Способ получения пентаникотината глицирризиновой кислоты, являющегося ингибитором репродукции вируса иммунодефицита человека

Изобретение относится к способу получения пентаникотината глицирризиновой кислоты без примесей путем взаимодействия глицирризиновой кислоты или ее аммонийной соли с химическим реагентом в растворителе с получением полиникатинатов глицирризиновой кислоты в виде осадка. В качестве химического реагента используют гидрохлорид хлорангидрида никотиновой кислоты, в качестве растворителя - пиридин, при соотношении реагентов гидрохлорида хлорангидрида никотиновой кислоты, пиридина и глицирризиновой кислоты соответственно (3-5):(26-27):1. Целевой продукт из полиникатинатов глицирризиновой кислоты выделяют методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Технический результат: выделение индивидуального пентаникотината глицерризиновой кислоты без примесей, который может использоваться в медицине, вирусологии, фармакологии, например в качестве ингибитора репродукции вируса иммунодефицита человека. 2 з.п. ф-лы, 6 табл.

 

Изобретение относится к биологически активным веществам, производным глицирризиновой кислоты, и может использоваться в медицине, вирусологии, фармакологии, например в качестве ингибитора репродукции вируса иммунодефицита человека.

Известно, что глицирризиновая кислота - основной ингредиент экстракта корней солодки голой (Glycyrrhiza glabra) и солодки уральской (Gl. Uralensis), обладает высокой биологической активностью и является высокоэффективным средством в лечении различных заболеваний. Так, она применяется при лечении вирусных гепатитов, входит в перечень препаратов (который насчитывает около 50 наименований), подавляющих репродукцию вируса иммунодефицита человека in vitro. Названная кислота оказывает противовирусное, противовоспалительное, противозудное и иммуномодулирующее действие, действует на разные типы ДНК и РНК вирусов in vitro и in vivo (Varicella zoster; Herpes simplex 1 и 2 типа; различные типы вируса папилломы человека, в т.ч. онкогенные), прерывает репликацию вирусов на ранних стадиях, вызывает выход вириона из капсида, тем самым не допуская его проникновения в клетки, что связано с селективным дозозависимым ингибированием фосфорилирующей киназы Р. Глицирризиновая кислота взаимодействует со структурами вируса (возможно, с белками), изменяя различные фазы вирусного цикла, что сопровождается необратимой инактивацией вирусных частиц, находящихся в свободном состоянии вне клеток, блокирует внедрение активных вирусных частиц внутрь клетки, нарушает способность вируса к индукции синтеза новых вирусных частиц, индуцирует образование интерферона, что является одним из компонентов противовирусного действия, инактивирует указанные вирусы в нетоксичных для нормально функционирующих клеток концентрациях. Мутантные штаммы вирусов, резистентные к ацикловиру и йодоуридину, также высокочувствительны к глицирризиновой кислоте, как и немутантные штаммы. Противовоспалительная активность глицирризиновой кислоты сочетается со стимулирующим влиянием на гуморальные и клеточные факторы иммунитета.

Производные глицирризиновой кислоты также, как и сама кислота, обладают высокой биологической активностью. В частности, моноаммониевая соль глицирризиновой кислоты (глицирам Г) или пента-О-никотинат глицирризиновой кислоты, 3-(b-D-2,3,4-три-о-никотинилглюкуронпиранозил)

1 2(a-D-3,4-ди-О-никотинилглюкуронпиранозил глицирретовой кислоты (ниглизин, НГ) используются для ингибирования репродукции вируса Марбург (Патент РФ №2088232, МПК А61К 31/70, опубл. 27.08.1997 г.).

Известны способы получения пента-О-никотината глицирризиновой кислоты (авторское свидетельство СССР №482446, МПК С07С 173/00, опубл. 30.08.1975 и авторское свидетельство СССР №1069403, МПК С07J 63/00, опубл. 30.04.1994 г.), в которых описаны различные способы получения пентаникотината глицирризиновой кислоты. В упомянутых авторских свидетельствах в качестве доказательств структуры образующегося вещества были использованы данные ИК-спектроскопии и элементного анализа.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения пента-О-никотината глицирризиновой кислоты из глицирризиновой кислоты с использованием хлорангидрида никотиновой кислоты в среде азотистого основания (патент РФ №2073009, МПК С07J 63/00, опубл. 10.02.1997 г.). Глицирризиновую кислоту переводят в глицирам или трикалиевую соль и подвергают азеотропной сушке в смеси трибутиламина и бензола при 69-70°С в вакууме и хлорагидрид никотиновой кислоты используют в виде хлоргидрата при температуре 75-80°С в течение 3-4 ч при молярном соотношении реагентов 1:7.4-7.6 соответственно с последующей декантацией трибутиламина и обработкой реакционной смеси ацетоном при 50°С.

