Композиции и способы для регуляции развития сосудов

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ снижения или ингибирования ангиогенеза у индивидуума со связанным с ангиогенезом патологическим состоянием, предусматривающий введение индивидууму антагониста EGFL7, способного препятствовать индуцируемой EGFL7 миграции эндотелиальных клеток, тем самым снижая или ингибируя ангиогенез у индивидуума. Изобретение может быть использовано для регуляции вовлеченных в ангиогенез процессов. 12 з.п. ф-лы, 7 ил.

 

Эта непредварительная заявка, поданная согласно 37 CFR §1.53(b), претендует на приоритет согласно 35 USC §119(e) предварительной заявки США с серийным №60/562054, поданной 14 апреля 2004 г.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится в основном к композициям и способам, которые эффективны для регуляции развития сосудов. Конкретно настоящее изобретение относится к EGF-подобному домену 7 (EGFL7), новому происходящему из клеток эндотелия секретируемому фактору. Кроме того, настоящее изобретение относится к диагностике и лечению связанных с ангиогенезом состояний и заболеваний.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Развитие сосудистого снабжения представляет собой основную потребность для многих физиологических и патологических процессов. Активно растущие ткани, такие как эмбриональные и опухолевые, испытывают потребность в адекватном кровоснабжении. Эту потребность они удовлетворяют продукцией проангиогенных факторов, способствующих образованию новых кровеносных сосудов посредством процесса, называемого ангиогенезом. Формирование сосудистой трубки представляет собой сложное, но упорядоченное биологическое событие, включающее все или многие из следующих стадий: a) эндотелиальные клетки (EC) пролиферируют из существующих EC или дифференцируются из клеток-предшественников; b) EC мигрируют и объединяются, формируя тяжеподобные структуры; c) затем сосудистые тяжи претерпевают тубулогенез, образуя сосуды с центральным просветом; d) существующие тяжи или сосуды дают отростки, формируя вторичные сосуды; e) первичная сосудистая сеть подвергается дальнейшему реструктурированию и видоизменению; и f) для заключения эндотелиальных трубок в оболочку привлекаются периэндотелиальные клетки, обеспечивающие поддерживающие и регулирующие функции для сосудов; такие клетки включают перициты для мелких капилляров, гладкомышечные клетки для крупных сосудов и миокардиальные клетки в сердце. Hanahan, D. Science 277:48-50 (1997); Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3:513-23 (2002); Lubarsky, B. & Krasnow, M. A. Cell. 112:19-28 (2003).

В настоящее время точно установлено, что ангиогенез вовлечен в патогенез множества нарушений. Они включают солидные опухоли и метастазирование, атеросклероз, ретролентальную фиброплазию, гемангиомы, хроническое воспаление, внутриглазные неоваскулярные заболевания, такие как пролиферативные ретинопатии, например диабетическая ретинопатия, связанная с возрастом дегенерация желтого пятна (AMD), неоваскулярная глаукома, иммунное отторжение трансплантированной ткани роговицы и других тканей, ревматоидный артрит и псориаз. Folkman et al., J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992); Klagsbrunet al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); а также Garner A., "Vascular diseases", в: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710.

В случае опухолевого роста ангиогенез является решающим для перехода из гиперплазии в неоплазию и для обеспечения питательных веществ для роста и метастазирования опухоли. Folkman et al., Nature 339: 58 (1989). Образование новых сосудов позволяет опухолевым клеткам приобретать преимущество в росте и автономию пролиферации в сравнении с обычными клетками. Как правило, опухоль начинается с отдельной патологически измененной клетки, способной пролиферировать только до размера нескольких кубических миллиметров вследствие удаления от доступных капиллярных русел, кроме того, опухоль может в течение продолжительного периода времени оставаться в “состоянии покоя” в отсутствие дополнительного роста и распространения. Затем некоторые опухолевые клетки переключаются на ангиогенный фенотип для активации эндотелиальных клеток, которые пролиферируют и развиваются в новые капиллярные кровеносные сосуды. Эти вновь сформированные кровеносные сосуды делают возможным не только непрерывный рост первичной опухоли, но также и распространение и повторное заселение метастатическими опухолевыми клетками. Соответственно была выявлена взаимосвязь между плотностью сосудов микроциркуляции в опухолевых срезах и выживаемостью пациентов при раке молочной железы, а также при некоторых других опухолях. Weidner et al., N. Engl. J. Med 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340:1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340:145-146 (1992). Точные механизмы, контролирующие переключение на ангиогенез, не совсем ясны, однако предполагают, что формирование новых сосудов в опухолевом образовании происходит на основании общего соотношения стимуляторов и ингибиторов ангиогенеза (Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31).

Процесс развития сосудов жестко регулируется. К настоящему времени было выявлено значительное число молекул, в основном продуцируемых окружающими клетками секретируемых факторов, которые регулируют дифференцировку, пролиферацию, миграцию и объединение EC в тяжеподобные структуры. Например, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) был выявлен в качестве ключевого фактора, вовлеченного в стимуляцию ангиогенеза и в индукцию сосудистой проницаемости. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997). Открытие, что потеря даже одного аллеля VEGF приводит к эмбриональной смертности, указывает на незаменимую роль, которую играет этот фактор в развитии и дифференцировке сосудистой системы. Кроме того, было показано, что VEGF представляет собой ключевой медиатор в образовании новых сосудов, связанном с опухолями и внутриглазными заболеваниями. Ferrara et al., Endocr. Rev. выше. Большинство исследуемых опухолей человека сверхэкспрессируют мРНК VEGF. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer 73:931-934 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995).

Кроме того, уровни концентрации VEGF в жидкостях глаза в высокой степени соотносятся с наличием активной пролиферации кровеносных сосудов у пациентов с диабетической и другими связанными с ишемией ретинопатиями. Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994). Кроме того, в исследованиях было установлено расположение VEGF в оболочках новых хориоидальных сосудов пациентов, страдающих AMD. Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:855-868 (1996).

Нейтрализующие антитела к VEGF подавляют рост множества линий опухолевых клеток человека в голых мышах (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgström et al., Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-924 (1996)), а также ингибируют внутриглазной ангиогенез в моделях с ишемическими нарушениями сетчатки. Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996). Поэтому моноклональные антитела к VEGF или другие ингибиторы действия VEGF являются многообещающими кандидатами для лечения опухолей и различных связанных с новообразованными сосудами внутриглазных нарушений. Такие антитела описаны, например, в патенте EP 817648, опубликованном 14 января 1998; а также в патентах WО98/45331 и WО98/45332, опубликованных 15 октября 1998. Одно из таких антител к VEGF, бевацизумаб, было утверждено FDA для использования в сочетании с курсом химиотерапии для лечения метастазирующего рака прямой и ободочной кишки (CRC). Также во многих продолжающихся клинических испытаниях бевацизумаб исследуют на предмет лечения по различным раковым показаниям.

Известно, что внеклеточный матрикс (ECM) играет важную роль в ходе процесса ангиогенеза. Madri, Transpl. Immunol. 5:179-83 (1997). В ходе своей миграции EC окружены поддерживающим ECM и после формирования просвета прилегают к вновь синтезированным базальным мембранам сосудов. Было показано, что кроме обеспечения поддерживающего каркаса в ходе морфогенеза капилляров ECM осуществляет комплексный местный контроль над функциями EC. Например, ECM способен регулировать доступность для EC растворимых ангиогенных медиаторов и определять характер и тип взаимодействий с интегрином и молекулами клеточной адгезии. Также было предположено, что выживаемость EC регулируется взаимодействием рецепторов фактора роста и интегринов, которые, в свою очередь, регулируются составом местного ECM. Stupack and Cheresh, Oncogene 22:9022-29 (2003).

Несмотря на многие достижения в области ангиогенеза некоторые из стадий в ходе формирования трубки сосуда все еще плохо охарактеризованы. В частности, мало известно о регуляции тубулогенеза - как развиваются сосудистые тяжи, преобразовываясь в трубки, и какие факторы регулируют этот переход. Учитывая роль ангиогенеза во многих заболеваниях и нарушениях, желательно обладать средствами снижения или ингибирования одного или нескольких биологических эффектов, обусловленных этими процессами. Также желательно обладать способами анализа наличия патогенных полипептидов в нормальном и патологическом состояниях, а особенно при злокачественной опухоли. Также существует необходимость в выявлении мишеней и разработке способов, которые могут повышать эффективность существующих противоангиогенных способов лечения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на выявлении и охарактеризовывании происходящего из EC нового секретируемого фактора, EGF-подобного домена 7 (EGFL7). EGFL7 экспрессируется на высоких уровнях в сосудистой системе, связанной с пролиферацией ткани, и подавляется в большинстве зрелых сосудов в нормальных взрослых тканях. Утрата функции EGFL7 вызывала значительные сосудистые дефекты в эмбрионах животных и снижала рост опухоли. Основываясь на его структуре, экспрессии и активности, EGFL7 считают новой молекулой ECM. Кроме того, открыто, что EGFL7 поддерживает адгезию и миграцию EC, а также вовлечен в выполнение поддерживающей функции для ангиогенных факторов в опухолевом ангиогенезе. С другой стороны, было открыто, что антагонисты EGFL7 эффективно блокируют связанные с EGFL7 адгезию и миграцию EC. Соответственно настоящее изобретение обеспечивает новые композиции и их применение для регуляции (например, стимуляции или ингибирования) вовлеченных в ангиогенез процессов.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую антагонист EGFL7 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. В одном из аспектов композиция содержит терапевтически эффективное количество антагониста. В другом аспекте композиция содержит дополнительный активный ингредиент, например противоангиогенное средство. Предпочтительно композиция стерильна. Антагонист EGFL7 можно вводить в форме жидкого фармацевтического препарата, который можно консервировать для достижения устойчивости при длительном хранении. Консервированные жидкие фармацевтические препараты могут содержать многократные дозы антагониста EGFL7 и поэтому могут быть приемлемы для многократного применения. В предпочтительном варианте осуществления, где композиция содержит антитело, антитело представляет собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, гуманизированное антитело или одноцепочечное антитело.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ получения такой композиции, приемлемой для лечения связанного с ангиогенезом нарушения, где способ предусматривает смешивание терапевтически эффективного количества антагониста EGFL7 с фармацевтически приемлемым носителем.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает изделие, содержащее:

(a) композицию, содержащую антагонист EGFL7;

(b) контейнер, содержащий указанную композицию; и

(c) прикрепленный к указанному контейнеру ярлык или включенный в указанный контейнер листок-вкладыш, относящиеся к использованию указанного антагониста EGFL7 в лечении связанного с ангиогенезом нарушения, где антагонист может представлять собой антитело, связывающееся с EGFL7 и блокирующее его активность. Композиция может содержать терапевтически эффективное количество антагониста EGFL7.

В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает способ выявления соединения, ингибирующего активность полипептида EGFL7, где способ предусматривает контактирование тестируемого соединения с полипептидом EGFL7 в условиях и в течение времени, достаточных для возможного взаимодействия тестируемого соединения и полипептида, а также предусматривает определение, ингибируется ли активность полипептида EGFL7. В конкретном предпочтительном аспекте либо тестируемое соединение, либо полипептид EGFL7 иммобилизуют на твердом носителе. В другом предпочтительном аспекте неиммобилизованный компонент несет детектируемую метку. В предпочтительном аспекте этот способ содержит стадии:

(a) контактирования клеток и подлежащего отбору тестируемого соединения в присутствии полипептида EGFL7 в условиях, приемлемых для индукции клеточного ответа, обычно вызываемого полипептидом EGFL7; и

(b) определения индукции указанного клеточного ответа для определения, является ли тестируемое соединение эффективным антагонистом.

В другом предпочтительном аспекте этот процесс содержит стадии:

(a) контактирования клеток и подлежащего отбору тестируемого соединения в присутствии полипептида EGFL7 в условиях, приемлемых для стимуляции пролиферации клеток полипептидом EGFL7; и

b) измерения пролиферации клеток для определения, является ли тестируемое соединение эффективным антагонистом.

Один из типов антагониста полипептида EGFL7, ингибирующий одну или несколько функций или активностей полипептида EGFL7, представляет собой антитело. Таким образом, в другом аспекте изобретение обеспечивает выделенное антитело, связывающее полипептид EGFL7. В предпочтительном аспекте антитело представляет собой моноклональное антитело, предпочтительно имеющее не принадлежащие человеку остатки гипервариабельного участка (CDR) и принадлежащие человеку остатки каркасной области (FR). Антитело может быть меченым и может быть иммобилизованным на твердом носителе. В другом аспекте антитело представляет собой фрагмент антитела, одноцепочечное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека. Предпочтительно антитело специфически связывается с полипептидом.

В еще одном аспекте изобретение обеспечивает способ диагностики сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения у млекопитающего, предусматривающий анализ уровня экспрессии кодирующего полипептид EGFL7 гена (a) в тестируемом образце клеток ткани, который получают от указанного млекопитающего, и (b) в контрольном образце известных нормальных клеток ткани того же клеточного типа, где более высокий или низкий уровень экспрессии в тестируемом образце в сравнении с контрольным образцом указывает на наличие у указанного млекопитающего сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения. Экспрессию кодирующего полипептид EGFL7 гена можно, необязательно, определять измерением уровня мРНК или полипептида в тестируемом образце в сравнении с контрольным образцом.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения у млекопитающего, предусматривающий выявление наличия или отсутствия полипептида EGFL7 в тестируемом образце клеток ткани, который получают от указанного млекопитающего, где наличие или отсутствие указанного полипептида EGFL7 в указанном тестируемом образце указывает на наличие у указанного млекопитающего сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения.

В еще одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ диагностики сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения у млекопитающего, предусматривающий (a) контактирование антитела к EGFL7 с тестируемым образцом клеток ткани, который получают у млекопитающего, и (b) детектирование образования комплекса между антителом и полипептидом EGFL7 в тестируемом образце, где образование указанного комплекса указывает на наличие у млекопитающего сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения. Детектирование может быть качественным или количественным, и его можно проводить в сравнении с наблюдением образования комплекса в контрольном образце известных нормальных клеток ткани того же клеточного типа. Большее или меньшее количество формируемых в тестируемом образце комплексов указывает на наличие сердечно-сосудистой, эндотелиальной или ангиогенной дисфункции у млекопитающего, от которого были получены тестируемые клетки ткани. Предпочтительно антитело несет детектируемую метку. Образование комплекса можно наблюдать, например, посредством световой микроскопии, проточной цитометрии, флуориметрии или других известных в данной области способов. Как правило, тестируемый образец получают у индивидуума, у которого предполагают наличие сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения.

В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает способ определения наличия полипептида EGFL7 в образце, предусматривающий воздействие антитела к EGFL7 на образец, в котором предполагают наличие полипептида EGFL7, и определение связывания указанного антитела с компонентом указанного образца. В конкретном аспекте образец содержит клетку, предположительно содержащую полипептид EGFL7, и антитело связывается с клеткой. Предпочтительно антитело метят детектируемой меткой и/или связывают с твердым носителем.

В других аспектах изобретение обеспечивает набор для диагностики сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения, содержащий антитело к EGFL7 и носитель в подходящей упаковке. Предпочтительно такой набор дополнительно содержит инструкции по применению указанного антитела для выявления наличия полипептида EGFL7. Предпочтительно носитель представляет собой, например, буфер. Предпочтительно сердечно-сосудистое, эндотелиальное или ангиогенное нарушение представляет собой злокачественную опухоль.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ снижения или ингибирования ангиогенеза у индивидуума со связанным с ангиогенезом патологическим состоянием, где способ предусматривает введение индивидууму антагониста EGFL7, способного препятствовать индуцируемой EGFL7 миграции эндотелиальных клеток, тем самым снижая или ингибируя у индивидуума ангиогенез. Предпочтительно антагонист EGFL7 представляет собой антитело к EGFL7. Способность антагониста препятствовать индуцируемой EGFL7 миграции EC можно выявлять, например, в анализе миграции клеток in vitro.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления связанное с ангиогенезом патологическое состояние представляет собой злокачественную опухоль. В другом предпочтительном варианте осуществления связанное с ангиогенезом патологическое состояние представляет собой внутриглазное неоваскулярное заболевание. В еще одном предпочтительном варианте осуществления антагонист EGFL7 вводят совместно с другим противоангиогенным средством, таким как антитело к VEGF, в том числе бевацизумаб. Также настоящее изобретение обеспечивает способ повышения эффективности лечения противоангиогенным средством индивидуума со связанным с ангиогенезом патологическим состоянием, где способ предусматривает введение индивидууму антагониста EGFL7 в сочетании с противоангиогенным средством. Такой способ эффективен в лечении злокачественных опухолей или внутриглазных неоваскулярных заболеваний, особенно тех заболеваний или стадий заболеваний, которые плохо поддаются лечению только противоангиогенным средством. Противоангиогенное средство может представлять собой любое средство, способное снижать или ингибировать ангиогенез, в том числе антагонисты VEGF, такие как антитело к VEGF. При лечении опухоли антагонист EGFL7 в отдельности или в сочетании с противоангиогенным средством можно дополнительно сочетать с курсом химиотерапии, включающим одно или несколько химиотерапевтических средств. Также для повышения эффективности можно использовать сочетание с лучевой терапией.

В еще одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ стимуляции образования сосудов у млекопитающего, предусматривающий введение млекопитающему полипептида EGFL7 или агониста полипептида EGFL7, где у указанного млекопитающего стимулируют образование сосудов. Предпочтительно млекопитающее представляет собой человека.

В еще одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ стимуляции ангиогенеза у млекопитающего, предусматривающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида EGFL7 или его агониста. Предпочтительно млекопитающее представляет собой человека, а более предпочтительно - ангиогенез способствует регенерации ткани или заживлению раны.

В еще одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ регуляции (например, ингибирования или стимуляции) образования сосудистой трубки у млекопитающего, предусматривающий введение млекопитающему композиции, которая содержит полипептид EGFL7, его агонист или антагонист.

В еще одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ регуляции (например, индукции или снижения) ангиогенеза посредством регуляции (например, индукции или снижения) миграции эндотелиальных клеток у млекопитающего, где способ предусматривает введение млекопитающему полипептида EGFL7, его агониста или антагониста, где у указанного млекопитающего регулируют миграцию эндотелиальных клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигурах 1a и 1b показано, что EGFL7 консервативен в ходе эволюции позвоночных. a: выравнивание аминокислот для EGFL7 человека, мыши, шпорцевой лягушки и данио рерио. Ген EGFL7 кодирует предполагаемый секретируемый белок ~30 кДа. Аминокислотная последовательность человека (Homo sapiens)гомологична таковой для мыши (Mus musculus), лягушки (Xenopus laevis) и данио рерио (Danio rerio) на 77,45%, 47,14% и 42,96% соответственно. Структурный анализ с использованием множества алгоритмов позволяет предположить, что белки EGFL7 содержат следующие домены (в рамках, начиная с N'-конца): сигнальную последовательность, домен EMI, два EGF-подобных домена в центральном участке, за которыми следует богатая лейцином и валином C-концевая область. b: Последовательность кДНК, аминокислот и интрона EGFL7 данио рерио. Стрелки указывают на два антисмысловых олигонуклеотида, AS_-47 (SEQ ID №6) и AS₁₉₅ (SEQ ID №7), а также на праймеры для ПЦР (SEQ ID №№8 и 9), используемые для выявления удержания интрона.

На фигурах 2a-2n представлен профиль экспрессии EGFL7. Тотальный препарат EGFL7 при гибридизации in situ для эмбрионов мыши (a-b) и данио рерио (j-n). b: поперечный срез a, окрашенный ядерным прочным красным. RBC=эритроциты. j-m: светлая стрелка=мезодерма боковой пластинки, темная стрелка=спинная аорта, темная стрелка-указатель=ISV. Вставка: увеличенное изображение ствола. n: мутант cloche. so=сомит. c: матка беременной мыши, окрашенная на EGFL7 и PECAM. В скобках = децидуальная оболочка. d-i: радиоактивная гибридизация in situ (g-i) и H&E (d-f) для срезов легких человека. Измерительная линейка: 0,45 мм (a, m, n), 0,07 мм (b), 0,38 мм (c-i), 0,25 мм (j, l), 0,15 мм (k), 0,26 мм (вставка m) и 0,04 мм (вставка c).

На фигурах 3a-3d показано, что нокдаун гена EGFL7 вызывает дефект сосудистого тубулогенеза у эмбрионов данио рерио. Эмбрионы данио рерио, в которые вводят инъекцией контрольный (Con_-47 или Con₁₉₅) или EGFL7-антисмысловой (AS_-47 или AS₁₉₅) олигонуклеотиды. a: макроскопическая морфология через 48 часов (Con_-47 или Con₁₉₅) или EGFL7-антисмысловой (AS_-47 или AS₁₉₅) олигонуклеотиды. a: макроскопическая морфология через 48 часов после оплодотворения. Стрелка указывает на перикардиальный отек, стрелка-указатель указывает на кровоизлияние. b-d: экспрессия fli1 через 23 часа после оплодотворения (b) и через 30 часов после оплодотворения (c-d). d: увеличенное изображение сосудов средней части туловища, представленных на с. Белая стрелка-указатель: просвет спинной аорты, черная стрелка-указатель: просвет задней кардинальной вены, черная стрелка: межсегментные сосуды. Измерительная линейка: 0,6 мм (a), 0,23 мм (d) и 0,5 мм (b, c).

На фигурах 4a-4h показано, что количество EC не изменено в KD EGFL7. Трансгенных рыб flk1:GFP, в которых вводили инъекцией контрольный (a, c, e, g) или антисмысловой (b, d, f, h) олигонуклеотиды, анализировали на стадии 22 сомитов (a-d) или проводили анализ через 30 часов после оплодотворения (e-h). a, b: вид с дорзальной стороны. e, f: вид сбоку. c, d, g, h: поперечные срезы, полученные на уровне, который указан белыми линиями на a-b, e-f, контрокрашивали фаллоидином и DAPI. PD: протоки предпочки, So: сомиты, N: нотохорды, белые стрелки: артериальные EC, белые стрелки-указатели=венозные EC, DA=спинная аорта, PCV=задняя кардинальная вена. Измерительная линейка: 0,33 мм (a, b), 0,03 мм (c, d, g, h), 0,47 мм (e, f).

На фигурах 5a-5g показано, что EGFL7 способствует адгезии EC. При окрашивании винкулина в клетках эндотелия сосудов пуповины человека (HUVEC) выявляют образование фокальной адгезии для фибронектина (b), коллагена I типа (c) и EGFL7 (d), но не для BSA (a). Прочность адгезии для EGFL7 меньше, чем для коллагена или фибронектина, поскольку после центрифугирования при 46 g меньшее число клеток остаются прикрепленными к субстрату EGFL7 (e). Зависящее от дозы блокирование антителом к EGFL7 адгезии HUVEC к EGFL7, но не к фибронектину подтверждает специфичность субстрата. Контрольное антитело (к B7x) не оказывает эффекта ни на один из субстратов (f). g: кинетика адгезии HUVEC для различных субстратов. Измерительная линейка: 0,03 мм (a-d).

На фигуре 6 представлено сравнение скоростей роста меланомной опухоли B16 у гомозиготных EGFL7^-/- (n=11) и гетерозиготных EGFL7^+/- (n=11) нокаутных мышей.

На фигурах 7a-7b представлено сравнение частоты возникновения и скорости роста меланомной опухоли B16 у гомозиготных EGFL7^-/- нокаутных мышей (n=10) в сравнении с мышами дикого типа одного с ними помета (n=13). На 7b были исключены не имеющие опухоли мыши.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Определения

Пока не указано иначе, используемые здесь технические и научные термины имеют такое же значение, как обычно понимает специалист в данной области, к которой относится это изобретение. См., например, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). В целях настоящего изобретения ниже определены следующие термины.

В рамках настоящей заявки используемые взаимозаменяемо термины "EGFL7" и "полипептид EGFL7" относятся к природной последовательности EGFL7, вариантам EGFL7 и химерному EGFL7, каждый из которых определен здесь. Не обязательно, EGFL7 не связан с природным гликозилированием. “Природное гликозилирование” относится к углеводным группам, ковалентно присоединенным к EGFL7 в случае его продуцирования в клетках млекопитающих, особенно в клетках, в которых он продуцируется в природе. Соответственно продуцируемый в не принадлежащей человеку клетке EGFL7 человека представляет собой пример EGFL7, который может “быть не связан с природным гликозилированием”. Иногда EGFL7 может быть полностью не гликозилирован, как в случае, когда он продуцируется в прокариотах, например, E. coli.

Нуклеиновая кислота EGFL7 представляет собой РНК или ДНК, которая кодирует полипептид EGFL7, как указано выше, или которая гибридизуется с такой ДНК или РНК и остается устойчиво связанной с ней в строгих условиях гибридизации, а также длина которой составляет приблизительно более 10 нуклеотидов. Строгие условия представляют собой условия, в которых (1) используют низкую ионную силу и высокую температуру для промывки, например, 0,15 M NaCl/0,015 M цитрат натрия/0,1% NaDodSO₄ при 50°C, или (2) используют в ходе гибридизации денатурирующее средство, такое как формамид, например, 50% (об./об.) формамид с 0,1% бычьим сывороточным альбумином/0,1% фиколлом/0,1% поливинилпирролидоном/50 мМ натрий-фосфатным буфером при pH 6,5 с 750 мМ NaCl, 75 мМ цитратом натрия при 42°C.

Нуклеиновая кислота является функционально связанной при приведении нуклеиновой кислоты в функциональную взаимосвязь с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота EGFL7 может быть функционально связана с последовательностью другой нуклеиновой кислоты в векторе таким образом, что она может экспрессироваться в конкретном организме-хозяине. Это можно осуществить хорошо известными в данной области способами. Например, ДНК для препоследовательности или секреторного лидера функционально связывают с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в виде белка-предшественника, участвующего в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связывают с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию последовательности; или связывающий рибосому участок функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, что способствует трансляции. Как правило, “функционально связанный” означает, что связанные последовательности ДНК прилегают друг к другу, а также в случае секреторного лидера прилегают друг к другу и в стадии считывания. Однако энхансеры не обязательно должны прилегать друг к другу. Связывание осуществляют лигированием в подходящие участки рестрикции. Если такие участки не существуют, тогда в соответствии с общепринятой практикой используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.

