия.

Способы лечения, диагностики или профилактики вышеупомянутых медицинских состояний описанными здесь антителами могут быть также использованы на других белках в надсемействе TGF-β. Многие из этих белков являются близкими по их структуре GDF-8, такими как ВМР-11. Таким образом, другой вариант осуществления обеспечивает способы лечения вышеупомянутых нарушений введением субъекту антитела, способного ингибировать ВМР-11 или активин, либо отдельно, либо в комбинации с другими ингибиторами TGF-β, такими как нейтрализующее антитело против GDF-8. Антитела данного изобретения могут быть также использованы для лечения заболевания или состояния, связанного с ВМР-11 или опосредованного ВМР-11. См., например, патенты США с номерами 5639638 и 6437111.

Антитела данного изобретения могут быть использованы для обнаружения присутствия белков, принадлежащих к надсемейству TGF-β, таких как ВМР-11 и GDF-8, in vivo или in vitro. Корреляцией присутствия или уровня этих белков с медицинским состоянием специалист с квалификацией в данной области может диагностировать ассоциированное с ними медицинское состояние. Медицинские состояния, которые могут быть диагностированы посредством описанных здесь антител, приведены выше.

Такие способы обнаружения хорошо известны в данной области и включают в себя ELISA, радиоиммуноанализ, иммуноблот, Вестерн-блот, иммунофлуоресценцию, иммунопреципитацию и другие сравнимые способы. Эти антитела могут быть дополнительно обеспечены в диагностическом наборе, который применим для одного или нескольких способов для детектирования белка (например, GDF-8). Такой набор может содержать другие компоненты, упаковку, инструкции или другие материалы, способствующие детектированию этого белка и применению этого набора.

В случае, когда эти антитела предназначены для диагностических целей, может быть желательной их модификация, например, лигандной группой (такой как биотин) или детектируемой маркерной группой (такой как флуоресцентная группа, радиоизотоп или фермент). Если желательно, эти антитела (поликлональные или моноклональные) могут быть помечены с использованием общепринятых способов. Подходящие метки включают в себя флуорофоры, хромофоры, радиоактивные атомы, электронно-плотные реагенты, ферменты и лиганды, имеющие специфических партнеров связывания. Ферменты обычно детектирует по их активности. Например, пероксидаза хрена может быть детектирована по ее способности превращать тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, который может быть определен количественно при помощи спектрофотометра. Другие подходящие метки могут включать в себя биотин и авидин или стрептавидин, IgG и белок А и многочисленные пары рецептор-лиганд, известные в данной области. Другие перестановки и возможности будут вполне очевидными специалистам с обычной квалификацией в данной области и рассматриваются как эквиваленты в объеме данного изобретения.

Еще один аспект данного изобретения относится к способу идентификации терапевтических агентов, применимых в лечении мышечных и костных нарушений. В данной области известны подходящие анализы-скрининги. В таком анализе-скрининге первую связывающую молекулу образуют объединением антитела данного изобретения и лиганда, например GDF-8, ВМР-11, активина; и измеряют количество связывания между этим лигандом и этим антителом в первой смеси для связывания (М₀). Вторую смесь для связывания также образуют объединением антитела, лиганда и подлежащего скринингу соединения или агента, и количество связывания между лигандом и антителом измеряют в этой второй смеси для связывания (М₁). Затем количества связываний в первой и второй смесях для связывания сравнивают, например, путем расчета отношения М₁/М₀. Считается, что это соединение или агент способен ингибировать активность GDF-8, если наблюдают уменьшение связывания во второй смеси для связывания в сравнении с первой смесью для связывания. Образование и оптимизация смесей для связывания находятся в рамках квалификации в данной области, и такие смеси для связывания могут также содержать буферы и соли, необходимые для усиления или оптимизации связывания, и дополнительные контрольные анализы могут быть включены в анализ-скрининг данного изобретения.

Соединения, уменьшающие связывание антитело-лиганд по меньшей мере на приблизительно 10% (т.е. М₁/М₀<0,9), согласно анализу, предпочтительно более, чем на приблизительно 30%, могут быть таким образом идентифицированы и затем, если желательно, вторично подвергнуты скринингу на способность ингибировать активность GDF-8 в других анализах, таких как анализ связывания ActRIIB (пример 2), и других анализов на основе клеток и анализов in vivo, как описано в примерах 13, 15 и 16.

III. Фармацевтические композиции и способы введения

Данное изобретение относится к композиции, содержащей эти описанные теперь антитела. Такие композиции могут быть пригодны для фармацевтического применения и введения пациентам. Обычно эти композиции содержат одно или несколько антител данного изобретения и фармацевтически приемлемый эксципиент. В данном контексте фраза “фармацевтически приемлемый эксципиент” включает в себя любой растворитель и все растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и т.п., которые являются совместимыми с фармацевтическим введением. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. Эти композиции могут также содержать другие активные соединения, обеспечивающие дополнительные, добавочные или усиленные терапевтические функции. Эти фармацевтические композиции могут быть включены в контейнер, упаковку или распределительное устройство вместе с инструкциями для введения.

Фармацевтическую композицию данного изобретения готовят таким образом, что она является совместимой с предполагаемым способом введения. Способы выполнения введения известны специалистам с обычной квалификацией в данной области. Можно также получать композиции, которые могут вводиться местно или перорально или которые могут быть способны проходить через слизистые оболочки. Введение может быть, например, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутриполостным, подкожным или чрескожным.

Растворы или суспензии, используемые для внутрикожного или подкожного введения, обычно включают в себя один или несколько из следующих компонентов: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, полипропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразователи, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты; и агенты для коррекции тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. рН может доводиться кислотами или основаниями, такими как хлористоводородная кислота или гидроксид натрия. Такие препараты могут быть заключены в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы со множественными дозами из стекла или пластика.

Фармацевтические композиции, пригодные для инъекции, включают в себя стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для незапланированного приготовления инъекционных растворов или дисперсий. Для внутривенного введения подходящие носители включают в себя физиологический солевой раствор, бактериостатическую воду, Cremophor™ EL (BASF, Parsippany, NJ) или забуференный фосфатом солевой раствор (ЗФР). Во всех случаях эта композиция должна быть стерильной и должна быть текучей до степени, которая пригодна для введения шприцем. Она должна быть стабильной в условиях приготовления и хранения и должна быть предохранена против загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может быть растворителем или диспергирующей средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, полипропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Подходящая текучесть может поддерживаться, например, с использованием покрытия, такого как лецитин, поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и с использованием поверхностно-активных веществ. Предупреждение действия микроорганизмов может достигаться посредством разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимерозала и т.п. Во многих случаях будет предпочтительным включение изотонических агентов, например сахаров, полиспиртов, таких как маннит, сорбит и хлорида натрия в эту композицию. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть получена включением в эту композицию агента, который задерживает абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.