Однако в приведенных выше аналогах, в том числе и в прототипе, получают не чистое вещество, а пента-О-никотинат глицирризиновой кислоты с большим количеством примесей других никотинатов ГК.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание такой технологии, которая обеспечивает выделение индивидуального пентаникотината глицирризиновой кислоты без примесей.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения пентаникотината глицирризиновой кислоты путем взаимодействия глицирризиновой кислоты или ее аммонийной соли с химическим реагентом в растворителе с получением полиникатинатов глицирризиновой кислоты в виде осадка, согласно изобретению в качестве химического реагента используют гидрохлорид хлорангидрида никотиновой кислоты, в качестве растворителя - пиридин, при соотношении реагентов гидрохлорида хлорангидрида никотиновой кислоты, пиридина и глицирризиновой кислоты соответственно (3-5):(26-27):1, а целевой продукт из полиникатинатов глицирризиновой кислоты выделяют методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии по схеме, представленной ниже:

Препаративную высокоэффективную жидкостную хроматографию проводят путем растворения полиникатинатов глицирризиновой кислоты в этиловом спирте в соотношении 1:4 с последующим нанесением раствора на колонку и осуществления градиентного элюирования смесью 0.3 М раствора перхлората лития в воде и метанола в течение не более 15 минут. Целевой продукт в виде полиникатинатов глицирризиновой кислоты получают в количестве около 60 мас.%, а конечный продукт из полиникатинатов глицирризиновой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии выделяют в количестве не менее 3 мас.%.

В результате проведенных исследований были подобраны аналитические условия, позволяющие надежно контролировать качественный состав реакционной смеси, включая исходные соединения, использующиеся растворители, промежуточные и конечные продукты реакций в условиях синтеза пентаникотината глицирризиновой кислоты, описанных в прототипах. Использование современных методик анализа позволило обнаружить, что реакционная смесь во всех случаях неоднородна и состоит из набора никотинатов глицирризиновой кислоты, содержащих в своей структуре как различное количество никотинатных остатков, так и являющихся изомерами замещения никотиновыми фрагментами гидроксильных групп глицирризиновой кислоты. В составе реакционной смеси присутствует и продукт полной этерификации исходного соединения - пентаникотинат глицирризиновой кислоты в количестве не более 4%. Варьирование условий реакции и оптимизация процесса по разным параметрам не приводят к преобладанию пентаникотината в реакционной смеси. Выделение целевого продукта было проведено с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Пример 1. Анализ реакционных смесей

Вначале получают обзорные хроматограммы образцов реакционных смесей, выполненных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе «Милихром-А02». В табл.1 приведены условия хроматографирования.

Для идентификации получаемых продуктов были разработаны методики разделения реакционных смесей с использованием различных методов высокоэффективной жидкостной хроматографии и проведены препаративные разделения наработанных реакционных смесей. Выделенные продукты были охарактеризованы с использованием ЯМР-спектроскопии 1Н и 13C и ВЭЖХ-хроматомасс спектроскопии. На основании анализа молекулярных масс ионов, наблюдающихся в ВЭЖХ-хроматомасс спектре, показано, что реакционные смеси содержат набор полиникотинатов глицирризиновой кислоты, в том числе три- и тетраникотинаты, а также пентаникотинат глицирризиновой кислоты.

Таблица 1
Условия хроматографирования
Колонка Стальная, 75×2 мм, заполненная сорбентом LiChrospher RP-18 с размером частиц 5 мкм
Температура колонки 35°С
Подвижная фаза (ПФ) А:0.3 М раствор перхлората лития в воде; В: метанол
Расход ПФ В от 0 до 100 мкл/мин (элюент А 5 мин, градиент 100% за 15 мин, элюент В 5 мин)
Детектор Ультрафиолетовый, длина волны 260 нм
Время анализа 25 мин

Сравнением хроматограмм, полученных на ВЭЖХ-хроматомасс спектрометре с использованием УФ-детектора, данных ионмасс-детектора и соответствующих аналитических ВЭЖХ-хроматограмм, определены группы пиков в аналитических ВЭЖХ-хроматограммах, соответствующие различным полиникотинатам глицирризиновой кислоты, в том числе и пентаникотинату глицирризиновой кислоты.

