Средство коррекции метаболических нарушений после криодеструкции печени (в эксперименте)
Владельцы патента RU 2361584:
Федеральное государственное учреждение "Научно-исследовательский институт онкологии им. Н.Н. Петрова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" (RU)
Заявленное средство относится к химико-фармацевтической промышленности и касается средства коррекции метаболических нарушений после криодеструкции печени. Изобретение представляет собой раствор метронидазола для парентерального введения в дозе 20 мг/кг массы тела и обеспечивает снижение интенсивности перекисного окисления фосфолипидов клеточных мембран гепатоцитов путем уменьшения продукции ксантиноксидазой активных форм кислорода. 3 табл.
Изобретение относится к медицине и медицинской фармакологии, связано с онкологией и хирургией.
Практикой лечения отдаленных метастазов колоректального рака, рака почки и рака некоторых других локализаций стало хирургическое вмешательство (В.А.Вишневский, С.А.Шалимов, М.Е.Нечитайло, Ю.И.Патютко). Хирургическое лечение метастатического рака печени в целом сопровождается 5-летней выживаемостью в 25% случаев. Осложнения наблюдаются 23,4% больных. Послеоперационная летальность в среднем -13,2%. В основном причинами смерти больных послужили полиорганная, острая печеночная и сердечно сосудистая недостаточность, ДВС синдром [Tepper J.E., O'Connell M., Donna H.et al.Analysis of surgical salvage after failure of primary therapy in rectal cancer: results from INT 0114. Program and abstracts of the American Society of Clinical Oncology 38th Annual Meeting; May 18 21, 2002. - Orlando, Florida. - Abstr.507]. Неудовлетворенность результатами заставляет онкологов применять альтернативные способы воздействия на опухолевую ткань. Одна из них - низкотемпературное воздействие, обладающее рядом преимуществ в комплексном лечении метастатических поражений печени. [Альперович Б.И., Парамонова Л. М., Мерзликин Н.В. Криохирургия печени и поджелудочной железы.- Томск, 1985. - 126 с.].
В печени после криодеструкции усиливаются процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), инициатором которых являются активные формы кислорода. Последние усиленно продуцируются ксантиноксидазой в процессе глубокого метаболизма пуринов [Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б., Шеринг С.М. Окислительный стресс диагностика, терапия, профилактика. - Новосибирск, 1993. - 181 С.]. Поэтому целью изобретения является уменьшение интенсивности распада пуриновых производных до мочевой кислоты путем ингибирования ксантиноксидазы. Торможение активности этого фермента позволит снизить необратимую потерю гипоксантина тканями печени и уменьшить продукцию супероксидных радикалов и перекиси водорода. Этот вопрос заслуживает внимания, так как побочный токсический эффект криодеструкции может стать причиной грозных осложнений в послеоперационном периоде [Милонов О.Б., Колосс О.Е., Минкина С.М., Марченко А.Л., Лазарева И.В., Смирнова Л.А. Результаты применения криовоздействия в хирургическом лечении распространенного альвеококкоза печени // Хирургия. - 1988. - №2. - С.40-44].
Известен препарат аллопуринол (химическая формула 4-окси-пирозоло-[3,4-d] пиримидин) аналог гипоксантина, снижающий активность ксантиноксидазной реакции на этапе превращения последнего в ксантин (Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. М.: Астра-Фарм-Сервис, 2006 г., на с.225). Однако при этом он не позволяет получить технический (медицинский) результат, выраженный в уменьшении продукции активных форм кислорода, торможению перекисного окисления липидов и уменьшению побочных эффектов глубокого метаболизма пуринов в печени, сокращении сроков биохимических нарушений в послеоперационном периоде [Конвай В.Д. Нарушение пуринового обмена в печени в постреанимационном периоде и его профилактика: Дисс.… д-ра мед. наук. - Томск, 1988. - 426 л].
