Резистентные мутанты протеазы ns3-ns4a hcv

Изобретение относится к биотехнологии и касается белка протеазы NS3/4A HCV или его биологически активного фрагмента, который содержит последовательность, в которой остаток аминокислоты, который соответствует аминокислоте 156 протеазы NS3/4A HCV дикого типа, не является остатком аланина и, необязательно, остаток аминокислоты, который соответствует аминокислоте 168 протеазы NS3/4A HCV дикого типа, не является аспарагиновой кислотой. Изобретение касается также полинуклеотида, кодирующего данный белок, а также использования данного белка при определении присутствия HCV в биологическом образце, а также в способе определения, является ли инфекция, опосредованная HCV, у пациента резистентной к лекарственному средству против HCV, в способе оценки, имеет ли инфицированный HCV пациент сниженную чувствительность или восприимчивость к VX-950, а также в способе исследования кандидата на ингибитор или потенциального ингибитора HCV. Изобретение позволяет расширить арсенал средств для лечения HCV. 22 н. и 46 з.п. ф-лы, 17 ил., 6 табл.

 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к резистентным мутантам протеазы NS3/4A вируса гепатита С.

Уровень техники родственной области

Инфекция, вызванная вирусом гепатита С (“HCV”), представляет собой непреодолимую проблему медицины человека. HCV рассматривают как этиологический фактор для большинства случаев гепатита ни А, ни В с серологически установленной распространенностью среди людей 3% в мировом масштабе [A. Alberti et al., “Natural History of Hepatitis C,” J. Hepatology, 31., (Suppl.), pp. 17-24 (1999)]. Почти четыре миллиона индивидуумов могут быть инфицированы только в Соединенных Штатах [M.J. Alter et al., “The Epidemiology of Viral Hepatitis in the United States, Gastroenterol. Clin. North Am., 23, pp. 437-455 (1994); M.J. Alter “Hepatitis C Virus Infection in the United States,” J. Hepatology, 31, (Suppl.), pp. 88-91 (1999)].

При первом контакте с HCV приблизительно только у 20% инфицированных индивидуумов развивается острый клинический гепатит, тогда как оказалось, что у других индивидуумов не появляются значительные видимые симптомы инфекционного заболевания. Однако почти в 70% случаев вирус является причиной хронической инфекции, которая сохраняется в течение десятилетий [S. Iwarson, “The Natural Course of Chronic Hepatitis,” FEMS Microbiology Reviews, 14, pp. 201-204 (1994); D. Lavanchy, “Global Surveillance and Control of Hepatitis C,“ J. Viral Hepatitis, 6, pp. 35-47 (1999)]. Обычно это приводит к рецидивирующему и прогрессивно ухудшающемуся воспалению печени, которое часто ведет к более серьезным патологическим состояниям, таким как цирроз печени и печеночно-клеточный рак [M.C. Kew, "Hepatitis С and Hepatocellular Carcinoma", FEMS Microbiology Reviews, 14, pp. 211-220 (1994); I. Saito et. al., "Hepatitis С Virus Infection is Associated with the Development of Hepatocellular Carcinoma," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 6547-6549 (1990)]. К сожалению, не существует никаких достаточно эффективных способов лечения для ослабления прогрессирования хронического HCV.

Геном HCV кодирует полибелок из 3010-3033 аминокислот [Q.L. Choo, et. al., "Genetic Organization and Diversity of the Hepatitis С Virus." Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp. 2451-2455 (1991); N. Kato et al., "Molecular Cloning of the Human Hepatitis C Virus Genome From Japanese Patients with Non-A, Non-B Hepatitis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 9524-9528 (1990); A. Takamizawa et. al., "Structure and Organization of the Hepatitis С Virus Genome Isolated From Human Carriers," J. Virol., 65, pp. 1105-1113 (1991)]. Полагают, что неструктурные (NS) белки HCV обеспечивают необходимый каталитический механизм для репликации вируса. NS-белки образуются в результате протеолитического расщепления полибелка [R. Bartenschlager et. al., «Nonstructural Protein 3 of the Hepatitis С Virus Encodes a Serine-Type Proteinase Required for Cleavage at the NS3/4 and NS4/5 Junctions,» J. Virol, 67, pp. 3835-3844 (1993); A. Grakoui et. al., "Characterization of the Hepatitis С Virus-Encoded Serine Proteinase: Determination of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites," J. Virol., 67, pp. 2832-2843 (1993); A. Grakoui et. аl., "Expression and Identification of Hepatitis С Virus Polyprotein Cleavage Products," J. Virol., 67, pp. 1385-1395 (1993); L. Tomei et. al., "NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis С virus polyprotein", J. Virol., 67, pp. 4017-4026 (1993)].

NS-белок 3 (NS3) HCV проявляет активность сериновой протеазы, которая осуществляет процессинг вирусного полибелка с образованием большинства вирусных ферментов, и является необходимой для репликации и инфективности вируса. Показано, что первые 181 аминокислоты NS3 (остатки 1027-1207 вирусного полибелка) составляют домен сериновой протеазы NS3, который осуществляет процессинг всех четырех последующих участков полибелка HCV [C. Lin et al., “Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase: Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics”, J. Virol., 68, pp. 8147-8157 (1994)]. Замещения каталитической триады сериновой протеазы NS3 HCV приводят к нарушению репликации и инфективности вируса у шимпанзе [A.A. Kolykhalov et al., "Hepatitis С virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3' nontranslated region are essential for virus replication in vivo", J. Virol., 74: 2046-2051]. Известно, что мутации в протеазе NS3 вируса желтой лихорадки снижают инфективность вируса [Chambers, T.J. et. al., "Evidence that the N-terminal Domain of Nonstractural Protein NS3 From Yellow Fever Virus is a Serine Protease Responsible for Site-Specific Cleavages in the Viral Polyprotein", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 8898-8902 (1990)].

Сериновая протеаза NS3 HCV и ассоциированный с ней кофактор, NS4A, осуществляют процессинг области вирусного неструктурного белка в индивидуальные неструктурные белки, включая все вирусные ферменты [С. Failla, et al., "An ammo-terminal domain of the hepatitis С virus NS3 protease is essential for interaction with NS4A", J. Virol. 69, pp. 1769-1777; Y. Tanji et al., "Hepatitits С virus-encoded nonstructural protein NS4A has versatile functions in viral protein processing", J. Virol. 69, pp. 1575-1581; C. Lin et al., "A central region in the hepatitis С virus NS4A protein allows formation of an active NS3-NS4A serine proteinase complex in vivo and in vitro", J. Virol. 69, pp. 4373-4380], и являются необходимыми для вирусной репликации. Оказалось, что упомянутый процессинг аналогичен процессингу, осуществляемому аспартильной протеазой вируса иммунодефицита человека, которая также вовлечена в процессинг вирусных белков. Ингибиторы протеазы HIV (ВИЧ), которые ингибируют процессинг вирусных белков, являются сильными противовирусными средствами для человека, указывая, что прерывание указанной стадии цикла жизни вируса является основанием для разработки терапевтически эффективных средств. Следовательно, это является привлекательной мишенью для разработки лекарственных средств.

Некоторые потенциальные ингибиторы протеазы HCV были описаны в предыдущем уровне техники в данной области [публикации PCT №№ WO 02/18369, WO 02/08244, WO 00/09558, WO 00/09543, WO 99/64442, WO 99/07733, WO 99/07734, WO 99/50230, WO 98/46630, WO 98/17679 и WO 97/43310, патент Соединенных Штатов 5990276, M. Llinas-Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, pp. 1713-18 (1998); W. Han et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 711-13 (2000); R. Dunsdon et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 1571-79 (2000); M. Llinas-Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 2267-70 (2000); and S. LaPlante et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 2271-74 (2000)]. Однако неизвестно, имеют ли названные соединения соответствующие профили, чтобы быть приемлемыми лекарственными средствами. Кроме того, возможно, что протеаза HCV может становиться резистентной к другому подходящему лекарственному средству.

Поэтому современные представления относительно HCV не приводят к каким-либо удовлетворительным анти-HCV средствам или способам лечения инфекции HCV. Единственным признанным способом лечения заболевания, вызванного HCV, является терапия на основе альфа-интерферона. Однако альфа-интерфероны проявляют значительные побочные эффекты [M. A. Walker et al., "Hepatitis С Virus: An Overview of Current Approaches and Progress," DDT, 4, pp. 518-29 (1999); D. Moradpour et al., "Current and Evolving Therapies for Hepatitis C," Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 11, pp. 1199-1202 (1999); H. L. A. Janssen et al. "Suicide Associated with Alfa-Interferon Therapy for Chronic Viral Hepatitis," J. Hepatol., 21, pp. 241-243 (1994); P.F. Renault et al., "Side Effects of Alpha Interferon," Seminars in Liver Disease, 9, pp. 273-277. (1989)] и индуцируют длительную ремиссию только в части случаев (~25%) [O. Weiland, “Interferon Therapy in Chronic Hepatitis C Virus Infection”, FEMS Microbiol. Rev., 14, pp. 279-288 (1994)]. Существующий стандарт лечения, пэгилированным альфа-интерфероном в комбинации с рибавирином, приводит к длительному вирусному ответу (SVR) приблизительно в 40-50% случаев у пациентов, инфицированных генотипом 1, что имеет значение для 70% пациентов с хроническим гепатитом С в развивающихся странах, и к SVR в 80% у пациентов, инфицированных генотипом 2 или 3 [J.G. McHutchison, et al., N. Engl. J. Med., 339: 1485-1492 (1998); G.L. Davis et al., N. Engl. J. Med., 339: 1493-1499 (1998)]. Кроме того, перспективы относительно эффективных анти-HCV вакцин остаются неясными.