Пример 2. Варианты синтеза пентаникотината глицирризиновой кислоты

Для отработки методики синтеза пентаникотината глицирризиновой кислоты были экспериментально исследованы возможные варианты синтеза полиникотинатов глицирризиновой кислоты, включающие в себя:

а) взаимодействие глицирризиновой кислоты (или ее аммонийной соли) с предварительно синтезированными по известным методикам ангидридом никотиновой кислоты или гидрохлоридом хлорангидрида никотиновой кислоты в различных растворителях (пиридин, N-метилпирролидон, триэтиламин и т.д.), в том числе в присутствии катализаторов;

б) взаимодействие глицирризиновой кислоты (или ее аммонийной соли) с полученным in situ гидрохлоридом хлорангидрида никотиновой кислоты в различных растворителях;

в) взаимодействие глицирризиновой кислоты (или ее аммонийной соли) с никотиновой кислотой в присутствии борсодержащих катализаторов;

г) взаимодействие активированной металлическим натрием аммонийной соли глицирризиновой кислоты с никотиновой кислотой;

д) взаимодействие глицирризиновой кислоты (или ее аммонийной соли) с никотиновой кислотой в условиях физического воздействия (микроволнового излучения).

На основании анализа полученных ВЭЖХ-хроматограмм определена наиболее перспективная методика синтеза полиникотинатов глицирризиновой кислоты - взаимодействие глицирризиновой кислоты (или ее аммонийной соли) с полученным in situ гидрохлоридом хлорангидрида никотиновой кислоты в пиридине.

Пример 3. Многофакторная оптимизация процесса (табл.2-4)

Варьируемые факторы: количество никотиновой кислоты, PCl5, пиридина, продолжительность и температура реакции.

Фиксированные факторы: количество глицирризиновой кислоты (10 г); температура и продолжительность первой стадии (синтез хлорангидрида никотиновой кислоты); обработка реакционной смеси.

Таблица 2
Основные характеристики плана оптимизации
№ фактора, j Факторы варьирования ΔZj
1 Количество пиридина, мл 600 100 350 250
2 Количество никотиновой кислоты, г 40 10 25 15
3 PCl5, г 28 14 21 7
4 Т, °С (±5°С) 65 35 50 15
5 Время, ч 8 1 4.5 3.5
Примечание: ;

Таблица 3
Матрица для пяти переменных факторов оптимизации
xl x2 x3 х4 x5
0.5 0.289 0.204 0.158 0.13
-0.5 0.289 0.204 0.158 0.13
0 -0.578 0.204 0.158 0.13
0 0 -0.612 0.158 0.13
0 0 0 -0.632 0.13
0 0 0 0 -0.65

Рассчитываемый фактор в физической величине для исходной серии опытов:

, где хj - коэффициент по матрице.

Таблица 4
Исходная серия опытов оптимизации
Количество Количество Количество Т, °С Время, ч
опыта пиридина, мл никотиновой кислоты, г РСl5, г (±5°С)
Z1 Z2 Z3 Z4 Z5
1 475 29.4 22.4 52 5
2 225 29.4 22.4 52 5
3 350 16.4 22.4 52 5
4 350 25 16.8 52 5
5 350 25 21 40.5 5
6 350 25 21 50 2.2

По итогам первого этапа оптимизации определили наихудший опыт.

Рассчитываемый фактор в физической величине для следующего опыта: Zj=(2/n)ΣZji-Zi, где n - число факторов в матрице планирования, i - номер опыта, j - номер фактора, ΣZji - сумма значений i-x факторов без наихудшего опыта, Zi - значение i-го фактора в наихудшем опыте предыдущего симплекса.

Расчеты факторов каждого последующего опыта проводились после определения наихудшего опыта по этой же формуле.

Исходя из анализа полученных ВЭЖХ-хроматограмм и масс полученных продуктов выбраны условия реакции, подходящие для последующего масштабирования.

Пример 4. Синтез смеси никотинатов глицирризиновой кислоты

Двугорлую колбу емкостью 5 л, снабженную эффективной механической мешалкой, помещают в баню с глицерином с термометром. В колбу заливают 4.0 л пиридина, засыпают 500 г никотиновой кислоты и при перемешивании нагревают реакционную смесь до 30-35°С (здесь и далее указана температура бани), затем, не прекращая перемешивания, добавляют к образовавшейся суспензии 204.2 г пятихлористого фосфора. По окончании прибавления смесь нагревают до 80±3°С и перемешивают при этой температуре в течение 2 ч (примерно через 30-40 мин цвет реакционной смеси из светлого становится темно-коричневым). Далее добавляют при перемешивании 150 г глицирризиновой кислоты и выдерживают при 80±3°С в течение 4 ч 50 мин.