“Природная последовательность EGFL7” включает полипептид, имеющий ту же аминокислотную последовательность, как и встречающийся в природе EGFL7, независимо от способа его получения или видов. Таким образом, природная последовательность EGFL7 может иметь аминокислотную последовательность встречающегося в природе EGFL7 человека, EGFL7 мыши, EGFL7 шпорцевой лягушки, EGFL7 данио рерио или EGFL7 из любых других видов. Например, на фигуре 1A представлена предпочтительная полноразмерная природная последовательность аминокислотной последовательности EGFL7 человека (SEQ ID №:1). Природная последовательность аминокислотной последовательности EGFL7 мыши представлена на фигуре 1A (SEQ ID №:2). Такую природную последовательность EGFL7 можно выделять из природных источников или можно получать рекомбинантными и/или синтетическими способами. Термин “природная последовательность EGFL7”, в частности, включает встречающиеся в природе препро-, про- и зрелые формы, а также усеченные формы EGFL7, встречающиеся в природе различные формы и встречающиеся в природе аллельные варианты.

“Варианты EGFL7“ представляют собой биологически активные полипептиды EGFL7, имеющие аминокислотную последовательность, которая вследствие вставки, делеции, модификации и/или замены одного или нескольких аминокислотных остатков в природной последовательности отличается от последовательности природной последовательности полипептида EGFL7, такой как представленные на фигуре 1A (SEQ ID №№:1-4) последовательности для EGFL7 человека, мыши, шпорцевой лягушки и данио рерио соответственно. Как правило, варианты EGFL7 имеют последовательность, менее чем на 100% совпадающую с природной последовательностью EGFL7, такой как EGFL7 человека из SEQ ID №:1. Однако обычно биологически активный вариант EGFL7 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 70% совпадающую с аминокислотной последовательностью встречающегося в природе EGFL7, такого как EGFL7 человека из SEQ ID №:1, предпочтительно - по меньшей мере приблизительно на 75%, более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно на 80%, еще более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно на 85%, даже более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно на 90%, при повышении предпочтительности в диапазоне по меньшей мере приблизительно от 95% до по меньшей мере приблизительно 99% совпадения аминокислотной последовательности при минимальном шаге 1%. Варианты EGFL7 включают пептидные фрагменты по меньшей мере из 5 аминокислот, сохраняющие биологическую активность соответствующей природной последовательности полипептида EGFL7. Также варианты EGFL7 включают полипептиды EGFL7, где к N- или C-концу или внутри природной последовательности EGFL7 добавлены один или несколько остатков аминокислот. Также варианты EGFL7 включают полипептиды EGFL7, где некоторое количество аминокислотных остатков удалено и, необязательно, заменено одним или несколькими остатками аминокислот. Также варианты EGFL7 могут быть ковалентно модифицированы, например, посредством замены группой, отличной от встречающейся в природе аминокислоты, или модификацией аминокислотного остатка для получения не встречающейся в природе аминокислоты. Варианты EGFL7 могут содержать связывающий гепарин домен.

“Процент совпадения аминокислотной последовательности” в отношении последовательности EGFL7 определен здесь как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, совпадающих с остатками в последовательности EGFL7, после выравнивания последовательностей и введения промежутков, если необходимо, для достижения максимального совпадения последовательностей, не учитывая при этом какие-либо консервативные замены как составляющую совпадения последовательностей. Никакие из N-концевых, C-концевых или внутренних удлинений, делеций или вставок в последовательности-кандидате EGFL7 не должны рассматриваться как влияющие на совпадение или гомологию последовательностей. Способы и компьютерные программы для выравнивания хорошо известны в данной области. Одна из таких компьютерных программ представляет собой разработанную Genentech “ALIGN-2”, представленную вместе с документацией для пользователя в бюро по охране авторских прав США, Washington, D. C. 20559, где она зарегистрирована под регистрационным номером авторского права США №TXU510087.

Молекула “химерного EGFL7” представляет собой полипептид, содержащий полноразмерный EGFL7 или один или несколько его доменов, слитых или связанных с гетерологичным полипептидом. Как правило, молекула химерного EGFL7 обладает по меньшей мере одним общим со встречающимся в природе EGFL7 биологическим свойством. Пример молекулы химерного EGFL7 представляет собой молекулу с эпитопом, меченным в целях очистки. Другая молекула химерного EGFL7 представляет собой иммуноадгезин EGFL7.

“Выделенный EGFL7” означает EGFL7, который очистили из источника EGFL7 или получили рекомбинантными или синтетическими способами и очистили. Очищенный EGFL7 практически не содержит другие полипептиды или пептиды. В рамках настоящей заявки “практически не содержит” означает примесь белков из другого источника, составляющую приблизительно менее чем 5%, предпочтительно - приблизительно менее чем 2%, более предпочтительно - приблизительно менее чем 1%, еще более предпочтительно - приблизительно менее чем 0,5%, наиболее предпочтительно - приблизительно менее чем 0,1%.

“По существу чистый” белок означает композицию, содержащую по меньшей мере приблизительно 90 мас.% белка от общей массы композиции, предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 95 мас.%, более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 90 мас.%, еще более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 95 мас.% “По сушеству гомогенный” белок означает композицию, содержащую по меньшей мере приблизительно 99 мас.% белка от общей массы композиции.

Термин “антагонист” используют в самом широком смысле, и термин включает любую молекулу, частично или полностью блокирующую, ингибирующую или нейтрализующую биологическую активность природного полипептида EGFL7. В частности, приемлемые молекулы антагонистов включают являющиеся антагонистами антитела или фрагменты антител, фрагменты или варианты аминокислотной последовательности природных полипептидов EGFL7, пептиды, растворимые фрагменты рецептора(ов) EGFL7, небольшие органические молекулы и т.д. Способы выявления агонистов или антагонистов полипептида EGFL7 могут предусматривать контактирование полипептида EGFL7 с молекулой-кандидатом агониста или антагониста и измерение поддающегося регистрации изменения в одной или нескольких биологических активностях, обычно связанных с полипептидом EGFL7.

В целях настоящей заявки “активный” или “активность” относится к форме(ам), сохраняющей биологическую и/или иммунологическую активность природного или встречающегося в природе EGFL7, где “биологическая” активность относится к обусловленной природным или встречающимся в природе EGFL7 биологической функции (ингибирующей или стимулирующей), отличной от способности индуцировать продукцию антитела к антигенному эпитопу, которым обладает природный или встречающийся в природе EGFL7, а “иммунологическая” активность относится к способности индуцировать продукцию антитела к антигенному эпитопу, которым обладает природный или встречающийся в природе EGFL7.

Таким образом, “биологически активный” при использовании в сочетании с "EGFL7" или "выделенным EGFL7" или агонистом EGFL7 означает полипептид EGFL7, проявляющий или обладающий эффекторной функцией природной последовательности EGFL7. Главная эффекторная функция EGFL7 представляет собой его способность стимулировать образование сосудов. Даже более предпочтительно биологическая активность представляет собой способность регулировать тубулогенез.

“Рецептор EGFL7” представляет собой молекулу, с которой связывается EGFL7 и которая опосредует биологические свойства EGFL7.

Термин “антитело” используют здесь в самом широком смысле, и термин, в частности, относится к принадлежащим человеку, не принадлежащим человеку (например, мышиным) и гуманизированным моноклональным антителам (в том числе полноразмерным моноклональным антителам), поликлональным антителам, полиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам) и фрагментам антител при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность.

“Антитела” (Ab) и “иммуноглобулины” (Ig) представляют собой гликопротеины, обладающие одинаковыми структурными характеристиками. Тогда как антитела проявляют специфичность связывания с конкретным антигеном, иммуноглобулины включают антитела и другие подобные антителам молекулы, у которых отсутствует антигенная специфичность. Полипептиды последнего типа, например, продуцируются на низких уровнях лимфатической системой и на повышенных уровнях миеломами.

Как правило, “природные антитела” и “природные иммуноглобулины” представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух одинаковых легких (L) цепей и двух одинаковых тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как между тяжелыми цепями различных изотипов иммуноглобулинов количество дисульфидных связей различается. Также каждая тяжелая и легкая цепи имеет равномерно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь на одном конце имеет вариабельный домен (V_H) с последующим некоторым количеством константных доменов. Каждая легкая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (V_L) и константный домен на другом ее конце; константный домен легкой цепи ориентирован к первому константному домену тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи ориентирован к вариабельному домену тяжелой цепи. Предполагают, что поверхность раздела между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей формируют специфические аминокислотные остатки.

Термин “вариабельный” относится к факту, что среди антител определенные участки вариабельных доменов широко различаются в последовательности и используются в связывании и специфичности каждого конкретного антитела для его конкретного антигена. Однако на протяжении вариабельных доменов антител вариабельность распределена неравномерно. Она сосредоточена в трех участках, называемых гипервариабельными участками, в вариабельных доменах как легкой так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные участки вариабельных доменов называют каркасной областью (FR). Каждый их вариабельных доменов природных тяжелой и легкой цепей содержит четыре FR (FR1, FR2, FR3 и FR4 соответственно), в основном принимающих β-складчатую конфигурацию, связанных с тремя гипервариабельными участками, которые формируют петли, связывающие, а в некоторых случаях образующие часть β-складчатой структуры. Гипервариабельные участки в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости посредством FR и вместе с гипервариабельными участками из другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), pages 647-669). Константные домены непосредственно не вовлечены в связывание антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в зависящей от антитела клеточной токсичности.

В рамках настоящей заявки термин “гипервариабельный участок” относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из “гипервариабельного участка” или “CDR” (т.е. остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)), а также аминокислотные остатки из “гипервариабельной петли” (т.е. остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). “Каркасные” или “FR” остатки представляют собой те остатки вариабельного домена, которые отличны от остатков гипервариабельного участка, как определено здесь.

Расщепление антител папаином приводит к двум одинаковым антигенсвязывающим фрагментам, называемым фрагментами “Fab”, каждый с отдельным антигенсвязывающим участком, и к остаточному фрагменту “Fc”, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином приводит к фрагменту F(ab')₂, который имеет два антигенсвязывающих участка и все еще способен к перекрестному связыванию антигена.

“Fv” представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий участок. Этот участок состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, находящихся в прочной нековалентной связи. Именно в этой конфигурации три гипервариабельных участка каждого вариабельного домена взаимодействуют для формирования антигенсвязывающего участка на поверхности димера V_H-V_L. Шесть гипервариабельных участков совместно придают антителу специфичность в связывании антигена. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три специфичных для антигена гипервариабельных участка), обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем полный связывающий участок.

Фрагмент Fab также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab добавлением нескольких остатков к карбоксильному концу домена CH1 тяжелой цепи, в том числе одного или нескольких цистеинов из шарнирного участка антитела. В рамках настоящей заявки Fab'-SH представляет собой обозначение для Fab', в котором цистеиновый остаток(ки) константных доменов несет свободную тиольную группу. Фрагменты F(ab')₂ первоначально получали в виде пар фрагментов Fab', имеющих между собой образующие шарнир цистеины. Также известны другие варианты химического связывания фрагментов антитела.

“Легкие цепи” антител (иммуноглобулинов) из любого вида позвоночных можно отнести к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), основываясь на аминокислотных последовательностях их константных доменов.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей иммуноглобулины можно относить к различным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называют α, δ, ε, γ и μ соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

“Фрагменты антитела” содержат участок полноразмерного антитела, как правило, его антигенсвязывающий домен или вариабельный домен. Примеры фрагментов антитела включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv; диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечного антитела; а также образованные из фрагментов антитела полиспецифичные антитела.

В рамках настоящей заявки термин “моноклональное антитело” относится к антителу, получаемому из популяции практически гомогенных антител, т.е. составляющие популяцию отдельные антитела одинаковы, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны, являясь направленными к отдельному антигенному участку. Кроме того, в отличие от традиционных (поликлональных) препаратов антител, как правило, включающих различные антитела, направленные к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело направлено к отдельной детерминанте на антигене. Определение “моноклональный” указывает на природу антитела как получаемого из практически гомогенной популяции антител и не должно рассматриваться как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, подлежащие использованию по настоящему изобретению, можно получать способом гибридомы, впервые описанным Kohler et al., Nature 256:495 (1975), или можно получать способами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США №4816567). Также “моноклональные антитела” можно выделять из фаговых библиотек антител с использованием способов, например, описанных в Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991).

В рамках настоящей заявки моноклональные антитела, в частности, включают “химерные” антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи совпадает с или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах, получаемых из конкретных видов или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть цепи(ей) совпадает с или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах, получаемых из других видов или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также включают фрагменты таких антител при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (патент США №4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).

“Гуманизированные” формы не принадлежащих человеку (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из не принадлежащего человеку иммуноглобулина. В основном гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки гипервариабельных участков реципиента заменены остатками гипервариабельных участков из не относящихся к человеку видов (антитело-донор), таких как мышь, крыса, кролик или не являющийся человеком примат, с желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменены соответствующими не принадлежащими человеку остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не встречающиеся в антителе-реципиенте или антителе-доноре. Эти модификации осуществляют для дополнительного улучшения рабочих характеристик антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного, а, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные участки соответствуют таковым из не принадлежащего человеку иммуноглобулина, а все или практически все FR представляют собой FR из последовательности иммуноглобулина человека. Также гуманизированное антитело необязательно содержит по меньшей мере участок константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека. Для дополнительных подробностей см. Jones et al. Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al. Nature 332: 323-329 (1988); и Presta Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

“Одноцепочечные Fv” или “sFv” фрагменты антитела содержат домены антитела V_H и V_L, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, позволяющий sFv формировать желаемую структуру для связывания антигена. Для обзора sFv см. Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Термин “диатела” (“димеры”) относится к малым фрагментам антитела с двумя антигенсвязывающими участками, где фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в одной и той же полипептидной цепи (V_H - V_L). При использовании линкера, слишком короткого для предоставления возможности образования пар между двумя доменами в одной и той же цепи, домены вынуждены образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи и формировать антигенсвязывающие участки. Более подробно димеры описаны, например, в EP 404097; WO93/11161; и Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

В рамках настоящей заявки выражение “линейные антитела” относится к антителам, описанным в Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995). Вкратце, эти антитела содержат пару последовательно соединенных участков Fd (V_H-C_H1-V_H-C_H1), которые формируют пару антигенсвязывающих участков. Линейные антитела могут быть биспецифичны или моноспецифичны.

Термин “эпитоп” используют для обозначения связывающих участков для антител (моноклональных или поликлональных) на белковых антигенах.

Под “антителом-агонистом” подразумевают антитело, представляющее собой агонист EGFL7 и, таким образом, обладающее одним или несколькими биологическими свойствами природной последовательности EGFL7.

Термин “иммуноадгезин EGFL7” используют взаимозаменяемо с термином “химера EGFL7-иммуноглобулин”, и он относится к химерной молекуле, в которой по меньшей мере участок молекулы EGFL7 (природной или варианта) объединен с последовательностью иммуноглобулина. Предпочтительно, но необязательно последовательность иммуноглобулина представляет собой константный домен иммуноглобулина. Иммуноадгезины могут обладать многими ценными химическими и биологическими свойствами антител человека. Поскольку иммуноадгезины можно конструировать из последовательности белка человека с желаемой специфичностью, связанной с соответствующей последовательностью шарнирного участка и константного домена (Fc) иммуноглобулина человека, то представляющую интерес специфичность связывания можно достигать с использованием только относящихся к человеку компонентов. Такие иммуноадгезины минимально иммуногенны для пациента и безопасны для длительного или многократного применения.

Примеры описанных для терапевтического применения гомополимерных иммуноадгезинов включают иммуноадгезин CD4-IgG для блокирования связывания ВИЧ с CD4 поверхности клеток. Данные, полученные со стадии I клинических испытаний, в которых беременным женщинам непосредственно перед родами вводили CD4-IgG, позволяют предположить, что этот иммуноадгезин может быть эффективен в профилактике переноса ВИЧ от матери к плоду (Ashkenazi et al., Intern. Rev. Immunol. 10: 219-227 (1993)). Также был разработан иммуноадгезин, связывающий фактор некроза опухолей (TNF). TNF представляет собой провоспалительный цитокин, который, как было показано, является главным медиатором септического шока. На основе модели септического шока на мыши было показано, что иммуноадгезин рецептора TNF перспективен в качестве кандидата для клинического применения в лечении септического шока (Ashkenazi, A. et al. PNAS USA 88: 10535-10539 (1991)). ENBREL^® (этанерцепт), иммуноадгезин, который содержит последовательность рецептора TNF, слитую с участком Fc IgG, был утвержден 2 ноября 1998 управлением США по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами (FDA) для лечения ревматоидного артрита. Новое более широкое применение ENBREL^® в лечении ревматоидного артрита было утверждено FDA 6 июня 2000. Для последней информации о блокаторах TNF, в том числе ENBREL^®, см. Lovell et al., N. Engl. J. Med. 342: 763-169 (2000), и сопровождающую редакционную статью на стр. 810-811; а также Weinblatt et al., N. Engl. J. Med. 340: 253-259 (1999); по которым сделан обзор в Maini and Taylor, Annu. Rev. Med. 51: 207-229 (2000).

Если два участка структуры иммуноадгезина обладают разными специфичностями, то иммуноадгезин называют “биспецифичным иммуноадгезином” по аналогии с биспецифичными антителами. В Dietsch et al., J. Immunol. Methods 162:123 (1993) описан такой биспецифичный иммуноадгезин, объединяющий внеклеточные домены молекул адгезии, E-селектина и P-селектина, где каждый из этих селектинов в природе экспрессируется в различных типах клеток. Исследования связывания указывают на то, что сформированный таким образом биспецифичный слитый белок иммуноглобулина обладал повышенной способностью к связыванию с миелоидной линией клеток в сравнении с моноспецифичным иммуноадгезином, из которого он был получен.

Термин “гетероадгезин” используют взаимозаменяемо с выражением “химерный гетерополимерный адгезин”, и он относится к комплексу химерных молекул (аминокислотных последовательностей), в котором каждая химерная молекула сочетает биологически активный участок, такой как внеклеточный домен каждого из мономеров гетерополимерного рецептора, с доменом полимеризации. “Домен полимеризации” способствует устойчивому взаимодействию химерных молекул в пределах гетерополимерного комплекса. Домены полимеризации могут взаимодействовать посредством последовательности иммуноглобулина, лейциновой застежки, гидрофобного участка, гидрофильного участка или свободной тиольной группы, формирующей внутримолекулярную дисульфидную связь между химерными молекулами химерного гетерополимера. Домен полимеризации может содержать константную область иммуноглобулина. Кроме того, область полимеризации можно конструировать таким образом, что стерические взаимодействия не только способствуют устойчивому взаимодействию, но и дополнительно способствуют образованию большего количества гетеродимеров, чем гомодимеров, из смеси мономеров. “Выступы” конструируют посредством замены небольших боковых аминокислотных цепей с поверхности первого полипептида на более крупные боковые цепи (например, тирозин или триптофан). Компенсирующие “полости” аналогичного или сходного размера с выступами, необязательно, получают на поверхности второго полипептида посредством замены крупных боковых аминокислотных цепей на более мелкие цепи (например, аланин или треонин). Предпочтительно, но необязательно последовательность иммуноглобулина представляет собой константный домен иммуноглобулина. Молекулу иммуноглобулина в химерах по настоящему изобретению можно получать из подтипов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, IgA, IgE, IgD или IgM, а предпочтительно IgG1 или IgG3.

В рамках настоящей заявки “лечение” представляет собой подход для достижения благоприятных или желаемых клинических результатов. В целях этого изобретения благоприятные или желаемые клинические результаты включают, но ими не ограничиваются, ослабление симптомов, снижение степени распространенности заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) состояния при заболевании, задержку или замедление развития заболевания, улучшение или временное облегчение состояния при заболевании, а также ремиссию (частичную или полную), поддающиеся выявлению или не поддающиеся выявлению. Также “лечение” может означать более продолжительное выживание в сравнении с ожидаемым выживанием при отсутствии лечения. “Лечение” представляет собой вмешательство, выполняемое с целью предотвращения развития или изменения патологии нарушения. Соответственно “лечение” относится к терапевтическому лечению и к профилактическим или предупредительным мерам. Индивидуумы, которым необходимо лечение, представляют собой уже имеющих заболевание индивидуумов, а также индивидуумов, у которых следует предотвратить заболевание. Конкретно, лечение может непосредственно предотвращать, замедлять или иным способом снижать патологию дегенерации или повреждения клеток, такую как патология опухолевых клеток при лечении злокачественой опухоли, или может придавать клеткам восприимчивость к лечению другими терапевтическими средствами.

“Длительное” введение относится к введению средства(в) непрерывным способом в отличие от экстренного способа таким образом, чтобы обеспечивать первичный терапевтический эффект (активность) в течение продолжительного периода времени. “Дробное” введение представляет собой лечение, которое проводят не последовательно, без перерыва, а которое имеет циклический характер.

В целях лечения “млекопитающее” относится к любому животному, которое относят к млекопитающему, в том числе человеку, другим высшим приматам, домашним и сельскохозяйственным животным, а также животным в зоопарке, животным для спорта или прирученным животным, таким как собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы, свиньи, козы, кролики и т.д. Предпочтительно млекопитающее представляет собой человека.

В рамках настоящей заявки “опухоль” относится к любому злокачественному или доброкачественному неопластическому росту и пролиферации клеток, а также к любым предраковым и раковым клеткам и тканям.

Термины “злокачественная опухоль” и “раковый” относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры злокачественной опухоли включают, но ими не ограничиваются, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкемию. Более конкретные примеры таких видов злокачественной опухоли включают плоскоклеточный рак, рак легких (в том числе мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких и плоскоклеточную карциному легких), рак брюшной полости, гепатоцеллюлярный рак, гастральный рак или рак желудка (в том числе рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой и ободочной кишки, карциному эндометрия или матки, карциному слюнных желез, рак почек или ренальный рак, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, гепатокарциному и различные типы рака головы и шеи, а также B-клеточную лимфому (в том числе низкой степени злокачественности/фолликулярную неходжкинскую лимфому (NHL); NHL малых лимфоцитов (SL); промежуточной степени злокачественности/фолликулярную NHL; диффузную NHL промежуточной степени злокачественности; иммунобластную NHL высокой степени злокачественности; лимфобластную NHL высокой степени злокачественности; NHL мелких клеток с нерасщепленными ядрами высокой степени злокачественности; NHL с массивным поражением; лимфому из клеток мантийной зоны; связанную со СПИД лимфому; а также макроглобулинемию Вальденстрема); хронический лимфолейкоз (CLL); острый лимфобластный лейкоз (ALL); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз; и посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (PTLD), а также связанную с факоматозами патологическую пролиферацию сосудов, отек (такой как связанный с опухолями головного мозга) и синдром Мейгса.

“Химиотерапевтическое средство” представляет собой эффективное в лечении злокачественной опухоли химическое соединение. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид CYTOXAN^®; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, в том числе альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (в том числе синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (в том числе его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (особенно криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (в том числе синтетические аналоги, KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид оксида мехлоретамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихимицин, особенно калихимицин-гамма1I и калихимицин-омегаI1 (см., например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994)); динемицин, в том числе динемицин A; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные ему хромофоры хромопротеинового энедиинового антибиотика), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицин, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин ADRIAMYCIN^® (в том числе морфолинодоксорубицин, цианморфолинодоксорубицин, 2-пирролиндоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин,6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; противоадреналовые средства, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглато; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатрексат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK^® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-C"); циклофосфамид; тиотепу; таксоиды, например паклитаксел TAXOL^® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), не содержащий кремофор, сконструированный с альбумином препарат наночастиц паклитаксела ABRAXANE^TM (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) и доксетаксел TAXOTERE^® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; гемцитабин GEMZAR^®; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; координационные комплексы платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин NAVELBINE^®; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселоду; ибандронат; иринотекан (например, CPT-11); ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанного выше.

Также в это определение включены противогормональные средства, которые действуют, регулируя или ингибируя воздействие гормона на опухоли, где средства представляют собой такие, как противоэстрогенные средства и избирательные регуляторы рецептора эстрогена (SERM), в том числе, например, тамоксифен (включая тамоксифен NOLVADEX^®), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен FARESTON; ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, регулирующую продукцию эстрогена в надпочечниках, где ингибиторы ароматазы представляют собой такие, как 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, ацетат мегестрола MEGASE^®, экземестан AROMASIN^®, форместан, фадрозол, ворозол RIVISOR^®, летрозол FEMARA^® и анастрозол ARIMIDEX^®; а также противоандрогенные средства, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид и гозерелин; а также троксацитабин (аналог 1,3-диоксолана нуклеозида цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, особенно олигонуклеотиды, ингибирующие экспрессию генов в путях передачи сигнала, которые вовлечены в патологическую пролиферацию клеток, где гены представляют собой такие, как, например, PKC-альфа, Ralf и H-Ras; рибозимы, такие как ингибитор экпсрессии VEGF (например, рибозим ANGIOZYME^®) и ингибитор экпсрессии HER2; вакцины, такие как вакцины для генотерапии, например, вакцина ALLOVECTIN^®, вакцина LEUVECTIN^® и вакцина VAXID^®; rIL-2 PROLEUKIN^®; ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN^®; rmRH ABARELIX^®; а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанного выше.

“Внутриглазное неоваскулярное заболевание” представляет собой заболевание, характеризующееся образованием новых сосудов в глазе. Примеры внутриглазных неоваскулярных заболеваний включают, но ими не ограничиваются, пролиферативные ретинопатии, хориоидальное образование новых сосудов (CNV), связанную с возрастом дегенерацию желтого пятна (AMD), диабетическую и другие связанные с ишемией ретинопатии, диабетический отек желтого пятна, патологическую миопию, болезнь Гиппель-Линдау, гистоплазмоз глаза, окклюзию центральной вены сетчатки (CRVO), образование новых сосудов в роговице, образование новых сосудов в сетчатке и т.д.

“Патология” заболевания включает все явления, нарушающие хорошее самочувствие пациента. В случае злокачественной опухоли это понятие включает, но ими не ограничивается, патологический или неконтролируемый рост клеток, метастазирование, препятствие нормальному функционированию соседних клеток, высвобождение цитокинов или других секреторных продуктов на патологических уровнях, подавление или обострение воспалительной или иммунологической реакции и т.д.