Таким образом, существует потребность в более эффективных анти-HCV способах лечения, в особенности потребность в соединениях, которые ингибируют протеазу NS3 HCV. Такие соединения можно использовать как противовирусные средства, в частности как анти-HCV средства. Представления о HCV-резистентных мутантах следует далее совершенствовать в направлении разработки эффективных способов лечения HCV.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к резистентной мутантной протеазе NS3/4A вируса гепатита С.

Таким образом, в некоторых аспектах изобретение включает в себя выделенные полинуклеотиды HCV, которые кодируют мутантные протеазы NS3/4A HCV или их биологически активные аналоги и фрагменты, в которых кодон, который соответствует кодону 156 полинуклеотида дикого типа, и/или кодон, который соответствует кодону 168 полинуклеотида дикого типа, мутирован так, что он не кодирует аланин в положении 156 и/или аспарагиновую кислоту в положении 168. Примеры таких мутаций, описанные здесь, включают в себя полинуклеотиды, в которых кодон, который соответствует кодону 156 полинуклеотида дикого типа, кодирует серин, валин или треонин. Другие показательные воплощения охватывают полинуклеотиды, в которых кодон полинуклеотида, который соответствует кодону 168 полинуклеотида дикого типа, кодирует аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аланин, глицин или тирозин. Любые комбинации мутаций в кодоне 156 и 168 рассматривают особо. Протеаза NS3/4A HCV дикого типа хорошо известна специалистам в данной области. Она кодируется полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1. Такая полинуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

В данном описании также рассматривают полипептиды или их биологически активные фрагменты, которые кодируются полинуклеотидами, рассматриваемыми здесь. Кроме того, изобретение охватывает векторы, которые содержат клетки хозяина, трансформированные или трансфицированные такими полинуклеотидами, и клеточные линии, которые содержат упомянутые полинуклеотиды. Способы и композиции для создания таких векторов, трансформации клеток хозяина и получения клеточных линий являются стандартными и общепринятыми методами, известными специалистам в данной области. Выделенные варианты HCV, которые содержат описываемые мутантные полинуклеотиды или белки, также являются частью данного изобретения.

Композиции, содержащие полинуклеотиды или белки или отдельно или в комбинации с другими композициями и компонентами, также рассматривают в описании.

В изобретении описывают способ обнаружения присутствия резистентного к лекарственному средству HCV в биологическом образце, включающий в себя определение присутствия описываемого полинуклеотида. Обычно такие способы включают в себя получение или выделение полинуклеотида из образца, определение последовательности полинуклеотида и оценку, присутствует ли в полинуклеотиде ассоциированная с резистентностью мутация, такая как одна или более мутаций, обсуждаемых в описании (например, мутация, которая кодирует серин, валин или треонин в остатке, который соответствует остатку 156, и/или кодирует глутаминовую кислоту, валин, аланин, глицин или тирозин в остатке, который соответствует остатку 168 протеазы NS3/4A HCV дикого типа).

Также рассматривают способы обнаружения или выявления, является ли HCV-инфекция у пациента резистентной к лекарственному средству, включающие в себя забор биологического образца от инфицированного HCV пациента и определение, содержит ли образец плазмы нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантную протеазу NS3/4A HCV, при этом присутствие мутантной протеазы NS3/4A HCV указывает, что пациент имеет резистентную к лекарству инфекцию, вызванную HCV.

В других аспектах рассматривают способы оценки, имеет ли инфицированный HCV пациент сниженную чувствительность или восприимчивость к VX-950, включающие в себя оценку, имеется ли у пациента ДНК протеазы NS3/4A вируса гепатита С, имеющая мутацию в кодоне, который кодирует остаток 156 протеазы NS3/4A вируса гепатита С дикого типа.

Следующие аспекты направлены на способы оценки, имеет ли инфицированный HCV пациент сниженную чувствительность или восприимчивость к ингибитору протеазы, включающие в себя оценку, присутствует ли у пациента ДНК протеазы NS3/4A вируса гепатита С, имеющая мутацию в кодоне, который кодирует остаток 156 протеазы NS3/4A вируса гепатита С дикого типа.

В изобретении, кроме того, рассматривают способы оценки кандидата на ингибитор или потенциального ингибитора HCV, включающие в себя введение вектора, содержащего полинуклеотид изобретения и ген-индикатор, кодирующий индикатор в клетку хозяина, культивирование клетки хозяина и определение индикатора в присутствии и в отсутствие ингибитора.

Другие способы исследования активности соединений против HCV включают в себя обеспечение мутантной протеазой, обсуждаемой в описании, и протеазного субстрата; контактирование с кандидатным или потенциальным ингибитором в присутствии субстрата и оценку или количественное определение ингибирования протеолитической активности протеазы.

В других аспектах представляют способы идентификации соединения как ингибитора резистентной к лекарству протеазы, рассматриваемой в описании, исследованием активности такой протеазы в отсутствие соединения; исследованием активности протеазы в присутствии соединения; сравнением результатов исследований, проводимых в присутствии и отсутствие соединения, при этом любое снижение протеазной активности как результат присутствия соединения указывает, что соединение является ингибитором протеазы.

Также описывают способы идентификации соединений, которые способны восстанавливать активность VX-950, при этом протеаза NS3/4A становится резистентной к VX-950, способы, при которых резистентная протеаза контактирует с соединением, и способность VX-950 ингибировать активность протеазы оценивают в присутствии такого соединения.

В данном изобретении используют тот факт, что установлена трехмерная структура протеазы NS3/4A (смотри, например, WO 98/11134). Используя такие методы и рекомендации данного изобретения, получают трехмерную модель резистентной протеазы изобретения; соединения конструируют или выбирают для взаимодействия с трехмерной структурой мутантной протеазы и оценивают способность соединения связывать протеазу или взаимодействовать с ней (например, молекулярным моделированием). Типичные трехмерные модели основаны на рентгеновской кристаллической структуре протеазы NS3/4A (фигура 1 и фигура 2). Такие модели можно получать по способам, выполняемым на компьютере, способам или методом рентгеновской кристаллографии. Полученные результаты можно сравнивать с данными, установленными для протеазы дикого типа.

Соединение может быть идентифицировано из комбинаторной химической библиотеки или получено методом рационального конструирования лекарственного средства. В показательных воплощениях соединение является соединением, полученным методом рационального конструирования лекарственного средства и установленным на основании структуры VX-950. В других показательных воплощениях идентифицированное соединение готовят в виде композиции, содержащей соединение и фармацевтически подходящий носитель, адъювант или наполнитель. Предпочтительно, композиция содержит соединение в количестве эффективном, чтобы ингибировать сериновую протеазу NS3/4A. Более предпочтительно, композицию составляют для введения пациенту. Композиции также могут содержать дополнительное средство, выбранное из иммуномодулирующего средства, противовирусного средства, второго ингибитора протеазы HCV, ингибитора другой мишени в цикле жизни HCV, ингибитора цитохрома Р-450 или их комбинаций.

Другие способы изобретения, предполагающие ингибирование активности протеазы NS3/4A вируса гепатита С, включают в себя стадию контактирования сериновой протеазы с таким соединением или композицией. В следующих аспектах рассматривают способы лечения инфекционного заболевания HCV у пациента, включающие в себя стадию введения пациенту такого соединения композиции.

В дополнительных аспектах рассматривают способы лечения или ослабления инфекции, вызванной HCV, у пациента, включающие в себя определение, имеет ли пациент HCV-инфекцию, которая резистентна к терапии с использованием обсуждаемого в описании способа, который обеспечивает обнаружение описываемых мутаций и лечение пациента композицией или терапией, направленной на лечение резистентной к лекарственному средству инфекции HCV.

В других дополнительных аспектах обсуждают способы элиминации или снижения заражения HCV биологического образца или медицинского или лабораторного оборудования, включающие в себя стадию контактирования биологического образца или медицинского или лабораторного оборудования с соединением, идентифицированным, как описывают в заявке. В следующих воплощениях биологический образец или медицинское или лабораторное оборудование инфицировано резистентным к лекарству штаммом HCV, что устанавливают по описанным способам определения.

Другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из следующего подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и специальные примеры, указывающие на предпочтительные воплощения изобретения, представляются только для иллюстрации, так как различные изменения и модификации в пределах идеи и сферы действия изобретения станут очевидными специалистам в данной области из предлагаемого подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Следующие чертежи составляют часть данного описания и включены для дальнейшей иллюстрации аспектов данного изобретения. Изобретение может быть понято лучше благодаря ссылкам на чертежи в сочетании с подробным описанием специальных воплощений, представляемых в описании.

Фигура 1: Рентгеновские структуры двух комплексов протеаза NS3 HCV - протеазный ингибитор (PI) BILN 2061 и VX-950. Две ко-комплексные структуры установлены и нанесены на схему (VX-950 голубым цветом и BILN 2061 красным цветом). Три остатка, изображенные в виде шар-и-палочка (R123, R155 и D168), образуют солевые мостиковые связи в структуре BILN 2061, а не в структуре VX-950. Удаление отрицательного заряда в D168 приводит к потере ограничения R155 и последующей потере упаковки большого Р2 BILN 2061 и увеличению стоимости десольватации. R155 не ограничен посредством D168 в структуре VX-950, а мутация D168V не влияет на его связывание.

Фигура 2: Мутация A156S вызывает потерю связывания вследствие пространственного столкновения с VX-950, а не с BILN 2061. Рентгеновские структуры VX-950 (верхний слева, голубой) или BILN 2061 (нижний слева, красный) с А156 дикого типа ярко освещены желтым цветом. Модели мутации A156S (серый цвет) с VX-950 (верхний правый, голубой) или с BILN 2061 (нижний правый, красный). Рассматривали все допустимые углы скручивания для боковой цепи серина в мутированном остатке.

Фигура 3: Мутация A156V вызывает потерю связывания PIs вследствие пространственного столкновения или с VX-950 или с BILN 2061. Модели мутации A156V (серый цвет) с VX-950 (слева, голубой цвет) или BILN 2061 (справа, красный цвет).

Фигура 4: Химические структуры VX-950 (A) и BILN 2061 (B).

Фигура 5: Получение содержащих репликон клеток HCV, которые резистентны к VX-950. Субгеномные, содержащие репликон клетки Con1 HCV серийно пассировали в присутствии G418 и увеличивающейся концентрации VX-905 (A), как описывают в разделе «Материалы и методы». Содержащие репликон клетки размножали и свежий PI добавляли в среду дважды в неделю. Затененные площади указывают на период времени, во время которого содержащие репликон клетки характеризовались незначительным ростом или отсутствием общего роста, что сопровождалось сопутствующей массивной гибелью клеток. Тотальную клеточную РНК содержащих репликон клеток в различные периоды времени (отмечено расширенными стрелками) во время селекции резистентности экстрагировали, и продукт RT-PCR (ПЦР-ОТ), охватывающий сериновую протеазу NS3 HCV, секвенировали или сразу или после субклонирования в ТА-вектор. Значения IC₅₀ для VX-950 относительно серии А или содержащих репликон клеток дикого типа определяли на 56 день в стандартном 48-часовом исследовании (В).

Фигура 6: Получение содержащих репликон клеток HCV, которые резистентны к BILN 2061. Субгеномные, содержащие репликон клетки Con1 HCV серийно пассировали в присутствии G418 и увеличивающейся концентрации BILN 2061 (A), как описывают в разделе «Материалы и методы». Содержащие репликон клетки размножали и свежий PI добавляли в среду дважды в неделю. Затененные площади указывают на период времени, во время которого содержащие репликон клетки характеризовались незначительным ростом или отсутствием общего роста, что сопровождалось сопутствующей массивной гибелью клеток. Тотальную клеточную РНК содержащих репликон клеток в различные временные точки (отмечено расширенными стрелками) во время селекции резистентности экстрагировали, и продукт RT-PCR (ПЦР-ОТ), охватывающий сериновую протеазу NS3 HCV, секвенировали или сразу, или после субклонирования в ТА-вектор. Значения IC₅₀ для BILN 2061 относительно серии В или содержащих репликон клеток дикого типа определяли на 59 день в стандартном 48-часовом исследовании (В).

Фигура 7: Модели комплексов протеаза:ингибитор. Белок представлен в виде рисунка, сделанного на основании вторичной структуры, в светло-сером цвете. Ингибиторы изображены как шар-и-палочка (VX-950 пурпурным цветом, а BILN 2061 желтым цветом) с азотами, окрашенными в голубой цвет, кислородами, окрашенными в красный цвет, и серой - в оранжевый цвет. Боковые цепи ключевых остатков изображены в виде палочек с различной окраской: Ala156 (зеленый), Asp168 (оранжевый) и Arg123 (оранжевый). Модель боковая цепь Arg155 BILN 2061:протеаза показана голубым цветом, а модель боковая цепь Arg155 VX-950:протеаза окрашена оранжевым цветом. Названные боковые цепи изображены в виде поверхностей из точек. Каталитическая триада, Ser139, His57 и Asp81 отмечена серым цветом. (Фигура создана с помощью Молекулярных графических систем PyMOL Molecular Graphics Systems, DeLano Scientific LLC, San Carlos, California, U.S.A. Copyright © 1998-2003).

Фигура 8: Получение двойных-резистентных репликонов из VX-950-резистентных, содержащих репликон клеток. (А) VX-950-резистентные, содержащие репликон клетки серийно пассировали в присутствии 0,25 мг/мл G418, 14 мкМ VX-950 и возрастающих концентраций BILN 2061. Содержащие репликон клетки размножали и свежие VX-950 и BILN 2061 добавляли в среду дважды в неделю, что показано с помощью заполненных прямоугольников и треугольников соответственно. Тотальную клеточную РНК содержащих репликон клеток на 32 день во время селекции резистентности экстрагировали, и продукт ПЦР-ОТ, охватывающий сериновую протеазу NS3 HCV, секвенировали или сразу, или после субклонирования в ТА-вектор. (В) Представлено титрование VX-950 против серии А (VX-950-резистентная) (заполненные прямоугольники) или серии С (двойная резистентность) (открытые прямоугольники) содержащих релипкон клеток на 52 день посредством VX-950. Уровень РНК HCV определяли после 48-часовой инкубации с VX-950. (С) Представлено титрование BILN 2061 против серии А (VX-950-резистентная) (заполненные треугольники) или серии С (двойная резистентность) (открытые треугольники) содержащих репликон клеток на 52 день посредством BILN 2061. Уровень РНК HCV определяли после 48-часовой инкубации с BILN 2061.

Фигура 9: Получение двойных-резистентных репликонов из BILN 2061-резистентных, содержащих репликон клеток. (А) BILN 2061-резистентные, содержащие репликон клетки серийно пассировали в присутствии 0,25 мг/мл G418, 7 или 14 мкМ VX-950 и возрастающих концентраций BILN 2061. Содержащие репликон клетки размножали и свежие VX-950 и BILN 2061 добавляли в среду дважды в неделю, что показано с помощью заполненных прямоугольников и треугольников соответственно. Тотальную клеточную РНК содержащих репликон клеток на 32 день во время селекции резистентности экстрагировали, и продукт ПЦР-ОТ, охватывающий сериновую протеазу NS3 HCV, секвенировали или сразу, или после субклонирования в ТА-вектор. (В) Представлено титрование VX-950 против серии В (BILN 2061-резистентная) (заполненные прямоугольники) или серии D (двойная резистентность) (открытые прямоугольники) содержащих репликон клеток на 52 день посредством VX-950. Уровень РНК HCV определяли после 48-часовой инкубации с VX-950. (С) Показано титрование BILN 2061 против серии В (BILN 2061-резистентная) (заполненные треугольники) или серии D (двойная резистентность) (открытые треугольники) содержащих репликон клеток на 52 день посредством BILN 2061. Уровень РНК HCV определяли после 48-часовой инкубации с BILN 2061.

Фигура 10: Получение двойных-резистентных репликонов из «наивных» содержащих репликон клеток. Субгеномные, содержащие репликон клетки HCV серийно пассировали в присутствии 0,25 мг/мл G418 и возрастающих концентраций VX-950 и BILN 2061. Содержащие репликон клетки размножали и свежие VX-950 и BILN 2061 добавляли в среду дважды в неделю, что показано с помощью заполненных прямоугольников и ромбами соответственно. Изолированная область указывает период времени, во время которого содержащие репликон клетки характеризуются небольшим ростом или полным отсутствием роста, что сопровождается сопутствующей массивной гибелью клеток. Тотальную клеточную РНК содержащих репликон клеток в различные периоды времени, указанные открытыми стрелками, во время селекции резистентности экстрагировали, и продукт ПЦР-ОТ, охватывающий сериновую протеазу NS3 HCV, секвенировали или сразу или после субклонирования в ТА-вектор.