По окончании реакции убирают баню и дают остыть колбе до ~30-40°С, затем полученную суспензию разливают поровну в два стакана емкостью 5 л и добавляют в каждый стакан по ~1.0 л измельченного льда, приготовленного из дистиллированной воды, для перенесения оставшегося на стенках колбы осадка используют дистиллированную воду. Содержимое стаканов перемешивают и добавляют в них концентрированную соляную кислоту (~1.3 л в каждый стакан) до достижения слабокислого рН (~6), при этом наблюдается выпадение дополнительного количества осадка. Прибавление соляной кислоты сопровождается сильным разогревом реакционной массы. Оставляют стаканы на ночь для полного выпадения осадка. Выпавший в обоих стаканах коричневый осадок фильтруют. Объединенные с обоих стаканов осадки промывают дистиллированной водой (4×1 л). Вес светло-коричневого осадка составляет ~300 г.

Смешивают 2 л хлороформа и 0.4 л метанола (хлороформ: метанол = 5:1) и растворяют в этой смеси полученный ранее осадок. Растворение протекает достаточно медленно и требует выдержки в течение 1-2 ч при интенсивном перемешивании. Полученный раствор фильтруют, оставшийся осадок промывают 100 мл смеси хлороформа с метанолом в соотношении 5:1 (дважды по 50 мл), осадок (~10-15 г) выбросить. К фильтрату добавляют 2.3 л диэтилового эфира, при этом наблюдается интенсивное выпадение осадка. Полученную смесь перемешивают и оставляют на 1 ч для полного формирования осадка. Выпавший осадок фильтруют. Осадок промывают 150 мл диэтилового эфира (трижды по 50 мл), высушивают на фильтре. Вес осадка ~165 г. К полученному осадку добавляют 150 мл этилового спирта, перемешивают, фильтруют, высушивают на фильтре. Вес высушенного светло-коричневого осадка составляет ~150 г (выход ~60%).

Пример 5. Выделение пентаникотината глицирризиновой кислоты методом препаративной ВЭЖХ

Выделение целевого продукта из реакционной смеси проводят с использованием градиентной препаративной системы KNAUER на колонке 24×250 мм с Диасфер-С18, 10 мкм. Подвижная фаза - 0,3 М раствора перхлората лития в воде и метанол. Детекция проводилась с использованием прибора «Миллихром-А02». Реакционную смесь (полиникатинаты глицирризиновой кислоты) в количестве 5 г растворяют в этиловом спирте (20 мл) и наносят полученный раствор на колонку. Градиентное элюирование проводят смесью 0.3 М раствора перхлората лития в воде и метанола в течение 15 минут. Отбирают целевую фракцию, выходящую на 14,5 минуте. Из 5 г реакционной смеси было выделено 0,15 г (3%) пентаникотината глицирризиновой кислоты. Ниже приведена схема получения готового продукта:

Спектры ЯМР 1Н и 13С записывали на спектрометрах АМ-400 и AV-300 фирмы Bruker с рабочими частотами 400.13 и 300.13 МГц для 1Н, 100.61 и 75.47 МГц для 13С, соответственно, для растворов веществ в CDC13 или в смеси CDCl3-CCl4 (~1:1 по объему). В качестве внутреннего стандарта использовали сигналы хлороформа (δН 7.24 м.д., δС 76.90 м.д.).

Пример 6. Исследование анти-ВИЧ активности пентаникотината глицирризиновой кислоты

В табл.6 приведены сравнительные данные по исследованию анти-ВИЧ активности на культуре клеток МТ-4 пентаникотината глицирризиновой кислоты и смеси никотинатов глицирризиновой кислоты.

Таблица 6
Данные анти-ВИЧ активности пентаникотината глицирризиновой кислоты
Соединение CD50, мкМ ID50, мкМ IS
Смесь никотинатов глицирризиновой кислоты 2065 46,3 44,6
Пентаникотинат глицирризиновой кислоты 2040 15,1 57,0

Как видно из табл.6, пентаникотинат глицирризиновой кислоты обладает достаточно высокой анти-ВИЧ активностью.