Введение “в сочетании с” одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами включает одновременное (совместное) и последовательное введение в любом порядке.

В рамках настоящей заявки “носители” включают фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы, не токсичные для клетки или млекопитающего при воздействии на них в используемых дозах и концентрациях. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный pH-буферный раствор. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и относящиеся к другим органическим кислотам; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту; полипептид с низкой молекулярной массой (приблизительно менее чем 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие средства, такие как EDTA; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN^TM, полиэтиленгликоль (PEG) и PLURONICS^TM.

“Липосома” представляет собой небольшую везикулу, составленную из различных типов липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, которая эффективна для доставки млекопитающему лекарственного средства (такого как полипептид EGFL7 или антитело к нему). Как правило, компоненты липосомы организованы в двухслойную структуру, сходную с расположением липидов в биологических мембранах.

В рамках настоящей заявки “небольшая молекула” имеет молекулярную массу приблизительно менее 500 дальтон.

В рамках настоящей заявки термины “фактор роста эндотелия сосудов”, “VEGF”, “полипептид VEGF” и “белок VEGF” включают природную последовательность VEGF и варианты VEGF (которые дополнительно определены здесь). Полипептид VEGF можно выделять из множества источников, например из типов тканей человека или из другого источника, или получать рекомбинантными и/или синтетическими способами.

“Природная последовательность VEGF” содержит полипептид с такой же аминокислотной последовательностью, как получаемый из природного источника VEGF. Такие природные последовательности VEGF можно выделять из природного источника или получать рекомбинантными и/или синтетическими способами. В частности, термин “природная последовательность VEGF” включает встречающиеся в природе усеченные или секретируемые формы (например, последовательность внеклеточного домена), встречающиеся в природе различные формы (например, подвергшиеся альтернативному сплайсингу формы) и встречающиеся в природе аллельные варианты VEGF. В одном из вариантов осуществления изобретения природная последовательность VEGF представляет собой одну из пяти известных изоформ, состоящих из 121, 145, 165, 189 и 206 аминокислотных остатков соответственно, как описано, например, в патентах США №№5332671 и 5240848; в публикации PCT № WO 98/10071; Leung et al., Science 246: 1306-1309 (1989); и Keck et al., Science 246: 1309-1312 (1989).

“Вариант полипептида VEGF” означает активный полипептид VEGF, как определено ниже, имеющий аминокислотную последовательность, которая совпадает с аминокислотной последовательностью природной последовательности VEGF по меньшей мере приблизительно на 80%, предпочтительно - по меньшей мере приблизительно на 85%, более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно на 90%, еще более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно на 95%, наиболее предпочтительно - по меньшей мере приблизительно на 98%. Такие варианты полипептидов VEGF включают, например, полипептиды VEGF, где к N- и/или C-концу, а также в пределах одного или нескольких внутренних доменов природной последовательности добавлены или удалены один или несколько аминокислотных остатков.

Совпадение последовательности (аминокислот или нуклеиновой кислоты) для VEGF определяют с использованием того же способа, который, в частности, описан в отношении EGFL7. Сходным образом, определения, которые представлены для агониста и антагонистов EGFL7, включающих, но ими не ограничивающихся, антитела, применимы для агонистов и антагонистов VEGF.

Способы осуществления изобретения

EGFL7

Ген EGFL7 кодирует секретируемый связанный с ECM белок ~30 кДа, являющийся эволюционно консервативным. Аминокислотная последовательность для человека (Homo sapiens) (SEQ ID №:1) гомологична таковой для мыши (Mus musculus; SEQ ID №:2), лягушки (Xenopus laevis; SEQ ID №:3) и данио рерио (Danio rerio; SEQ ID №:4) на 77%, 47% и 43% соответственно. Белок EGFL7 содержит сигнальную последовательность, домен EMI на N-конце (домен EMI присутствует во множестве связанных с внеклеточным матриксом белков, вовлеченных в регуляцию адгезии клеток) с последующими двумя EGF-подобными доменами и богатой лейцином и валином C-концевой областью.

По настоящему изобретению используют молекулы нуклеиновых кислот и полипептидов. Аминокислотные последовательности EGFL7 для человека, мыши, шпорцевой лягушки и данио рерио представлены как SEQ ID №№:1-4 соответственно (см. фигуру 1A). кДНК данио рерио (с неполной геномной последовательностью интрона) представлена как SEQ ID №:5 (см. фигуру 1B). Используемые по настоящему изобретению полинуклеотиды можно получать с использованием хорошо известных специалистам в данной области традиционных способов, таких как, например, отбор гибридизацией и способ ПЦР.

Уникальные идентификаторы для EGFL7 представляют собой: NM_016215 (homo sapiens EGFL7/VE-статин), NM_178444 (mus musculus EGFL7), AF184973 (mus musculus подобный Notch4), P_AAZ37135 (mus musculus TANGO125), BC044267 (xenopus laevis NEU1), AY542170 (danio rerio EGFL7). Уникальные идентификаторы для Egfl8 представляют собой: NM_030652 (Homo Sapiens), NM_152922 (mus musculus).

Получение и выявление регуляторов активности EGFL7

Также настоящее изобретение относится к способам отбора соединений для выявления соединений, воспроизводящих или усиливающих одну или несколько биологических активностей EGFL7 (агонистов); или ингибирующих или снижающих эффект EGFL7 (антагонистов). Агонисты и антагонисты EGFL7 также называют регуляторами EGFL7. Анализы для отбора лекарственных средств-кандидатов, являющихся антагонистами, разработаны для выявления соединений, которые связывают или образуют комплекс с полипептидами EGFL7 или иным способом препятствуют взаимодействию EGFL7 с другими белками клетки.

Отбор небольших молекул

Небольшие молекулы могут обладать способностью действовать как агонисты или антагонисты EGFL7 и, таким образом, быть терапевтически эффективными. Такие небольшие молекулы могут включать встречающиеся в природе небольшие молекулы, синтетические органические или неорганические соединения и пептиды. Однако небольшие молекулы по настоящему изобретению не ограничиваются этими формами. Коммерчески доступны подробные библиотеки небольших молекул, а в данной области хорошо известно множество анализов для отбора этих молекул на предмет желаемой активности.

Предпочтительно являющиеся кандидатами-агонистами или антагонистами EGFL7 небольшие молекулы сначала выявляют в анализе, позволяющем быстрое выявление возможных регуляторов активности EGFL7. Пример такого анализа представляет собой анализ белок-белкового связывания, где измеряют способность молекулы-кандидата связываться с рецептором EGFL7. В другом примере измеряют способность молекул-кандидатов препятствовать связыванию EGFL7 с рецептором EGFL7.

В предпочтительном варианте осуществления небольшие молекулы агонистов EGFL7 выявляют посредством их способности воспроизводить одну или несколько биологических активностей EGFL7. Например, небольшие молекулы отбирают на предмет их способности индуцировать пролиферацию эндотелиальных клеток, способствовать выживанию эндотелиальных клеток, как описано в указанных ниже примерах 2 и 3, или индуцировать ангиогенез, как описано в указанном ниже примере 4.

В другом варианте осуществления небольшие молекулы антагонистов EGFL7 выявляют посредством их способности ингибировать одну или несколько биологических активностей EGFL7. Таким образом, соединение-кандидат контактирует с EGFL7. Затем оценивают биологическую активность EGFL7. В одном из вариантов осуществления определяют способность EGFL7 стимулировать пролиферацию эндотелиальных клеток, например, как описано в примере 2. В другом варианте осуществления определяют способность EGFL7 способствовать выживанию эндотелиальных клеток, например, как описано в примере 3. Соединение определяют как являющееся антагонистом в случае ингибирования биологической активности EGFL7.

Соединения, определенные в качестве агонистов или антагонистов EGFL7, можно использовать в способах по настоящему изобретению. Например, антагонисты EGFL7 можно использовать для лечения злокачественной опухоли.

Анализы для отбора взаимодействующих с EGFL7 белков

Для выявления взаимодействующих с EGFL7 белков или других молекул, включающих, но ими не ограничивающихся, трансмембранные или внутриклеточные белки, можно использовать любой приемлемый для регистрации белок-белковых взаимодействий способ. В число общепринятых способов, которые можно использовать для выявления взаимодействующих с EGFL7 белков, входит совместная иммунопреципитация, перекрестное связывание и совместная очистка посредством градиентов или хроматографических колонок. В таких анализах компонент EGFL7 может представлять собой полноразмерный белок, его растворимое производное, пептид, который соответствует представляющему интерес домену, или содержащий определенный участок EGFL7 слитый белок.

Можно использовать способы, приводящие к одновременному выявлению генов, которые кодируют белки, способные взаимодействовать с EGFL7. Эти способы включают, например, исследование зондами библиотек экспрессии способом, сходным с хорошо известным способом исследования библиотек 8gt11 антителами в качестве зондов с использованием меченного EGFL7 или его варианта.

Способ для выявления взаимодействий белков in vivo, двухгибридная система, подробно описан только для иллюстрации, а не в целях ограничения. Один из вариантов этой системы был описан (Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9578-9582 (1991)) и коммерчески доступен в Clontech (Palo Alto, CA).

Вкратце, при использовании такой системы конструируют плазмиды, кодирующие два гибридных белка: одна плазмида состоит из нуклеотидов, кодирующих ДНК-связывающий домен белка-активатора транскрипции, которые слиты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей EGFL7 или полипептид, пептид или слитый белок на их основе, а другая плазмида состоит из нуклеотидов, которые кодируют домен активации белка-активатора транскрипции, слитых с кДНК, которая кодирует неизвестный белок, рекомбинированный в эту плазмиду в качестве части библиотеки кДНК. Слитую плазмиду для ДНК-связывающего домена и библиотеку кДНК трансформировали в штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, содержащий ген-репортер (например, HBS или lacZ), чья регуляторная область включает участок связывания активатора транскрипции. Каждый из гибридных белков в отдельности не способен активировать транскрипцию гена-репортера: гибридный ДНК-связывающий домен не способен, поскольку он не обеспечивает функцию активации, а гибридный домен активации не способен, поскольку он не может определить месторасположение участков связывания активатора. Взаимодействие двух гибридных белков восстанавливает функциональный белок-активатор и приводит к экспрессии гена-репортера, выявляемой посредством анализа на предмет продукта гена-репортера.

Двухгибридную систему или связанный с ней способ можно использовать для отбора библиотек доменов активации на предмет белков, взаимодействующих с генным продуктом-“наживкой”. В целях примера и не подразумевая ограничений, в качестве генного продукта-наживки можно использовать EGFL7. Общую геномную последовательность или последовательности кДНК сливают с ДНК, кодирующей домен активации. Эту библиотеку и плазмиду, которая кодирует гибрид генного продукта-наживки EGFL7, слитого с ДНК-связывающим доменом, совместно трансформируют в штамм дрожжей с репортером, а получаемые трансформанты отбирают на предмет трансформантов, которые экспрессируют ген-репортер. В целях примера и не подразумевая ограничений, последовательность гена наживки EGFL7, например генов открытой рамки считывания, можно клонировать в вектор таким образом, чтобы трансляционно слить с ДНК, кодирующей ДНК-связывающий домен белка GAL4. Эти колонии очищают и выделяют ответственные за экспрессию гена-репортера плазмиды библиотеки. Затем для выявления белков, кодирующихся плазмидами библиотеки, используют секвенирование ДНК.

Библиотеку кДНК линии клеток, из которой подлежат выявлению белки, взаимодействующие с продуктом-наживкой гена EGFL7, можно получать с использованием обычно применяемых в данной области способов. Например, в соответствии с описанной здесь конкретной системой фрагменты кДНК можно вставлять в вектор таким образом, чтобы трансляционно слить их с доменом активации транскрипции GAL4. Эту библиотеку можно совместно трансформировать вместе со слитой плазмидой ген наживки EGFL7-GAL4 в штамм дрожжей, который содержит ген lacZ, активируемый промотором, содержащим последовательность активации GAL4. Кодируемый кДНК белок, слитый с доменом активации транскрипции GAL4, который взаимодействует с продуктом-наживкой гена EGFL7, восстанавливает активный белок GAL4 и, таким образом, активирует экспрессию. Активирующие экспрессию колонии можно выявлять общепринятыми в данной области способами. Затем из этих штаммов можно очищать кДНК и использовать для получения и выделения белка, взаимодействующего с геном наживки EGFL7, применяя обычно используемые в данной области способы.

Анализы для соединений, регулирующих экспрессию или активность EGFL7

Разработаны следующие анализы для выявления соединений, взаимодействующих с (например, связывающихся с) EGFL7, соединений, препятствующих взаимодействию EGFL7 с участвующими в его связывании веществами, родственными веществами или рецептором, а также для соединений, регулирующих активность экспрессии гена EGFL7 (т.е. регулирующих уровень экспрессии гена EGFL7) или регулирующих уровни EGFL7 в организме. Кроме того, можно использовать анализы, выявляющие соединения, которые связываются с регуляторными последовательностями гена EGFL7 (например, последовательностями промоторов) и, следовательно, могут регулировать экпсрессию гена EGFL7. См., например, Platt, K.A., J. Biol. Chem. 269: 28558-28562 (1994), которая приведена здесь полностью в качестве ссылки.

Соединения, которые можно отбирать по изобретению, включают, но ими не ограничиваются, пептиды, антитела и их фрагменты, а также другие органические соединения (например, пептидомиметики), связывающиеся с EGFL7 или рецептором EGFL7 и воспроизводящие вызываемую природным лигандом активность (т.е. агонисты) или ингибирующие вызываемую природным лигандом активность (т.е. антагонисты).

Такие соединения могут включать, но ими не ограничиваются, пептиды, такие как, например, растворимые пептиды, включающие, но ими не ограничивающиеся, члены выбранных случайным образом библиотек пептидов; (см., например, Lam, K. S. et al., Nature 354:82-84 (1991); Houghten, R. et al., Nature 354:84-86 (1991)), а также комбинаторные, получаемые химическими способами молекулярные библиотеки, составленные из аминокислот D- и/или L-конфигурации, фосфопептидов (включающих, но ими не ограничивающихся, члены выбранных случайным образом или частично вырожденных направленных библиотек фосфопептидов; см., например, Songyang, Z. et al., Cell 72: 767-778 (1993)), антитела (включая, но ими не ограничиваясь, поликлональные, моноклональные, гуманизированные, антиидиотипические, химерные или одноцепочечные антитела, а также фрагменты библиотеки экспрессии FAb, F(abN)₂ и FAb, и их связывающие эпитоп фрагменты), а также небольшие органические или неорганические молекулы.

Другие соединения, которые можно отбирать по изобретению, включают, но ими не ограничиваются, небольшие органические молекулы, способные проникать в соответствующую клетку (например, эндотелиальную клетку) и влиять на экспрессию гена EGFL7 или какого-либо другого гена, вовлеченного в опосредуемый EGFL7 каскад (например, посредством взаимодействия с регуляторной областью или факторами транскрипции, вовлеченными в экспрессию гена); или такие соединения, которые влияют или замещают активность EGFL7 или активность какого-либо другого внутриклеточного фактора, вовлеченного в пути передачи сигнала, пути катаболизма или метаболизма EGFL7.

Способы компьютерного моделирования и поиска позволяют выявлять соединения или улучшать уже выявленные соединения, которые могут регулировать экспрессию или активность EGFL7. После выявления такого соединения или композиции определяют активные участки или области. Как правило, такие активные участки могут представлять собой связывающие лиганд участки. Активный участок можно выявлять с использованием известных в данной области способов, в том числе, например, из аминокислотных последовательностей пептидов, из нуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот или из исследования комплексов соответствующего соединения или композиции с их природным лигандом. В последнем случае можно использовать химические способы или способы кристаллографии с применением рентгеновского излучения для выявления активного участка посредством определения местонахождения комплексного лиганда на факторе.

Затем определяют трехмерную геометрическую структуру активного участка. Это можно выполнять известными способами, в том числе кристаллографией с применением рентгеновского излучения, которой можно определять полную молекулярную структуру. С другой стороны, для определения некоторых внутримолекулярных расстояний можно использовать твердо- или жидкофазный ЯМР. Для получения частичных или полных геометрических структур можно использовать любой другой экспериментальный способ определения структуры. Геометрические структуры можно оценивать с использованием комплексного лиганда, природного или искусственного, который может повышать точность определения структуры активного участка.

При неполном или недостаточно точном определении структуры можно использовать способы цифрового моделирования на основе компьютера для завершения структуры или повышения ее точности. Можно использовать любой общепринятый способ моделирования, в том числе параметризованные модели, специфичные для конкретных биополимеров, таких как белки или нуклеиновые кислоты, модели молекулярной динамики на основе вычисления движений молекул, модели статистической механики на основе тепловых ансамблей или сочетанные модели. Для большинства видов моделей необходимы стандартные молекулярные силовые поля, отражающие силы между входящими в состав атомами и группами, и их можно выбирать из известных в физической химии силовых полей. Неполные или менее точные экспериментальные структуры могут служить в качестве ограничений для полных и более точных структур, вычисляемых этими способами моделирования.

Наконец, после экспериментального посредством моделирования или сочетания определения структуры активного участка (или участка связывания) можно выявлять регулирующие соединения-кандидаты поиском в базах данных, содержащих соединения вместе с информацией об их молекулярной структуре. В таком поиске определяют соединения, имеющие структуры, которые соответствуют установленной структуре активного участка и взаимодействуют с группами, характеризующими активный участок. Такой поиск можно проводить ручным способом, но предпочтительно с использованием компьютера. Эти соединения, выявленные в этом поиске, представляют собой возможные регуляторы активности EGFL7.

Альтернативно, эти способы можно использовать для выявления улучшенных регулирующих соединений из уже известного регулирующего соединения или лиганда. Композицию известного соединения можно модифицировать, а структурные эффекты модификации можно определять с использованием указанных выше способов экспериментального и компьютерного моделирования, применяемых к новой композиции. Затем измененную структуру сравнивают со структурой активного участка соединения для определения, достигнуто ли улучшенное соответствие или взаимодействие. Таким образом, можно быстро оценивать систематические изменения в композиции, такие как при изменении боковых групп, для получения модифицированных регулирующих соединений или лигандов с улучшенной специфичностью или активностью.

Для специалистов в данной области очевидны другие способы экспериментального и компьютерного моделирования, эффективные для выявления регулирующих соединений на основе определения активных участков (или участков связывания) EGFL7 и связанных с ним факторов трансдукции и транскрипции.

Примерами систем молекулярного моделирования являются программы CHARMm и QUANTA (Polygen Corporation, Waltham, MA). CHARMm осуществляет минимизацию энергии и функции молекулярной динамики. QUANTA осуществляет конструирование, графическое моделирование и анализ молекулярной структуры. QUANTA предоставляет возможность интерактивного конструирования, модификации, получения изображения и анализа действия молекул друг на друга.

Обзор компьютерного моделирования лекарственных средств, взаимодействующих с конкретными белками, проведен во множестве статей, таких как Rotivinen, et al., Acta Pharmaceutical Fennica 97: 159-166 (1988); Ripka, New Scientist 54-57 (June 16, 1988); McKinaly and Rossmann, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29: 111-122 (1989); Perry and Davies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis and Dean, Proc. R. Soc. Lond. 236: 125-140 (1989) и 141-162; а также в отношении модели рецептора для компонентов нуклеиновых кислот, Askew, et al., J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090 (1989). Другие компьютерные программы, отбирающие и графически отображающие химические вещества, доступны у компаний, таких как BioDesign, Inc. (Pasadena, CA.), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canada) и Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario). Хотя исходно они предназначены для использования для лекарственных средств, специфичных к конкретным белкам, их можно приспосабливать для разработки лекарственных средств, специфичных к участкам ДНК или РНК, в случае выявления такого участка.

Несмотря на описанное выше в отношении разработки и получения способных изменять связывание соединений также можно проводить скрининг библиотек известных соединений, в том числе природных продуктов или синтетических химических веществ, а также биологически активных веществ, в том числе белков, на предмет соединений, являющихся ингибиторами или активаторами.

Соединения, выявляемые посредством анализов, таких как описанные здесь анализы, могут быть эффективны, например, в выявлении биологической функции продукта гена EGFL7. Такие соединения можно вводить пациенту в терапевтически эффективных дозах для лечения любого из множества физиологических нарушений. Терапевтически эффективные дозы относятся к количеству соединения, достаточному для достижения какого-либо улучшения, задержки, предотвращения или изменения любого биологического симптома.

Анализы для связывающихся с EGFL7 соединений

Системы могут быть предназначены для выявления соединений, способных взаимодействовать с (например, связываться с) или имитировать EGFL7, или способных препятствовать связыванию EGFL7 с родственным рецептором, участвующим в его связывании веществом или субстратом. Выявляемые соединения могут быть эффективны, например, в регуляции активности продуктов гена EGFL7 дикого типа и/или мутантного гена EGFL7; могут быть эффективны в выявлении биологической функции EGFL7; могут быть использованы в скринингах для выявления соединений, которые нарушают обычные взаимодействия EGFL7; или могут сами нарушать или активировать такие взаимодействия.

Принцип анализов, используемых для выявления соединений, которые связываются с EGFL7 или родственными для EGFL7 рецепторами или субстратами, включает получение реакционной смеси EGFL7 и тестируемого соединения в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы позволить двум компонентам взаимодействовать и связываться, тем самым формируя комплекс, который можно удалять и/или выявлять в реакционной смеси. Используемые виды EGFL7 могут различаться в зависимости от цели анализа отбора. Например, где желательны агонисты природного рецептора, можно использовать полноразмерный EGFL7 или растворимый усеченный EGFL7, пептид или слитый белок, содержащий один или несколько доменов EGFL7, которые слиты с белком или полипептидом, обеспечивающим преимущества в системе анализа (например, в мечении, выделении получаемого в результате комплекса и т.д.). В случае поиска непосредственно взаимодействующих с EGFL7 соединений можно использовать пептиды, соответствующие EGFL7 и содержащим EGFL7 слитым белкам.

Анализы отбора можно проводить множеством способов. Например, один из способов для проведения такого анализа предусматривает закрепление EGFL7, полипептида, пептида или слитого белка на их основе, или тестируемого соединения на твердой фазе и выявление в конце реакции закрепленных на твердой фазе комплексов EGFL7/тестируемое соединение. В одном из вариантов осуществления такого способа взаимодействующее вещество EGFL7 можно закреплять на твердой поверхности, а незакрепленное тестируемое соединение можно метить, прямо или косвенно.

На практике в качестве твердой фазы может быть удобно использовать планшеты для микротитрования. Закрепляемый компонент можно иммобилизовать нековалентными или ковалентными взаимодействиями. Нековалентное взаимодействие можно осуществлять простым покрытием твердой поверхности раствором белка и сушкой. Альтернативно для иммобилизации белка на твердой поверхности можно использовать иммобилизованное антитело, предпочтительно моноклональное антитело, которое специфично к подлежащему иммобилизации белку. Поверхности можно получать заранее и хранить.

Для проведения анализа к содержащей закрепленный компонент поверхности с покрытием добавляют неиммобилизованный компонент. После завершения реакции непрореагировавшие компоненты удаляют (например, промывкой) в таких условиях, чтобы любые сформировавшиеся комплексы остались иммобилизованными на твердой поверхности. Выявление закрепленных на твердой поверхности комплексов можно осуществлять множеством способов. В случае предварительного мечения исходно неиммобилизованного компонента выявление метки, иммобилизованной на поверхности, указывает на образование комплексов. Когда предварительное мечение исходно неиммобилизованного компонента отсутствует, то для выявления закрепленных на поверхности комплексов можно использовать косвенную метку; например использовать меченое антитело, специфичное к исходно неиммобилизованному компоненту (антитело, в свою очередь, можно метить прямо или метить косвенно меченым антителом к Ig).

Альтернативно реакцию можно проводить в жидкой фазе, отделять продукты реакции от непрореагировавших компонентов и выявлять комплексы; например, используя для закрепления любых образуемых в растворе комплексов иммобилизованное антитело, специфичное к белку EGFL7, полипептиду, пептиду или слитому белку, или тестируемому соединению, а для выявления закрепленных комплексов используя меченое антитело, специфичное к другому компоненту возможного комплекса.

Анализы для соединений, препятствующих взаимодействиям EGFL7

В целях этого описания взаимодействующие с EGFL7 макромолекулы называют “партнерами по связыванию”. Вероятно, эти партнеры по связыванию вовлечены в опосредуемые EGFL7 биологические каскады. Поэтому желательно выявить соединения, препятствующие или нарушающие взаимодействие таких партнеров по связыванию, где эти соединения могут быть эффективны в регуляции или повышении активности EGFL7 в организме и/или контролировании нарушений, связанных с его активностью (или его недостаточностью).

Основной принцип систем анализа, используемых для выявления соединений, которые препятствуют взаимодействию между EGFL7 и партнером или партнерами по связыванию, включает получение реакционной смеси, содержащей EGFL7 или его определенный вариант и партнер по связыванию, в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы позволить двум веществам взаимодействовать и связываться, тем самым формируя комплекс. Для тестирования соединения на предмет ингибирующей активности реакционную смесь получают в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения. Тестируемое соединение можно исходно включать в реакционную смесь или можно добавлять в дальнейшее время после добавления EGFL7 и партнера по связыванию. Контрольные реакционные смеси инкубируют в отсутствие тестируемого соединения или в присутствии плацебо. Затем выявляют образование любых комплексов между EGFL7 и партнером по связыванию. Образование комплекса в контрольной реакции, а не в содержащей тестируемое соединение реакционной смеси, указывает на то, что соединение препятствует взаимодействию EGFL7 и взаимодействующего партнера по связыванию. Кроме того, образование комплекса в реакционных смесях, содержащих тестируемое соединение и обычный белок EGFL7, также можно сравнивать с образованием комплекса в реакционных смесях, которые содержат тестируемое соединение и мутантный EGFL7. Это сравнение может быть важно в тех случаях, когда желательно выявить соединения, специфически нарушающие взаимодействия мутантного или мутировавшего EGFL7, а не обычных белков.