Пероральные композиции обычно включают в себя инертный разбавитель или годный в пищу носитель. Они могут быть заключены в желатиновые капсулы или спрессованы в таблетки. Для целей перорального терапевтического введения антитела могут включаться с эксципиентами и использоваться в форме таблеток или капсул. Фармацевтически совместимые связывающие агенты и/или адъювантные материалы могут быть включены в виде части композиции. Таблетки, пилюли, капсулы и т.п. могут содержать любые из следующих ингредиентов или соединения сходной природы; связывающее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; эксципиент, такой как крахмал или лактоза; дезинтегрирующий агент, такой как альгиновая кислота, Primogel™ или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или Sterotes™; скользящее вещество, такое как коллоидальный диоксид кремния; подслащивающий агент, такой как сахароза или сахарин; или ароматизирующий агент, такой как мята перечная, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор.

Для введения ингаляцией антитела доставляют в форме аэрозольного спрея из находящегося под давлением контейнера или распределительного устройства, которые содержат подходящий пропеллент, например газ, такой как диоксид углерода, или распылителя.

Системное введение может быть также трансмукозным или чрескожным. Например, в случае антител, которые содержат Fc-часть, композиции могут быть способны проходить через слизистые оболочки (например, кишечника, полости рта или легких) посредством опосредованного FcRn-рецептором пути (патент США №6030613). Трансмукозное введение может быть выполнено, например, посредством применения пастилок, назальных спреев, ингаляторов или суппозиториев. Для чрескожного введения активные соединения готовят в виде притираний, мазей, гелей или кремов, как обычно известно в данной области. Для трансмукозного или чрескожного введения в приготовлении используют пенетранты, подходящие для барьера, который должен пересекаться. Такие пенетранты обычно известны в данной области и включают в себя, например, детергенты, соли желчных кислот и производные фусидовой кислоты.

Описанные теперь антитела могут быть приготовлены с носителями, которые защищают соединение против быстрой элиминации из тела, такими как композиция регулируемого высвобождения, в том числе имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы диодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких композиций будут очевидны специалистам с квалификацией в данной области. Липосомные суспензии, содержащие описанные здесь антитела, могут быть также использованы в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть приготовлены в соответствии со способами, известными специалистам с квалификацией в данной области, например, как описано в патенте США №4522811.

Может быть удобным приготовление пероральных или парентеральных композиций в дозированной унифицированной форме для облегчения введения и однородности дозы. Дозированная унифицированная форма в данном контексте обозначает физически дискретные единицы, пригодные в качестве единичных доз для проходящего лечение субъекта; причем каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное таким образом, чтобы давать желаемый терапевтический эффект, вместе с требующимся фармацевтическим носителем. Спецификация в отношении дозированных унифицированных форм данного изобретения диктуется уникальными характеристиками активного соединения и конкретным терапевтическим эффектом, который должен быть достигнут, и зависит от них, а также от ограничений, присущих типу приготовления такого активного соединения для лечения индивидуумов.

Следующие примеры обеспечивают иллюстративные варианты данного изобретения, которые никоим образом не ограничивают данное изобретение. Специалисту с обычной квалификацией в данной области будут известны многочисленные другие варианты осуществления, и они находятся в объеме данного изобретения.

Полные содержания всех ссылок, патентов и опубликованных заявок на патенты, цитируемых во всей этой заявке, включены здесь в качестве ссылки.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Очистка GDF-8

Кондиционированную среду из выбранной клеточной линии, экспрессирующей белок GDF-8 человека (зрелый GDF-8 и пропептид GDF-8), подкисляли до рН 6,5 и наносили на анионообменную колонку POROS™ HQ 80×50 мм в тандеме с катионообменной колонкой POROS™ SP 80×50 мм (PerSeptive Biosystems, Foster City, CA). Протекающий раствор доводили до рН 5,0 и наносили на катионообменную колонку POROS™ SP 75×20 мм (PerSeptive Biosystems) и элюировали градиентом NaCl. Фракции, содержащие латентный комплекс GDF-8, как подтверждено электрофорезом в ДСН-ПААГ, объединяли, подкисляли трифторуксусной кислотой (ТФУ) до рН 2-3, затем доводили до 200 мл 0,1% ТФУ для снижения вязкости. Затем этот пул наносили на колонку С₅ 250×21,2 мм (Phenomenex, Torrance, CA), которой предшествовала предохранительная колонка 60×21,2 мм (Phenomenex), и элюировали градиентом ТФУ/ацетонитрил для отделения зрелого GDF-8 от пропептида GDF-8. Объединенные фракции, содержащие зрелый GDF-8, концентрировали лиофилизацией для удаления ацетонитрила и добавляли 20 мл 0,1% ТФУ. Затем эту пробу наносили на колонку С₅ 250×10 мм (Phenomenex), нагретую до 60°С, для улучшения разделения. Это повторяли, пока уже не могло достигаться разделение. Затем фракции, содержащие GDF-8, объединяли и доводили до 40% ацетонитрила и наносили на гель-фильтрационную колонку BioSep™ S-3000 600×21,2 мм (Phenomenex), которой предшествовала предохранительная колонка 60×21,2. Фракции, содержащие очищенный зрелый GDF-8, объединяли и концентрировали для использования в последующих экспериментах.

При электрофорезе в ДСН-ПААГ очищенный зрелый GDF-8 мигрировал в виде широкой полосы при 25 кДа при невосстанавливающих условиях и при 13 кДа при восстанавливающих условиях. Сходный профиль электрофореза в ДСН-ПААГ сообщался для мышиного GDF-8 McPherron et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997): 12457-12461), и он отражает димерную природу зрелого белка. Активный димер зрелого ВМР-11 счищали из кондиционированной среды от клеточной линии, экспрессирующей рекомбинантный ВМР-11 человека, сходным образом.