Фигура 11: Схемы конформаций боковой цепи Thr156 в зависимости от связывания ингибитора. Толстые линии изображают боковую цепь Thr156 мутантного фермента и боковую цепь Р2 ингибитора или субстрата. Также рассматривали такие же три конформации для боковой цепи Val156. Последние (-60/180°) конформации имели наиболее низкую энергию для любой мутации, но плохо связывали оба ингибитора.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ

В данном изобретении установлено, что штаммы HCV подвергаются определенным мутациям в присутствии некоторых терапевтических соединений, которые делают штаммы HCV резистентными к терапевтическому потенциалу таких соединений. В особых воплощениях установлено, что протеаза NS3/4A вируса гепатита С мутируется в такие резистентные мутанты HCV так, что мутанты оказываются резистентными к соединениям-ингибиторам протеаз. Упомянутые данные можно использовать при создании терапий для лечения инфекций HCV.

В специальных воплощениях установлено, что аминокислотный остаток 156 NS3/4A HCV дикого типа (последовательность которой представляют как SEQ ID NO:2) чувствителен к мутации. Мутация названного остатка приводит к резистентности HCV к терапевтическому воздействию протеазными ингибиторами. В одном воплощении показано, что кодон 156 дикого типа, который в NS3/4A HCV дикого типа кодирует аланин, мутирован в кодон, который кодирует серин в том же соответствующем положении в полипептиде NS3/4A HCV. В другом воплощении кодон мутирован в кодон, который кодирует валин в том же соответствующем положении в полипептиде NS3/4A HCV. В еще одном воплощении треонин кодирован в том же соответствующем положении в NS3/4A HCV.

Учитывая вышеприведенные данные, изобретение обеспечивает ДНК HCV, кодирующую протеазу NS3/4A HCV (или ее фрагмент, или аналог), в которой кодон 156 ДНК кодирует серин. В другом воплощении данного изобретения обеспечивают ДНК HCV, кодирующую протеазу NS3/4A HCV (или ее фрагмент, или аналог), в которой кодон 156 ДНК кодирует валин. В еще одном воплощении обеспечивают ДНК HCV, кодирующую протеазу NS3/4A HCV (или ее фрагмент, или аналог), в которой кодон 156 ДНК кодирует треонин.

В следующих воплощениях установлено, что в некоторых воплощениях кодон 156 является кодом, который кодирует валин, серин или треонин по остатку 156, который обычно является остатком аланина в нативной/дикого типа NS3/4A HCV, и имеется другая мутация, в которой кодон по остатку 168 нативной/дикого типа NS3/4A HCV, который обычно является остатком аспарагиновой кислоты, мутирован в остаток валина, аланина, глицина или тирозина. Хотя в определенных воплощениях предполагают, что мутантная протеаза NS3/4A HCV может содержать мутации в положениях как 156, так и 165, считают, что мутанты, которые содержат одиночные мутации, также являются частью данного изобретения.

Специальные аспекты изобретения включают в себя ДНК HCV, кодирующую протеазу NS3/4A HCV (или ее фрагмент или аналог), в которой кодон 156 ДНК кодирует валин или треонин, а кодон 168 кодирует аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту. В другом воплощении данного изобретения обеспечивают ДНК HCV, кодирующую протеазу NS3/4A HCV (или ее фрагмент или аналог), в которой кодон 168 ДНК кодирует валин. В следующем воплощении данного изобретения предусматривают ДНК HCV, кодирующую протеазу NS3/4A HCV (или ее фрагмент или аналог), в которой кодон 168 ДНК кодирует аланин, глицин или тирозин.

Система нумерации для ДНК данного изобретения находится в соответствии с последовательностью SEQ ID NO.1. ДНК согласно данному изобретению может быть выведена из SEQ ID NO.1. ДНК можно получать методом твердофазного синтеза или рекомбинантными способами. В специальных воплощениях сайт-направленный мутагенез последовательности SEQ ID NO:2 используют для того, чтобы получить один или другой из мутантов, описываемых в описании.

Следует признать, что белковые мутации могут быть полными (то есть весь или почти весь белок превращают в мутантный белок), частичными или отсутствовать (то есть никакой или почти никакой мутации). Поэтому композиция или способ данного изобретения могут включать в себя смесь белка дикого типа и мутантного белка.

В соответствии с другим воплощением данного изобретения обеспечивают белок протеазы NS3/4A HCV (или его фрагмент, или аналог), содержащий аминокислоту 156 протеазы, при этом аминокислота 156 является серином.

В другом воплощении данного изобретения обеспечивают белок протеазы NS3/4A HCV (или его фрагмент, или аналог), содержащий аминокислоту 156 протеазы, при этом аминокислота 156 представляет собой валин.

В еще одном воплощении данного изобретения обеспечивают белок протеазы NS3/4A HCV (или его фрагмент, или аналог), содержащий аминокислоту 156 протеазы, при этом аминокислота 156 представляет собой треонин.

В следующем воплощении данного изобретения обеспечивают белок протеазы NS3/4A HCV (или его фрагмент, или аналог), содержащий аминокислоту 156 протеазы, при этом аминокислота 156 представляет собой валин или треонин, а аминокислота 168 представляет собой аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту.

В другом воплощении данного изобретения обеспечивают выделенный белок протеазы NS3/4A HCV (или его фрагмент, или аналог), содержащий аминокислоту 156 протеазы, при этом аминокислота 168 представляет собой валин.

В другом воплощении данного изобретения обеспечивают белок протеазы NS3/4A HCV (или его фрагмент, или аналог), содержащий аминокислоту 156 протеазы, при этом аминокислота 168 представляет собой аланин, глицин или тирозин.

ДНК и белки согласно данному изобретению можно модифицировать, используя стандартные методы. Например, ДНК может содержать модификацию для присоединения ДНК к твердому носителю. Белки могут содержать ковалентно-присоединенное маркерное соединение.

ДНК или белки согласно данному изобретению могут быть в виде формы, читаемой на компьютере, включающей в себя читаемые на компьютере носители и/или базы данных, читаемые на компьютере, не ограничиваясь названными формами (смотри, например, WO 98/11134).

Что касается некоторых применений, ДНК согласно данному изобретению может быть вставлена в вектор. Любой подходящий вектор может относиться к сфере действия изобретения. Подходящие векторы известны в данной области. В одном воплощении предусматривают вектор экспрессии. В другом воплощении предусматривают вирусный вектор. Вектор может быть клонирующим средством или может дополнительно содержать регуляторные последовательности, такие как промотер, усилители и терминаторы или сигналы полиаденилирования.

Соответственно данное изобретение также обеспечивает вектор, содержащий ДНК протеазы NS3/4A HCV (или ее фрагмент, или аналог), в котором:

кодон 156 ДНК кодирует серин;

кодон 156 ДНК кодирует валин;

кодон 156 ДНК кодирует треонин;

кодон 156 ДНК кодирует валин или треонин, а кодон 168 кодирует аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту;

кодон 168 ДНК кодирует валин;

кодон 168 ДНК кодирует аланин;

кодон 168 ДНК кодирует глицин и/или

кодон 168 ДНК кодирует тирозин.

В другом воплощении обеспечивают экспрессирующий вектор. В следующем воплощении обеспечивают вирусный вектор. Вектор может быть средством клонирования или может дополнительно содержать регуляторные последовательности, такие как промотер, усилители и терминаторы или сигналы полиаденилирования. Названные векторы можно использовать в любой подходящей клетке хозяина. Клетки хозяина известны в данной области.

Таким образом, в данном изобретении также предусматривают клетки хозяина, содержащие ДНК протеазы NS3/4A, в которой кодон 156 ДНК кодирует серин; кодон 156 ДНК кодирует валин; кодон 156 ДНК кодирует треонин; кодон 156 ДНК кодирует валин или треонин, а кодон 168 кодирует аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту; кодон 168 ДНК кодирует валин; кодон 168 ДНК кодирует аланин; кодон 168 ДНК кодирует глицин и/или кодон 168 ДНК кодирует тирозин. Экспрессия ДНК будет обеспечивать клетку хозяина, содержащую протеазу, имеющую А156 с мутацией в серин; А156 с мутацией в валин; А156 с мутацией в треонин; А156 с мутацией в валин или треонин и D168 с мутацией в глутаминовую кислоту; D168 с мутацией в валин; D168 с мутацией в аланин; D168 с мутацией в глицин и/или D168 с мутацией в тирозин. Также обеспечивают линии клеток, содержащие ДНК или белки согласно данному изобретению.

Изобретение также обеспечивает вариант HCV, содержащий ДНК согласно данному изобретению или белок согласно данному изобретению и композиции, содержащие ДНК и белки.

Варианты HCV, а также ДНК и/или белки согласно изобретению можно использовать для обнаружения лекарственного средства, а также для мониторинга соответствующих терапий HCV.