Анализ для соединений, препятствующих взаимодействию между EGFL7 и партнерами по связыванию, можно проводить по гетерогенной или гомогенной схеме. Гетерогенный анализ включает закрепление EGFL7 или партнера по связыванию на твердой фазе и выявление в конце реакции закрепленных на твердой фазе комплексов. В гомогенном анализе всю реакцию проводят в жидкой фазе. В каждом из способов порядок добавления реагирующих веществ может различаться для получения различной информации о тестируемых соединениях. Например, тестируемые соединения, препятствующие взаимодействию посредством конкуренции, можно выявлять проведением реакции в присутствии тестируемого вещества; т.е. посредством добавления тестируемого вещества к реакционной смеси перед или одновременно с EGFL7 и взаимодействующим партнером по связыванию. Альтернативно тестируемые соединения, разрушающие предварительно образованные комплексы, например соединения с более высокими константами связывания, которые вытесняют из комплекса один из компонентов, можно тестировать добавлением тестируемого соединения в реакционную смесь после образования комплексов. Различные схемы кратко описаны ниже.

В системе гетерогенного анализа EGFL7 или взаимодействующий партнер по связыванию закрепляют на твердой поверхности, тогда как незакрепленные вещества метят, прямо или косвенно. На практике удобно использовать планшеты для микротитрования. Закрепляемые вещества можно иммобилизовать нековалентными или ковалентными взаимодействиями. Нековалентное взаимодействие можно осуществлять простым покрытием твердой поверхности раствором EGFL7 или партнером по связыванию и сушкой. Альтернативно для закрепления веществ на твердой поверхности можно использовать имобилизованные антитела, специфичные для подлежащих закреплению веществ. Поверхности можно получать заранее и хранить.

Для проведения анализа на поверхность с покрытием воздействуют веществами, соответствующими иммобилизованным веществам, в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения. После завершения реакции непрореагировавшие компоненты удаляют (например, промывкой), а любые сформировавшиеся комплексы остаются иммобилизованными на твердой поверхности. Выявление закрепленных на твердой поверхности комплексов можно осуществлять множеством способов. В случае предварительного мечения неиммобилизованных веществ на образование комплексов указывает выявление метки, иммобилизованной на поверхности. Когда предварительное мечение неиммобилизованных веществ отсутствует, то для выявления закрепленных на поверхности комплексов можно использовать косвенную метку; например, использовать меченое антитело, специфичное к исходно неиммобилизованным веществам (антитело, в свою очередь, можно метить прямо или метить косвенно меченым антителом к Ig). В зависимости от порядка добавления реакционных компонентов можно выявлять тестируемые соединения, ингибирующие образование комплекса или разрушающие предварительно образованные комплексы.

Альтернативно реакцию можно проводить в жидкой фазе в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения, отделять продукты реакции от непрореагировавших компонентов и выявлять комплексы; например, используя для закрепления любых образуемых в растворе комплексов иммобилизованное антитело, специфичное для одного из связывающихся компонентов, а для выявления закрепленных комплексов используя меченое антитело, специфичное к другому участвующему компоненту. В свою очередь, в зависимости от порядка добавления реагирующих веществ к жидкой фазе можно выявлять тестируемые соединения, ингибирующие образование комплекса или разрушающие предварительно образованные комплексы.

В альтернативном варианте осуществления изобретения можно использовать гомогенный анализ. В этом способе получают предварительно образованный комплекс EGFL7 и взаимодействующего партнера по связыванию, где EGFL7 или его партнеры по связывани мечены, а вызываемый меткой сигнал гасится вследствие образования комплекса (см., например, принадлежащий Rubenstein патент США №4109496, в котором этот способ используют для иммуноанализов). Добавление тестируемого вещества, конкурирующего и вытесняющего одно из веществ из предварительно сформированного комплекса, приводит к образованию сигнала выше фонового уровня. Таким образом можно выявлять нарушающие взаимодействие тестируемые вещества.

В конкретном варианте осуществления для иммобилизации можно получать слитый EGFL7. Например, EGFL7 или его пептидный фрагмент можно сливать с геном глутатион-S-трансферазы (GST), используя слитый вектор, такой как pGEX-5X-1, таким образом, чтобы сохранить в получаемом слитом белке связывающую активность EGFL7. Взаимодействующий партнер по связыванию можно очищать и использовать для получения моноклонального антитела с применением общепринятых в данной области и описанных выше способов. Это антитело можно метить радиоактивным изотопом ¹²⁵I, например, общепринятыми в данной области способами. В гетерогенном анализе слитый белок можно закреплять на глутатион-агарозных гранулах. Затем можно добавлять взаимодействующий партнер по связыванию в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения способом, позволяющим осуществление взаимодействия и связывания. В конце периода реакции несвязавшееся вещество можно удалять промывкой, а к системе можно добавлять меченое моноклональное антитело и позволять связываться с комплексными компонентами. Взаимодействие между EGFL7 и взаимодействующим партнером по связыванию можно выявлять измерением уровня радиоактивности, который остается обусловленным глутатион-агарозными гранулами. Эффективное ингибирование взаимодействия тестируемым соединением приводит к снижению измеряемой радиоактивности.

Альтернативно слитый белок GST и взаимодействующий партнер по связыванию можно смешивать друг с другом в жидкости в отсутствие твердых глутатион-агарозных гранул. Тестируемое соединение можно добавлять в течение или после предоставления веществам возможности взаимодействия. Затем эту смесь можно добавлять к глутатион-агарозным гранулам и удалять промывкой несвязавшееся вещество. В свою очередь, величину ингибирования взаимодействия между EGFL7 и партнером по связыванию можно выявлять добавлением меченого антитела и измерением обусловленной гранулами радиоактивности.

В другом варианте осуществления изобретения можно применять те же самые способы с использованием пептидных фрагментов, соответствующих связывающим доменам EGFL7 и/или взаимодействующего партнера или партнера по связыванию (в случаях, когда партнер по связыванию представляет собой белок) вместо одного или обоих полноразмерных белков. Для выявления и выделения участков связывания можно использовать любое количество общепринятых в данной области способов. Эти способы включают, но ими не ограничиваются, мутагенез гена, кодирующего один из белков, и отбор на предмет нарушения связывания в анализе совместной иммунопреципитации. Затем можно отбирать компенсирующие мутации в гене, кодирующем вторые вещества в комплексе. В результате анализа последовательности кодирующих соответствующие белки генов выявлены мутации, которые соответствуют области белка, вовлеченной во взаимодействие при связывании. Альтернативно один белок можно закреплять на твердой поверхности с использованием указанных выше способов и позволять взаимодействовать и связываться с его меченым партнером по связыванию, который был обработан протеолитическим ферментом, таким как трипсин. После промывки относительно короткий меченый пептид, содержащий домен связывания, может оставаться связанным с твердым веществом и его можно выделять и определять секвенированием аминокислот. Также при получении гена, кодирующего внутриклеточный партнер по связыванию, можно конструировать короткие участки гена для экспрессии пептидных фрагментов белка, которые затем можно тестировать на предмет связывающей активности и очищать или синтезировать.

Например, не подразумевая ограничений, EGFL7 можно закреплять на твердом веществе, как указано выше, посредством получения слитого белка GST и позволять ему связываться с глутатион-агарозными гранулами. Взаимодействующий партнер по связыванию можно метить радиоактивным изотопом, таким как ³⁵S, и расщеплять протеолитическим ферментом, таким как трипсин. Затем продукты расщепления можно добавлять к закрепленному слитому белку и позволять связываться. После удаления промывкой несвязавшихся пептидов меченое связавшееся вещество, представляющее собой связывающий домен внутриклеточного партнера по связыванию, можно элюировать, очищать и анализировать на предмет аминокислотной последовательности общепринятыми способами. Выявленные таким образом пептиды можно получать синтетически или посредством слияния со способствующими белками с использованием способа рекомбинантной ДНК.

Варианты применения композиций EGFL7

Анализы на предмет сердечно-сосудистой, эндотелиальной и ангиогенной активности

Для тестирования указанного здесь полипептида на предмет сердечно-сосудистой, эндотелиальной и ангиогенной активности можно использовать различные анализы. Такие анализы включают анализы, представленные в указанных ниже примерах.

Анализы на предмет активности для образования ткани включают, но ими не ограничиваются, анализы, описанные в WO 95/16035 (кость, хрящ, сухожилие); WO 95/05846 (нервное волокно, нейроны) и WO 91/07491 (кожа, эндотелий).

Анализы на предмет заживляющей раны активности включают, например, анализы, описанные в Winter, Epidermal Wound Healing, Maibach, HI and Rovee, DT, eds. (Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago), pp. 71-112, как изменено в статье Eaglstein and Mertz, J. Invest. Dermatol. 71: 382-384 (1978).

Существует несколько анализов гипертрофии сердца. Анализы in vitro включают индукцию распространения зрелых кардиомиоцитов крысы. В этом анализе миоциты желудочка выделяют из одной крысы (самца Sprague-Dawley), в основном придерживаясь модификации процедуры, подробно описанной Piper et al., "Adult ventricular rat heart muscle cells" в Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, H. M. Piper, ed. (Berlin: Springer-Verlag, 1990), pp. 36-60. Эта процедура позволяет выделять зрелые миоциты желудочка и длительно культивировать эти клетки при палочкообразном фенотипе. Было показано, что фенилэфрин и простагландин F_2α (PGF_2α) индуцируют у этих зрелых клеток реакцию распространения. Затем тестируют ингибирование распространения миоцитов, вызываемого PGF_2α или аналогами PGF_2α (например, флупростенолом) и фенилэфрином, посредством различных возможных ингибиторов гипертрофии сердца.

В случае злокачественной опухоли можно использовать множество общепринятых моделей на животных для дальнейшего понимания роли EGFL7 в развитии и патогенезе опухолей и для тестирования эффективности терапевтических средств-кандидатов, в том числе антител и других антагонистов природных полипептидов EGFL7, таких как небольшие молекулы-антагонисты. Характер in vivo таких моделей делает их имеющими особую предсказательную силу для реакций у пациентов людей. Модели опухолей и злокачественных опухолей на животных (например, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака предстательной железы, рака легких и т.д.) включают нерекомбинантных и рекомбинантных (трансгенных) животных. Модели на нерекомбинантных животных включают, например, грызунов, например, модели на мышах. Такие модели можно получать введением опухолевых клеток в сингенных мышей с использованием общепринятых способов, например подкожной инъекции, инъекцией в вену хвоста, имплантацией в селезенку, внутрибрюшинной имплантацией, имплантацией под капсулу почки или имплантацией посредством ортоперекалывания например, имплантацией раковых клеток толстой кишки в ткань толстой кишки. См., например, публикацию PCT № WO 97/33551, опубликованную 18 сентября 1997. Вероятно, наиболее часто используемыми в онкологических исследованиях видами животных являются иммунодефицитные мыши, а особенно голые мыши. Наблюдение, что голые мыши с гипо/аплазией тимуса могут эффективно действовать в качестве организма-хозяина для ксенотрансплантатов опухоли человека, привело к широко распространенному использованию их в этих целях. Аутосомно-рецессивный ген nu вводили в очень большое количество различных конгенных линий голых мышей, в том числе, например, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII и SJL. Кроме того, было выведено и использовано в качестве реципиентов опухолевых ксенотрансплантатов большое разнообразие других животных с наследственными иммунологическими дефектами, отличными от голой мыши. Для дополнительных подробностей см., например, The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd, eds. (CRC Press, Inc., 1991).

Вводимые в таких животных клетки можно получать из известных линий опухолевых/раковых клеток, таких как любые из указанных выше линий опухолевых клеток, а также, например, линий клеток B 104-1-1 (устойчивая линия клеток NIH-3T3, трансфицированных протоонкогеном neu); трансфицированных ras клеток NIH-3T3; Caco-2 (ATCC HTB-37); или линии клеток относительно высокодифференцированной аденокарциномы толстой кишки человека II степени злокачественности, HT-29 (ATCC HTB-38); или из опухолей и злокачественных опухолей. Образцы опухолевых или раковых клеток можно получать у подвергающихся хирургическому вмешательству пациентов, используя общепринятые условия, в том числе замораживание и хранение в жидком азоте. Karmali et al., Br. J. Cancer 48: 689-696 (1983).

Опухолевые клетки можно вводить в животных, таких как голые мыши или мыши с нокаутом по EGFL7, посредством множества процедур. Особенно приемлемо для имплантации опухоли подкожное (s.c.) пространство у мышей. Опухоли можно трансплантировать подкожно в виде твердых масс, в виде биопсий иглой с использованием троакара или в виде суспензий клеток. При имплантации твердой массы или с использованием троакара в подкожное пространство вводят фрагменты опухолевой ткани приемлемого размера. Получают свежие суспензии клеток из первичных опухолей или из устойчивых линий опухолевых клеток и вводят подкожной инъекцией. Также опухолевые клетки можно вводить инъекцией в виде подкожных имплантатов. В этом расположении инокулят помещают между нижней частью соединительной ткани кожи и подкожно-жировой клетчаткой.

Модели рака молочной железы на животных можно получать, например, имплантацией клеток нейробластомы крысы (из которых был исходно выделен онкоген neu) или трансформированных neu клеток NIH-3T3 в голых мышей, в основном, как описано Drebin et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83: 9129-9133 (1986).

Сходным образом модели рака толстой кишки на животных можно получать прививанием раковых клеток толстой кишки животным, например, голым мышам, что приводит к возникновению у этих животных опухолей. Модель ортотопического трансплантата рака толстой кишки человека у голых мышей была описана, например, Wang et al., Cancer Research 54: 4726-4728 (1994) и Too et al., Cancer Research 55:681-684 (1995). Эта модель основана на так называемом “METAMOUSE^TM”, продаваемом AntiCancer, Inc., (San Diego, California).

Возникающие у животных опухоли можно удалять и культивировать in vitro. Затем клетки из культур in vitro можно прививать животным. Такие опухоли могут служить в качестве мишеней для дальнейшего тестирования или отбора лекарственного средства. Альтернативно можно выделять получаемые в результате прививания опухоли и анализировать РНК из клеток перед прививанием и клеток, выделяемых после одного или нескольких циклов прививания, на предмет дифференциальной экспрессии представляющих интерес генов. Такие способы прививания можно осуществлять для любых известных линий опухолевых или раковых клеток.

Например, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 и WEHI-164 представляют собой химически индуцированные фибросаркомы самок мышей BALB/c (DeLeo et al., J. Exp. Med. 146:720 (1977)), обеспечивающие высококонтролируемую модельную систему для исследования противоопухолевой активности различных средств. Palladino et al., J. Immunol. 138: 4023-4032 (1987). Вкратце, опухолевые клетки размножают в культуре клеток in vitro. Перед инъекцией животным линии клеток промывают и суспендируют в буфере при плотности клеток, составляющей приблизительно от 10x10⁶ до 10x10⁷ клеток/мл. Затем животных инфицируют подкожно суспензией клеток в количестве от 10 до 100 мкл, предоставляя от одной до трех недель для возникновения опухоли.

Кроме того, в качестве исследуемой модели опухоли можно использовать карциному легких Льюиса у мышей, представляющую собой одну из наиболее тщательно изученных экспериментальных опухолей. Эффективность для этой модели опухоли соответствовала благоприятным эффектам в лечении пациентов людей с диагнозом мелкоклеточная карцинома легких (SCCL). Эту опухоль можно вводить в обычных мышей посредством инъекции фрагментов опухоли из пораженной мыши или клеток, поддерживаемых в культуре. Zupi et al., Br. J. Cancer 41: suppl. 4, 30 (1980). Данные указывают на то, что опухоли могут возникать в результате инъекции даже одной клетки и что выживает очень высокая доля инфицированных опухолевых клеток. Для дополнительной информации об этой модели опухоли см. Zacharski, Haemostasis 16: 300-320 (1986).

Один из способов оценки эффективности тестируемого соединения в модели на животном с имплантированной опухолью представляет собой измерение размера опухоли перед и после обработки. Как правило, размер имплантированных опухолей оценивали штангенциркулем в двух или трех измерениях. Ограниченная двумя измерениями оценка не отражает точный размер опухоли; поэтому оценку обычно преобразуют в соответствующую величину объема с использованием математической формулы. Однако измерение размера опухоли очень неточно. Терапевтические эффекты лекарственного средства-кандидата могут быть лучше описаны в виде вызываемой обработкой задержки роста и специфической задержки роста. Другая важная переменная в описании роста опухоли представляет собой время удвоения объема опухоли. Также для расчета и описания роста опухоли доступны компьютерные программы, такие как программа, описанная Rygaard and Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds. (Basel, 1989), p. 301. Однако отмечено, что некроз и воспалительные реакции после обработки могут на самом деле приводить к увеличению размера опухоли, по меньшей мере вначале. Поэтому необходимо тщательно наблюдать за этими изменениями посредством сочетания морфометрического способа и анализа проточной цитометрией.

Кроме того, модели на рекомбинантных (трансгенных) животных можно конструировать введением кодирующего участка гена EGFL7, определенного здесь, в геном представляющих интерес животных с использованием общепринятых способов для получения трансгенных животных. Животные, которые могут служить в качестве мишени для трансгенной процедуры, включают, но ими не ограничиваются, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, овец, коз, свиней и не относящихся к человеку приматов, например павианов, шимпанзе и мартышек. Известные в данной области способы для введения трансгена таким животным включают микроинъекцию пронуклеуса (патент США №4873191); опосредуемый ретровирусом перенос гена в зародышевые линии (например, Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-615 (1985)); направленное воздействие на гены в эмбриональных стволовых клетках (Thompson et al., Cell 56: 313-321 (1989)); электропорацию эмбрионов (Lo, Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814 (1983)); а также опосредуемый сперматозоидами перенос гена. Lavitrano et al., Cell 57:717-73 (1989). Для обзора см., например, патент США №4736866.

В целях настоящего изобретения трансгенные животные включают животных, несущих трансген только в части своих клеток (“мозаичные животные”). Трансген можно встраивать в виде отдельного трансгена или в конкатемерах, например тандемах голова-к-голове или голова-к-хвосту. Также возможно избирательное введение трансгена в конкретный тип клеток посредством, например, следующего способа Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-636 (1992). Экспрессию трансгена в трансгенных животных можно наблюдать общепринятыми способами. Например, для подтверждения встраивания трансгена можно использовать анализ саузерн-блот или амплификацию ПЦР. Затем можно анализировать уровень экспрессии мРНК с использованием таких способов, как гибридизация in situ, анализ нозерн-блот, ПЦР или иммуноцитохимия. Животных дополнительно исследуют на предмет признаков развития опухоли или злокачественной опухоли.

Альтернативно, можно конструировать “нокаутных” животных, которые имеют дефектный или измененный ген, кодирующий определенный здесь EGFL7, в результате гомологичной рекомбинации между кодирующим EGFL7 эндогенным геном и кодирующей тот же полипептид, измененной геномной ДНК, которую вводят в эмбриональную клетку животного. Например, кодирующую конкретный полипептид EGFL7 кДНК можно использовать для клонирования кодирующей этот полипептид геномной ДНК в соответствии с общепринятыми способами. Участок геномной ДНК, кодирующей конкретный полипептид EGFL7, можно удалять или заменять другим геном, таким как ген, кодирующий селектируемый маркер, который можно использовать для наблюдения за встраиванием. Как правило, несколько тысяч пар нуклеотидов неизмененной фланкирующей ДНК (с концов 5' и 3') включают в вектор. Для описания гомологичной рекомбинации векторов см., например, Thomas and Capecchi, Cell 51: 503 (1987). Вектор вводят в линию эмбриональных стволовых клеток (например, электропорацией) и отбирают клетки, в которых введенная ДНК гомологично рекомбинировала с эндогенной ДНК. См., например, Li et al., Cell 69: 915 (1992). Затем отобранные клетки вводят инъекцией в бластоцисту животного (например, мыши или крысы) для образования совокупности химер. См., например, Bradley, в Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL: Oxford, 1987), pp. 113-152. Затем химерный эмбрион можно имплантировать в приемлемую неродную ложнобеременную самку животного, и эмбрион вынашивается до срока родов для получения “нокаутного” животного. Потомство, которое несет в своих зародышевых клетках гомологично рекомбинированную ДНК, можно выявлять общепринятыми способами и использовать для выведения животных, в которых все клетки животного содержат гомологично рекомбинированную ДНК. Нокаутных животных можно охарактеризовывать, например, по их способности противостоять определенным патологическим состояниям и по развитию у них патологических состояний вследствие отсутствия EGFL7.

Эффективность антител, специфично связывающих определенный здесь EGFL7, и других лекарственных средств-кандидатов также можно тестировать в обработке самопроизвольно возникающих опухолей у животных. Приемлемым объектом для таких исследований является плоскоклеточная карцинома (SCC) полости рта у кошки. SCC полости рта у кошки представляет собой высокоинвазивную злокачественную опухоль, которая является наиболее распространенной злокачественной опухолью полости рта у кошек, составляющей свыше 60% опухолей полости рта, наблюдаемых в этом виде. Она редко метастазирует в отдаленные участки, хотя низкая частота ее метастазирования может представлять собой лишь отражение короткого времени выживания для кошек с этой опухолью. Как правило, эти опухоли не подлежат хирургическому вмешательству в основном вследствие анатомии полости рта кошки. В настоящее время не существует эффективного лечения для этой опухоли. Перед включением в исследование каждую кошку подвергают полному клиническому обследованию и биопсии, а также проводят сканирование посредством компьютерной томографии (CT). Из исследования исключают кошек с диагнозом подъязычные плоскоклеточные опухоли полости рта. В результате такой опухоли может наступать паралич языка, и даже в случае устранения опухоли обработкой животные могут быть не способны питаться самостоятельно. Каждую кошку обрабатывают многократно в течение продолжительного периода времени. Фотографии опухолей получают ежесуточно в течение периода обработки и при каждой последующей повторной проверке. После обработки каждую кошку подвергали еще одному сканированию CT. В дальнейшем томограммы CT и радиограммы грудной клетки оценивали каждые 8 недель. Данные оценивали на предмет различий в выживании, реакции и токсичности в сравнении с контрольными группами. Для положительной реакции могут быть необходимы признаки регрессии опухоли, предпочтительно с улучшением качества жизни и/или увеличением продолжительности жизни.

Кроме того, также можно тестировать другие самопроизвольно возникающие опухоли животных, такие как фибросаркома, аденокарцинома, лимфома, хондрома или лейомиосаркома собак, кошек и павианов. Из них предпочтительной моделью является аденокарцинома молочной железы у собак и кошек, поскольку ее наружный вид и характер изменения очень сходны с таковыми у человека. Однако использование этой модели ограничено редкой частотой возникновения этого типа опухоли у животных.

Также здесь приемлемы другие известные в данной области сердечно-сосудистые, эндотелиальные и ангиогенные тесты in vitro и in vivo.

Распределение тканей

Полученные здесь результаты сердечно-сосудистых, эндотелиальных и ангиогенных анализов можно подтверждать дополнительными исследованиями, такими как определение экспрессии мРНК в различных тканях человека.

Как указано ранее, амплификацию гена и/или экспрессию гена в различных тканях можно измерять общепринятым саузерн-блоттингом, нозерн-блоттингом для количественного определения транскрипции мРНК (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201-5205 (1980)), дот-блоттингом (анализ ДНК) или гибридизацией in situ с использованием соответствующего меченого зонда, основываясь на предоставленных здесь последовательностях. Альтернативно можно использовать антитела, способные распознавать специфичные дуплексы, в том числе дуплексы ДНК, дуплексы РНК и гибридные дуплексы ДНК-РНК или дуплексы ДНК-белок.

Альтернативно экспрессию генов в различных тканях можно измерять иммунологическими способами, такими как иммуногистохимическое окрашивание срезов ткани и анализ культуры клеток или жидкостей организма, для прямого количественного определения экспрессии продукта гена. Эффективные для иммуногистохимического окрашивания и/или анализа образцов жидкостей антитела могут быть моноклональными или поликлональными, и их можно получать в любом млекопитающем. Для удобства можно получать антитела к природной последовательности полипептида EGFL7, или к синтетическому пептиду на основе предоставленных здесь последовательностей ДНК, или к экзогенной последовательности, слитой с ДНК EGFL7 и кодирующей специфичный к антителу эпитоп. Основные способы для получения антител и конкретные протоколы для гибридизации in situ приведены в настоящей заявке ниже.

Исследования связывания антител

Результаты сердечно-сосудистого, эндотелиального и ангиогенного исследования можно дополнительно подтверждать исследованиями связывания антител, в которых тестируют способность антител к EGFL7 ингибировать эффект EGFL7 в эндотелиальных клетках или других клетках, используемых в сердечно-сосудистых, эндотелиальных и ангиогенных анализах. Примеры антител включают поликлональные, моноклональные, гуманизированные, биспецифичные и гетероконъюгированные антитела, получение которых описано в настоящей заявке ниже.

Исследования связывания антител можно проводить любым известным способом анализа, таким как анализы конкурентного связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc., 1987), pp.147-158.

Анализы конкурентного связывания основаны на способности меченого эталонного образца конкурировать с тестируемым образцом анализируемого вещества за связывание с ограниченным количеством антител. Количество исследуемого белка в тестируемом образце обратно пропорционально количеству эталонного образца, который оказывается связанным с антителами. Для способствования определению количества эталонного образца, который оказывается связанным с антителами, антитела предпочтительно переводят в нерастворимую форму перед или после конкуренции таким образом, чтобы связывающиеся с антителами эталонный образец и анализируемое вещество можно было легко отделять от остающихся несвязанными эталонного образца и анализируемого вещества.

Сэндвич-анализ включает использование двух антител, где каждое способно связываться с различным иммуногенным участком, или эпитопом, подлежащего выявлению белка. В сэндвич-анализе тестируемый образец анализируемого вещества связывается первым антителом, которое иммобилизовано на твердом носителе, а затем с анализируемым веществом связывается второе антитело, тем самым образуя нерастворимый комплекс из трех частей. См., например, патент США №4376110. Второе антитело может быть само мечено поддающимся выявлению веществом (прямые сэндвич-анализы), или его можно оценивать с использованием антитела к иммуноглобулину, которое мечено поддающимся выявлению веществом (непрямые сэндвич-анализы). Например, одним из видов сэндвич-анализа является анализ ELISA, в случае которого поддающееся выявлению вещество представляет собой фермент.

В случае иммуногистохимии образец ткани может быть свежим или замороженным или может быть помещен в парафин и зафиксирован консервантом, таким как, например, формалин.