Активный зрелый ВМР-11 очищали из кондиционированной среды от клеточной линии, экспрессирующей химерный белок пропептид GDF-8 человека/зрелый ВМР-11. Эту кондиционированную среду наносили на 10 мл колонки TALON™ (Clonotech, Palo Alto, CA) в 50 мМ Трисе рН 8,0, 1 М NaCl при 1 мл/мин. Связанный белок элюировали 50 мМ Трисом рН 8,0, 0,1 М NaCl, 500 мМ имодазолом. Объединенные фракции, содержащие латентный комплекс пропептид GDF-8/ВМР-11, подкисляли 10% ТФУ до рН 3. Затем этот пул наносили на колонку Jupiter C4 250×4,6 мм (Phenomenex, Torrance, CA), которую нагревали до 60ºС для лучшего разделения зрелого ВМР-11 и пропептида GDF-8 и элюировали градиентом ТФУ/ацетонитрил. Объединенные фракции, содержащие зрелый ВМР-11, концентрировали лиофилизацией. При электрофорезе в ДСН-ПААГ очищенный зрелый ВМР-11 мигрировал при 25 кДа при невосстанавливающих условиях и при 12 кДа при восстанавливающих условиях.

Пример 2. Биологическая активность очищенного рекомбинантного GDF-8 человека

Для демонстрации активности GDF-8 разработали анализ с использованием репортерного гена (RGA) с применением репортерного вектора pGL3(CAGA)₁₂, экспрессирующего люциферазу. Ранее сообщалось, что последовательность CAGA является отвечающей на TGF-β последовательностью в промоторе индуцируемого TGF-β гена PAI-1 (Denner et al. (1998) EMBO J., 17:3091-3100).

Репортерный вектор, содержащий 12 блоков CAGA, получали с использованием основной люциферазной репортерной плазмиды pGL3 (Promega, Madison, WI). ТАТА-блок и сайт инициации транскрипции из большого позднего промотора аденовируса (-35/+10) встраивали между сайтами BglII и HindIII. Олигонуклеотиды, содержащие 12 повторов CAGA-блоков AGCCAGACA, отжигали и клонировали в сайт XhoI. Линию клеток рабдомиосаркомы человека А204 (АТСС HTB-82) транзиторно трансфицировали pGL3(CAGA)₁₂ с использованием трансфицирующего реагента FuGENE™ 6 (Boehringer Mannheim, Germany). После трансфекции клетки культивировали на 48-луночных планшетах в среде McCoy 5A, дополненной 2 мМ глутамином, 100 Е/мл стрептомицина, 100 мкг/мл пенициллина и 10% фетальной телячьей сывороткой, в течение 16 часов. Затем клетки обрабатывали с 10 нг/мл GDF-8 или без 10 нг/мл GDF-8 в среде McCoy 5A с глутамином, стрептомицином, пенициллином и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина в течение 6 часов при 37°С. Люциферазу определяли количественно в обработанных клетках с использованием системы анализа с использованием люциферазы (Promega).

Фиг.4А показывает, что GDF-8 максимально активировал эту репортерную конструкцию в 10 раз, с ED₅₀ 10 нг/мл, что указывает на то, что очищенный рекомбинантный GDF-8 был биологически активным. ВМР-11 и активин индуцировали сходную биологическую реакцию.

Пример 3. Связывающие свойства очищенного GDF-8 в анализе связывания ActRIIB

Латентный комплекс GDF-8 биотинилировали при соотношении 20 молей сульфо-NHS-биотина EZ-link (Pierce, Rockford, Illinois, Cat. No. 21217) и 1 моль комплекса GDF-8 в течение 2 часов на льду. Реакцию останавливали понижением рН с использованием 0,5% ТФУ и этот комплекс подвергали хроматографии на колонке Jupiter C₄ 250×4,6 мм (Phenomenex) для отделения зрелого GDF-8 от пропептида GDF-8. Фракции биотинилированного зрелого GDF-8, элюированные градиентом ТФУ/СН₃CN, объединяли, концентрировали и определяли количественно с использованием набора реагентов для анализа белков MicroBCA™ (Pierce, Rockford, Illinois, Cat. No.23235).

Биотинилированный зрелый ВМР-11 получали из латентного комплекса ВМР-11 так же, как описано выше. Рекомбинантную химеру ActRIIB-Fc ((R&D Systems, Minneapolis, MN, Cat. No.339-RB/CF) наносили на 96-луночные плоскодонные планшеты для анализ.ов (Costar, NY, Cat. No. 3590) при 1 мкг/мл в 0,2 М натрий-карбонатном буфере в течение ночи при 4ºС. Затем планшеты блокировали 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и промывали согласно стандартному протоколу ELISA. В блокированный планшет ELISA добавляли аликвоты 100 мкл биотинилированного GDF-8 или ВМР-11 при различных концентрациях, инкубировали в течение 1 часа и количество связанного GDF-8 или ВМР-11 детектировали с использованием комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена (SA-HRB, BD PharMingen, San Diego, CA, Cat. No. 13047E) с последующим добавлением TMB (KPL, Gaithersburg, MD, Cat. No. 50-76-04). Колориметрические измерения выполняли при 450 нМ в микропланшет-ридере Molecular Devices.

Как показано на фиг.1, биотинилированные GDF-8 и ВМР-11 связывались с ActRIIB, предположительным рецептором типа II GDF-8, с ED₅₀ 15 и 40 нг/мл соответственно, свидетельствуя о том, что анализ связывания ActRIIB является чувствительным анализом связывания in vitro для GDF-8 и ВМР-11.

Пример 4. Выделение Myo22 пэннингом библиотек scFv на GDF-8

Фагмидную библиотеку scFv, которая является расширенной версией описанной 1,38×10¹⁰-библиотеки (Vaughan et al. (1996) Nature Biotech., 14: 309-314), использовали для отбора антител, специфических в отношении GDF-8. Растворимый белок GDF-8 (при 10 мкг/мл в 50 мМ натрий-карбонатном буфере, рН 9,6) наносили в виде покрытия на лунки микротитрационного планшета и выдерживали в течение ночи при 4ºС. Лунки промывали в ЗФР и блокировали в течение 2 часов при 37ºС в MPBS (3% Marvel™ сухом обезжиренном порошке в ЗФР). Очищенный фаг (10¹² трансдуцирующих единиц (tu)) в 100 л 3% MPBS добавляли в блокированные лунки e инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Лунки промывали 10 раз ЗФРТ (ЗФР, содержащим 0,1% (об./об.) Твин™ 20), затем 10 раз ЗФР. Связанные фаговые частицы элюировали 100 мкл 10 мМ триэтиламина в течение 10 минут при комнатной температуре, затем сразу же нейтрализовали 50 мкл 1 М Трис-HCl рН 7,4. Элюированный фаг использовали для инфицирования 10 мл экспоненциально растущей E. coli TG1. Инфицированные клетки выращивали в 2TY-бульоне в течение 30 минут при 37ºС стационарно и затем 30 минут при 37ºС с аэрацией, затем наносили штриховкой на чашки 2TYAG и инкубировали в течение при 30ºС. Колони выскребали из чашек в 10 мл 2TY-бульона и добавляли 15% глицерин для хранения при -70ºС.