Известен также лекарственный препарат метронидазол (химическая формула 1-(в-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазол), например, "Метронидазол-Тева". Состав: Метронидазол - 250 мг. Производитель: фирма "TEVA", Израиль, применяемый при лечении бактериальных и протозойных инфекций. Эти заболевания, вызываемые такими возбудителями как хламидии, анаэробные микроорганизмы, сопровождаются воспалительными процессами различных органов. Это лекарственное средство обладает сходным химическим строением с мочевой кислотой конечным продуктом ксантиноксидазной реакции. Сведения об этом препарате приведены в изданиях "Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России". М.: Астра-Фарм-Сервис, 2006 г. и М.Д.Машковский. "Лекарственные средства", т.2, Харьков, Гарант, 1997, сведения о метронидазоле - на с.272. В результате проведенного поиска по источникам медицинской и патентной информации не обнаружено описания свойств этого препарата (вещества) с совокупностью существенных признаков, а именно способности снижать активность ксантиноксидазы и продукцию последней активных форм кислорода, совпадающей с предлагаемым изобретением и обеспечивающего заявленный технический результат.
Указанный технический результат достигается тем, что в послеоперационном периоде парентерально вводится метронидазол 20 мг/кг массы тела. Заявленное свойство лекарственного средства прошло экспериментальную проверку. Его применение основывается на результатах исследования, где изучали активность ксантиноксидазы и состояние системы перекисного окисления липидов в неповрежденных участках печени и влияние метронидазола (20 мг/кг массы тела внутрибрюшинно) на процессы чрезмерной липопероксидации. В опытах с лабораторными животными использовали 85 белых беспородных крыс-самцов массой 200±20 г.
Первая экспериментальная контрольная группа (группа "К") включала в себя 29 белых крыс, которых подвергали тем же воздействиям, что и животные в 2 и 3 группах (наркозу, фиксации, лапаротомии), за исключением криовоздействия. Вторая группа (группа "КД") состояла из 28 белых крыс, которым под эфирным наркозом производили лапаротомию и криодеструкцию участка левой латеральной доли печени температуры -20°С, и экспозицией 3 минуты. Третья экспериментальная группа (группа «КД+М») состояла из 28 белых крыс, которым под эфирным наркозом выполняли лапаротомию и криодеструкцию участка левой латеральной доли печени с параметрами, аналогичными параметрам воздействия в 2 группе. Животные этой группы в послеоперационном периоде получали метронидазол в дозе 20 мг/кг массы тела в сутки.
Для определения биохимических показателей в ткани печени, орган прижизненно фиксировали и хранили в жидком азоте. Из тканей печени готовили липидный экстракт по Folch et аl. В нем определяли содержание общих липидов по Bragdon, диеновых конъюгатов (DC)- по Plazer, липофусциноодобного пигмента (ЛФП) - по Fletcher et al. Для определения активности ферментов замороженную ткань печени гомогенезировали при 0-20°С в стеклянном гомогенезаторе Поттера с 0,25 М раствором сахарозы, приготовленном на 10 мм растворе трис-НСl, рН 7,4 и центрифугировали в течение 20 минут при 2000 g и температуре 0-2°С. Активность супероксиддисмутазы (SOD) [1.15.1.1.] определяли методом В.Н.Чумакова и Л.Ф.Осинской, каталазы (КАТ) [1.11.1.6.] - по В.Д.Конвай и А.В.Лукошкину, глутатионпероксидазы (GPO) [1.11.1.9] - по Paglia et Valentine, глутатионредуктазы (GR) [1.6.4.2] - по Racker, a глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G-6-PDH) [1.1.1.49] - по Ю.Л.Захарьину. Содержание глутатиона (G-SH) определяли по Sedlak et Linsey.
В сыворотке крови исследовали содержание мочевой кислоты (Ur), лактата (Lac), белка и белковых фракций, глюкозы, активность аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) с помощью унифицированных лабораторных методов исследования.
Результаты исследования, полученные в группе «К», сравнивали с данными, полученными в группах «КД» и «КД+М» с помощью общепринятых методов вариационной статистики.