Анализы опухоли на основе клеток

Анализы на основе клеток и модели на животных для сердечно-сосудистых, эндотелиальных и ангиогенных нарушений, таких как опухоли, можно использовать для подтверждения открытий в результате указанного здесь сердечно-сосудистого, эндотелиального и ангиогенного анализа, а также для дальнейшего понимания взаимосвязи между определенным здесь геном и развитием и патогенезом нежелательного роста сердечно-сосудистых, эндотелиальных и ангиогенных клеток. Роль определенных здесь продуктов гена в развитии и патогенезе нежелательного роста сердечно-сосудистых, эндотелиальных и ангиогенных клеток, например опухолевых клеток, можно тестировать с использованием клеток или линий клеток, которые были выявлены как стимулируемые или ингибируемые указанным здесь EGFL7. Такие клетки включают, например, клетки, указанные в приведенных ниже примерах.

В различных способах клетки клеточного типа, для которого известно вовлечение в конкретное сердечно-сосудистое, эндотелиальное и ангиогенное нарушение, трансфицируют указанными здесь кДНК и анализируют способность этих кДНК индуцировать повышенный рост или ингибировать рост. Если сердечно-сосудистое, эндотелиальное и ангиогенное нарушение представляет собой злокачественную опухоль, то приемлемые опухолевые клетки включают, например, устойчивые линии опухолевых клеток, такие как линия клеток B104-1-1 (устойчивая линия клеток NIH-3T3, трансфицированных протоонкогеном neu) и трансфицированные ras клетки NIH-3T3, которые можно трансфицировать желаемым геном и наблюдать на предмет опухолеобразующего роста. Затем такие трансфицированные линии клеток можно использовать для тестирования способности поли- или моноклональных антител или композиций антител ингибировать опухолеобразующий рост клеток посредством воздействия цитостатической или цитотоксической активности на рост трансформированных клеток или опосредованием зависящей от антител клеточной цитотоксичности (ADCC). Клетки, трансфицированные кодирующими последовательностями определенного здесь гена, можно дополнительно использовать для выявления лекарственных средств-кандидатов для лечения сердечно-сосудистых, эндотелиальных и ангиогенных нарушений, таких как злокачественная опухоль.

Кроме того, получаемые из опухолей в трансгенных животных первичные культуры (как указано выше) можно использовать в указанных здесь анализах на основе клеток, хотя предпочтительны устойчивые линии клеток. Способы для получения непрерывных линий клеток из трансгенных животных хорошо известны в данной области. См., например, Small et al., Mol. Cell. Biol. 5:642-648 (1985).

Применение гена в качестве диагностического средства

Также это изобретение относится к применению кодирующего EGFL7 гена в качестве диагностического средства. Выявление мутантной формы EGFL7 позволяет диагностировать сердечно-сосудистое, эндотелиальное и ангиогенное заболевание или предрасположенность к сердечно-сосудистому, эндотелиальному и ангиогенному заболеванию, такому как опухоль.

Индивидуумов, несущих мутации в гене, который кодирует полипептид EGFL7 человека, можно выявлять на уровне ДНК множеством способов. Нуклеиновые кислоты для диагностики можно получать из клеток пациента, таких как из крови, мочи, слюны, материала биопсии и аутопсии тканей. Геномную ДНК можно непосредственно использовать для выявления или можно перед анализом амплифицировать ферментным способом с использованием ПЦР (Saiki et al., Nature 324:163-166 (1986)). Также в тех же целях можно использовать РНК или кДНК. Например, для выявления и анализа мутаций EGFL7 можно использовать праймеры для ПЦР, комплементарные кодирующей EGFL7 нуклеиновой кислоте. Например, делеции и вставки можно выявлять в результате изменения размера амплифицируемого продукта в сравнении с обычным генотипом. Точковые мутации можно выявлять гибридизацией амплифицированной ДНК с меченной радиоактивным изотопом РНК, которая кодирует EGFL7, или, альтернативно, с меченными радиоактивным изотопом антисмысловыми последовательностями ДНК, которые кодируют EGFL7. Полностью совпадающие последовательности можно отделять от плохо совпадающих дуплексов посредством расщепления РНКазой A или посредством различий в температурах плавления.

Основанное на различиях последовательностей ДНК генетическое тестирование можно осуществлять выявлением изменения в элетрофоретической подвижности фрагментов ДНК в гелях в присутствии или в отсутствие денатурирующих средств. Небольшие делеции и вставки в последовательностях можно наблюдать посредством гель-электрофореза с высокой разрешающей способностью. Фрагменты ДНК различных последовательностей можно разделять в денатурирующих гелях с градиентом формамидина, в которых подвижность различных фрагментов ДНК замедляется в различных положениях, соответствующих их специфическим температурам плавления или частичного плавления. См., например, Myers et al., Science 230:1242 (1985).

Изменения последовательности в конкретных положениях также можно выявлять анализами на защиту от нуклеаз, такую как защита от РНКазы и S1, или способом химического расщепления, например, Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397-4401 (1985).

Таким образом, выявление конкретной последовательности ДНК можно осуществлять такими способами, как гибридизация, защита от РНКазы, химическое расщепление, прямое секвенирование ДНК или использование ферментов рестрикции, например полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP), а также саузерн-блоттинг геномной ДНК.

Применение для выявления уровней экспрессии полипептида

Кроме более распространенных гель-электрофореза и секвенирования ДНК мутации также можно выявлять анализом in situ.

Экспрессия кодирующей EGFL7 нуклеиновой кислоты может быть связана с сосудистым заболеванием или образованием новых сосудов, связанным с формированием опухоли. Если EGFL7 имеет сигнальную последовательность, а мРНК экспрессируется на высоком уровне в эндотелиальных клетках и на меньшем уровне в гладкомышечных клетках, это указывает на присутствие EGFL7 в сыворотке. Соответственно для диагностики сосудистого заболевания или образования новых сосудов, связанного с формированием опухоли, можно использовать антитело к полипептиду EGFL7, поскольку измененный уровень этого полипептида EGFL7 может указывать на такие нарушения.

Можно использовать конкурентный анализ, где специфичные к EGFL7 антитела закрепляют на твердом носителе, а над твердым носителем пропускают меченый полипептид EGFL7 и получаемый из организма-хозяина образец, и количество выявляемой метки, прикрепившейся к твердому носителю, может соответствовать количеству EGFL7 в образце.

Картирование хромосом

Последовательности по настоящему изобретению также важны для выявления хромосом. Последовательность специфически направляют к и могут гибридизовать с конкретным участком на хромосоме конкретного индивидуума. Более того, в настоящее время существует необходимость в выявлении конкретных участков на хромосоме.

В настоящее время для маркирования хромосомного участка доступны несколько реактивов для маркирования хромосом на основе существующих данных о последовательностях (повторяющиеся полиморфизмы). Картирование ДНК на хромосомах по настоящему изобретению представляет собой важный первый шаг в соотнесении этих последовательностей со связанными с заболеванием генами.

Вкратце, последовательности можно картировать на хромосомах посредством получения из кДНК праймеров для ПЦР (предпочтительно 15-25 п.о.). Для быстрого отбора праймеров, которые перекрывают не более чем один экзон в геномной ДНК, не осложняя тем самым процесс амплификации, используют компьютерный анализ 3'-нетранслируемой области. Затем эти праймеры используют для отбора посредством ПЦР гибридов соматических клеток, содержащих отдельные хромосомы человека. Амплифицированный фрагмент получают только в случае тех гибридов, которые содержат соответствующий праймеру ген человека.

Картирование посредством ПЦР гибридов соматических клеток представляет собой быструю процедуру для соотнесения конкретной ДНК с конкретной хромосомой. Используя настоящее изобретение с одинаковыми олигонуклеотидными праймерами, можно сходным образом достигать более конкретного определения местоположения с использованием наборов фрагментов из конкретных хромосом или совокупностей крупных геномных клонов. Другие способы картирования, которые можно сходным образом использовать для картирования определенной хромосомы, включают гибридизацию in situ, предварительный отбор с использованием меченых, отсортированных проточным способом хромосом, а также предварительный отбор посредством гибридизации для конструирования библиотек кДНК, специфичных для хромосом.

Для обеспечения точного одностадийного определения положения на хромосоме можно использовать флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) клона кДНК с хромосомами метафазной пластинки. Этот способ можно использовать с такими короткими кДНК, как 500 или 600 оснований; однако клоны, составляющие более чем 2000 п.о., обладают более высокой вероятностью связывания с уникальным участком хромосомы при интенсивности сигнала, достаточной для простой регистрации. Для FISH необходимо использование клонов, из которых был получен кодирующий EGFL7 ген, и чем длиннее, тем лучше. Например, достаточным является 2000 п.о., более хорошим является 4000 п.о., а более чем 4000, вероятно, не является необходимым для получения хороших результатов за приемлемый период времени. Для обзора этого способа см. Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York, 1988).

После соотнесения последовательности с точным положением на хромосоме физическое положение последовательности на хромосоме можно соотносить с данными генетической карты. Такие данные описаны, например, в V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (в интерактивном доступе в Johns Hopkins University Welch Medical Library). Затем выявляют взаимосвязь между генами и заболеваниями, картированными в той же области хромосомы, посредством анализа сцепления (совместного наследования физически смежных генов).

Затем необходимо определить различия в последовательности кДНК или геномной последовательности между пораженными и непораженными индивидуумами. Если мутацию наблюдают у некоторых или у всех пораженных индивидуумов, а не у нормальных индивидуумов, тогда мутация, вероятно, является этиологическим фактором заболевания.

При существующем в настоящее время разрешении способов физического картирования и генетического картирования кДНК с точно определенным расположением на связанном с заболеванием участке хромосомы может представлять собой один из диапазона от 50 до 500 возможных обуславливающих заболевание генов. (Это предполагает разрешение картирования, составляющее 1 миллион оснований, и один ген на 20 т.п.о.).

Анализы отбора лекарственных средств-кандидатов

Это изобретение включает способы отбора соединений для выявления соединений, которые воспроизводят действие EGFL7 (агонисты) или предотвращают эффект EGFL7 (антагонисты). Анализы отбора являющихся антагонистами лекарственных средств-кандидатов предназначены для выявления соединений, которые связывают или образуют комплекс с EGFL7, или иным способом препятствуют взаимодействию кодируемых полипептидов с другими белками клетки. Такие анализы отбора включают анализы, приемлемые для высокопроизводительного скрининга химических библиотек, что делает их особенно приемлемыми для выявления лекарственных средств-кандидатов, являющихся небольшими молекулами.

Анализы можно выполнять по множеству схем, включая хорошо охарактеризованные в данной области анализы белок-белкового связывания, биохимические анализы отбора, иммуноанализы и анализы на основе клеток.

Все анализы для антагонистов сходны в том, что в них предусмотрено контактирование лекарственного средства-кандидата с EGFL7 в условиях и в течение времени, достаточных для предоставления возможности взаимодействия этих двух компонентов.

В анализах связывания взаимодействие представляет собой связывание, а формируемый комплекс можно выделять или выявлять в реакционной смеси. В конкретном варианте осуществления EGFL7 или лекарственное средство-кандидат иммобилизуют на твердой фазе, например на планшете для микротитрования, посредством ковалентных или нековалентных взаимодействий. Как правило, нековалентное взаимодействие осуществляют посредством покрывания твердой поверхности раствором EGFL7 и сушкой. Альтернативно можно использовать иммобилизованное антитело, например моноклональное антитело, специфичное к подлежащему иммобилизации EGFL7, для закрепления его на твердой поверхности. Анализ выполняют добавлением неиммобилизованного компонента, который можно метить поддающейся выявлению меткой, к иммобилизованному компоненту, например содержащей прикрепленный компонент поверхности с покрытием. После завершения реакции непрореагировавшие компоненты удаляют, например, промывкой, и выявляют прикрепленные к твердой поверхности комплексы. Если поддающуюся выявлению метку несет исходно неиммобилизованный компонент, то на произошедшее образование комплекса указывает выявление метки, иммобилизованной на поверхности. Если исходно неиммобилизованный компонент не несет метку, то образование комплекса можно выявлять, например, с использованием меченого антитела, специфично связывающего иммобилизованный комплекс.

Если соединение-кандидат взаимодействует, но не связывается с конкретным полипептидом EGFL7, то его взаимодействие с таким полипептидом можно анализировать общепринятыми для выявления белок-белковых взаимодействий способами. Такие анализы включают общепринятые способы, такие как, например, перекрестное связывание, совместную иммунопреципитацию и совместную очистку посредством градиентов или хроматографических колонок. Кроме того, белок-белковые взаимодействия можно наблюдать с использованием генетической системы на основе дрожжей, описанной Fields и сотрудниками (Fields and Song, Nature (London) 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582 (1991)), как указано Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5789-5793 (1991). Многие активаторы транскрипции, такие как GAL4 дрожжей, состоят из двух физически раздельных блочных доменов, где один действует как ДНК-связывающий домен, а другой функционирует в качестве домена активации транскрипции. В дрожжевой системе экспрессии, описанной в указанных выше публикациях (как правило, называемой “двухгибридной системой”), используют преимущество этой особенности и применяют два гибридных белка: один, в котором исследуемый белок слит с ДНК-связывающим доменом GAL4, и другой, в котором активирующие белки-кандидаты слиты с доменом активации. Экспрессия гена-репортера GAL1-lacZ под контролем GAL4-активируемого промотора зависит от восстановления активности GAL4 посредством белок-белкового взаимодействия. Содержащие взаимодействующие полипептиды колонии выявляют с использованием хромогенного субстрата для β-галактозидазы. Полный набор (MATCHMAKER^TM) для выявления белок-белковых взаимодействий между двумя конкретными белками с использованием двухгибридного способа коммерчески доступен в Clontech. Также эту систему можно расширять для картирования доменов белков, вовлеченных в конкретные белковые взаимодействия, а также для точного определения аминокислотных остатков, необходимых для этих взаимодействий.

Соединения, препятствующие взаимодействию EGFL7 и других внутри- или внеклеточных компонентов, можно тестировать следующим образом. Как правило, получают реакционную смесь, содержащую EGFL7 и внутри- или внеклеточный компонент, в условиях и в течение времени, достаточных для предоставления возможности взаимодействия и связывания двух продуктов. Для тестирования способности соединения-кандидата ингибировать связывание реакцию проводят в отсутствие и в присутствии тестируемого соединения. Кроме того, к третьей реакционной смеси можно добавлять плацебо, выступающее в качестве положительного контроля. Связывание (образование комплекса) между присутствующими в смеси тестируемым соединением и внутри- или внеклеточным компонентом наблюдают, как указано выше. Образование комплекса в контрольной реакции(ях), а не в содержащей тестируемое соединение реакционной смеси указывает на то, что тестируемое соединение препятствует взаимодействию тестируемого соединения и участвующего в реакции с ним вещества.

Антагонисты EGFL7 можно выявлять совмещением EGFL7 и возможного антагониста со связанными с мембраной рецепторами полипептида EGFL7 или рекомбинантными рецепторами в соответствующих условиях для анализа конкурентного ингибирования. EGFL7 можно метить, например, радиоактивностью, таким образом, что количество связавшихся с рецептором молекул полипептида EGFL7 можно использовать для определения эффективности возможного антагониста. Кодирующий рецептор ген можно выявлять множеством известных специалистам в данной области способов, например пэннингом лигандов и сортировкой FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun. 1(2):Chapter 5 (1991). Предпочтительно используют клонирование для экспрессии, где получают полиаденилированную РНК из восприимчивой к EGFL7 клетки, а созданную из этой РНК библиотеку кДНК подразделяют на группы и используют для трансфекции клеток COS или других клеток, которые не восприимчивы к EGFL7. Выращиваемые на предметных стеклах трансфицированные клетки подвергают воздействию меченого полипептида EGFL7. EGFL7 можно метить множеством способов, в том числе йодированием или включением участка распознавания для специфичной к участку протеинкиназы. После фиксации и инкубирования предметные стекла подвергают авторадиографическому анализу. Выявляют положительные группы и получают подгруппы, а также проводят повторную трансфекцию с использованием согласованного процесса разделения на подгруппы и повторного отбора, получая в итоге отдельный клон, который кодирует предполагаемый рецептор.

В качестве альтернативного способа выявления рецептора меченый полипептид EGFL7 можно посредством фотоаффинности связывать с клеточной мембраной или препаратами экстракта, экспрессирующими молекулу рецептора. Перекрестно связанное вещество разделяют посредством PAGE и воздействуют на рентгеновскую пленку. Содержащий рецептор меченый комплекс можно вырезать, разделять на пептидные фрагменты и подвергать микросеквенированию белка. Получаемую в результате микросеквенирования аминокислотную последовательность можно использовать для разработки набора вырожденных олигонуклеотидных зондов для скрининга библиотеки кДНК для выявления кодирующего предполагаемый рецептор гена.

В другом анализе для антагонистов клетки млекопитающего или препарат мембраны, экспрессирующие рецептор, инкубируют с меченым полипептидом EGFL7 в присутствии соединения-кандидата. Затем можно оценивать способность соединения усиливать или блокировать это взаимодействие.

Композиции, эффективные в лечении сердечно-сосудистых, эндотелиальных и ангиогенных нарушений, включают, но ими не ограничиваются, антитела, небольшие органические и неорганические молекулы, пептиды, фосфопептиды, антисмысловые молекулы и молекулы рибозимов, трехспиральные молекулы и т.д., ингибирующие экспрессию и/или активность заданного продукта гена.

Более конкретные примеры возможных антагонистов включают олигонуклеотид, связывающийся с продуктами слияния иммуноглобулина с EGFL7, а в особенности антитела, которые включают, но ими не ограничиваются, поли- и моноклональные антитела и фрагменты антител, одноцепочечные антитела, антиидиотипические антитела и химерные или гуманизированные варианты таких антител или фрагментов, а также антитела и фрагменты антител человека. Альтернативно возможный антагонист может представлять собой близкородственный белок, например мутантную форму EGFL7, которая распознает рецептор, но не оказывает эффект, тем самым конкурентно ингибируя действие EGFL7.

Другой возможный антагонист EGFL7 представляет собой конструкт антисмысловой РНК или ДНК, получаемый с использованием способа антисмысловых веществ, где, например, молекула антисмысловой РНК или ДНК действует, непосредственно блокируя трансляцию мРНК посредством гибридизации с заданной мРНК и предотвращения трансляции белка. Способ антисмысловых веществ можно использовать для управления экспрессией гена посредством трехспиральной структуры или посредством антисмысловой ДНК или РНК, где оба эти способа основаны на связывании полинуклеотида с ДНК или РНК. Например, 5'-кодирующий участок полинуклеотидной последовательности, которая кодирует указанные здесь зрелые полипептиды EGFL7, используют для конструирования антисмыслового олигонуклеотида РНК с длиной приблизительно от 10 до 40 пар оснований. Олигонуклеотид ДНК конструируют комплементарным участку гена, вовлеченному в транскрипцию (тройная спираль - см. Lee et al., Nucl. Acids Res. 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); Dervan et al., Science 251:1360 (1991)), тем самым предотвращая транскрипцию и продукцию EGFL7. В рамках настоящей заявки последовательность, “комплементарная” участку РНК, означает последовательность, которая обладает достаточной комплементарностью, чтобы быть способной гибридизоваться с РНК, образуя устойчивый дуплекс; в случае двухцепочечных антисмысловых нуклеиновых кислот можно, таким образом, тестировать отдельную цепь дуплекса ДНК или можно анализировать трехспиральную структуру. Способность гибридизоваться зависит от степени комплементарности и длины антисмысловой нуклеиновой кислоты. Как правило, чем длиннее гибридизующаяся нуклеиновая кислота, тем больше несовпадающих с РНК оснований она может содержать и при этом формировать устойчивый дуплекс (или триплекс как возможный случай). Специалист в данной области может определять допустимую степень несовпадения, используя общепринятые процедуры для определения точки плавления гибридизационного комплекса. Антисмысловой олигонуклеотид РНК гибридизуется с мРНК in vivo и блокирует трансляцию молекулы мРНК в EGFL7 (антисмысловой - Okano, Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988).

Антисмысловые олигонуклеотиды могут представлять собой ДНК или РНК, или их химерные смеси или производные, или модифицированные варианты, одноцепочечные или двухцепочечные. У олигонуклеотида можно модифицировать фрагмент основания, фрагмент сахара или фосфатную цепь, например, для улучшения стабильности молекулы, гибридизации и т.д. Олигонуклеотид может содержать другие присоединеные группы, такие как пептиды (например, для направленного воздействия на рецепторы клеток организма-хозяина in vivo) или средства, способствующие транспорту через клеточную мембрану (см., например, Letsinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556 (1989); Lemaitre, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:648-652 (1987); публикация PCT № WО88/09810, опубликованная 15 декабря 1988) или через гематоэнцефалитический барьер (см., например, публикацию PCT № WО89/10134, опубликованную 25 апреля 1988), запускающие гибридизацию расщепляющие средства (см., например, Krol et al., BioTechniques 6:958-976 (1988)) или средства для вставки (см., например, Zon, Pharm. Res. 5:539-549 (1988)). В этих целях олигонуклеотид можно конъюгировать с другой молекулой, например пептидом, запускающим гибридизацию перекрестно связывающимся средством, транспортным средством, запускающим гибридизацию расщепляющим средством и т.д.

Антисмысловой олигонуклеотид может содержать по меньшей мере один модифицированный фрагмент основания, который выбирают из группы, включающей, но ими не ограничивающейся, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-йодурацил, гипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, бета-D-галактозилквеозин, инозин, N6-изопентениладенин, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-аденин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеозин, 5'-метоксикарбоксиметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6-изопентениладенин, урацил-5-оксиуксусную кислоту (v), вибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, сложный метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусную кислоту (v), 5-метил-2-тиоурацил, 3-(3-амино-3-N-2-кабоксипропил)урацил, (acp3)w и 2,6-диаминопурин.

Также антисмысловой олигонуклеотид может содержать по меньшей мере один модифицированный фрагмент сахара, выбранный из группы, которая включает, но ими не ограничивается, арабинозу, 2-фторарабинозу, ксилулозу и гексозу.

В еще одном варианте осуществления антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную фосфатную цепь, выбранную из группы, которая состоит из фосфортиоата, фосфордитиоата, фосфорамидотиоата, фосфорамидата, фосфордиамидата, метилфосфоната, сложного алкилфосфотриэфира и формацеталя или их аналога.

В еще одном варианте осуществления антисмысловой олигонуклеотид представляет собой аномерный олигонуклеотид. Аномерный олигонуклеотид образует специфические двухцепочечные гибриды с комплементарной РНК, в которой в отличие от обычных звеньев цепи направлены параллельно друг другу (Gautier, et al., Nucl. Acids Res. 15:6625-6641 (1987)). Олигонуклеотид представляет собой 2'-0-метилрибонуклеотид (Inoue, et al., Nucl. Acids Res. 15:6131-6148 (1987)) или химерный РНК-ДНК аналог (Inoue, et al., FEBS Lett. 215:327-330 (1987)).

Олигонуклеотиды по изобретению можно синтезировать известными в данной области общепринятыми способами, например, с использованием автоматического синтезатора ДНК (такого как коммерчески доступные в Biosearch, Applied Biosystems и т.д.). Например, фосфортиоатные олигонуклеотиды можно синтезировать способом Stein, et al. (Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)), метилфосфонатные олигонуклеотиды можно получать с использованием носителей из полимерного стекла с контролируемым размером пор (Sarin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451 (1988)) и т.д.

Также описанные выше олигонуклеотиды можно доставлять в клетки таким образом, что антисмысловая РНК или ДНК может экспрессироваться in vivo, ингибируя продукцию EGFL7. При использовании антисмысловой ДНК предпочтительны олигодезоксирибонуклеотиды, получаемые из участка инициации трансляции, например, между положениями -10 и +10 нуклеотидной последовательности заданного гена.

Как правило, молекулы антисмысловой РНК или ДНК имеют длину по меньшей мере приблизительно 5 оснований, длину приблизительно 10 оснований, длину приблизительно 15 оснований, длину приблизительно 20 оснований, длину приблизительно 25 оснований, длину приблизительно 30 оснований, длину приблизительно 35 оснований, длину приблизительно 40 оснований, длину приблизительно 45 оснований, длину приблизительно 50 оснований, длину приблизительно 55 оснований, длину приблизительно 60 оснований, длину приблизительно 65 оснований, длину приблизительно 70 оснований, длину приблизительно 75 оснований, длину приблизительно 80 оснований, длину приблизительно 85 оснований, длину приблизительно 90 оснований, длину приблизительно 95 оснований, длину приблизительно 100 оснований или более.

Кроме того, возможные антагонисты включают небольшие молекулы, связывающиеся с активным участком, участком связывания рецептора или участком связывания фактора роста или другим соответствующим участком связывания, принадлежащим EGFL7, тем самым блокируя обычную биологическую активность EGFL7. Примеры небольших молекул включают, но ими не ограничиваются, небольшие пептиды или пептидоподобные молекулы, предпочтительно растворимые пептиды, а также синтетические непептидильные органические или неорганические соединения.

Дополнительные возможные антагонисты представляют собой рибозимы, являющиеся ферментативными молекулами РНК, которые способны катализировать специфическое расщепление РНК. Рибозимы действуют посредством специфичной к последовательности гибридизации с комплементарной РНК-мишенью с последующим эндонуклеолитическим расщеплением. Специфичные участки расщепления для рибозима в пределах возможной РНК-мишени можно выявлять известными способами. Для дополнительных подробностей см., например, Rossi, Current Biology 4:469-471 (1994) и публикацию PCT № WO 97/33551 (опубликованную 18 сентября 1997).

Хотя для разрушения мРНК гена-мишени можно использовать рибозимы, расщепляющие мРНК в последовательностях для сайт-специфичного распознавания, предпочтительным является использование рибозимов со структурой “головка молотка”. Рибозимы со структурой “головка молотка” расщепляют мРНК в положениях, обусловленных фланкирующими участками, которые формируют комплементарные пары оснований с мРНК-мишенью. Единственное условие состоит в том, что мРНК-мишень имеет следующую последовательность из двух оснований: 5'-UG-3'. Конструирование и получение рибозимов со структурой “головка молотка” хорошо известно в данной области и более подробно описано в Myers, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York (1995), (см. особенно фигуру 4, страницу 833) и в Haseloff and Gerlach, Nature, 334:585-591 (1988), которые приведены здесь полностью в качестве ссылки.