Исходные культуры в глицерине из отбора пэннингом первого раунда суперинфицировали хелперным фагом и сохраняли (спасали) с получением экспрессирующих scFv-антитела фаговых частиц для пэннинга второго раунда. Таким образом проводили всего три раунда пэннинга.

Пример 5. Отбор Myo28 и Myo29 из scFv-библиотек

Отборы в растворе проводили с использованием биотинилированного белка GDF-8 (bioGDF-8). BioGDF-8 использовали в концентрации 1 мкг/мл. Использовали scFv-библиотеку, описанную в примере 4. Очищенный scFv-фаг (10¹² tu) в 100 мкл 3% MPBS блокировали в течение 30 минут, затем добавляли биотинилированный антиген и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли фаг/антиген к 50 мкл покрытых стрептавидином магнитных гранул М280 Dynal™, которые блокировали в течение 1 часа при 37ºС в 1 мл 3% MPBS и инкубировали еще в течение 15 минут при комнатной температуре. Гранулы захватывали магнитной подвеской и промывали четыре раза в 1 мл 3% MPBS с 0,1% (об./об.) Твином™ 20 с последующими тремя промывками в ЗФР. После последней промывки ЗФР гранулы ресуспендировали в 100 мкл ЗФР и инкубировали для инфицирования 5 мл экспоненциально растущих клеток E. coli TG-1. Клетки и фаг инкубировали в течение 1 часа при 37ºС (30 минут стационарно, 30 минут при перемешивании при 250 об/мин) и затем высевали штриховкой на чашки 2TYAG. Чашки инкубировали при 30ºС в течение ночи и колонии визуализировали на следующий день. Полученные колонии выскребали из чашек, и фаг сохраняли (спасали), как описано выше. Второй раунд отбора в растворе проводили, как описано выше.

Пример 6. Анализ и скрининг ингибирования рецептора ActRIIB

Выросшие колонии, полученные, как описано в примерах 4 и 5, выскребали в 96-луночные планшеты, содержащие 100 мкл 2TYAG. Продуцирование scFv индуцировали добавлением 1 мМ IPTG к экспоненциально растущим культурам и инкубированием в течение ночи при 30ºС. Содержащие неочищенный scFv культуральные супернатанты подвергали скринингу на способность ингибровать связывание bioGDF-8 с ActRIIB, по существу так, как описано в примере 3. Этот анализ слегка модифицировали таким образом, что связывание bioGDF-8 детектировали с меченым европием стрептавидином и с использованием набора реагентов DELFIA™ (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) во флуорометрических анализах, разделенных во времени (TRF). Положительные клоны, обнаруживающие ингибирование сигнала связывания, большее, чем в случае посторонних клонов, выскребали и анализировали для подтверждения активности.

Очищенный scFv из положительных клонов, идентифицированный из скрининга на ингибирование рецептора, испытывали в анализе ингибирования, как описано выше. Для установления эффективности клона, определяемой по величинам IC₅₀, в этом анализе использовали титрование концентраций scFv. Результаты этих экспериментов показаны на фиг.2. Как определено из этих анализов, IC₅₀ для scFv Myo29, Myo28 или Myo22 равны, соответственно, 2,4 нМ, 1,7 нМ и 60 нМ. Таким образом, эти антитела являются сильнодействующими ингибиторами активности GDF-8.

Пример 7. Характеристика специфичности фагового ELISA

Для определения специфичности антител выполняли фаговый ELISA для положительных клонов из ActRIIB-скрининга против GDF-8 и посторонних белков. Индивидуальные колонии E. coli, содержащие фагмиду, инокулировали в 96-луночные планшеты, содержащие 100 мкл среды 2TYAG на лунку. Хелперный фаг М13К07 добавляли до множественности заражения (moi) 10 к экспоненциально растущей культуре и планшеты инкубировали дополнительно в течение 1 часа при 37ºС. Планшеты центрифугировали в настольной центрифуге при 2000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант удаляли и осадки клеток ресуспендировали в 100 мкл 2TYAK и инкубировали при 30ºС в течение ночи при перемешивании. На следующий день планшеты центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 минут и 100 мкл содержащего фаг супернатанта из каждой лунки переносили в свежий 96-луночный планшет. Пробы фага блокировали в конечной концентрации 3% MPBS в течение 1 часа при комнатной температуре перед ELISA.

GDF-8 или посторонний белок наносили в виде покрытия в течение ночи при 4ºС на 96-луночный микротитрационный планшет при 1 мкг/мл. После нанесения растворы удаляли из лунок и планшеты блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре в 3% MPBS. Планшеты промывали ЗФР, затем в каждую лунку добавляли 50 мкл предварительно блокированного фага. Эти планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа и затем промывали 3 сменами ЗФРТ с последующими 3 сменами ЗФР. В каждую лунку добавляли 50 мкл разведения 1:5000 конъюгата анти-М13-HRP (Pharmacia) и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждый планшет промывали три раза ЗФРТ, затем 3 раза ЗРР. В каждую лунку добавляли пятьдесят микролитров субстрата ТМВ и инкубировали до развития окраски. Реакцию останавливали добавлением 25 мкл 0,5 М Н₂SO₄. Генерируемый сигнал измеряли считыванием оптической плотности при 450 нм с использованием микропланшет-ридера. Подтверждали специфическое связывание GDF-8.

Пример 8. Секвенирование scFv, превращение в IgG и в ближайшие последовательности зародышевого типа (germlining)

Нейтрализующие scFv-клоны E. coli высевали штриховкой на 2TYAG-чашки и инкубировали в течение при 30ºС. Колонии в трех повторностях из этих чашек секвенировали с использованием олигонуклеотидов для последовательности вектора pCANTAB6 для амплификации V_H- и V_L-районов из этого scFv-клона. ДНК-последовательности scFv-фрагментов, используемые для получения IgG Myo29, Myo28 или Myo22, представлены SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:1, соответственно.