Установлено, что введение препарата вызывало снижение концентрации мочевой кислоты в плазме крови крыс группы "КД+М": через 1 сутки после операции на 13% (Р<0,01), через 3-е сутки - на 14,6% (Р<0,01), через 7 сутки - на 28,8% (Р<0,01) по сравнению с аналогичным показателем в группе "КД" (табл.1, 2, 3).
| Таблица 1 | |||
| Показатели энергетического обмена и перекисного окисления липидов в плазме крови и печени крыс в группах «К», «КД» и «КД+М» к концу 1-х суток после криовоздействия M±m для каждой группы | |||
| Показатели | Группы животных | ||
| «К» n=11 | «КД» n=10 | «КД+М» n=10 | |
| В крови | |||
| Ur (мкмоль/л) | 154±4 | 192±5* | 167±4*# |
| Глюкоза (ммоль/л) | 8,66±0,29 | 9,82±0,26* | 9,62±0,27* |
| Lac (ммоль/л) | 5,10±0,41 | 6,80±0,49* | 7,08±0,47* |
| ALT (МЕ/л) | 110±4 | 1193±20* | 921±65*# |
| AST (МЕ/л) | 237±11 | 2301±125* | 1977±81* |
| В печени | |||
| SOD (единиц/г ткани) | 1929±142 | 2116±84 | 2717±119*# |
| КАТ (единиц/г ткани) | 1738±94 | 2641±86* | 2493±59* |
| DC (Мэкв/мг липидов) | 6,85±0,43 | 13,83±0,77* | 6,13±0,32# |
| ЛФП(ед.флюорисценции/мг липидов) | 8,02±087 | 17,76±1,16* | 11,73±0,61*# |
| GPO (мкмоль/г ткани*мин) | 3,68±0,08 | 3,23±0,24 | 3,52±0,11 |
| G-SH (мкмоль/г ткани) | 3,91±0,17 | 4,24±0,13 | 4,04±0,36 |
| GR (мкмоль/г ткани*мин) | 2,80±0,05 | 3,76±0,15* | 3,42±0,23* |
| G-6-PDH (нмоль/г ткани*мин) | 477±9 | 674±7* | 622±11*# |
| *различие достоверно по сравнению с группой «К» # различие достоверно по сравнению с группой «КД» |
Активность SOD крыс, получавших в послеоперационном периоде метронидазол, достоверно повышена относительно показателя активности этого фермента в группах "К" и "КД" через 1 суток после операции соответственно на 40,9% (Р<0,01) и 28,4% (Р<0,05) (табл.1). В остальные сроки наблюдения этот показатель достоверно не отличается от аналогичного показателя у животных группы «КД» и превышает активность SOD в печени контрольных крыс через 3-е сутки после операции на 97,5% (Р<0,001), через 7 суток - в 2,2 раза (Р<0,001).
Уровень активности каталазы в группе «КД+М» через 1 сутки после операции не достоверно отличается от аналогичного показателя в группе "КД" и превышает контрольные цифры на 43,4% (Р<0,001) (табл.1). К исходу 3-х суток активность каталазы достоверно повышена относительно уровня активности фермента в группе "КД" на 25,6% (Р<0,01) и относительно контроля на 67,9% (Р<0,001) (табл.2). К исходу недели эксперимента показатель активности каталазы в исследуемой группе существенно не отличается от аналогичного показателя в группе "КД", но достоверно выше контрольных цифр в эти же сроки на 64,4% (Р<0,001) (табл.3).
Эффект введения препарата в послеоперационном периоде выражен к 1-м к 3-м суткам, когда содержание продуктов перекисного окисления липидов в печени крыс группы "КД+М" достоверно ниже, чем в группе животных, не получавших препарат в послеоперационном периоде. Так концентрация DC и ЛФП снижены через 1 суткам соответственно на 55,7% (Р<0,001) и 34% (Р<0,001), к исходу 3-х суток - на 36,1% (Р<0,001) и 21,7% (Р<0,05) (табл.1,2).
Введение в послеоперационном периоде метронидазола предотвращает падение активности GPO в печени крыс после криодеструкции на 3 и 7 сутки эксперимента и предупреждает снижение концентрации глутатиона в печени крыс к концу недели послеоперационного периода. Уровень активности GPO в печени животных группы «КД+М» достоверно выше аналогичного показателя в группе «КД» через 3 и 7 суток соответственно на 20,3% (Р<0,001) (табл.2) и 18,2% (Р<0,01) (табл.3). А содержание глутатиона к концу недели выше на 29,9% (Р<0,05) у крыс, перенесших криодеструкцию печени на фоне введения метронидазола (табл.3).