1. Способ получения пентаникотината глицирризиновой кислоты путем взаимодействия глицирризиновой кислоты или ее аммонийной соли с химическим реагентом в растворителе с получением полиникатинатов глицирризиновой кислоты в виде осадка, отличающийся тем, что в качестве химического реагента используют гидрохлорид хлорангидрида никотиновой кислоты, в качестве растворителя - пиридин, при соотношении реагентов гидрохлорида хлорангидрида никотиновой кислоты, пиридина и глицирризиновой кислоты соответственно (3-5):(26-27):1, а целевой продукт из полиникатинатов глицирризиновой кислоты выделяют методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии по схеме, представленной ниже:

2. Способ получения пентаникотината глицирризиновой кислоты по п.1, отличающийся тем, что препаративную высокоэффективную жидкостную хроматографию проводят путем растворения полиникатинатов глицирризиновой кислоты в этиловом спирте в соотношении 1:4 с последующим нанесением раствора на колонку и осуществления градиентного элюирования смесью 0,3 М раствора перхлората лития в воде и метанола в течение не более 15 мин.

3. Способ получения пентаникотината глицирризиновой кислоты по п.1, отличающийся тем, что целевой продукт в виде полиникатинатов глицирризиновой кислоты получают в количестве около 60 мас.%, а конечный продукт из полиникатинатов глицирризиновой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии выделяют в количестве не менее 3 мас.%.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к получению лекарственных, ветеринарных, косметических препаратов, а также к пищевой промышленности и сельскому хозяйству. .

Изобретение относится к способу получения тритерпеновых дипептидов лупанового ряда, проявляющих противовирусную антипролиферативную и иммуностимулирующую активность.

Изобретение относится к способу контрацепции, включающим назначение мужской особи, способной к воспроизводству себе подобных, в особенности человеческой, соединения согласно изобретению в единичных дозировках и балансе, который является обоснованным для упомянутого соединения, чтобы оно само по себе являлось конрацептивно эффективным и которое одновременно служит для поддержания значительного андрогенного уровня в мужской особи, которая подвергается этому конрацептивному способу.

Изобретение относится к корректорам цитостатической полихимиотерапии. .

Изобретение относится к улучшенному способу получения диацетата бетулинола из бетулинола. .

Изобретение относится к улучшенному способу получения ценного органического соединения - бетулина, используемого в медицинской, химической и парфюмерной промышленности.
Изобретение относится к улучшенному способу аллобетулина (19, 28-эпоксиолеанан-3-ола) (1)-пентациклического тритерпеноида олеананового ряда, обладающего выраженной противовирусной активностью и представляющего большой интерес для химико-фармацевтической промышленности.
Изобретение относится к улучшенному способу получения биологически активных веществ из продуктов химической переработки наружного слоя коры березы (бересты), а именно к способу получения бетулоновой кислоты из бетулина.

Изобретение относится к фармации. .

Изобретение относится к области органической химии и может найти применение в аналитической химии и биологических исследованиях. .
Изобретение относится к получению лекарственных, ветеринарных, косметических препаратов, а также к пищевой промышленности и сельскому хозяйству

Изобретение относится к улучшенному способу получения аллобетулина (19 ,28-эпоксиолеанан-3-ола) - пентациклического тритерпеноида олеананового ряда, обладающего выраженной противовирусной активностью и представляющего большой интерес для химико-фармацевтической промышленности

Изобретение относится к биологически активным веществам, производным глицирризиновой кислоты, а именно солям ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты, являющимся ингибиторами репродукции вируса иммунодефицита человека, включая соли ди- и/или триникотинатов глицирризиновой кислоты

Изобретение относится к улучшенному способу получения аллобетулина, обладающего выраженной противовирусной активностью и представляющего большой интерес для химико-фармацевтической промышленности
Изобретение относится к деревообрабатывающей и лесохимической промышленности

Изобретение относится к области фармацевтики

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к 3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ену формулы (I), которое может быть использовано в медицине в качестве корректора паранеопластических повреждений и токсических эффектов цитостатической полихимиотерапии

Изобретение относится к фармацевтике

Изобретение относится к биологически активным аналогам стероидных эстрогенов

Изобретение относится к способу получения пентаникотината глицирризиновой кислоты без примесей путем взаимодействия глицирризиновой кислоты или ее аммонийной соли с химическим реагентом в растворителе с получением полиникатинатов глицирризиновой кислоты в виде осадка

Наверх