Таким образом, в другом воплощении данное изобретение обеспечивает способ обнаружения присутствия HCV в биологическом образце, включающий в себя определение присутствия ДНК согласно данному изобретению. Упомянутые способы могут включать в себя стадии a) получения (или экстракции) ДНК; b) определения последовательности ДНК; с) установления или предположения, кодирует ли в ДНК кодон 156 серин, кодирует ли кодон 156 валин, кодирует ли кодон 156 полинуклеотида треонин, кодирует ли кодон 156 валин или треонин и кодирует ли кодон 168 аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту, кодирует ли кодон 168 валин или кодирует ли кодон 168 аланин, глицин или тирозин. В некоторых воплощениях биологический образец, содержащий HCV, получают от млекопитающего, которое инфицировано HCV. Обнаружение присутствия такой ДНК можно использовать в диагностических целях, чтобы служить указанием практикующему врачу, что индивидуум является индивидуумом, у которого инфекция HCV, вероятно, будет резистентной или иным образом нечувствительной к лечению протеазными ингибиторами. Учитывая такое указание, специалист профессионал может модифицировать способ лечения субъекта, имеющего такую инфекцию, например, кроме увеличения дозы терапии, применением дополнительных способов лечения, использующих средства, к которым штамм HCV, инфицирующий субъекта, не резистентен.

Способы данного изобретения могут требовать получения определенных количеств ДНК. Как должен признать практикующий специалист, ДНК следует получать, а затем амплифицировать. Стандартные методы (например, ПЦР, гибридизация) можно использовать при практическом применении данного изобретения. Такие методы хорошо известны специалистам в данной области.

Данное изобретение также обеспечивает способы лечения или предупреждения инфекции HCV посредством непрерывного контроля мутаций, рассматриваемых в изобретении. Если резистентный мутант присутствует в HCV, тогда пациента можно лечить соответственно. Такой способ будет включать в себя: а) забор образца (например, образец плазмы, PMBC, клетка печени или другой образец) у пациента, инфицированного HCV; и b) оценку, содержит ли образец плазмы нуклеиновую кислоту, кодирующую протеазу NS3/4A HCV, содержащую мутацию в кодоне 156; при этом мутация приводит к замещению аланина серином. Подобные способы можно выполнять посредством замещения 156-аланина мутацией на серин с другими мутациями, описанными в описании. Соответственно подобные способы могут включать в себя идентификацию А156 с мутацией на серин (или другой мутацией, охарактеризованной в описании) и другую мутацию протеазы. Все названные способы будут включать в себя получение ДНК, амплификацию ДНК и определение последовательности ДНК.

Данное изобретение также обеспечивает способы оценки эффективности лечения ингибиторами протеазы NS3/4A пациента, инфицированного HCV. Такие способы включают в себя: а) забор образца (например, образца плазмы) от пациента, инфицированного HCV; и b) оценку, содержит ли образец плазмы нуклеиновую кислоту, кодирующую протеазу NS3/4A HCV, имеющую мутацию в кодоне 156; при этом мутация приводит к замещению аланина серином. Подобные способы можно выполнять с другими мутациями данного изобретения.

Способы данного изобретения предназначены для идентификации резистентных мутантов у пациентов, которым вводили ингибиторы протеазы HCV. Описанный способ можно практически применять пациенту, которого лечат или лечили. Упомянутые и другие диагностические методы известны в данной области (смотри, например, US 5631128 и US 6489098).

Таким образом, в одном воплощении обеспечивают способ оценки, содержится ли у инфицированного HCV пациента ДНК протеазы NS3/4A вируса гепатита С, имеющая мутацию в кодоне 156. Возможно, упомянутый пациент является резистентным к терапии таким средством, как VX-950. Соответственно пациента можно лечить терапией, в которой применяют заместитель VX-950. В другом воплощении предусматривают способ определения, имеется ли у пациента, инфицированного HCV, ДНК протеазы NS3/4A вируса гепатита С, имеющая мутацию в кодоне 168.

Некоторые из названных мутаций приводят к сниженной чувствительности или восприимчивости к VX-950. Аналогично, некоторые из мутаций коррелируют со сниженной чувствительностью или приводят к сниженной чувствительности или восприимчивости к BILN 2061 (WO 00/599929; US 6608027). Другие мутации приводят к сниженной чувствительности или восприимчивости как к VX-950, так и к BILN 2061. Сниженную чувствительность или восприимчивость к любому или обоим соединениям можно оценивать согласно данному изобретению. Имея определенные представления относительно особенностей резистентной мутации, можно разработать более эффективную схему лечения.

Например, данное изобретение позволяет конструировать и/или открывать соединения, которые активны против резистентных мутантов, обсуждаемых в описании.

Соответственно данное изобретение обеспечивает способ оценки кандидата на ингибитор и потенциального ингибитора HCV, включающий в себя:

а) введение вектора, содержащего ДНК согласно данному изобретению и ген-индикатор, кодирующий индикатор в клетке хозяина;

b) культивирование клетки хозяина;

с) количественное определение индикатора в присутствии ингибитора и отсутствие ингибитора.

В описанном способе тестируемое соединение можно добавлять на любой одной или более из стадий а)-с).

В другом воплощении данного изобретения обеспечивается способ исследования активности соединения против HCV, включающий в себя:

а) обеспечение протеазой согласно данному изобретению и протеазным субстратом;

b) контакт протеазы с кандидатом на ингибитор или потенциальным ингибитором в присутствии субстрата;

с) оценка или количественное определение ингибирования протеолитической активности протеазы.

В другом воплощении данного изобретения обеспечивают способ идентификации ингибитора протеазы согласно данному изобретению, включающий в себя:

а) исследование активности протеазы в отсутствие соединения;

b) исследование активности протеазы в присутствии соединения;

с) сравнение результатов а) и результатов b).

Описанный способ может дополнительно включать в себя:

d) исследование активности протеазы дикого типа в отсутствие соединения;

e) исследование активности протеазы дикого типа в присутствии соединения;

f) сравнение результатов d) и результатов e).

Данные, полученные описанными способами, затем можно анализировать, например, сравнивая результаты а) и/или b) и результаты d) и/или e).

Также обеспечиваются способы, включающие в себя:

d) исследование активности второй протеазы NS3/4A, содержащей аминокислоту 168 протеазы, в которой аминокислота 168 представляет собой валин, аланин, глицин или тирозин, в отсутствие соединения;

e) исследование активности второй протеазы в присутствии соединения;

f) сравнение результатов d) и e).

Способ может еще включать в себя:

g) исследование активности протеазы дикого типа в отсутствие соединения;

h) исследование активности протеазы дикого типа в присутствии соединения;

i) сравнение результатов g) и результатов h).

В более специальном воплощении способ включает в себя сравнение результатов из а) и/или b) и результатов d) и/или e) и/или результатов из g) и/или h).

После того как вирусы становятся резистентными к лекарственному средству, возможно, что вирус может еще мутировать и снова становиться чувствительным к лекарственному средству. Так, это происходит при вступлении вируса в контакт со вторым лекарственным средством. Соответственно в данном изобретении также предусматривают способы идентификации соединения, способного восстанавливать активность VX-950, при которых протеаза NS3/4A становится резистентной к VX-950, включающие в себя:

а) контактирование обсуждаемой мутантной протеазы с представляющим интерес соединением;

b) исследование способности VX-950 ингибировать активность протеазы из а). Также обеспечиваются подобные способы восстановления активности BILN 2061 против резистентных мутантов и/или мутантов с двойной резистентностью к VX-950 и BILN 2061.

Другой аспект в отношении резистентных к лекарству вирусов заключается в том, что вирус можно излечивать другим лекарственным средством. Поэтому способы индентификации соединений, которые эффективны в отношении вируса, резистентного к лекарству, являются очень полезными способами выявления лекарственного средства. Описанные здесь способы можно применять в методах скрининга большого количества материала. Альтернативно, изобретение также обеспечивает способы осуществления рационального конструирования лекарственного средства, используя информацию по структуре протеазы NS3/4A HCV, освещаемой в описании (то есть той мутации особых остатков в 156 и/или 168 белка дикого типа), как основу для конструирования эффективных протеазных ингибиторов. Точнее, в данном изобретении впервые идентифицируют те штаммы HCV, которые являются резистентными к лечению протеазными ингибиторами, такими как VX-950 и BILN 2061.

Рациональное конструирование лекарственного средства также можно комбинировать с систематическим способом крупномасштабных скрининговых экспериментов, в которых мишени возможных протеазных ингибиторных лекарств тестируют с соединениями из комбинаторных библиотек.

Рациональное конструирование лекарственного средства представляет собой собирательный подход, в котором используют информацию относительно структуры лекарственного рецептора или одного из его природных лигандов для идентификации или создания кандидатов на лекарственные средства. Трехмерную структуру белка можно устанавливать, используя способы, такие как рентгеновская кристаллография или спектроскопия ядерного магнитного резонанса. В данном изобретении трехмерную структуру мутанта протеазы NS3/4A HCV, который содержит одну, другую или обе мутации остатков 156 или 168, в настоящее время можно легко установить, используя стандартный способ рентгеновской кристаллографии и/или спектроскопию ЯМР.