Предпочтительно рибозим конструируют таким образом, что участок распознавания для расщепления расположен рядом с 5'-концом мРНК гена-мишени, т.е. для повышения эффективности и для минимизации внутриклеточного накопления нефункциональных транскриптов мРНК.

Также рибозимы по настоящему изобретению включают РНК-эндорибонуклеазы (здесь и далее “рибозимы Чех-типа”), такие как рибозим, который встречается в природе у Tetrahymena thermophila (известный как IVS или РНК L-19 IVS) и который был подробно описан Thomas Cech и сотрудниками (Zaug, et al., Science, 224:574-578 (1984); Zaug and Cech, Science, 231:470-475 (1986); Zaug, et al., Nature, 324:429-433 (1986); опубликованная международная патентная заявка №WO 88/04300 в University Patents Inc.; Been and Cech, Cell, 47:207-216 (1986)). Рибозимы Чех-типа имеют активный участок из восьми пар оснований, который гибридизуется с последовательностью РНК-мишени, после чего происходит расщепление РНК-мишени. Изобретение включает те рибозимы Чех-типа, которые направлены к последовательностям активных участков из восьми пар оснований, присутствующим в гене-мишени.

Как и в способе антисмысловых веществ, рибозимы можно составлять из модифицированных олигонуклеотидов (например, для улучшенной устойчивости, направленности и т.д.), и их следует доставлять в клетки, экспрессирующие ген-мишень in vivo. Предпочтительный способ доставки предусматривает использование конструкта ДНК, “кодирующего” рибозим под контролем сильного конститутивного промотора pol III или pol II таким образом, что трансфицируемые клетки продуцируют достаточные количества рибозима для разрушения транскриптов эндогенного гена-мишени и ингибирования трансляции. Поскольку рибозимы в отличие от антисмысловых молекул являются каталитическими, то для эффективности действия необходима более низкая концентрация внутри клетки.

Используемые для ингибирования транскрипции молекулы нуклеиновой кислоты с трехспиральной структурой должны быть одноцепочечными и состоять из дезоксинуклеотидов. Основную композицию этих олигонуклеотидов разрабатывают таким образом, что она способствует образованию трехспиральной структуры согласно правилам спаривания оснований Хугстэна, которые в основном требуют значительного размера участков из пуринов или пиримидинов на одной из цепей дуплекса. Для дополнительных подробностей см., например, PCT № WO 97/33551, выше.

Эти небольшие молекулы можно выявлять каким-либо одним или несколькими указанными выше анализами отбора и/или другими хорошо известными для специалистов в данной области способами отбора.

Типы подлежащих лечению сердечно-сосудистых, эндотелиальных и ангиогенных нарушений

EGFL7 или его агонисты, обладающие активностью в описанных здесь сердечно-сосудистых, эндотелиальных и ангиогенных анализах, вероятно, имеют терапевтическое применение для множества сердечно-сосудистых, эндотелиальных и ангиогенных нарушений, в том числе системных нарушений, поражающих сосуды, таких как сахарный диабет. Их терапевтическое применение может включать заболевания артерий, капилляров, вен и/или лимфатических сосудов. В настоящей заявке примеры вариантов лечения включают лечение синдрома атрофии мышц, лечение остеопороза, способствование в фиксации имплантата, стимулируя рост клеток вокруг имплантата и тем самым способствуя его прикреплению в предназначенном для него участке, повышение устойчивости IGF в тканях или в сыворотке, если возможно, а также повышение связывания с рецептором IGF (поскольку было показано in vitro, что IGF усиливает рост эритроцитарных и гранулоцитарных клеток-предшественников костного мозга человека).

Также EGFL7 или его агонисты можно использовать для стимуляции эритропоэза или гранулоцитопоэза для стимуляции заживления ран или регенерации тканей, а также связанных способов лечения, которые относятся к повторному росту ткани, такой как соединительная ткань, кожа, кость, хрящ, мышцы, легкие или почки, для способствования ангиогенезу, для стимуляции или ингибирования миграции эндотелиальных клеток, а также для повышения роста гладкой мускулатуры сосудов и продукции эндотелиальных клеток. Опосредуемое EGFL7 или агонистом усиление ангиогенеза благоприятно для ишемизированных тканей и для развития в сердце коллатералей коронарных сосудов после коронарного стеноза. Антагонисты используют для ингибирования действия таких полипептидов, например, для ограничения избыточной продукции соединительной ткани в ходе заживления ран или фиброза легких, если EGFL7 способствует такой продукции. Это включает лечение острого инфаркта миокарда и сердечной недостаточности.

Ниже описаны конкретные типы заболеваний, при которых EGFL7 может быть эффективен для связанного с сосудами нацеливания лекарственного средства или служить в качестве терапевтических мишеней для лечения или профилактики заболеваний. Атеросклероз представляет собой заболевание, характеризующееся накоплением утолщающих интиму артерий бляшек вследствие накопления липидов, пролиферации гладкомышечных клеток и образования в стенке артерий фиброзной ткани. Заболевание может поражать крупные, средние и мелкие артерии в любом органе. Известно, что изменения функции эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудов играют важную роль в регуляции накопления и регресса этих бляшек.

Гипертензия характеризуется повышенным сосудистым давлением в системах системных артерий, легочных артерий и воротной вены. Повышенное давление может возникать в результате или приводить в результате к нарушенной функции эндотелия и/или сосудистому заболеванию.

Воспалительные васкулиты включают гигантоклеточный артериит, артериит Такаясу, узелковый полиартериит (в том числе микроангиопатическую форму), болезнь Кавасаки, микроскопический полиангиит, гранулематоз Вегенера и множество связанных с инфекцией сосудистых нарушений (в том числе пурпуру Геноха-Шенлейна). Была показана важность в этих заболеваниях измененной функции эндотелиальных клеток.

Болезнь Рейно и феномен Рейно характеризуются периодическим патологическим нарушением кровотока в конечностях при воздействии холода. Была показана важность в этом заболевании измененной функции эндотелиальных клеток.

Аневризмы представляют собой мешковидные или веретенообразные расширения артериального или венозного ствола, связанные с измененными эндотелиальными клетками и/или сосудистыми гладкомышечными клетками.

Рестеноз артерии (рестеноз стенки артерии) может возникать после ангиопластики как результат изменения функции и пролиферации эндотелиальных и сосудистых гладкомышечных клеток.

Тромбофлебит и лимфангит представляют собой воспалительные заболевания вен и лимфатических сосудов соответственно, которые могут возникать в результате и/или приводить в результате к измененной функции эндотелиальных клеток. Сходным образом лимфатический отек представляет собой состояние, включающее повреждение лимфатических сосудов, которое обусловлено функцией эндотелиальных клеток.

Семейство доброкачественных и злокачественных сосудистых опухолей характеризуется патологической пролиферацией и ростом клеточных элементов сосудистой системы. Например, лимфангиомы представляют собой доброкачественные опухоли лимфатической системы, являющиеся врожденными, обычно кистозными, пороками лимфатических сосудов, которые возникают, как правило, у новорожденных. Кистозные опухоли имеют тенденцию прорастать в прилегающую ткань. Как правило, кистозные опухоли возникают в шейной и подмышечной областях. Также они могут возникать в мягкой ткани конечностей. Основными симптомами являются расширенные, иногда сетевидные, структурированные лимфатические сосуды и лимфатические кисты, окруженные соединительной тканью. Предполагают, что лимфангиомы обусловлены неправильным соединением эмбриональных лимфатических сосудов или их недостатком. Результатом является нарушенный местный отток лимфы. Griener et al., Lymphology 4:140-144 (1971).

Другой вариант применения антагонистов EGFL7 представляет собой профилактику опухолевого ангиогенеза, который включает образование сосудов в опухоли, позволяющее ей расти и/или метастазировать. Этот процесс зависит от роста новых кровеносных сосудов. Примеры новообразований и связанных состояний, в которые вовлечен опухолевый ангиогенез, включают плоскоклеточный рак, рак легких (в том числе мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких и плоскоклеточную карциному легких), рак брюшной полости, гепатоцеллюлярный рак, гастральный рак или рак желудка (в том числе рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой и ободочной кишки, карциному эндометрия или матки, карциному слюнных желез, рак почек или ренальный рак, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, гепатокарциному и различные типы рака головы и шеи, а также B-клеточную лимфому (в том числе низкой степени злокачественности/фолликулярную неходжкинскую лимфому (NHL); NHL малых лимфоцитов (SL); промежуточной степени злокачественности/фолликулярную NHL; диффузную NHL промежуточной степени злокачественности; иммунобластную NHL высокой степени злокачественности; лимфобластную NHL высокой степени злокачественности; NHL мелких клеток с нерасщепленными ядрами высокой степени злокачественности; NHL с массивным поражением; лимфому из клеток мантийной зоны; связанную со СПИД лимфому; а также макроглобулинемию Вальденстрема); хронический лимфолейкоз (CLL); острый лимфобластный лейкоз (ALL); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз; и посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (PTLD), а также связанную с факоматозами патологическую пролиферацию сосудов, отек (такой как связанный с опухолями головного мозга) и синдром Мейгса.

Также антагонисты EGFL7 могут быть эффективны в лечении внутриглазных неоваскулярных заболеваний, включающих, но ими не ограничивающихся, пролиферативные ретинопатии, хориоидальное образование новых сосудов (CNV), связанную с возрастом дегенерацию желтого пятна (AMD), диабетическую и другие связанные с ишемией ретинопатии, диабетический отек желтого пятна, патологическую миопию, болезнь Гиппель-Линдау, гистоплазмоз глаза, окклюзию центральной вены сетчатки (CRVO), образование новых сосудов в роговице, образование новых сосудов в сетчатке и т.д.

Другим показанием является ревматоидный артрит. Рост кровеносных сосудов и направление воздействия провоспалительных клеток через сосудистую систему представляют собой важный компонент в патогенезе ревматоидной и серонегативной форм артрита.

В связи с указанным выше описанные здесь EGFL7, его агонисты или антагонисты, для которых показано изменение или влияние на функцию и миграцию эндотелиальных клеток, вероятно, играют важную роль в этиологии и патогенезе многих или всех указанных выше нарушений и, как таковые, могут служить в качестве терапевтических мишеней для усиления или ингибирования этих процессов или для связанного с сосудами нацеливания лекарственного средства при этих нарушениях.

Протоколы, схемы, дозы и препараты для введения

Указанные здесь молекулы и их агонисты и антагонисты фармацевтически эффективны в качестве профилактического и терапевтического средства для различных нарушений и заболеваний, как описано выше.

Терапевтические композиции EGFL7 или агонистовили антагонистов получают для хранения в виде лиофилизированных препаратов или водных растворов посредством смешивания желаемой молекулы, имеющей соответствующую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)). Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы в используемых дозах и концентрациях не токсичны для реципиентов и содержат буферы, такие как фосфатный, цитратный и относящиеся к другим органическим кислотам; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; феноловый, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; пентанол-3; а также м-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (приблизительно менее чем 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металла (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN^TM, PLURONICS^TM или полиэтиленгликоль (PEG).

Дополнительные примеры таких носителей включают ионообменные вещества, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, белки сыворотки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, неполные глицеридные смеси насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, вторичный кислый фосфат натрия, первичный кислый фосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный оксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы и полиэтиленгликоль. Носители для форм агониста или антагониста для местного применения или на основе геля включают полисахариды, такие как карбоксиметилцеллюлозу натрия или метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, полиакрилаты, блок-полимеры полиоксиэтилен-полиоксипропилен, полиэтиленгликоль и древесные парафиновые спирты. Соответственно для всех способов введения используют общепринятые депонирующие формы. Такие формы включают, например, микрокапсулы, нанокапсулы, липосомы, пластыри, формы для ингаляции, спреи для носа, таблетки для подъязычного применения и препараты с замедленным высвобождением. Как правило, EGFL7 или агонистыили антагонисты смешивают с такими носителями в концентрации приблизительно от 0,1 мг/мл до 100 мг/мл.

Другой препарат содержит EGFL7 или его агонист, или антагонист, включенный в состав формованных веществ. Такие вещества можно использовать в регуляции роста эндотелиальных клеток и ангиогенеза. Кроме того, с использованием этих веществ можно регулировать инвазию и метастазирование опухоли.

Подлежащие применению для введения in vivo полипептиды EGFL7 или агонистыили антагонисты должны быть стерильны. Это легко осуществлять фильтрацией через стерильные мембраны для фильтрации перед или после лиофилизации и восстановления. В случае системного введения полипептиды EGFL7 обычно хранят в лиофилизированном виде или в растворе. Как правило, в случае лиофилизированной формы EGFL7 или его агонист, или антагонист составляют в сочетании с другими ингредиентами для восстановления с соответствующим разбавителем на момент использования. Пример жидкого препарата EGFL7 или агониста, или антагониста представляет собой стерильный, прозрачный бесцветный неконсервированный раствор, которым заполняют сосуд для однократной дозы для подкожной инъекции. Приемлемые для многократного применения консервированные фармацевтические композиции могут содержать, например, в основном в зависимости от показания и типа полипептида:

полипептид EGFL7 или его агонист, или антагонист;

буферное вещество, способное поддерживать pH в диапазоне для максимальной стабильности полипептида или другой молекулы в растворе, предпочтительно приблизительно 4-8;

детергент/поверхностно-активное вещество, в основном, для придания устойчивости полипептиду или молекуле к вызываемой перемешиванием агрегации;

придающее изотоничность средство;

консервант, выбранный из группы фенола, бензилового спирта и галогенида бензетония, например, хлорида; а также

воду.

В случае использования неионного детергента он может представлять собой, например, полисорбаты (например, POLYSORBATE^TM (TWEEN^TM) 20, 80 и т.д.) или полоксамеры (например, POLOXAMER^TM 188). Использование неионных поверхностно-активных веществ позволяет подвергать препарат воздействию напряжений сдвига поверхности, не вызывая денатурацию полипептида. Кроме того, такие содержащие поверхностно-активное вещество препараты можно использовать в аэрозольных устройствах, таких как устройства, используемые для введения дозы в легкие, и в безыгольных реактивных пистолетах для инъекции (см., например, EP 257956).

Придающее изотоничность средство может присутствовать для обеспечения изотоничности жидкой композиции EGFL7 или его агониста, или антагониста и включает многоатомные сахарные спирты, предпочтительно трехатомные или более сахарные спирты, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит и маннит. Эти сахарные спирты можно использовать по отдельности или в сочетании. Альтернативно для придания растворам изотоничности можно использовать хлорид натрия или другие соответствующие неорганические соли.

Буфер может представлять собой, например, ацетатный, цитратный, сукцинатный или фосфатный буфер в зависимости от желаемого pH. Величина pH одного из типов жидкого препарата по этому изобретению поддерживается буфером в диапазоне приблизительно от 4 до 8, предпочтительно приблизительно на уровне физиологического pH.

Известные противомикробные средства, которые можно использовать, представляют собой консерванты фенол, бензиловый спирт и галогениды бензетония, например, хлорид.

Как правило, описанные здесь терапевтические композиции полипептида помещают в контейнер со стерильным входным отверстием, например в пакет или сосуд для внутривенного раствора, имеющий пробку, которая поддается прокалыванию иглой для подкожной инъекции. Предпочтительно препараты вводят в виде многократных внутривенных (i.v.), подкожных (s.c.) или внутримышечных (i.m.) инъекций или в виде аэрозольных препаратов, приемлемых для интраназальной или внутрилегочной доставки (для внутрилегочной доставки см., например, EP 257956).

Также терапевтические полипептиды можно вводить в виде препаратов с замедленным высвобождением. Приемлемые примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из содержащих белок твердых гидрофобных полимеров, где матрицы находятся в виде веществ с заданной формой, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), как описано Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981) и Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982), или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США №3773919, EP 58481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата (Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983)), неразлагаемый ацетат этиленвинила (Langer et al., выше), разлагаемые сополимеры молочная кислота-гликолевая кислота, такие как Lupron Depot^TM (вводимые инъекцией микросферы, состоящие из сополимера молочная кислота-гликолевая кислота и ацетата леупролида), а также поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту (EP 133988).

Тогда как полимеры, такие как ацетат этиленвинила и молочная кислота-гликолевая кислота, способны высвобождать молекулы в течение более чем 100 суток, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. Если заключенные в капсулу белки остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия влаги при 37°C, что приводит к утрате биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. В зависимости от имеющего место механизма можно разрабатывать целесообразные способы для стабилизации белка. Например, если выявленный механизм агрегации представляет собой образование внутримолекулярных связей S-S посредством реакции тиодисульфидного обмена, то стабилизацию можно осуществлять модифицированием сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислых растворов, контролированием содержания влаги, использованием соответствующих добавок и разработкой специфических композиций полимерных матриц.

Также композиции полипептида EGFL7 с замедленным высвобождением включают заключенные в липосомы полипептиды EGFL7. Содержащие полипептид EGFL7 липосомы получают способами, известными в качестве таковых: DE 3218121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030-4034 (1980); EP 52322; EP 36676; EP 88046; EP 143949; EP 142641; патентная заявка Японии 83-118008; патенты США №№4485045 и 4544545; а также EP 102324. Как правило, липосомы являются мелкими (приблизительно 200-800 ангстрем), однослойного типа, в которых содержание липидов составляет приблизительно более чем 30% молярных холестерина, где выбираемое соотношение приводят в соответствие для оптимального лечения.

Безусловно терапевтически эффективная доза EGFL7 или его агониста, или антагониста различается в зависимости от таких факторов, как подлежащее лечению (в том числе профилактике) патологическое состояние, способ введения, тип используемого для лечения соединения, какое-либо применяемое сочетанное лечение, возраст пациента, масса, общее медицинское состояние, история болезни и т.д., и определение этой дозы полностью входит в навыки практикующего врача. Соответственно врачу необходимо титровать дозу и изменять способ введения, как необходимо для достижения максимального терапевтического эффекта. Если EGFL7 имеет узкий диапазон организмов-хозяев, то для лечения пациента человека предпочтительны препараты, содержащие полипептид EGFL7 человека, более предпочтительно - природную последовательность полипептида EGFL7 человека. Врач-клиницист вводит EGFL7 до достижения дозы, обеспечивающей желаемый эффект для лечения рассматриваемого состояния. Например, если цель состоит в лечении CHF, то количество представляет собой количество, которое ингибирует связанную с этим состоянием прогрессирующую гипертрофию сердца. Эффективность этого лечения легко наблюдать посредством эхокардиографии. Сходным образом, пациентам с гипертрофической кардиомиопатией EGFL7 можно вводить на эмпирической основе.

В связи с указанными выше рекомендациями эффективная доза, как правило, находится в диапазоне приблизительно от 0,001 до приблизительно 1,0 мг/кг, более предпочтительно - приблизительно 0,01-1,0 мг/кг, наиболее предпочтительно - 0,01-0,1 мг/кг.

При непероральном применении в лечении гипертензии у взрослых людей EGFL7 эффективно вводить в виде раствора для инъекции в количестве приблизительно от 0,01 до 50 мг, предпочтительно - приблизительно от 0,05 до 20 мг, наиболее предпочтительно - от 1 до 20 мг на кг массы тела, от 1 до 3 раз в сутки посредством внутривенной инъекции. При пероральном введении молекулу на основе EGFL7 вводят в количестве приблизительно от 5 мг до 1 г, предпочтительно - приблизительно от 10 мг до 100 мг на кг массы тела, от 1 до 3 раз в сутки. Следует понимать, что примесь эндотоксина должна находиться, как минимум, на безопасном уровне, например, менее чем 0,5 нг/мг белка. Более того, в случае введения человеку препараты предпочтительно удовлетворяют условиям стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты, как требуют стандарты управления FDA и биологические стандарты.

Схему введения дозы, содержащей EGFL7 фармацевтической композиции, которая подлежит использованию для регенерации тканей, определяет лечащий врач, учитывая различные факторы, изменяющие действие полипептидов, например величину массы ткани, которую желательно образовать, участок повреждения, состояние поврежденной ткани, размер раны, тип поврежденной ткани (например, кость), возраст пациента, пол и диету, тяжесть какой-либо инфекции, время введения и другие клинические факторы. Дозы могут различаться в зависимости от типа используемой в восстановлении матрицы и от включения в фармацевтическую композицию других белков. Например, на дозу может также влиять добавка к конечной композиции других известных факторов роста, таких как IGF-I. Эффективность можно наблюдать периодической оценкой роста ткани/кости и/или восстановления, например, посредством рентгенографии, гистоморфометрических определений и мечения тетрациклина.

Способы введения полипептида EGFL7 или антагониста, или агониста соответствуют известным способам, например с использованием инъекции или инфузии посредством внутривенного, внутримышечного, внутримозгового, внутрибрюшинного, внутриспинномозгового, подкожного, внутриглазного, внутрисуставного, внутрисиновиального, интратекального, перорального, местного способов введения или способа введения ингаляцией, или посредством систем с замедленным высвобождением, как указано ниже. EGFL7 или его агонист, или антагонист также приемлемо вводить способами введения внутрь опухоли, вокруг опухоли, внутрь поврежденной области или вокруг поврежденной области для оказания местных, а также системных терапевтических эффектов. Предполагают, что способ внутрибрюшинного введения особенно эффективен, например, в лечении опухолей яичника.

Если в качестве антагониста или агониста используют пептид или небольшую молекулу, то их предпочтительно вводить млекопитающим перорально или неперорально в виде жидкости или твердого вещества.

Примеры фармакологически приемлемых солей молекул, которые образуют соли и могут использоваться здесь, включают соли щелочных металлов (например, соль натрия, соль калия), соли щелочноземельных металлов (например, соль кальция, соль магния), соли аммония, соли органических оснований (например, соль пиридина, соль триэтиламина), соли неорганических кислот (например, гидрохлорид, сульфат, нитрат) и соли органических кислот (например, ацетат, оксалат, п-толуолсульфонат).

Для указанных здесь композиций, эффективных для регенерации кости, хряща, сухожилия или связки, способ лечения включает наружное, системное или местное применение композиции в виде имплантата или устройства. При введении используемая терапевтическая композиция находится в не содержащей пирогенов физиологически приемлемой форме. Кроме того, может быть желательно заключать композицию в капсулу или вводить инъекцией в вязком виде для доставки к участку повреждения кости, хряща или ткани. Наружное применение может быть приемлемо для заживления ран и восстановления тканей. Предпочтительно для образования кости и/или хряща композиция включает матрицу, способную доставлять содержащую белок композицию к участку повреждения кости и/или хряща, обеспечивая структуру для развития кости и хряща, а также предпочтительно способную к всасыванию в организме. Такие матрицы можно получать из материалов, используемых в настоящее время для других медицинских способов применения имплантации.

Выбор вещества матрицы основан на биосовместимости, биоразлагаемости, механических свойствах, косметическом наружном виде и свойствах поверхности. Соответствующий препарат обусловлен конкретным вариантом применения композиций. Возможные матрицы для композиций могут представлять собой биоразлагаемый и с заданным химическим составом сульфат кальция, трикальцийфосфат, гидроксиапатит, полимер молочной кислоты, полимер гликолевой кислоты и полиангидриды. Другие возможные вещества представляют собой биоразлагаемые и с четко определенным биологическим составом вещества, такие как коллаген костей или кожи. Другие матрицы состоят из чистых белков или компонентов внеклеточного матрикса. Другие возможные матрицы представляют собой небиоразлагаемые и с заданным химическим составом вещества, такие как спеченный гидроксиапатит, биостекло, алюминаты или другие керамические вещества. Матрицы могут состоять из сочетаний любых из указанных выше типов веществ, таких как полимер молочной кислоты и гидроксиапатит или коллаген и трикальцийфосфат. Биокерамические вещества можно изменять по составу, такому как в фосфате кальцийалюминия, и обрабатывать для изменения размера пор, размера частиц, формы частиц и биоразлагаемости.

Один из конкретных вариантов осуществления представляет собой сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты 50:50 (по молярной массе) в виде пористых частиц с диаметрами в диапазоне от 150 до 800 микрон. В некоторых вариантах применения эффективно использовать связывающее средство, такое как карбоксиметилцеллюлоза или аутологичный сгусток крови, для предотвращения диссоциации композиций полипептида из матрицы.

Одно из приемлемых семейств связывающих средств представляет собой целлюлозные вещества, такие как алкилцеллюлозы (в том числе гидроксиалкилцеллюлозы), включая метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу, где предпочтительны катионные соли карбоксиметилцеллюлозы (CMC). Другие предпочтительные связывающие вещества включают гиалуроновую кислоту, альгинат натрия, поли(этиленгликоль), оксид полиоксиэтилена, карбоксивиниловый полимер и поли(виниловый спирт). Эффективное здесь количество связывающего средства составляет 0,5-20 мас.%, предпочтительно - 1-10 мас.% от общей массы препарата, представляя собой количество, необходимое для предотвращения десорбции полипептида (или его антагониста) из полимерной матрицы и для обеспечения соответствующего применения композиции, но не настолько большое, чтобы предотвращать инфильтрацию матрицы клетками-предшественниками, тем самым предоставляя полипептиду (или его антагонисту) возможность способствовать остеогенной активности клеток-предшественников.

Варианты сочетанного (комбинированного) лечения

Эффективность EGFL7 или его агониста, или антагониста в профилактике или лечении рассматриваемого нарушения можно повышать введением активного средства периодически или в сочетании с другим эффективным для этих целей средством в той же самой композиции или в виде отдельных композиций.

Например, антагонисты EGFL7, используемые для лечения связанных с ангиогенезом состояний, таких как злокачественная опухоль или глазные заболевания, можно сочетать с цитотоксическими, химиотерапевтическими или противоангиогенными средствами, как указано выше. На модели опухоли было открыто, что EGFL7 остается в участках следования претерпевающих обратное развитие сосудов опухоли после того, как опухоль обрабатывали антителом к VEGF (см. примеры). Не желая ограничиваться конкретной теорией, возможно, что EGFL7 действует, способствуя миграции EC вдоль существующих путей ECM и, таким образом, способствуя повторному росту сосудов опухоли после противоангиогенной обработки. Поэтому желательно использовать антагонисты EGFL7 в сочетании с противоангиогенным средством для усиления или повышения восприимчивости к действию противоангиогенного средства. В предпочтительном варианте осуществления антагонист EGFL7 используют в сочетании с антителом к VEGF, бевацизумабом, для повышения его противоопухолевой эффективности.