V-области тяжелой и легкой цепей из клонов scFv амплифицировали с использованием ПЦР и клон-специфических праймеров. Продукты ПЦР расщепляли подходящими рестрикционными ферментами и субклонировали в векторы, содержащие константный домен тяжелой цепи IgG₁ человека (для V_H-доменов), или в векторы, содержащие константный домен легкой цепи лямбда человека, по мере целесообразности, (для V_L-доменов). Правильное встраивание доменов V-областей в плазмиды подтверждали секвенированием плазмидной ДНК из индивидуальных колоний E. coli. Плазмиды получали из культур E. coli стандартными способами и конструкции тяжелой и легкой цепей котрансфицировали в клетки COS с использованием стандартных способов. Секретируемый IgG очищали с использованием Протеин А-Сефарозы (Pharmacia, Peapack, NJ) и буфер заменяли на ЗФР.

Результаты секвенирования для клонов scFv использовали для идентификации ближайшей последовательности зародышевого типа для тяжелой и легкой цепи каждого клона. Подходящие мутации получали с использованием стандартных способов сайт-направленного мутагенеза с подходящими мутагенными праймерами. Мутацию последовательностей scFv подтверждали анализом секвенирования. Последовательности scFv и V_H- и V_L-доменов зародышевого типа для Myo28 и Myo29 представлены в SEQ ID NO:19 и SEQ ID NO:25, соответственно.

Пример 9. Биологическая активность антител

Фиг.3А показывает, что предынкубация Myo29 с биотинилированным GDF-8 при 10 нг/мл ингибировала связывание GDF-8 с ActRIIB в анализе связывания ActRIIB, как описано в примере 3, с IC₅₀ 0,2-0,4 нМ. Подобным образом, Myo29 ингибировал связывание ВМР-11 с ActRIIB с такой же IC₅₀.

Myo29 блокировал также активность GDF-8 в биоанализе in vitro. В качестве примера, при предынкубировании GDF-8 с Myo29 в течение 1 часа при комнатной температуре биологическая активность GDF-8 уменьшалась, как определено в RGA-анализах, выполненных по существу, как описано в примере 2. Фиг.4С показывает индукцию репортерной активности pGL3(CAGA)₁₂ при ED₅₀ для GDF-8 20 нг/мл в присутствии Myo29. Myo29 уменьшал индукцию GDF-8 зависимым от дозы образом, с IC₅₀ 15-30 нг/мл (0,1-0,2 нМ). Myo29 ингибировал также биологическую активность ВМР-11 в той же степени (фиг.4В). В противоположность этому, Myo29 не действовал на активность активина в этом анализе (фиг.4D), предположительно вследствие относительно высокой гомологии между GDF-8 и активином в сравнении с GDF-8 и ВМР-11.

Myo22 и Myo28 также испытывали в RGA-анализе и анализе связывания ActRIIB. Оба антитела блокируют активность GDF-8 и ВМР-11. Например, IC₅₀ для Myo28 равна 0,2-0,35 нМ.

Пример 10. Картирование эпитопов для Myo22, Myo28 и Myo29

Для картирования точного эпитопа этих антител синтезировали 48 перекрывающихся состоящих из 13 остатков пептидов, представляющих полную последовательность зрелого GDF-8, представленную в SEQ ID NO:49, непосредственно на целлюлозной бумаге с использованием способа синтеза на пятнах (Molina et al. (1996) Peptide Research, 9: 151-155; Frank et al. (1992) Tetrahedron, 48: 9217-9232). Перекрывание пептидов составляло 11 аминокислот. В этом массиве остатки цистеина заменяли остатками серина для уменьшения химических осложнений, вызываемых присутствием цистеинов. Целлюлозные мембраны, модифицированные полиэтиленгликолем, и Fmoc-защищенные аминокислоты покупали из Abimed (Lagenfeld, Germany). Этот массив помещали на эту мембрану связыванием β-аланинового спейсера и пептиды синтезировали с использованием стандартной химии DIC (диизопропилкарбодиимид)/HOBt (гидроксибензотриазол)-связывания, как описано ранее (Molina et al. (1996) Peptide Research, 9: 151-155; Frank et al. (1992) TetrahedBon, 48: 9217-9232).

Активированные аминокислоты наносили в виде пятен с использованием робота Abimed ASP 222. Стадии промывания и удаления защитных грыпп выполняли вручную и пептиды ацетилировали на N-конце после конечного цикла синтеза. После синтеза пептидов мембрану промывали в метаноле в течение 10 минут и в блокаторе (ТВСТ (забуференный Трисом солевой раствор с 0,1% (об./об.) Твином™ 20) и 1% (масса/объем) казеином) в течение 10 минут. Затем эту мембрану инкубировали с 2,5 мкг/мл анти-GDF-8-антитела в блокаторе в течение 1 часа при осторожном встряхивании. После промывания блокатором 3 раза в течение 10 минут мембрану инкубировали с HRP-меченым вторичным антителом (0,25 мкг/мл в блокаторе) в течение 30 минут. Затем мембрану промывали три раза в течение 10 минут, каждый, блокатором и 2 раза в течение 10 минут, каждый, ТВСТ. Связанное антитело визуализировали с использованием реагента Веста SuperSignal™ (Pierce) и цифровой камеры (Alphananotech Fluoromager). Результаты показаны на фиг.5. В частности, как видно из фиг.5, эпитоп для Myo29 был картирован между аминокислотами 72 и o8 зрелого GDF-8. С другой стороны, Myo22 узнает эпитоп в первых 44 N-концевых аминокислотах в последовательности зрелого GDF-8 (аминокислоты 1-44 SEQ ID NO:49). Наконец, эпитоп для Myo28 содержит остатки, локализованные в первых 98 N-концевых аминокислотах зрелого GDF-8.

Для дополнительной характеристики эпитопа Myo29 выполняли анализы делеций и замен с использованием синтеза на пятнах. В анализе замен каждый остаток этого пептида индивидуально заменяли каждой из 20 природных аминокислот, за исключением цистеина. Синтез и анализы связывания выполняли, как описано выше. Результаты показаны на фиг.6, где перый ряд, первые два столбца и последние три столбца представляют контроли пептидов дикого типа. Эти результаты показывают, что при мутировании каждого из Lys-78, Pro-81 и Asn-83 индивидуально в другую аминокислоту, аффинность связывания Myo29 с этим пептидом значимо уменьшается. Таким образом, Myo29 узнает последовательность, содержащую Lys-Xaa1-Xaa2-Pro-Xaa3-Asn (SEQ ID NO:54), где каждый из Xaa1, Xaa2 и Xaa3 является либо любой аминокислотой, либо Xaa1 = Met, Xaa2 = Ser и Xaa3 = Ile, независимо один от другого.