Рациональное конструирование лекарственного средства также можно комбинировать с систематическим способом крупномасштабных скрининговых экспериментов, в которых мишени возможных протеазных ингибиторных лекарств тестируют с соединениями из комбинаторных библиотек. Располагая представленной в описании информацией, профессиональные специалисты могут применять компьютерные программы для изучения баз данных, содержащих структуры многочисленных различных химических соединений. Компьютер может выбрать те соединения, которые являются наиболее подходящими, чтобы взаимодействовать с протеазой NS3/4A HCV из резистентных к лекарству мутантов и тестировать такое идентифицированное соединение стандартными лабораторными способами с протеазными ингибиторами, такими как способы, описанные здесь.

В некоторых воплощениях считают, что структуру VX-950 или BILN 2061 (смотри фигуру 4) можно использовать как исходную структуру, на основе которой можно конструировать дополнительные молекулы. В описании показано, что мутантные протеазы являются такими, что взаимодействие VX-950 с ними оказывается сниженным. Структуры, полученные на основе VX-950, которые легче подходят и взаимодействуют с разработанной трехмерной структурой, когда остаток 156 является валином, серином или треонином и/или остаток 168 представляет собой валин, аланин, глицин или глутаминовую кислоту, будут полезными новыми протеазными ингибиторами, которые можно применять против резистентных штаммов HCV, в которых имеются мутации в протеазе NS3/4A HCV. Такие соединения также могут быть эффективными против штаммов HCV дикого типа, в которых протеаза NS3/4A HCV не мутирована. Рекомендации данного изобретения позволят специалистам сконцентрировать и сузить исследования настолько, насколько возможно, чтобы ограничить стоимость крупномасштабного скрининга.

В определенных воплощениях структура исходного соединения имеет структуру VX-950 (показана ниже в структуре В). Хотя VX-950 служит примером, любой стереоизомер 950 можно использовать со смесью D- и L-изомеров в боковой цепи н-пропила, специально включенной. Следующая структура А изображает такой диастереоизомер. Это представляет собой смесь соединений структуры В (VX-950) и структуры С.

Структура А

Структура В

Структура С

Рациональное конструирование лекарственных средств можно использовать, чтобы серийно изменять различные положения на данной молекуле, чтобы получить ее производные, которые можно использовать как ингибиторы протеазы. Кристаллические структуры протеазы NS3/4A HCV дикого типа с VX-950, связанным с ней, представлены на фигуре 1. Данные, представленные на упомянутой фигуре, показывают, что удаление отрицательного заряда D168 протеазы NS3/4A HCV приводит к потере ограничения R155 и последующей потере упаковки с большим P2 BILN 2061 и увеличению стоимости десольватации. R155 не ограничен посредством D168 в установленной с VX-950 структуре, а мутация D168V не влияет на его связывание. Такие исследования связывания можно легко осуществлять с производными, установленными рациональным конструированием лекарственного средства, чтобы идентифицировать средства, которые проявляют связывающую способность и/или терапевтическую эффективность в мутантах.

Рациональное конструирование лекарственного средства ранее использовали, чтобы идентифицировать реленз, который используют для лечения гриппа. Конструирование, которое привело к открытию реленза, было разработано в результате отбора молекул, которые больше всего подходили для взаимодействия с нейраминидазой, продуцируемым вирусом ферментом, который требуется, чтобы высвобождать вновь образованные вирусы из инфицированных клеток. Многочисленные современные лекарственные средства для лечения инфекций HCV (например, ритонивир™, индинавир™) также идентифицировали по схемам рационального конструирования лекарственного средства, по которым лекарственные средства конструировали для взаимодействия с вирусной протеазой, ферментом, который расщепляет вирусные белки и позволяет им собираться должным образом.

Другим хорошо известным лекарственным средством, которое создавали по способу рационального конструирования на основе лиганда, является виагра™. Упомянутое лекарственное средство разрабатывали похожим на кГМФ, лиганд, который связывает фосфодиэстеразу.

Учитывая, что способы рационального конструирования лекарственного средства оказываются эффективными, если только структура мишени лекарственного средства известна, ожидали, что открытия данного изобретения, которые выявят структуры протеазы NS3/4A HCV, которые появляются в штаммах HCV, являющихся резистентными к известным ингибиторам протеазы HCV, специалисты в данной области смогут применять для рационального конструирования лекарственного средства, чтобы идентифицировать лекарственные средства, подходящие для лечения HCV.

Соответственно в данном изобретении также обеспечивают способ идентификации соединения, эффективного против протеазы согласно данному изобретению, включающий в себя:

а) получение трехмерной модели протеазы;

b) конструирование или выбор соединения;

с) оценка способности соединения связываться с протеазой или взаимодействовать с ней.

В таких способах трехмерная модель основана на рентгеновской кристаллической структуре протеазы NS3/4A (фигура 1 и фигура 2). Известны способы разработки моделей кристаллической структуры, например, выполняемые на компьютере способы молекулярного конструирования (смотри, например, US 6162613, WO 98/11134 и/или WO 02/068933). Трехмерную модель также можно получать методом рентгеновской кристаллографии белка согласно данному изобретению. Как признано в данной области, белок можно кристаллизовать в присутствии отсутствия лиганда (такого как оцениваемое соединение).

Способы оценки способности соединения связываться с протеазой или взаимодействовать с ней известны в данной области (смотри, например, US 6162613, WO 98/11134 и/или WO 02/068933). Оценку можно производить, например, молекулярным конструированием. После того как соединение выбрано, его можно тестировать в стандартных исследованиях или исследованиях, описанных здесь, чтобы установить соединения, которые действуют на различные протеазы HCV.

Таким образом, если имеются рекомендации данного изобретения, оказывается возможным проводить скрининговые исследования, чтобы идентифицировать протеазные ингибиторы, которые эффективны против резистентных к лекарству инфекций HCV. В данном изобретении показывают, что лекарственная резистентность индуцирована в тех штаммах HCV, которые имеют мутацию или по остатку 156, или 168 протеазы NS3/4A HCV. Точнее, показано, что мутация А156 на серин, валин или треонин и/или мутация D168 на валин, аланин, глицин или глутаминовую кислоту дает в результате HCV, являющийся резистентным к лекарственной терапии.

Предполагают, что композиции, которые действуют как ингибиторы мутантных протеаз NS3/4A HCV, которые содержат одну или более отчетливо описанные выше мутации, будут полезными в терапевтических воплощениях для лечения HCV. Соединения могут быть соединениями, которые конструируют, чтобы имитировать действие VX-950 или BILN 2061, или получают из VX-950 или BILN 2061. В скрининговых исследованиях для идентификации таких соединений кандидатное вещество сначала может быть проверено относительно основной биохимической активности in vitro, а затем тестировано относительно его способности снижать, ослаблять или иным образом терапевтически вмешиваются в инфекцию HCV на модели инфекции HCV in vivo. Мутантные протеазы изобретения обладают протеазной активностью. Любое из скрининговых исследований можно проводить, чтобы определить активность мутантной протеазы NS3/4A HCV, используя любое общепринятое исследование, применяемое, чтобы установить активность протеазы NS3/4A HCV дикого типа. В предпочтительных воплощениях активность ингибиторов относительно мутантной протеазы NS3/4A HCV сравнивают с активностью ингибиторов против протеазы NS3/4A HCV дикого типа.

Способность вещества-кандидата ингибировать протеазу определяют посредством получения образца, содержащего протеазу NS3/4A HCV; и контактирования образца с веществом-кандидатом. Активность протеазы HCV определяют в присутствии и в отсутствие вещества-кандидата. Протеаза может представлять собой выделенный белок, мембранную фракцию, содержащую выделенный белок, или она может быть в клетке, которая экспрессирует протеазу. Так, активность протеазы обычно определяют в образце, содержащем протеазу, в отсутствие вещества-кандидата. Затем добавляют вещество-кандидат в ту же самую или подобную композицию образца, содержащую протеазу, и определяют активность протеазы. Любое вещество-кандидат, которое снижает активность протеазы образца, указывает, что вещество-кандидат обладает требуемой ингибиторной активностью.

В скрининговых исследованиях in vivo соединение вводят модельному животному в течение периода времени и в различных дозировках и наблюдают за ослаблением симптомов, ассоциированных с инфекцией HCV. Любое улучшение в одном или более из упомянутых симптомов будет указывать, что вещество-кандидат является эффективным средством.

Используемый в описании термин «вещество-кандидат» относится к любой молекуле, которая потенциально может действовать как ингибитор протеаз HCV, несмотря на то, являются ли протеазы протеазами дикого типа или мутантной разновидностью. Такое средство может быть белком или его фрагментом, ингибитором с небольшой молекулой или даже молекулой нуклеиновой кислоты. Может оказаться так, что большинство используемых фармакологических соединений будут соединениями, которые являются структурно родственными другим известным ингибиторам протеаз HCV, например, такими как VX-950 или BILN 2061, или другим ингибиторам, обсуждаемым в описании. Рациональное конструирование лекарственного средства включает в себя не только сравнение с известными такими ингибиторами, но предсказания, касающиеся структуры молекул-мишеней таких ингибиторов.