Эффективные количества терапевтических средств, вводимых в сочетании с EGFL7 или его агонистом, или антагонистом, оставляют на усмотрение врача или ветеринара. Введение и регулирование доз осуществляют для обеспечения наилучшего лечения подлежащих лечению состояний. Например, в идеальном случае, при лечении гипертензии для этих количеств учитывают использование диуретиков или препаратов наперстянки, а также такие состояния, как гипер- или гипотензия, почечная недостаточность и т.д. Кроме того, доза зависит от таких факторов, как тип подлежащего использованию терапевтического средства и конкретный пациент, подлежащий лечению. Как правило, используемое количество составляет такую же дозу, которую используют при введении указанного терапевтического средства в отсутствие EGFL7.

Изделия

Изделие, такое как набор, содержащий EGFL7 или его агонисты, или антагонисты, которые эффективны для диагностики или лечения указанных выше заболеваний, содержит по меньшей мере контейнер и ярлык. Приемлемые контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и пробирки. Контейнеры можно получать из множества веществ, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, эффективную для диагностики или лечения состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет или сосуд для внутривенного раствора, имеющий пробку, которая поддается прокалыванию иглой для подкожной инъекции). Активное средство в композиции представляет собой EGFL7 или его агонист, или антагонист. На ярлыке, расположенном на или приложенным с контейнером, указывают, что композицию применяют для диагностики или лечения выбранного состояния. Кроме того, набор может содержать второй контейнер, включающий фармацевтически приемлемый буфер, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, он может содержать другие вещества, желательные с коммерческой или потребительской точки зрения, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и листки-вкладыши с инструкциями по применению. Также изделие может содержать второй или третий контейнер с другим активным средством, как описано выше.

Антитела к EGFL7

Некоторые наиболее перспективные лекарственные средства-кандидаты по настоящему изобретению представляют собой антитела и фрагменты антител, способные ингибировать продукцию или генный продукт указанного здесь гена и/или снижать активность продуктов гена.

Поликлональные антитела

Специалисту в данной области известны способы получения поликлональных антител. Поликлональные антитела можно получать у млекопитающего, например, одной или несколькими инъекциями иммунизирующего средства и, по желанию, адъюванта. Как правило, иммунизирующее средство и/или адъювант вводят млекопитающему инъекцией посредством многократных подкожных или внутрибрюшинных инъекций. Иммунизирующее средство может содержать полипептид EGFL7 или его слитый белок. Может быть эффективна конъюгация иммунизирующего средства с белком, для которого известна иммуногенность у подлежащего иммунизации животного. Примеры таких иммуногенных белков включают, но ими не ограничиваются, гемоцианин лимфы улитки, сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин и соевый ингибитор трипсина. Примеры адъювантов, которые можно использовать, включают полный адъювант Фрейнда и адъювант MPL-TDM (монофосфориллипид A или синтетический дикориномиколат трегалозы). Схему иммунизации специалист в данной области может выбирать в отсутствие лишнего проведения экспериментов.

Моноклональные антитела

Альтернативно антитела к EGFL7 могут представлять собой моноклональные антитела. Моноклональные антитела можно получать с использованием способов гибридом, таких как способы, описанные Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975). Как правило, в способе гибридом мышь, хомяка или другое соответствующее животное-хозяина иммунизируют иммунизирующим средством для получения лимфоцитов, продуцирующих или способных продуцировать антитела, которые специфически связываются с иммунизирующим средством. Альтернативно лимфоциты можно иммунизировать in vitro.

Как правило, иммунизирующее средство содержит полипептид EGFL7 или его слитый белок. В целом, если желательны клетки человеческого происхождения, то используют лимфоциты периферической крови (“PBL”), а если желательны источники из не относящихся к человеку млекопитающих, то используют клетки селезенки или клетки лимфатических узлов. Затем лимфоциты сливают с бессмертной линией клеток с использованием приемлемого средства для слияния, такого как полиэтиленгликоль, образуя клеточную гибридому. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103. Как правило, бессмертные линии клеток представляют собой трансформированные клетки млекопитающих, особенно клетки миеломы, происходящие от грызунов, быка или человека. Как правило, используют линии клеток миеломы крысы или мыши. Клеточные гибридомы можно культивировать в приемлемой культуральной среде, предпочтительно содержащей одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых бессмертных клеток. Например, если у родительских клеток отсутствует фермент гипоксантин-гуанин-фосфорибозил-трансфераза (HGPRT или HPRT), то культуральная среда для гибридом, как правило, содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин (“среда HAT”), где эти вещества предотвращают рост HGPRT-дефицитных клеток.

Предпочтительные бессмертные линии клеток представляют собой линии, которые эффективно сливаются, поддерживают на высоком уровне устойчивую экспрессию антитела выбранными клетками, продуцирующими антитело и которые чувствительны к среде, такой как среда HAT. Более предпочтительные бессмертные линии клеток представляет собой линии миеломы мыши, которые можно получать, например, из Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California и Американской коллекции типовых культур, Manassas, Virginia. Также для получения моноклональных антител человека были описаны линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы человека-мыши. Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) pp. 51-63.

Затем культуральную среду, в которой культивируют клеточные гибридомы, можно анализировать на наличие направленных к полипептиду EGFL7 моноклональных антител. Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клеточными гибридомами, определяют иммунопреципитацией или анализом связывания in vitro, таким как радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Такие способы и анализы известны в данной области. Например, аффинность связывания моноклонального антитела можно определять анализом Скэтчарда по Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980).

После выявления желаемых клеточных гибридом клоны можно субклонировать способом серийных разведений и выращивать посредством известных способов. Goding, выше. Приемлемые для этой цели культуральные среды включают, например, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла и среду RPMI-1640. Альтернативно клеточные гибридомы можно выращивать in vivo в виде асцита у млекопитающего.

Секретируемые субклонами моноклональные антитела можно выделять или очищать из культуральной среды или асцитной жидкости общепринятыми процедурами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, белок A-сефароза, хроматография на основе гидроксиапатита, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

Также моноклональные антитела можно получать способами рекомбинантной ДНК, такими как способы, описанные в патенте США №4816567. Кодирующую моноклональные антитела по изобретению ДНК можно легко выделять и секвенировать с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, которые кодируют тяжелую и легкую цепи антител мыши). В качестве предпочтительного источника такой ДНК служат клеточные гибридомы по изобретению. После выделения ДНК можно помещать в векторы экспрессии, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, не продуцирующие иным способом белок иммуноглобулина, для достижения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Также ДНК можно модифицировать, например, заменой кодирующей последовательности для константных доменов тяжелой и легкой цепей человека вместо гомологичных последовательностей мыши (патент США №4816567; Morrison et al., выше) или ковалентным присоединением к кодирующей иммуноглобулин последовательности всей или части кодирующей последовательности для не относящегося к иммуноглобулину полипептида. Таким не относящимся к иммуноглобулину полипептидом можно заменять константные домены антитела по изобретению или можно заменять вариабельные домены одного из антигенсвязывающих участков антитела по изобретению для получения химерного бивалентного антитела.

Антитела могут представлять собой моновалентные антитела. Способы для получения моновалентных антител хорошо известны в данной области. Например, один из способов предусматривает рекомбинантную экспрессию легкой цепи и модифицированной тяжелой цепи иммуноглобулина. Как правило, тяжелую цепь усекают в каком-либо положении участка Fc таким образом, чтобы предотвратить перекрестное связывание тяжелых цепей. Альтернативно соответствующие остатки цистеина заменяют другим аминокислотным остатком или удаляют таким образом, чтобы предотвратить перекрестное связывание.

Также для получения моновалентных антител приемлемы способы in vitro. Расщепление антител для получения их фрагментов, особенно фрагментов Fab, можно осуществлять с использованием общепринятых известных в данной области способов.

Антитела человека и гуманизированные антитела

Антитела к EGFL7 могут дополнительно содержать гуманизированные антитела или антитела человека. Гуманизированные формы не принадлежащих человеку (например, мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, происходящую из не принадлежащего человеку иммуноглобулина. Гуманизированные антитела включают иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых участки из CDR реципиента заменены участками из CDR не относящихся к человеку видов (антитело-донор), таких как мышь, крыса или кролик, обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv иммуноглобулина человека заменены соответствующими не принадлежащими человеку остатками. Также гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются ни в антителе-реципиенте, ни в вводимых последовательностях CDR или каркасной области. Как правило, гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или практически все участки CDR соответствуют таковым у не принадлежащего человеку иммуноглобулина, а все или практически все участки FR представляют собой участки консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Предпочтительно гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере участок константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, константной области иммуноглобулина человека. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Способы для гуманизирования не принадлежащих человеку антител хорошо известны в данной области. Как правило, гуманизированное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, вводимых в него из не относящегося к человеку источника. Эти не принадлежащие человеку аминокислотные остатки часто называют “импортируемыми” остатками, которые, как правило, получают из “импортируемого” вариабельного домена. В целом, гуманизацию можно осуществлять, следуя способу Winter и сотрудников (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), посредством замены CDR или последовательностями CDR грызуна соответствующих последовательностей антитела человека. Соответственно такие “гуманизированные” антитела представляют собой химерные антитела (патент США №4816567), где значительно меньший, чем целый вариабельный домен человека был заменен на соответствующую последовательность из не относящихся к человеку видов. На практике гуманизированные антитела, как правило, представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных участков в антителах грызуна.

Также антитела человека можно получать с использованием различных известных в данной области способов, в том числе библиотек фагового дисплея. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991). Для получения моноклональных антител человека также доступны способы Cole et al. и Boerner et al. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) и Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991). Сходным образом антитела человека можно получать введением участков иммуноглобулина человека в трансгенных животных, например мышей, у которых были частично или полностью инактивированы гены эндогенных иммуноглобулинов. На основании воздействия антигеном наблюдают, что продукция антител человека очень сходна во всех отношениях с продукцией, наблюдаемой у человека, включая перестройку, сборку генов и спектр антител. Этот способ описан, например, в патентах США №№ 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016, а также в следующих научных публикациях: Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995).

Биспецифичные антитела

Биспецифичные антитела представляют собой моноклональные, предпочтительно человека или гуманизированные антитела, обладающие специфичностями связывания по меньшей мере для двух различных антигенов. В настоящем случае одна из специфичностей связывания является для полипептида EGFL7; другая является для любого другого антигена, а предпочтительно для белка поверхности клетки или рецептора, или субъединицы рецептора.

Способы получения биспецифичных антител известны в данной области. Как правило, рекомбинантная продукция биспецифичных антител основана на совместной экспрессии двух пар тяжелая цепь/легкая цепь иммуноглобулина, где две тяжелые цепи имеют различные специфичности связывания. Milstein and Cuello, Nature 305:537-539 (1983). Вследствие случайного набора тяжелых и легких цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) продуцируют возможную смесь из десяти различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифичную структуру. Как правило, очистку правильной молекулы осуществляют стадиями аффинной хроматографии. Сходные процедуры описаны в WO 93/08829, опубликованном 13 мая 1993, и в Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991).

Вариабельные домены антитела с желаемыми специфичностями связывания (участками связывания антитело-антиген) можно сливать с последовательностями константного домена иммуноглобулина. Предпочтительно сливают с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирной области, областей CH2 и CH3. Предпочтительно иметь первый константный участок тяжелой цепи (CH1), содержащий участок, который необходим для связывания легкой цепи, присутствующей хотя бы в одном из слитых продуктов. ДНК, кодирующие слитые тяжелые цепи иммуноглобулина и, по желанию, легкую цепь иммуноглобулина, вставляют в отдельные векторы экспрессии и совместно трансфицируют в приемлемый организм-хозяин. Для дополнительных подробностей получения биспецифичных антител см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).

Гетероконъюгированные антитела

Гетероконъюгированные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител. Такие антитела были предложены, например, для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США №4676980) и для лечения инфекции ВИЧ. WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089. Предусматривают, что антитела можно получать in vitro с использованием известных способов в химии синтетических белков, в том числе способов, включающих перекрестно связывающие средства. Например, иммунотоксины можно конструировать с использованием дисульфидного обменного взаимодействия или формированием простой тиоэфирной связи. Примеры приемлемых реагирующих веществ для этой цели включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат, а также вещества, описанные, например, в патенте США №4676980.

Иммуноконъюгаты

Также изобретение относится к иммуноконъюгатам, содержащим антитело, которое конъюгировано с цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое средство, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат).

Эффективные в получении таких иммуноконъюгатов химиотерапевтические средства были описаны выше. Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь токсина дифтерии A, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь экзотоксина A (из Pseudomonas aeruginosa), цепь рицина A, цепь абрина A, цепь модекцина A, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены. Для получения радиоконъюгированных антител доступно множество радионуклидов. Примеры включают ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y и ¹⁸⁶Re.

Конъюгаты антитела и цитотоксического средства получают с использованием множества бифункциональных связывающих белки средств, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (таких как диметиладипимидат HC1), активные сложные эфиры (такие как суберат дисукцинимидила), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как 2,6-диизоцианат толуола) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицина можно получать, как описано в Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Примером хелатобразующего вещества для конъюгации радионуклеотида с антителом является меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA). См. WO94/11026.

В другом варианте осуществления антитело можно конъюгировать с “рецептором” (таким как стрептавидин) для использования в предварительном нацеливании на опухоль, где пациенту вводят конъюгат антитело-рецептор с последующим удалением несвязавшегося конъюгата из кровотока с использованием очищающего средства, а затем вводят “лиганд” (например, авидин), который конъюгирован с цитотоксическим средством (например, радионуклеотидом).

Иммунолипосомы

Также описанные здесь антитела можно составлять в виде иммунолипосом. Содержащие антитело липосомы получают известными в данной области способами, такими как описанные в Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); и патентах США №№4485045 и 4544545. Липосомы с повышенным временем циркуляции описаны в патенте США №5013556.

Особенно эффективные липосомы можно получать способом обращенно-фазового выпаривания с использованием липидной композиции, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и PEG-дериватизированный фосфатидилэтаноламин (PEG-PE). Для получения липосом с желаемым диаметром проводят экструзию липосом через фильтры с заданным размером пор. Фрагменты Fab' антитела по настоящему изобретению можно конъюгировать с липосомами, как описано в Martin et al., J. Biol. Chein. 257:286-288 (1982), реакцией дисульфидного обмена. Необязательно, липосома содержит химиотерапевтическое средство (такое как доксорубицин). См. Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19):1484 (1989).

Фармацевтические композиции антител

Антитела, специфически связывающие определенный здесь полипептид EGFL7, а также другие молекулы, выявленные указанными выше анализами отбора, можно вводить для лечения различных заболеваний, как указано выше и ниже, в виде фармацевтических композиций.

Указанный здесь препарат также может содержать более чем одно активное соединение, если необходимо для конкретного показания для лечения, предпочтительно соединения с взаимодополняющей активностью, не воздействующие неблагоприятным образом друг на друга. Альтернативно или в дополнение, композиция может содержать усиливающее ее функцию средство, такое как, например, цитотоксическое средство, цитокин, химиотерапевтическое средство, ингибирующее рост средство. Соответственно такие молекулы присутствуют в сочетании в таких количествах, которые эффективны для заданной цели.

Также активные ингредиенты можно заключать в микрокапсулы, которые получают, например, способами коацервации или полимеризацией на границе раздела фаз, например гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные)микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы для доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие способы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, выше.

Подлежащие использованию для введения in vivo препараты должны быть стерильны. Это легко осуществлять фильтрацией через стерильные мембраны для фильтрации.

Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Приемлемые примеры препаратов с замедленным высвобождением включают содержащие антитело полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, где матрицы находятся в виде веществ с заданной формой, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США №3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразлагаемый ацетат этиленвинила, разлагаемые сополимеры молочная кислота-гликолевая кислота, такие как LUPRON DEPOT^TM (вводимые инъекцией микросферы, состоящие из сополимера молочная кислота-гликолевая кислота и ацетата леупролида), а также поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. Тогда как полимеры, такие как ацетат этиленвинила и молочная кислота-гликолевая кислота, способны высвобождать молекулы в течение более чем 100 суток, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. Если заключенные в капсулу антитела остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия влаги при 37°C, что приводит к утрате биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. В зависимости от имеющего место механизма можно разрабатывать целесообразные способы для стабилизации. Например, если выявленный механизм агрегации представляет собой образование внутримолекулярных связей S-S посредством тиодисульфидного обмена, то стабилизацию можно осуществлять модифицированием сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислых растворов, контролированием содержания влаги, использованием соответствующих добавок и разработкой специфических композиций полимерных матриц.

Способы лечения с использованием антитела

Предусматривают, что антитела к полипептиду EGFL7 можно использовать для лечения различных связанных с ангиогенезом состояний, как указано выше.

Антитела вводят млекопитающему, предпочтительно человеку, в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение в виде ударной дозы или посредством непрерывной инфузии в течение периода времени, используя внутримышечный, внутрибрюшинный, внутриспинномозговой, подкожный, внутрисуставной, внутрисиновиальный, интратекальный, пероральный, местный способы введения или ингаляцию. Предпочтительно внутривенное введение антитела.

С введением антител по настоящему изобретению можно сочетать другие курсы лечения, как указано выше. Например, если антитела используют для лечения злокачественной опухоли, то пациенту, которого следует лечить с применением таких антител, можно также проводить лучевую терапию. Альтернативно или в дополнение пациенту можно вводить химиотерапевтическое средство. Схемы препаратов и введения доз для таких химиотерапевтических средств можно использовать в соответствии с инструкциями производителя или как определяет опытным путем практикующий специалист в данной области. Также схемы препаратов и введения доз для такой химиотерапии описаны в Chemotherapy Service, Ed., M. C. Perry (Williams & Wilkins: Baltimore, MD, 1992). Химиотерапевтическое средство можно вводить перед или после введения антитела или одновременно с ним. Антитело можно сочетать с противоэстрогенным соединением, таким как тамоксифен или EVISTA^TM, противопрогестеронным средством, таким как онапристон (см. EP 616812), в известных для таких молекул дозах.

Если антитела используют для лечения злокачественной опухоли, то может быть желательно также вводить антитела к другим связанным с опухолями антигенам, такие как антитела, связывающиеся с одним или несколькими из рецептора(ов) ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 или VEGF. Они также включают указанные выше средства. Также антитело приемлемо вводить периодически или в сочетании с радиологическими вариантами лечения, включая лучевую терапию или введение радиоактивных веществ. Альтернативно или в дополнение пациенту можно совместно вводить два или более указанных здесь антител, связывающих одинаковые или два или более различных антигена. В некоторых случаях может быть полезно также вводить пациенту один или несколько цитокинов. В предпочтительном варианте осуществления указанные здесь антитела совместно вводят с ингибирующим рост средством. Например, можно сначала вводить ингибирующее рост средство, а затем антитело по настоящему изобретению. Однако также предусматривают одновременное введение или введение сначала антитела по настоящему изобретению. Приемлемые дозы для ингибирующего рост средства представляют собой дозы, которые используют в настоящее время, и их можно снижать вследствие сочетанного действия (синергии) ингибирующего рост средства и указанного здесь антитела.

В одном из вариантов осуществления на образование сосудов в опухолях воздействуют сочетанной (комбинированной) терапией. Пациентам с опухолями вводят антитело к EGFL7 и другое антитело (например, к VEGF) в терапевтически эффективных дозах, как определено, например, посредством наблюдения за некрозом опухоли или очагами ее метастазирования, при наличии таковых. Кроме того, можно вводить дополнительные противоопухолевые средства, такие как альфа-, бета- или гамма-интерферон, антитело к HER2, херегулин, антитело к херегулину, D-фактор, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) или средства, способствующие микрососудистому свертыванию в опухолях, такие как антитело к белку C, антитело к белку S или C4b-связывающий белок (см. WO 91/01753, опубликованный 21 февраля 1991), или тепловое или лучевое воздействие.

В других вариантах осуществления пациенту вводят антагонисты FGF или PDGF, такие как нейтрализующее антитело к FGF или к PDGF, в сочетании с антителом к EGFL7. Предпочтительно лечение с использованием антител к EGFL7 временно прекращают в течение периодов заживления ран или желаемого образования новых сосудов.

В случае профилактики или лечения сердечно-сосудистого, эндотелиального и ангиогенного нарушения соответствующая доза указанного здесь антитела зависит от типа подлежащего лечению нарушения, как указано выше, тяжести и течения заболевания, вводят ли антитело в профилактических или лечебных целях, предшествующего лечения, истории болезни пациента и реакции на антитело, а также от усмотрения лечащего врача. Антитело приемлемо вводить пациенту один раз или в течение серий курсов лечения.

Например, в зависимости от типа и тяжести заболевания исходная доза-кандидат для введения пациенту составляет приблизительно от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг) антитела посредством, например, одного или нескольких отдельных введений или посредством непрерывной инфузии. Как правило, суточная или недельная доза находится в диапазоне приблизительно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. В случае многократных введений в течение нескольких суток или более в зависимости от состояния лечение повторяют или поддерживают до тех пор, пока не произойдет желаемое подавление симптомов заболевания. Однако могут быть эффективны другие схемы введения доз. Эффективность этого лечения легко наблюдать общепринятыми способами и анализами, в том числе, например, получением радиографического изображения опухоли.

Изделия с антителами

Также предоставляют изделия, содержащие контейнер с антителом и ярлык. Такие изделия описаны выше, где активное средство представляет собой антитело к EGFL7.

Диагностика и прогнозирование для опухолей с использованием антител

Если показание, по которому используют антитела, представляет собой злокачественную опухоль, то в то время как сверхэкспрессируемые в определенных опухолях белки поверхности клетки, такие как рецепторы роста, являются превосходными мишенями для лекарственных средств-кандидатов или лечения опухоли (например, злокачественной опухоли), для тех же белков вместе с полипептидами EGFL7 находят дополнительное применение в диагностике и прогнозировании для опухолей. Например, направленные к полипептидам EGFL7 антитела можно использовать в качестве диагностики или прогнозирования для опухоли.

Например, антитела, в том числе фрагменты антител, можно использовать качественно или количественно для выявления экспрессии генов, в том числе кодирующего полипептид EGFL7 гена. Предпочтительно антитело снабжают поддающейся выявлению, например, флуоресцентной меткой, а связывание можно наблюдать световой микроскопией, проточной цитометрией, флуориметрией или другими известными в данной области способами. Преимущественно такие анализы связывания выполняют, как описано выше.

Детекцию связывания антитела с продуктами гена-маркера in situ можно осуществлять, например, иммунофлуоресценцией или иммуноэлектронной микроскопией. Для этой цели удаляют у пациента гистологический образец и наносят на него меченое антитело, предпочтительно посредством наслаивания антитела на биологический образец. Также эта процедура позволяет определять распределение продукта гена-маркера в исследуемой ткани. Специалистам в данной области очевидно, что для регистрации in situ легко доступно широкое разнообразие гистологических способов.

Следующие примеры предназначены только для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения каким-либо образом объема настоящего изобретения.

Описания всех ссылок на патенты и литературных ссылок, цитируемых в настоящем описании, приведены здесь полностью в качестве ссылки.

ПРИМЕРЫ

Указанные в примерах коммерчески доступные реактивы использовали в соответствии с инструкциями производителя до тех пор, пока не указано иначе. Источником тех клеток, которые указаны в следующих примерах и на всем протяжении описания под уникальными идентификаторами ATCC, является Американская коллекция типовых культур, Manassas, VA 20108.

Все цитируемые в описании ссылки приведены в нем полностью в качестве ссылки.

ПРИМЕР 1. Клонирование EGFL7

EGFL7 выявляли и клонировали с целью нахождения новых секретируемых и трансмембранных белков человека, особенно белков, вовлеченных в регуляцию развития сосудов. Подробности клонирования и экспрессии EGFL7 человека описаны, например, в патентной заявке США 20030224984 (где EGFL7 указан как PRO1449). Вкратце, проводили скрининги гибридизацией in situ тотальных препаратов для выявления секретируемых факторов и рецепторов, которыми богата эмбриональная сосудистая система мыши. Посредством предсказывания сигнальных последовательностей и поиска гомологии внеклеточных доменов были выявлены и отобраны сотни кДНК человека и мыши, представляющие предполагаемые секретируемые факторы и рецепторы. Используя кДНК мыши в качестве образцов, получали рибозонды и проводили гибридизации in situ для целых мышиных эмбрионов в диапазоне от E7.5 до E14.5. Это временное окно развития было выбрано потому, что оно включает многие ключевые стадии в образовании и развитии сосудов и в ангиогенезе. Среди многих генов, выявленных в результате этого отбора, EGFL7 является уникально экспрессируемым в эндотелии активно растущих кровеносных сосудов. См. подробности экспрессии ниже.

EGFL7 шпорцевой лягушки был определен в качестве предварительного объекта, полученного из отдельной записи банка генов BC044267. EGFL7 данио рерио клонировали посредством ПЦР в условиях низкой жесткости и последующим скринингом библиотеки кДНК, полученной из эмбрионов через 24 часа после оплодотворения, на основе гомологии среди трех известных видов (человека, мыши и шпорцевой лягушки). Последовательность кДНК, неполная последовательность геномной ДНК и аминокислотная последовательность EGFL7 данио рерио представлены на фигуре 1B. EGFL8 был выявлен посредством BLAST с использованием последовательностей EGFL7.

В результате экспериментов по картированию с использованием радиоактивных гибридов, применяя набор T51, EGFL7 данио рерио был помещен в группу сцепления 21 (LG21), близкую к маркеру EST fk20d12.y1 (уникальный идентификатор AW566846). Этот участок LG21 данио рерио оказывается синтеничен участку хромосомы человека от 9q33 до 9q34, где расположен EGFL7 человека. В этом принадлежащем человеку участке открыты следующие гены: Notch1 (9q34), липаза сложных карбоксиэфиров (CELL; 9q34) и бета-7-субъединица протеосомы (psmb7; 9q33). Эти гены расположены в участке LG21, где картирован EGFL7 данио рерио (LG21, 19,6-29,0 сМ).