Пример 11. Иммунопреципитация GDF-8

Для оценки связывания Myo29 и Myo28 со зрелым GDF-8 и комплексами GDF-8 проводили исследование иммуноперципитации. Клетки СНО, экспрессирующие GDF-8, метили ³⁵S-метионином и ³⁵S-цистеином. 100 мкл кондиционированной среды от этих клеток, содержащей белок GDF-8 (зрелый GDF-8 и латентный комплекс), инкубировали с 20 мкг/мл Myo29 или Myo28 в течение 1 часа при 4ºС. Добавляли Протеин А-Сефарозу™ и инкубировали в течение при 4ºС. Иммунопреципитат собирали, ресуспендировали в восстанавливающем буфере для проб и анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ. Гель фиксировали, усиливали усиливающим радиоавтографию раствором, сушили и радиоавтограф проявляли. Фиг.7 показывает, что как Myo29, так и Myo28 могут иммунопреципитировать зрелый GDF-8, латентый комплекс и GDF-8 и непроцессированный GDF-8. Оба антитела связывают димер GDF-8 при невосстанавливающих условиях, как определено Вестерн-блоттингом.

Пример 12. Фармакокинетика

Фармакокинетику (ФК) Myo29 оценивали в мышах С57В6/SCID при дозе 1 мг/кг после единственного внутривенного (IV) или внутрибрюшинного (IP) введения. Животные получали смесь немеченого и ¹²⁵I-меченого Myo29 в дозе, указанной выше, и концентрации в сыворотке определяли на основе ¹²⁵I-радиоактивности в сыворотке и удельной активности инъецированной дозы. Фиг.8 показывает график концентрации в сыворотке в зависимости от времени для Myo29, введенного либо IV, либо IP.

Myo29 обнаружил пролонгированный конечный полупериод существования около одной недели и низкий клиренс около 1 мл/час/кг. Начальный объем распределения был приблизительно 83 мл/кг. Видимый объем распределения был приблизительно 227 мл/кг. Myo29 достигал максимальной концентрации при приблизительно 6 часах после инъекции. Доля, абсорбированная после IP-инъекции, была приблизительно 77%.

Пример 13. Действие in vivo Myo29 на мышечную массу и силу

Для определения, блокирует ли Myo29 активность GDF-8 in vivo, Myo29 испытывали на взрослых мышах SCID. Мыши SCID страдают от тяжелого комбинированного иммунодефицита и, следовательно, не генерируют иммунологическую реакцию после инъекций антител человека, таких как Myo29. Мышечную массу использовали в качестве показателя для активности GDF-8 на мышах, получавших Myo29.

Самцов восьминедельных мышей С57В6 SCID взвешивали и равномерно распределяли в соответствии с массой тела на группы из восьми мышей. Myo29 в ЗФР-буфере инъецировали в мышей внутрибрюшинно при различных дозах: 60, 10 и 1 мг/кг) один раз в неделю. В первую неделю вводили двойную дозу. В качестве контролей использовали получавших носитель (ЗФР) или ничего не получавших мышей. Мышечную массу оценивали иссечением и взвешиванием икроножной мышцы и четырехглавой мышцы бедра после лечения. После четырех недель лечения мышечная масса увеличивалась во всех группах, получавших Myo29, в диапазоне 10% - 23%, причем группы, получавшие более высокие дозы, достигали статистически значимых уровней (фиг.9, р<0,01).

В другом эксперименте самок крыс СВ17 SCID лечили Myo29 один раз в неделю при различных дозах (10, 5, 2,5 и 1 мг/кг) в течение 4 или 12 недель. Опять, введения Myo29 в течение 4 недель приводили к увеличению массы икроножной мышцы и четырехглавой мышцы бедра в диапазоне 10%-20% (фиг.10А и 10В). Более длительное лечение (12 недель) приводило к большим увеличениям мышечной массы (12%-28%), причем все группы, получавшие Myo29, достигали статистически значимых уровней (фиг.11А и 11В).

Для определения, приводит ли увеличенная мышечная масса к более сильным мышцам, мышечную силу передней конечности измеряли прибором для измерения силы хватания (model 1027 csx, Columbus Instruments, Columbus, OH). После 12 недель лечения сила передней конечности была на 17% и 23% более высокой в мышах, получавших 5 мг/кг или 10 мг/кг Myo29, соответственно, в сравнении с контролем-носителем (р<0,01, фиг.12). Результаты этого исследования показывают, что Myo29 ингибирует активность GDF-8 in vivo, приводя к значимым увеличениям мышечной массы и мышечной силы.

Пример 14. Лечение метаболических нарушений

Ингибиторы GDF-8, такие как, например, ингибиторные антитела, применимы для лечения метаболических нарушений, таких как диабет типа 2, нарушенная толерантность к глюкозе, метаболический синдром (например, синдром Х), инсулинорезистентность, индуцированная травмой (например, ожоги или нарушение азотного баланса) и нарушения жировой ткани (например, ожирение).

Эффективность анти-GDF-8-антител для лечения метаболических нарушений, например диабета типа 2 и/или ожирения, подтверждают с использованием хорошо установленных мышиных моделей ожирения, инсулинорезистентности и диабета типа 2, в том числе ob/ob, db/db, и штаммов, несущих летальную желтую мутацию. Инсулинорезистентность может быть также индуцирована имеющим высокое содержание жира или высококалорийным кормлением некоторых линий мышей, в том числе C57BL/6J. Подобно людям, эти грызуны развивают инсулинорезистентность, гиперинсулинемию, дислипидемию и нарушение глюкозного гомеостаза, приводящее к гипергликемии. Полученные оценки основываются на измерениях в сыворотке глюкозы, инсулина и липидов. Показатели улучшенной чувствительности к инсулину могут быть определены тестами на толерантность к инсулину и тестами на толерантность к глюкозе. Более чувствительными способами, которые включают в себя применение нормогликемических-гиперинсулинемических “ножниц” для оценки улучшений, являются гликемический контроль и чувствительность к инсулину. Кроме того, эти способы-«ножницы» делают возможной количественную оценку роли основных удаляющих глюкозу тканей (мышц, жировой ткани и печени) в улучшенном гликемическом контроле.

В одном исследовании, лечение анти-GDF-8-антителом, таким как Myo29 (инъекцией IP), или носителем проводят в течение одной недели - шести месяцев. Протокол лечения может варьироваться с испытанием различных доз и схем введения (например, инъекций один раз в день, один раз в неделю или один раз в две недели). Предполагается, что мыши, получающие анти-GDF-8-антитело, будут иметь более высокое поглощение глюкозы, увеличенный гликолиз и синтез гликогена, меньшие уровни свободных жирных кислот и триглицеридов в сыворотке в сравнении с мышами, получающими плацебо.