| Таблица 2 | |||
| Показатели энергетического обмена и перекисного окисления липидов в плазме крови и печени крыс в группах «К», «КД» и «КД+М» к концу 3-х суток после криовоздействия M±m для каждой группы | |||
| Показатели | Группы животных | ||
| «К» n=10 | «КД» n=9 | «КД+М» n=9 | |
| В крови | |||
| Ur (мкмоль/л) | 149±5 | 198±5* | 169±3*# |
| Глюкоза (ммоль/л) | 9,21±0,29 | 8,88±0,48 | 8,58±0,47 |
| Lac (ммоль/л) | 5,14±0,32 | 6,55±0,52* | 6,33±0,30* |
| ALT (МЕ/л) | 94,8±3,1 | 1307±13* | 863±81*# |
| AST (МЕ/л) | 217±13 | 2594±169* | 1679±68*# |
| В печени | |||
| SOD (единиц/г ткани) | 1629±197 | 3257±244* | 3217±195* |
| КАТ (единиц/г ткани) | 1416±42 | 1893±130* | 2377±53*# |
| DC (Мэкв/мг липидов) | 5,33±0,18 | 12,26±0,75* | 7,84±0,40*# |
| ЛФП (ед. флюорисценции/мг липидов) | 11,09±0,63 | 15,9±1,23* | 12,45±0,52# |
| GPO (мкмоль/г ткани*мин) | 3,47±0,1 | 3,01±0,1* | 3,62±0,05# |
| G-SH (мкмоль/г ткани) | 3,77±0,19 | 4,10±0,64 | 3,86±0,19 |
| GR (мкмоль/г ткани*мин) | 2,76±0,07 | 2,9±0,06* | 3,50±0,25*# |
| G-6-PDH (нмоль/г ткани*мин) | 498±11 | 541±29 | 576±13* |
| *различие достоверно по сравнению с группой «К» # различие достоверно по сравнению с группой «КД» |
Активность GR в печени животных группы «КД+М» в послеоперационном периоде через 1 сутки существенно не отличалась от значения активности этого фермента в группе «КД», но превышает контрольные значения на 221% (Р<0,05) (табл.1). Через 3-е суток уровень активности энзима достоверно выше показателей в группе «КД» и в контроле соответственно на 20,3% (Р<0,05) и 26,8% (Р<0,01) (табл.2). А к исходу недели эксперимента активность GR в печени крыс исследуемой группы достоверно отличается только от аналогичного значения в контроле на 28,4% (Р<0,01).
| Таблица 3 | |||
| Показатели энергетического обмена и перекисного окисления липидов в плазме крови и печени крыс в группах «К», «КД» и «КД+М» к концу 7-х суток после криовоздействия M±m для каждой группы | |||
| Показатели | Группы животных | ||
| «К» n=8 | «КД» n=9 | «КД+М» n=9 | |
| В крови | |||
| Ur (мкмоль/л) | 144±6 | 274±18* | 195±4*# |
| Глюкоза (ммоль/л) | 7,79±0,34 | 7,99±0,33 | 8,03±0,34 |
| Lac (ммоль/л) | 4,54±0,48 | 8,01±0,42* | 6,85±0,37* |
| ALT (МЕ/л) | 81,6±5,8 | 1048±31* | 807±49*# |
| AST (МЕ/л) | 250±22 | 2130±130* | 1778±63*# |
| В печени | |||
| SOD (единиц/г ткани) | 1436±148 | 2695±201* | 3180±233* |
| КАТ (единиц/г ткани) | 1403±82 | 1852±194* | 2307±54* |
| DC (Мэкв/мг липидов) | 5,02±0,34 | 8,95±0,81* | 8,03±0,39* |
| ЛФП (ед. флюорисценции/мг липидов) | 9,58±1,07 | 15,36±2,30* | 14,67±0,38* |
| GPO (мкмоль/г ткани *мин) | 3,57±0,16 | 2,87±0,13* | 3,40±0,08# |
| G-SH (мкмоль/г ткани) | 3,81±0,30 | 2,71±0,27* | 3,52±0,22# |
| GR (мкмоль/г ткани* мин) | 2,68±0,06 | 2,98±0,16 | 3,44±0,25* |
| G-6-PDH (нмоль/г ткани*мин) | 471±12 | 481±24 | 574±14*# |
| *различие достоверно по сравнению с группой «К» # различие достоверно по сравнению с группой «КД» |
Активность G-6-PDH в печени экспериментальных животных через 1 сутки после криодеструкции на фоне введения метронидазола ниже показателя в группе «КД» на 7,7% (Р<0,01) и выше контроля на 30,4% (Р<0,001) (табл.1). К концу 3-х суток активность этого фермента в группе «КД+М» существенно не отличается от аналогичного показателя в группе животных «КД», но выше контрольных значений на 15,7% (Р<0,01). И к исходу 7-х суток значения активности G-6-PDH в печени крыс, перенесших криодеструкцию на фоне введения метронидазола, достоверно выше активности этого энзима в группе животных, не получавших препарат в послеоперационном периоде и в контрольной группе соответственно на 19,3% (Р<0,01) и 21,8% (Р<0,001) (табл.3).