Ген EGFL7 кодирует предполагаемый секретируемый белок с относительной молекулярной массой ~30 кДа. EGFL эволюционно консервативен. См. фигуру 1a. Аминокислотная последовательность для человека (Homo sapiens) гомологична таковой для мыши (Mus musculus), шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) и данио рерио (Danio rerio) на 77,45%, 47,12% и 42,96%, соответственно.

Белок EGFL7 содержит сигнальную последовательность, домен EMI на N-конце (домен EMI присутствует во множестве связанных с внеклеточным матриксом белков, вовлеченных в регуляцию адгезии клеток) с последующими двумя EGF-подобными доменами и богатой лейцином и валином C-концевой областью. EGFL7 млекопитающих принадлежит к малому семейству генов. В результате поисков с использованием BLAST был выявлен один близкородственный ген EGFL8, обладающий такой же организацией доменов, как EGFL7. Интересно, что это семейство генов у млекопитающих оказывается более сложным, поскольку в геномах нескольких рыб (Danio rerio, Medaka и Fugu) не было выявлено ортолога EGFL8.

Кодирующую EGFL7 человека кДНК депонировали согласно условиям Будапештского договора в Американскую коллекцию типовых культур, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC), под регистрационным номером депозита ATCC №203243 (депонировано 9 сентября 1998).

Эти депозиты были получены в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры и установления правил на основании этого договора (Будапештского договора). Это обеспечивает поддержание жизнеспособной культуры депозита в течение 30 лет от даты депонирования. Депозиты доступны в ATCC в соответствии с условиями Будапештского договора и подлежат действию договора между обладателем настоящей заявки и ATCC, который обеспечивает постоянную и неограниченную доступность потомства культуры депозита для пользователей после опубликования соответствующего патента США или после предоставления в открытый доступ какой-либо патентной заявки США или иностранной патентной заявки, вне зависимости от того, какая будет первой, а также который обеспечивает доступность потомства для индивидуума, определенного комиссаром США по патентам и товарным знакам, которому предоставлено на это право в соответствии с 35 USC 122 и относящимися к этому правилами для комиссара (в том числе 37 CFR § 1.14 с особой ссылкой на 886 OG 638).

Обладатель настоящей заявки согласился с тем, что в случае гибели, утраты или разрушения культуры веществ на депозите при культивировании в приемлемых условиях вещества незамедлительно, с уведомлением заменят другими такими же веществами. Доступность депонированного вещества не следует понимать как разрешение осуществлять изобретение на практике в нарушение прав, гарантированных какими-либо органами власти в соответствии со своим патентным законодательством.

ПРИМЕР 2. Экспрессия EGFL7

Для выявления характера экспрессии EGFL7 проводили гибридизацию тотальных препаратов in situ, иммунофлуоресцентное окрашивание и радиоактивную гибридизацию in situ для эмбрионов мыши и данио рерио, а также для срезов тканей мыши и человека.

Линии данио рерио и мышей

Эмбрионы мыши получали от мышей CD-1 с точно установленным сроком беременности. В описанных ниже исследованиях экспрессии и активности использовали линию данио рерио дикого типа с длинными плавниками Tüebingen (TL), гомозиготных по cloche (clo ^m39) мутантных эмбрионов через ~30 часов после оплодотворения и их сибсов дикого типа. Взрослых данио рерио и эмбрионы содержали, как описано ранее (Westerfield 1993 Zebrafish Book).

Радиоактивная гибридизация in situ

Для гибридизации in situ ткани обрабатывали описанным ранее способом. Phillips et al. (1990) Science 250:290-4. Меченные посредством ³³P-UTP зонды РНК получали, как описано. Melton et al. (1984) Nucleic Acids Research 12:7035-56. Смысловые и антисмысловые зонды EGFL7 синтезировали из двух кДНК человека и одной кДНК мыши, соответствующих нуклеотидам от 382 до 1062, от -137 до 150 и от 173 до 774, соответственно. (Нуклеотид A в кодоне инициации принимают в качестве нуклеотида №1.)

Гибридизации тотальных препаратов in situ

Гибридизации тотальных препаратов in situ проводили, как описано, с незначительными изменениями. Shimamura et al. Development 120:2225-2234 (1994). Для фотографирования окрашенные эмбрионы очищали в смеси бензиловый спирт/бензилбензоат 2:1. Смысловой и антисмысловой рибозонды получали с использованием следующих образцов: клон неполной кДНК EGFL7 мыши (клон IMAGE 519249, уникальный идентификатор банка генов: AA107358); клон неполной кДНК EGFL7 данио рерио, соответствующий нуклеотидам от 169 до 807; все другие молекулярные маркеры были из лабораторий Fishman (MGH), Stainier (UCSF) and Weinstein (NIH). После анализа гибридизации тотальных препаратов in situ эмбрионы повторно фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) в 1X PBS, обезвоживали посредством серии разведений в этаноле и помещали в пластмассу JB-4Plus (Polysciences). Срезы 5 мкм контрокрашивали 0,2% ядерным прочным красным и закрепляли в Cytomount 60.

Окрашивание AP

Активность эндогенной щелочной фосфатазы в тотальных препаратах эмбрионов данио рерио через 48 часов после оплодотворения регистрировали, как описано ранее. Childs et al. Development 129:973-982 (2002).

Микроскопия с обращенной сверткой

Эмбрионы фиксировали в 4% PFA в течение ночи при 4°C, защищали от воздействия низкой температуры в 20% сахарозе/PBS, мгновенно замораживали в 7,5% желатине/15% сахарозе и получали срезы. Препараты сушили воздухом, делали проницаемыми в 1X PBS/0,1% Triton X-100/1% ДМСО, блокировали в течение 20 минут в указанном выше растворе с добавлением 1% BSA, окрашивали с использованием 66 нМ ALEXA Fluor594-фаллоидина (Molecular Probes) в течение 20 минут, промывали, закрепляли с использованием Vectashield DAPI (Vector labs.) и анализировали, применяя микроскоп с обращенной сверткой Deltavision с объективом 60X для использования с маслом.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Иммунизировали армянских хомячков рекомбинантным белком EGFL7 мыши, экспрессируемым в E. coli. Моноклональные антитела получали посредством слияния гибридом и субклонирования. Для иммунофлуоресцентного окрашивания использовали два моноклональных антитела 1C8 и 5H7, распознающих различные эпитопы. Ткани мыши мгновенно замораживали и получали криосрезы. Фиксированные клетки или нефиксированные срезы тканей 5 мкм окрашивали, как описано. Parker et al. Methods in Cell Biology 59:313-36 (1999). Используемые в этом исследовании антитела представляют собой: моноклональное антитело к ZO-1 (Zymed Inc. номер в каталоге №33-9100); к GFP (Torrey Pines Biolabs, номер в каталоге №TP401); моноклональное антитело к винкулину (Sigma).

Результаты

Характер экспрессии EGFL7 консервативен среди видов. У эмбрионов мыши, человека и данио рерио высокие уровни транскриптов EGFL7 были выявлены в эндотелиальных клетках-предшественниках и в EC во всех сосудах (фигуры 2a, 2b, 2g, 2j-2m), а также эндокарде. Высокая экспрессия в сосудах сохраняется в течение эмбрионального и неонатального развития; однако во многих взрослых органах транскрипты не поддаются выявлению (фигура 2h). У взрослых мышей экспрессия EGFL7 продолжается в малой группе сосудов некоторых высоконасыщенных сосудами органах, таких как легкие, сердце и почки. Интересно, что экспрессия EGFL7 сильно активировалась во многих пролиферирующих тканях, в том числе опухолях (фигура 2i), органах размножения в течение беременности (фигура 2с) и в воспаленных тканях. Кроме того, высокие уровни экспрессии были открыты в первично поражаемых заболеванием тканях человека, включающих, но ими не ограничивающихся, аденокарциному легких и плоскоклеточную карциному, карциному клеток почки, карциному предстательной железы, карциному яичников, гепатокарциному, карциному желудка, хондросаркому, остеосаркому, оболочки заново образованных сосудов из пораженных заболеванием глаз и участки воспаления.

Этот уникальный характер экспрессии позволяет предположить, что высокие уровни EGFL7 связаны с ростом и реструктурированием сосудов. EGFL7 не выявляли вне сердечно-сосудистой и гематопоэтической систем, где это наблюдение было подтверждено тем фактом, что у лишенного сосудов мутанта данио рерио cloche полностью прекращена экспрессия EGFL7 (фигура 2n). Stainier et al. Dev. Suppl. 121:3141-3150 (1995).

В иммунофлуоресцентном окрашивании показано, что белок EGFL7 секретируется, но остается близко от EC (вставка на фигуре 2c), вероятно связанный с внеклеточным матриксом. В дополнительном исследовании с использованием модели опухоли, обрабатываемой антителом к VEGF, было показано, что после фрагментации сосудистой сети в опухоли вследствие обработки антителом к VEGF EGFL7 оставался в оставляемых в ECM участках следования претерпевающих обратное развитие сосудов опухоли. Это позволяет предположить вероятную важную роль EGFL7 в способствовании сосудам опухоли для итогового возобновления роста и, таким образом, “избегания эффекта” обработки антителом к VEGF.

ПРИМЕР 3. Анализ фенотипа животных со сниженной активностью EGFL7

A. Дефекты сосудов у данио рерио с нокдауном по EGFL7

В последнем сообщении показано, что содержащая рекомбинантный белок EGFL7 кондиционированная среда ингибирует миграцию гладкомышечных клеток (SMC) in vitro. Soncin et al. EMBO J. 22:5700-5711 (2003). Однако его функция in vivo не была определена. Для выявления биологической функции EGFL7 in vivo использовали модельный организм данио рерио вследствие доступности средств для исследования образования и развития сосудов и ангиогенеза, а также легкости управления экспрессией генов в эмбрионах. Fishman et al. Circulation. Research 74: 757-63 (1994); Weinstein et al. Cardiovascular Research 31:E17-24 (1996); Dooley et al. Current Opinion in Genetics & Development 10: 252-6 (2000); Nasevicius & Ekker Nature Genetics 26: 216-20 (2000). Кроме того, было открыто, что Egfl8 экспрессировался в группе кровеносных сосудов и периферических нервов в эмбрионах мыши, что делает его вероятным дублирующим фактором в отношении EGFL7. С другой стороны, у данио рерио и в геномах некоторых других рыб не было найдено ортолога Egfl8. Поэтому данио рерио обеспечивает уникальное средство для определения биологической функции этого семейства генов.

Эксперименты по нокдауну гена проводили с использованием двух разных морфолиновых антисмысловых олигонуклеотидов, направленных к EGFL7 данио рерио: олигонуклеотид AS_-47 гибридизуется с 5'-UTR и блокирует трансляцию; олигонуклеотид AS₁₉₅ гибридизуется с экзон-интронным сочленением, приводя к удержанию интрона и, таким образом, к преждевременной терминации трансляции. Положения двух антисмысловых олигонуклеотидов указаны на фигуре 1B. Выбранные случайным образом контрольные образцы представляют собой

CON(-47): ACGACGGTCACGATGAA TGGAGAGT (SEQ ID №10); и

CON(195): CATTGTTCATCGTCTTGTTGCGTGT (SEQ ID №11).

Добавляли флуоресцеиновую метку для способствования в выявлении эмбрионов, которым надлежащим образом провели инъекцию, и для подтверждения равномерного распределения олигонуклеотидов в развивающихся эмбрионах. Исходный раствор олигонуклеотидов 5 мМ (~40 мг/мл) в воде разводили в 1X растворе Danieu (58 мМ NaCl, 0,7 мМ KCI, 0,4 мМ MgSO₄, 5 мМ HEPES, pH 7,6) с 0,25% феноловым красным. Составляющую приблизительно 4,6 нл ударную дозу вводили инъекцией в каждый эмбрион на стадиях от 1 клетки до 8 клеток с использованием микроинъектора Drummond Nanoject. В экспериментах по титрованию было показано, что инъекция 4 нг антисмыслового олигонуклеотида в эмбрион вызывала специфические дефекты сосудов при отсутствии наблюдаемых дефектов в других структурах наряду с отсутствием значительного повышения смертности у эмбрионов, в которых вводили инъекцией случайным образом выбранные контрольные олигонуклеотиды.

И те и другие олигонуклеотиды приводили к одинаковым фенотипическим результатам. При обследовании после начала кровообращения [через ~24 часа после оплодотворения (hpf)] у более чем 40% эмбрионов с нокдауном по EGFL7 (KD) наблюдали явные признаки дефектов сосудов: у них или вообще отсутствует кровообращение, или развивается незавершенная петля кровообращения; многие имеют перикардиальный отек и кровоизлияние (фигура 3a). В отличие от этого только 3% рыб, которым вводили инъекцией контрольные олигонуклеотиды, имели незначительные дефекты сосудов.

Кроме того, анализировали характер экспрессии следующих нескольких маркеров эндотелия сосудов, в том числе fli1, flk1, tie1, ephrinB2 и gridlock (маркер артериальных EC), flt4 и EphB4 (маркер венозных EC), а также активность эндогенной щелочной фосфатазы. Brown et al. Mech. Dev. 90: 237-252 (2000); Fouquet et al. Dev. Biol. 183: 37-48 (1997); Liao et al. Development 124:381-389 (1997); Lyons et al. Dev. Dyn. 212: 133-140 (1998); Lawson & Weinstein Nature Rev. Genet. 3: 674-682 (2002); Zhong et al. Science 287:1820-1824 (2000); Childs et al. Development 129:973-982 (2002). Также эксперименты по нокдауну проводили для трансгенной линии flk1-промотор-GFP. Начиная со стадии 7 сомитов и до 30 часов после оплодотворения у KD были неизменны общее пространственное распределение и интенсивность указанных выше маркеров, более того, все первичные артерии и вены у KD формировались в правильных положениях (фигуры 3, 4), что указывает на отсутствие значительного дефекта в ранней дифференцировке, пролиферации и миграции EC. Однако тубулогенез у KD был нарушен на протяжении всей системы. Через 30 часов после оплодотворения многие первичные сосуды у KD имели нарушенную организацию просветов или вообще не имели просвета (фигура 3c-d, 3h). Частота возникновения дефекта тубулогенеза, отражаемого молекулярными маркерами, для многократных экспериментов находится в диапазоне от 75 до 85%. Например, при окрашивании fli1 через 30 часов после оплодотворения было выявлено, что 76% (28/37) KD имели дефект тубулогенеза, тогда как у всех контрольных эмбрионов (n=37) развивались нормальные сосудистые трубки. Для подтверждения специфичности нокдауна обусловленный AS_-47 фенотип сосудов восстанавливали посредством кодирующей EGFL7 РНК без 5'-нетранслируемой области.

Отсутствие образование просвета у EGFL7 KD было подтверждено открытием, что основные сосуды у этих эмбрионов было невозможно заполнить красителем. Хотя существует возможность, что дефект тубулогенеза является следствием разрушения сосудов, обусловленного отсутствием кровотока, но следующие наблюдения делают ее маловероятной: во-первых, сократительная функция сердца у EGFL7 KDs была нормальной; во-вторых, у мутантов с молчащим сердцем, у которых отсутствует кровообращение, были нормальными образование просвета в первичных сосудах и их кратковременное поддержание. Sehnert et al. Nature Genet. 31: 106-110 (2002); Isogai et al. Development 130: 5281-5290 (2003).

Также у животных EGFL7 KD были показаны прогрессирующие дефекты ангиогенеза. Как правило, первоначальный рост межсегментных сосудов (ISV) происходил у мутантов через 22-24 часа после оплодотворения (фигура 3b). Однако эти вторичные сосуды постепенно исчезали при частичном отсутствии ISV через 30 часов после оплодотворения (фигура 2c-d) и полном устранении к 48-72 часам после оплодотворения. Вероятно, отсутствие кровообращения частично вносит вклад в дефект ангиогенеза, поскольку показано, что ISV подвергаются регрессу в отсутствие кровотока. Isogai et al. Development 130: 5281-5290 (2003). Вследствие доминантного фенотипа в первичных сосудах точную роль EGFL7 в ангиогенезе можно дополнительно определять с использованием таких способов, как индуцируемый нокаут.

Поскольку развитие сосудов зависит от соседних тканей, то сохраняется вопрос, является ли наблюдаемый у EGFL7 KD дефект сосудов косвенным следствием разрушения окружающих тканей. Brown et al. Mech. Dev. 90: 237-252 (2000); Sumoy et al. Mech. Dev. 63: 15-27 (1997); Vokes & Krieg Dev. Suppl. 129: 775-785 (2002). В поперечных срезах KD наблюдают существование нормального набора тканей (фигура 3). Кроме того, при гибридизации in situ с fkd7, ntl, axial/fkd1 и gata1 было показано, что все осевые структуры и гематопоэтическая линия дифференцировки у KD развивались нормально. Odenthal & Nusslein-Volhard Dev. Genes Evol. 208: 245-258 (1998); Schulte-Merker et al. Development 116: 1021-1032 (1992); Strahle et al. Genes Dev. 7: 1436-1446 (1993); Parker et al. Methods Cell Biol. 59: 313-336 (1999). После начала кровообращения клетки gata1 ⁺ у KD оставались в задней вентролатеральной области эмбриона, где они исходно развивались, что подтверждает дефективность сосудистой системы. Наконец, дефектное привлечение SMC представляет собой маловероятный этиологический фактор, поскольку у эмбрионов дикого типа не наблюдали признаков периваскулярной экспрессии SM22A на стадии 26 сомитов, временной точке, в которой были очевидны дефекты сосудов у KD. Взятые вместе, данные позволяют предположить, что недостаточность сосудистого тубулогенеза представляет собой первичный дефект, обусловленный нокдауном EGFL7.

Поскольку морфогенез сосудов обусловлен количеством EC, то дальнейшее наблюдение сосредоточили на том, изменялось ли у EGFL7 KD количество EC. Fong et al. Development 126: 3015-3025 (1999). В сериях поперечных срезов было показано, что нокдаун EGFL7 не изменял общее количество EC на всех осевых уровнях вне зависимости от стадии развития (фигура 4). Кроме того, на основе экспрессии ephrinB2 и flt4, а также различной регуляции промотора flk1 в артериях и венах у эмбрионов flk1:GFP было также открыто, что количества артериальных и венозных EC остаются неизмененными (фигура 4). В отличие от EGFL7 нокдаун vegf, известного митогенного фактора для EC, значительно снижал количество EC и в дальнейшем нарушал образование трубки. Таким образом, данные указывают на то, что EGFL7 играет уникальную роль, которая отлична от VEGF и необходима, главным образом, в ходе сосудистого тубулогенеза.

Для описания фенотипа сосудов на клеточном уровне проводили анализ изменений с течением времени, используя рыб flk1:GFP. Последовательные поперечные срезы туловища и продольные срезы головы получали на стадиях 22, 24, 26 сомитов (перед началом кровообращения), через 24 часа после оплодотворения (начало кровообращения) и через 30 часов после оплодотворения. При анализах этих срезов выявляют серии клеточных событий в течение перехода от тяжа к трубке у контрольных эмбрионов. На стадии 22 сомитов артериальные и венозные ангиобласты объединены в отдельные тяжи. В протяженных плотных соединениях выявлена тесная связь между ангиобластами. Приблизительно на стадии 24 сомитов при значительном совершенствовании структуры плотных соединений наблюдали постепенное разделение ангиобластов. На стадии 26 сомитов ангиобласты были в достаточной степени разделены таким образом, что артериальные и венозные ангиобласты занимали различные области и располагались в форме зачаточных трубок. Затем EC претерпевали значительные морфологические изменения и становились плоскими, тем самым придавая сосудистым трубкам их окончательную форму. Эта последовательность событий, приводящая к формированию основных сосудистых трубок, была в значительной степени нарушена у EGFL7 KD. На всех исследуемых стадиях ангиобласты с нокдауном не разделялись и сохраняли протяженные плотные соединения. Также у них не происходило изменение формы на последних стадиях (фигура 4h).

B. Сниженный рост опухоли и дефектная сосудистая система у мышей с нокаутом по EGFL7

Для дальнейшего выявления функции EGFL7 у млекопитающих животных получали мышей с нокаутом по mEGFL7 (KO) и использовали в качестве животных-хозяев для опухолевых имплантатов. Исходно мышей KO получали на основе 129/BL6 и проводили обратное скрещивание с BL6. Используемые в эксперименте животные представляли собой с 3 по 4 поколения обратного скрещивания.

Каждому животному со стороны спины вводили подкожной инъекцией свыше 500000 клеток меланомной опухоли B16 (F10). Участки инъекции ежесуточно обследовали на предмет возникновения опухоли. Опухоли регулярно измеряли для определения скорости роста. Скорость опухолевого роста у гомозиготных EGFL7^-/- животных сравнивали с таковой у гетерозиготных EGFL7^+/- животных или животных дикого типа одного с ними помета.

Как представлено на фигурах 6 и 7, рост меланомной опухоли B16 был значительно снижен у животных с полным нокаутом по EGFL7.

В сходных исследованиях роста опухолей с использованием опухолевых трансплантатов карциномы легких Льюиса (LLC) также был показан сниженный опухолевый рост у гомозиготных EGFL7^-/- мышей KO. Кроме того, в группе мышей EGFL7^-/- KO в опухолях LLC не происходило образование сосудов, что связано с ролью EGFL7 в образовании и развитии сосудов в опухолях.

В исследовании сравнения образования сосудистой сети в сетчатке у мышей EGFL7^-/- KO в сравнении с мышами дикого типа было показано, что несмотря на относительно нормальное формирование сетчатки отсутствие функции EGFL7 приводит к задержке сосудистой миграции в сетчатке. Кроме того, у мышей дикого типа экспрессия EGFL7 происходила в области миграции развития сетчатки.

ПРИМЕР 4. EGFL7 способствует адгезии и миграции EC

Отсутствие разделения EC, как показано в примере 3, указывает на то, что у EGFL7 KD нарушена регуляция подвижности или адгезии EC. Для проведения различий между этими двумя возможностями выполняли анализы миграции и адгезии эндотелиальных клеток in vitro.

Планшеты покрывали 5 мкг/см² белка [BSA (Sigma), коллаген (Upstate), фибронектин (Sigma), продуцируемый в E. coli рекомбинантный EGFL7 человека из Genentech]. После промывки посредством PBS высевали HUVEC (Cambrex) в среду EGM2 (Cambrex) при плотности 5x10⁵/см² и центрифугировали в течение 5 минут при 140g для синхронизации прикрепления клеток, а затем инкубировали. Для анализа специфичности планшеты перед посевом HUVEC предварительно инкубировали с антителом в указанных концентрациях.

Моноклональные антитела к EGFL7 человека получали с использованием в качестве иммуногенного средства рекомбинантных полипептидов EGFL7 человека и мыши. Связывания антитело-антиген оценивали посредством ELISA. Блокирующую активность этих антител тестировали в таких анализах, как анализ адгезии HUVEC. В исходных анализах было выявлено, что наивысшей ингибирующей активностью обладают моноклональные антитела к EGFL7 из гибридом 10G9, 18F7, 3A5 и 1B12.

Для определения прочности адгезии перевернутые планшеты центрифугировали при 46, 183 или 411g через 60 минут после инкубации. Число прикрепленных клеток количественно определяли с использованием анализа на основе флуоресценции (CyQUANT, молекулярные зонды) и проводили считывание данных, применяя флуоресцентный спектрофотометр для прочтения планшетов (Spectramax, молекулярные устройства).

Результаты показали, что нанесенный на культуральные планшеты EGFL7 усиливал адгезию HUVEC (фигура 5). Интересно, что прочность адгезии, которой способствует EGFL7, была значительно слабее, чем для других образцовых молекул клеточной адгезии, таких как фибронектин и коллагены (фигура 5e). Кроме того, кинетика адгезии HUVEC к EGFL7 была значительно медленнее, чем для других субстратов (фигура 5g). Учитывая характер экспрессии EGFL7, внутриклеточное расположение, функцию in vivo и свойства клеточной адгезии, предполагают, что в ходе активного роста сосудов EGFL7 может обеспечивать неограничивающий субстрат, который способствует подвижности, а не устойчивому прикреплению, тем самым делая возможным местное перемещение ангиобластов, необходимое для образование трубки. Кроме того, в анализах миграции с использованием покрытых EGFL7 субстратов при наличии или в отсутствие блокирующих моноклональных антител к EGFL7 было показано, что субстрат EGFL7 способствует миграции HUVEC.

В анализе образования трубки in vitro в присутствии выбранных моноклональных антител к EGFL7 было показано, что некоторые из блокирующих антител, в том числе антитела из гибридом 18F7, 3A5, 10G9 и 1B12, значительно изменяли образование трубки in vitro, дополнительно обеспечивая решающую роль EGFL7 в ходе образования сосудов.

Приведенное выше письменное описание подразумевают достаточным для предоставления возможности специалисту в данной области осуществлять изобретение на практике. Однако различные модификации изобретения в дополнение к представленным и описанным в рамках настоящей заявки вариантам очевидны из указанного выше описания специалистам в данной области и входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

1. Способ снижения или ингибирования ангиогенеза у индивидуума со связанным с ангиогенезом патологическим состоянием, предусматривающий введение индивидууму антагониста EGFL7, способного препятствовать индуцируемой EGFL7 миграции эндотелиальных клеток, тем самым снижая или ингибируя ангиогенез у индивидуума.

2. Способ по п.1, где антагонист EGFL7 представляет собой антитело к EGFL7.

3. Способ по п.1, где патологическое состояние представляет собой новообразование.

4. Способ по п.3, где новообразование представляет собой карциному.

5. Способ по п.1, где патологическое состояние связано с глазом.

6. Способ по п.5, где патологическое состояние представляет собой внутриглазное неоваскулярное заболевание.

7. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий введение индивидууму противоангиогенного средства.

8. Способ по п.7, где противоангиогенное средство вводят перед или после введения антагониста EGFL7.

9. Способ по п.7, где противоангиогенное средство вводят одновременно с антагонистом EGFL7.

10. Способ по п.7, где противоангиогенное средство представляет собой антагонист фактора роста клеток эндотелия сосудов (VEGF).

11. Способ по п.10, где антагонист VEGF представляет собой антитело к VEGF.

12. Способ по п.11, где антитело к VEGF представляет собой бевацизумаб.

13. Способ по п.1, где способность антагониста EGFL7 препятствовать индуцируемой EGFL7 миграции эндотелиальных клеток выявляют в анализе миграции клеток in vitro.