Ингибиторные антитела против GDF-8 используют также для предупреждения и/или уменьшения тяжести и/или симптомов этого заболевания. Предполагается, что анти-GDF-8-антитела будут вводиться подкожной инъекцией так часто, как один раз в день, и нечасто, например один раз в месяц. Продолжительность лечения находится в диапазоне от одного месяца до нескольких лет.

Для испытания клинической эффективности анти-GDF-8-антител у людей идентифицировали субъектов, страдающих от диабета типа 2 или имеющих риск диабета типа 2, и распределяли случайным образом на группы лечения. Группы лечения включают в себя группу плацебо и одну - три группы, получающие антитело (различные дозы). Предполагается наблюдение индивидуумов в течение одного месяца - трех лет для оценки изменений в метаболизме глюкозы. Предполагается, что индивидуумы, получающие лечение, будут проявлять улучшение.

Антитела вводят в качестве единственного активного соединения или в комбинации с другим соединением или другой композицией. При введении в качестве единственного активного соединения или в виде комбинации с другим соединением или другой композицией доза равна предпочтительно приблизительно 1 мкг/кг - приблизительно 20 мг/кг, в зависимости от тяжести симптомов и прогрессирования заболевания. Подходящая эффективная доза выбирается лечащим врачом из следующих диапазонов: 1 мкг/кг - 20 мкг/кг, 1 мкг/кг - 10 мг/кг, 1 мкг/кг - 1 мг/кг, 10 мкг/кг - 1 мг/кг, 10 мкг/кг - 100 мг/кг, 100 мкг/кг - 1 мг/кг и 500 мкг/кг - 1 мг/кг. Примеры схем лечения и результатов лечения суммированы в таблице 3.

ТАБЛИЦА 3 Примеры клинических случаев заболеваний
№ пациента	Состояние перед лечением	Схема лечения	Результат
Пациент 1	Клинических симптомов нет, семейный анамнез диабета типа 2	0,01-1 мг/кг каждые 4 недели в течение 48 недель	Предупреждение диабета типа 2
Пациент 2	Слабые клинические симптомы синдрома Х	0,01-20 мг/кг один раз в неделю в течение еще 4 недель	Улучшение толерантности к инсулину и метаболизма глюкозы и более низкое кровяное давление
Пациент 3	Продвинутая стадия диабета типа 2	0,01-20 мг/кг два раза в неделю в течение 6 или более недель	Улучшение клинических симптомов, уменьшение тяжести симптомов и/или увеличение отношения мышечная масса/жир тела
Пациент 4	Тяжелая инсулино-резистентность и/или ожирение	0,01-20 мг/кг один раз в день в течение 6 или более недель	Улучшение клинических симптомов, уменьшение тяжести симптомов и/или уменьшение жира тела

Данное описание может быть наилучшим образом понято в свете описаний ссылок, цитируемых в данном описании, все из которых включены в качестве ссылки в их полном виде. Варианты осуществления в данном описании относится к иллюстрацию вариантов осуществления данного изобретения и не должны рассматриваться как ограничение объема данного изобретения. Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что многие другие варианты осуществления охватываются заявленным изобретением и что предполагается, что это описание и примеры должны рассматриваться только в качестве примеров, причем истинный объем и идея данного изобретения определены следующей формулой изобретения.

1. Выделенное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
a) SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:26 или фрагмента SEQ ID NO:14 или SEQ ID NO:26, который способен специфически связывать любой из GDF-8 или ВМР-11, где фрагмент не является SEQ ID NO:32;
b) SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:20 или фрагмента SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:20, который способен специфически связывать любой из GDF-8 или BMP-11; и
c) SEQ ID NO:2 или фрагмента SEQ ID NO:2, который способен специфически связывать любой из GDF-8 или BMP-11, где фрагмент не является SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44 или SEQ ID NO:46;
где антитело способно специфически связывать любой из GDF-8 или ВМР-11.

2. Антитело по п.1, содержащее аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 и SEQ ID NO:36.

3. Антитело по п.1, содержащее аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 и SEQ ID NO:45.

4. Антитело по п.1, содержащее аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:47 и SEQ ID NO:48.

5. Применение антитела, содержащего по существу такую аминокислотную последовательность, как представлена в SEQ ID NO:n, где n равно 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 45, 47 или 48 для специфического связывания с любым из GDF-8 или ВМР-11.

6. Антитело по п.1, где это антитело способно специфически связываться с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:54, где SEQ ID NO:54 характеризуется по меньшей мере одним из следующего:
(a) вторая аминокислота SEQ ID NO:54 выбрана из группы, состоящей из метионина, аланина, гистидина, изолейцина, лизина, лейцина, аспарагина, глутамина, треонина и валина;
(b) третья аминокислота SEQ ID NO:54 выбрана из группы, состоящей из серина, аланина, фенилаланина, глицина, гистидина, изолейцина, лизина, лейцина, метионина, пролина, глутамина, аргинина, треонина, валина, триптофана и тирозина; и
(c) пятая аминокислота SEQ ID NO:54 выбрана из группы, состоящей из изолейцина, аланина, аспарагиновой кислоты, фенилаланина, глицина, гистидина, лизина, лейцина, метионина, аспарагина, глутамина, серина, треонина, валина, триптофана и тирозина.

7. Антитело по п.6, где SEQ ID NO:54 характеризуется по меньшей мере одним из следующего:
(a) вторая аминокислота SEQ ID NO:54 является метионином;
(b) третья аминокислота SEQ ID NO:54 является серином; и
(c) пятая аминокислота SEQ ID NO:54 является изолейцином.

8. Антитело по п.1, где антитело является человеческим.

9. Антитело по п.1, где антитело является IgG₁ или IgG₄.

10. Выделенное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(a) SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:26 или фрагмента SEQ ID NO:14 или SEQ ID NO:26, который способен специфически связывать любой из GDF-8 или ВМР-11, где фрагмент не является SEQ ID NO:32;
(b) SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:20 или фрагмента SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:20, который способен специфически связывать любой из GDF-8 или BMP-11; и
(c) SEQ ID NO:2 или фрагмента SEQ ID NO:2, который способен специфически связывать любой из GDF-8 или BMP-11, где фрагмент не является SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44 или SEQ ID NO:46;
где антитело способно специфически связывать любой из GDF-8 или ВМР-11, и где аминокислотная последовательность антитела модифицирована для уменьшения или изменения эффекторной функции, где модификация содержит аминокислотное замещение в аминокислоте 117 или аминокислоте 120 SEQ ID NO:53.