С другой стороны, можно просто приобретать из различных коммерческих источников, библиотек небольших молекул соединения, которые, как полагают, удовлетворяют основным критериям для эффективных лекарственных средств, с целью «жестко ускорить» идентификацию подходящих соединений. Скрининг таких библиотек, включая комбинаторно образованные библиотеки (например, пептидные библиотеки), представляет собой быстрый и эффективный способ проверки большого количества родственных (и неродственных) соединений в отношении активности. Комбинаторные подходы также сами способствуют быстрой эволюции потенциальных лекарственных средств посредством создания соединений второго, третьего и четвертого поколения, образованных из активных, но по другим параметрам нежелательных соединений.

Соединения-кандидаты могут включать в себя фрагменты или части природных соединений или могут быть созданы как активные комбинации из известных соединений, которые в других случаях не активны. Полагают, что соединения, выделенные из природных источников, таких как животные, бактерии, грибы, растительных источников, включающих в себя листья и кору, и морских источников, можно исследовать в качестве кандидатов относительно присутствия потенциально эффективных фармацевтических средств. Следует понимать, что фармацевтические средства, которые следует тестировать, также можно получать или синтезировать из химических смесей или соединений, сделанных человеком.

«Эффективные количества» средства-кандидата при определенных обстоятельствах составляют количества эффективные, чтобы воспроизводимым образом вызывать изменение ингибирования экспрессии или активности протеазы NS3/4A HCV, ингибирования продукции или вирулентности HCV, подавление инфекции HCV или уменьшение интенсивности или смягчение одного или более симптомов инфекции HCV по сравнению с уровнями упомянутых параметров в отсутствие такого средства. Соединения, при применении которых достигают значительных соответствующих изменений в таких параметрах, следует использовать. Значительные изменения активности и/или экспрессии будут соответствовать изменениям, которые являются изменениями в активности, составляющими, по крайней мере, приблизительно 30%-40%, а более предпочтительно, изменениями, составляющими, по крайней мере, 50%, конечно, возможны более высокие величины.

Доминантный VX-950-резистентный мутант, A156S, остается чувствительным к BILN 2061. Чтобы подтвердить, являются ли наблюдаемые мутации или по Ala156 или Asp168 достаточными, чтобы появилась резистентность к VX-950 и BILN 2061, соответственно использовали сайт-направленный мутагенез для введения каждой индивидуальной мутации по положению 156 или 168 в домен протеазы NS3 дикого типа.

Сайт-специфический мутагенез является другим методом, употребляемым для получения мутантных протеазных белков, используемым в способах изобретения. В названном методе применяют специфический мутагенез основной ДНК (которая кодирует аминокислотную последовательность, которая таргетирована для модификации). Метод, кроме того, обеспечивает быструю возможность получать и тестировать варианты последовательностей, учитывая одно или более из вышеприведенных соображений при внесении одного или более изменений нуклеотидной последовательности в ДНК. Сайт-специфический мутагенез позволяет производить мутации посредством применения специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК требуемой мутации, а также достаточное количество соседних нуклеотидов, чтобы обеспечить последовательность праймера достаточного размера и разнообразие последовательностей, чтобы образовать стабильный дуплекс на обеих сторонах соединения делеции, которую производили. Обычно предпочтительным является праймер приблизительно из 17-25 нуклеотидов по длине приблизительно с 5-10 остатками на обеих сторонах соединения последовательности, которую изменяли.

В способе обычно используют бактериофагальный вектор, который существует как в одноцепочечной и двухцепочечной форме. Обычные векторы, применяемые в сайт-направленном мутагенезе, включают в себя векторы, такие как фаг М13. Упомянутые фаговые векторы поставляются коммерчески, и их применение обычно хорошо известно специалистам в данной области. Двухцепочечные плазмиды также обычно используют в сайт-направленном мутагенезе, что устраняет стадию переноса гена из фага в плазмиду.

Вообще, сайт-направленный мутагенез осуществляют сначала получением одноцепочечного вектора или плавлением двух цепей двухцепочечного вектора, который включает в свою последовательность последовательность ДНК, кодирующую требуемый белок. Синтезируют олигонуклеотидный праймер, несущий требуемую мутантную последовательность. Полученный праймер затем отжигают с препаратом одноцепочечной ДНК, учитывая степень ошибочного спаривания при выборе условий гибридизации (отжига), и подвергают действию ферментов, полимеризующих ДНК, таких как фрагмент Кленова полимеразы I E. coli, для того чтобы завершить синтез цепи, имеющей мутацию. Таким образом, образуют гетеродуплекс, в котором одна цепь кодирует оригинальную немутированную последовательность, а вторая цепь имеет требуемую мутацию. Полученный гетеродуплксный вектор затем используют, чтобы трансформировать подходящие клетки, такие как клетки E. coli, и отбирают клоны, которые включают в себя рекомбинантные векторы, несущие структуру мутантной последовательности.

Конечно, описанный выше подход с использованием сайт-направленного мутагенеза не является единственным способом получения потенциально подходящих видов мутантной протеазы и, по существу, им не ограничиваются. В данном изобретении также рассматривают другие способы осуществления мутагенеза, например, такие как обработка рекомбинантных векторов, несущих ген представляющих интерес мутагенных средств, таких как гидроксиламин, чтобы получить варианты последовательности.

Кинетические параметры субстрата FRET для доменов протеаз NS3 дикого типа из генотипа 1а и 1b были идентичными [Таблица 1А и 1В] при используемых условиях исследования. Хотя пептидный кофактор NS4A был из генотипа 1а HCV, не наблюдали никаких распознаваемых различий в кинетических параметрах. Это согласуется с молекулярным моделированием, что позволяет предположить, что консервативные различия в центральной области NS4A между генотипами 1а и 1b не влияют на взаимодействие между пептидом ядра NS4A и доменом протеазы NS3. Величины Ki для VX-950 и BILN 2061 определяли, используя протеазы дикого типа генотипов 1а и 1b, не обнаружили никаких статистически значимых различий между двумя протеазами дикого типа (Таблица 2).

Кинетические параметры субстрата FRET для мутантной протеазы A156S были фактически такими же, как параметры протеазы дикого типа [Таблица 1А и 1В]. Однако величина Ki для VX-950 составляла 2,9 мкМ в отношении мутантной протеазы A156S, что является в 29 раз выше, чем величина Ki против протеазы дикого типа (0,1 мкМ) (Таблица 2). Величина Ki для BILN 2061 составляла 112 нМ в отношении мутанта A156S, что оказалось в 6 раз выше, чем величина Ki против протеазы дикого типа, 19 нМ (Таблица 2).

Уровень РНК HCV в содержащих репликон клетках, имеющих замещение A156S, был подобен уровню РНК содержащих репликон клеток дикого типа (данные не представлены), что согласуется со схожей энзиматической каталитической эффективностью мутанта A156S и сериновой протеазы NS3 дикого типа. Величина IC₅₀ VX-950 в отношении содержащих репликон клеток A156S составляла 4,65 мкМ, что в 12 раз выше, чем IC₅₀ против содержащих репликон клеток дикого типа (0,40 мкМ) (Таблица 3). Различия в величинах IC₅₀ для BILN 2061 в отношении A156S (7 нМ) и содержащими репликон клетками дикого типа (4 нМ) были незначительными (Таблица 3).

Основные мутанты, резистентные к BILN 2061, D168V и D168A, оставались вполне чувствительными к VX-950.

На кинетические параметры субстрата не оказывала влияние мутация D168V, и выявлены только минорные изменения (менее чем 10-кратные) для мутанта D168A, что показало сравнение величин kcat (Ккат) и kcat/Km для протеаз дикого типа и двух мутантных сериновых протеаз NS3 (Таблица 1А и 1В). Аналогично, не отмечали никакого значительного влияния любого замещения по Asp168 на величину Ki VX-950 (Таблица 2). Однако замена валина или аланина аспарагиновой кислотой по положению 168 давала в результате мутантную протеазу NS3, которая не ингибировалась концентрациями BILN 2061 вплоть до 1,2 мкМ (Таблица 2). Полученные данные указывают, что любая мутантная протеаза является, по крайней мере, в 63 раза менее чувствительной к BILN 2061 по сравнению с протеазой дикого типа. Точную величину резистентности нельзя установить, так как BILN 2061 не растворяется при концентрациях выше 1,2 мкМ в буфере исследования, что определяли по оптической плотности при 650 нм. Мутацию D168V или D168A также вводили в репликон HCV дикого типа методом сайт-направленного мутагенеза и получали стабильную линию содержащих репликон клеток, несущих любое замещение. BILN 2061 имел IC₅₀ 5,09 мкМ в отношении содержащих репликон клеток D168V, что более чем в 1300 раз выше, чем в отношении содержащих репликон клеток дикого типа (4 нМ) (Таблица 3). IC₅₀ для BILN 2061 составляла 1,86 мкМ в отношении мутантного репликона D168A. Отмечено небольшое различие в величинах IC₅₀ для VX-950 в отношении D168V и содержащих репликон клеток дикого типа (Таблица 3).