Из представленных в таблицах сведений о результатах биохимических тестов крови крыс группы "КД+М" видно, что через 1,3-е и 7 сутки активность ALT в этой группе достоверно ниже аналогичного показателя в группе "КД" соответственно на 22,8% (Р<0,01), 34% (Р<0,001) и 23% (Р<0,01). Уровень активности AST в крови крыс, получавших в послеоперационном периоде метронидазол также ниже значений активности этого фермента в группе животных, которым препарат не вводился через 1 сутки - на 14,1% (Р<0,1), к 3-м суткам - на 35,3% (Р<0,001) и к концу недели опыта - на 16,5% (Р<0,05). При сравнении данных протеинограммы в группах крыс, получавших метронидазол в послеоперационном периоде и перенесших криодеструкцию без введения препарата, обращает на себя внимание некоторое снижение концентрации Е-глобулинов в плазме крови через 1 и 3-е сутки после операции в первой группе соответственно на 10,4% (Р<0,2) и 17,8% (Р<0,05) повышение относительного количества альбуминов к 3-м и 7-м суток послеоперационного периода на 12% (Р<0,2) и на 17,4% (Р<0,01). Соответственно увеличивается альбумино-глобулиновый коэффициент, который через 7 суток в группе "КД+М" составляет 126,3% (Р<0,01) от аналогичного показателя в группе "КД".
Сравнивая результаты исследований в группах "КД" и "КД+М" можно сделать следующие выводы.
- Введение экспериментальным животным в послеоперационном периоде метронидазола в дозе 20 мг/кг веса снижает уровень урикемии, что связано с ингибированием этим препаратом ксантиноксидзы.
- Изолированное торможение активности одного из ключевых ферментов, продуцирующих активные формы кислорода, способствует снижению уровня липопероксидации, последнее отражается на концентрации продуктов ПОЛ в ткани печени.
- Обезвреживание перекисей липидов в системе, поддерживающей глутатиондисульфидное равновесие, происходит более эффективно, что следует из понижения их концентрации в ткани печени к исходу 1-х к 3-х суток и повышения активности ферментов, обеспечивающих функционирование названной выше системы: GPO на 3-й и 7-е сутки, GR к исходу 3-х суток и G-6-PDH на 7-е сутки послеоперационного периода, а также повышения содержания глутатиона в ткани печени к исходу 7-х суток после криодеструкции.
- Торможение процессов ПОЛ и изменения в системе антирадикальной и антиперекисной защиты положительно сказались на функциональных тестах печени, применяемых в клинической практике. Это выразилось в снижении активности ALT и AST в плазме крови оперированных животных и уменьшении степени выраженности диспротеинемии к исходу недели эксперимента.
Как видно из всего вышеописанного, именно заявленная совокупность существенных признаков предлагаемого изобретения, реализованная при заданных параметрах, позволяет обеспечить технический (медицинский) результат. Последний выражается в уменьшении побочного эффекта, проявляемого как чрезмерная липопероксидация фосфолипидов мембранных структур гепатоцитов при применении криодеструкции, путем снижения продукции ксантиноксидазой активных форм кислорода, а также сокращении сроков и степени биохимических нарушений. Таким образом, можно сделать вывод, что предлагаемое изобретение является патентоспособным, так как обладает новизной, изобретательским уровнем и практически применимо.
Средство коррекции метаболических нарушений после криодеструкции печени, отличающееся тем, что оно представляет собой раствор метронидазола для парентерального введения в дозе 20 мг/кг массы тела.