11. Антитело по п.1, где антитело является IgG_1λ или IgG_1к.

12. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по п.1, для лечения или профилактики заболевания или нарушения, ассоциированного с GDF-8 или BMP-11.

13. Способ лечения или профилактики заболевания или нарушения, ассоциированного с GDF-8 или BMP-11, предусматривающий введение эффективной дозы фармацевтической композиции по п.12.

14. Способ по п.13, где фармацевтическую композицию вводят млекопитающему, нуждающемуся в лечении или профилактике нарушения, выбранного из мышечного нарушения, нервно-мышечного нарушения и дегенеративного костного нарушения.

15. Способ по п.13, где фармацевтическую композицию вводят млекопитающему, нуждающемуся в лечении или профилактике нарушения, выбранного из мышечной дистрофии, мышечной дистрофии Дюшенна, мышечной атрофии, атрофии органа, синдрома канала запястья, хронической обструктивной болезни легких, саркопении, кахексии, синдрома мышечного истощения и бокового амиотрофического склероза.

16. Способ по п.13, где фармацевтическую композицию вводят млекопитающему, нуждающемуся в лечении или профилактике мышечной дистрофии Дюшенна.

17. Способ по п.13, где фармацевтическую композицию вводят млекопитающему, нуждающемуся в лечении или профилактике нарушения, выбранного из ожирения и нарушения жировой ткани.

18. Способ по п.13, где фармацевтическую композицию вводят млекопитающему, нуждающемуся в лечении или профилактике нарушения, выбранного из синдрома X, нарушенной толерантности к глюкозе, индуцированной травмой инсулинорезистентности и диабета типа 2.

19. Способ по п.13, где фармацевтическую композицию вводят млекопитающему, нуждающемуся в лечении или профилактике диабета типа 2.

20. Способ по п.13, где фармацевтическую композицию вводят млекопитающему, нуждающемуся в лечении или профилактике ожирения.

21. Способ по п.13, где фармацевтическую композицию вводят млекопитающему, нуждающемуся в восстановлении поврежденной мышцы.

22. Способ по п.21, где поврежденной мышцей является миокард.

23. Способ по п.21, где поврежденной мышцей является диафрагма.

24. Способ по п.13, где антитело вводят в эффективной дозе, выбранной из 1 мкг/кг-150 мг/кг, 1 мкг/кг-100 мг/кг, 1 мкг/кг-50 мг/кг, 1 мкг/кг-20 мг/кг, 1 мкг/кг-10 мг/кг, 1 мкг/кг-1 мг/кг, 10 мкг/кг-1 мг/кг, 10 мкг/кг-100 мкг/кг, 100 мкг/кг-1 мг/кг и 500 мкг/кг-1 мг/кг.

25. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по п.1.

26. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.25.

27. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.26.

28. Нуклеиновая кислота по п.25, где нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:n, где n равно 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 или 29.

29. Способ получения антитела, которое специфично взаимодействует с GDF-8, предусматривающий:
(a) обеспечение исходного репертуара нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельный домен, который или содержит подлежащий замене CDR3, или не содержит кодирующей CDR3 области;
(b) объединение этого репертуара с донорной нуклеиновой кислотой, кодирующей аминокислотную последовательность, по существу такую, как представлена в SEQ ID NO:n, где n равно целому числу от 31 до 48, таким образом, что эта донорная нуклеиновая кислота встроена в область CDR3 в этом репертуаре таким образом, чтобы обеспечить в качестве продукта репертуар нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельный домен;
(c) экспрессию нуклеиновых кислот полученного репертуара;
(а) отбор специфичного антигенсвязывающего фрагмента, специфичного в отношении GDF-8; и
(е) извлечение специфичного антигенсвязывающего фрагмента или нуклеиновой кислоты, кодирующей этот антигенсвязывающий фрагмент.

30. Антитело, полученное способом по п.29, способное специфически связывать GDF-8.

31. Способ идентификации ингибиторов GDF-8, предусматривающий:
(a) получение первой смеси для связывания, содержащей антитело по п.1 и GDF-8;
(b) измерение количества связывания между этим антителом и GDF-8 в первой смеси;
(c) получение второй смеси для связывания, содержащей антитело, GDF-8 и тестируемое соединение;
(а) измерение количества связывания между антителом и GDF-8 во второй смеси; и
(е) сравнение количеств связывания в первой и второй смеси для связывания;
где соединение признается способным ингибировать активность GDF-8, если наблюдается уменьшение связывания во второй смеси для связывания по сравнению с первой смесью для связывания.

32. Способ увеличения мышечной силы или массы, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества антитела по п.1 млекопитающему с увеличением посредством этого мышечной силы или массы.

33. Применение антитела по любому из пп.1-11 и 30 для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики по меньшей мере одного нарушения мышцы, кости или гомеостаза глюкозы у млекопитающего.

34. Применение по п.33, где млекопитающим является человек.

35. Применение по п.33, где нарушением является нервно-мышечное нарушение.

36. Применение по п.33, где нарушением является мышечная дистрофия, мышечная дистрофия Дюшенна, мышечная атрофия, атрофия органа, синдром канала запястья, хроническая обструктивная болезнь легких, саркопения, кахексия, синдром мышечного истощения и боковой амиотрофический склероз.

37. Применение по п.33, где нарушением является ожирение или нарушение жировой ткани.

38. Применение по п.33, где нарушением является синдром X, нарушенная толерантность к глюкозе, индуцированная травмой инсулинорезистентность или диабет типа 2.

39. Применение антитела по любому из пп.1-11 и 30 для приготовления лекарственного средства по меньшей мере для одного из: (а) восстановления мышечного повреждения, (b) увеличения мышечной массы или силы и (с) увеличения толерантности к глюкозе у млекопитающего.

40. Применение по п.39, где поврежденной мышцей (а) является миокард или диафрагма.

41. Применение по любому из пп.33-40, где антитело вводят млекопитающему при эффективной дозе, выбранной из 1 мкг/кг-150 мг/кг, 1 мкг/кг-100 мг/кг, 1 мкг/кг-50 мг/кг, 1 мкг/кг-20 мг/кг, 1 мкг/кг-10 мг/кг, 1 мкг/кг-1 мг/кг, 10 мкг/кг-1 мг/кг, 10 мкг/кг-100 мкг/кг, 100 мкг/кг-1 мг/кг и 500 мкг/кг-1 мг/кг.