Соответственно также обеспечиваются соединения, идентифицированные по способам данного изобретения, при этом соединение является ингибитором протеазы NS3/4A HCV. Такие соединения можно получать, например, методом рационального конструирования лекарственного вещества, которое обсуждали выше.

Изобретении также обеспечивает композиции, которые содержат описанные выше соединения, и их применение. Такие композиции можно использовать в предварительно обработанных вводимых приспособлениях, которые вводят пациенту для обработки биологических образцов, таких как кровь, перед введением пациенту, и для непосредственного введения пациенту. В каждом случае композицию следует использовать, чтобы ингибировать репликацию HCV и уменьшить риск или тяжесть инфекции HCV.

В другом воплощении данного изобретения предлагают композицию, содержащую соединение, идентифицированное в соответствии с данным изобретением, или его фармацевтически приемлемую соль. В соответствии с предпочтительным воплощением соединение, идентифицированное согласно данному изобретению, присутствует в количестве эффективном, чтобы снизить вирусный потенциал в образце или у пациента, у которого указанный вирус кодирует сериновую протеазу, необходимую для цикла жизни вируса, и фармацевтически приемлемый носитель.

Если фармацевтически приемлемые соли соединений данного изобретения используют в упомянутых композициях, такие соли предпочтительно получают из неорганических или органических кислот и оснований. Такие соли кислот включают в себя следующие: ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентан-пропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, 2 гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2 нафталинсульфонат, никотинат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3 фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоционат, тозилат и ундеканоат. Соли оснований включают в себя соли аммония, соли щелочных металлов, такие как соли натрия и калия, соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция и магния, соли органических оснований, такие как соли дициклогексиламина, N-метил D-глюкамина, и соли аминокислот, таких как аргинин, лизин и так далее.

Также основные азотсодержащие группы могут быть кватернизированы такими агентами, как галогениды низшего алкила, такие как хлориды, бромиды и иодиды метила, этила, пропила и бутила; диалкилсульфаты, такие как сульфаты диметила, диэтила, дибутила и диамила, галогениды с длинной цепью, такие как хлориды, бромиды и иодиды децила, лаурила, миристила и стеарила, аралкилгалогениды, такие как бромиды бензила и фенитила, и другие. Вследствие этого получают растворимые или диспергируемые в воде или масле продукты.

Соединения, используемые в композициях и способах данного изобретения, также можно модифицировать присоединением подходящих функциональных групп, чтобы повысить избирательные биологические свойства. Такие модификации известны в данной области и включают в себя модификации, которые увеличивают биологическое проникновение в данную биологическую систему (например, кровь, лимфатическую систему, центральную нервную систему), повышают пероральную биологическую доступность, улучшают растворимость, чтобы сделать возможным введение с помощью инъекции, изменяют метаболиз и изменяют скорость экскреции.

Фармацевтически приемлемые носители, которые можно использовать в описываемых композициях, не ограничиваясь, включают в себя ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, неполные глицеридные смеси насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, вторичный кислый фосфат натрия, кислый фосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный кремнезем, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, воски, блоксополимеры полиэтилен полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин.

Согласно предпочтительному воплощению, композиции данного изобретения получают для фармацевтического применения млекопитающему, предпочтительно человеку.

Такие фармацевтические композиции данного изобретения можно вводить перорально, парентерально, с помощью ингаляционного спрея, местно, ректально, назально, трансбуккально, вагинально или через имплантированный резервуар. Используемый термин «парентеральный» охватывает подкожную, внутривенную, внутримышечную, в сочленение, внутрисуставную, внутригрудинную, внутриоболочечную, в патологический очаг, внутрипеченочную и внутричерепную инъекцию или с помощью вливания. Предпочтительно, композиции вводят перорально или внутривенно.

Стерильные инъецируемые формы композиций данного изобретения могут быть водной или маслянистой суспензией. Указанные суспензии можно готовить по способам, известным в данной области, используя подходящие диспергирующие или смачивающие средства и суспендирующие средства. Стерильный инъецируемый препарат также может быть стерильным инъецируемым раствором или суспензией в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3 бутандиоле. К числу приемлемых наполнителей и растворителей, которые можно применять, относятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные, нелетучие масла обычно применяют в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели используют любое легкое, нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. При получении инъецируемых форм применяют жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, которые являются природными фармацевтически приемлемыми маслами, такими как оливковое масло или касторовое масло, особенно в их полиоксиэтиленированных вариантах. Такие масляные растворы или суспензии также могут содержать разбавитель, спирт с длинной цепью или диспергатор, такой как карбоксиметилцеллюлоза или подобные диспергирующие средства, которые обычно используют при приготовлении фармацевтически приемлемых лекарственных форм, включая эмульсии и суспензии. Другие применяемые обычно поверхностно-активные вещества, такие как твины, спаны и другие эмульгирующие средства или усилители биодоступности, которые вообще используют при производстве фармацевтически приемлемых твердых, жидких или других лекарственных форм, также можно применять для приготовления лекарственного средства.

Уровни доз приблизительно между 0,01 и 100 мг/кг массы тела в день, предпочтительно приблизительно между 0,5 и 75 мг/кг массы тела в день рассматриваемых протеазных ингибиторных соединений применяют в монотерапии для предупреждения и противовирусного лечения, особенно анти-HCV-опосредованного заболевания. Обычно фармацевтические композиции данного изобретения следует вводить приблизительно от 1 до 5 раз в день или, альтернативно, в виде непрерывной инфузии. Такое введение можно применять в виде длительного или экстренного лечения. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалами носителя, чтобы получить единую лекарственную форму, будет изменяться в зависимости от пациента, которого лечат, и конкретного способа введения. Обычный препарат содержит приблизительно от 5% до 95% активного соединения (мас./мас.). Предпочтительно, такие препараты содержат приблизительно от 20% до 80% активного соединения.

Если композиции данного изобретения включают в себя комбинацию соединения, идентифицированного согласно данному изобретению, и одно или более дополнительных терапевтических или профилактических средств, то как соединение, так и дополнительное средство должно присутствовать при уровнях доз приблизительно между 10 и 100% и более предпочтительно приблизительно от 10 до 80% дозировки, обычно вводимой по схеме монотерапии.

Фармацевтические композиции данного изобретения можно вводить перорально в любой подходящей для перорального применения лекарственной форме, включая капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы, не ограничиваясь перечисленными формами. В случае таблеток для перорального применения, носители, которые обычно используют, включают в себя лактозу и кукурузный крахмал. Обычно также добавляют смазки, такие как стеарат магния. Для перорального введения капсул, подходящие разбавители включают в себя лактозу и высушенный кукурузный крахмал. Когда для перорального применения требуются водные суспензии, активный ингредиент комбинируют с эмульгаторами и суспендирующими средствами. При необходимости также можно добавлять определенные подсластители, вкусовые или окрашивающие средства.

Альтернативно, фармацевтические композиции данного изобретения можно применять в виде суппозиториев для ректального введения. Суппозитирии можно готовить смешиванием средства с подходящим нераздражающим наполнителем, который представляет собой твердое вещество при комнатной температуре, но жидкое при ректальной температуре и поэтому расплавляется в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. Такие вещества включают в себя масло какао, воск и полиэтиленгликоли.

Фармацевтические композиции данного изобретения также можно вводить местно, особенно когда мишень лечения охватывает области и органы, легко доступные для местного применения, включая заболевания глаз, кожи или нижний отдел кишечника. Подходящие местные препараты легко готовят для каждой из упомянутых областей или органов.

Местное применение для нижнего отдела кишечника может быть эффективным при использовании ректального суппозиторного препарата (смотри выше) или подходящего препарата для клизмы. Трансдермальные пластыри также можно использовать местно.

Для местных применений фармацевтические композиции можно готовить в виде подходящей мази, содержащей активный компонент, суспендированный или растворенный в одном или более носителях. Носители для местного применения соединений данного изобретения, не ограничиваясь, включают в себя минеральное масло, вазелиновое масло, белый вазелин, полиэтиленгликоль, полиоксиэтилен, соединение полиоксипропилена, эмульгирующий воск и воду. Альтернативно, фармацевтические композиции можно готовить в виде подходящей примочки или крема, содержащего активные соединения, суспендированные или растворенные в одном или более фармацевтически приемлемых носителях. Приемлемые носители включают в себя минеральное масло, сорбитан моностеарат, полисорбат 60, сложные цетиловые эфиры, воск, цетеариловый спирт, 2 октилдодеканол, бензиловый спирт и воду, не ограничиваясь перечисленными носителями.

Для применения в офтальмологии фармацевтические композиции можно готовить в виде микронизированных суспензий в изотоническом стерильном физиологическом растворе с отрегулированным рН, или, предпочтительно, в виде растворов в изотоническом стерильном физиологическом растворе с отрегулированным рН, или с консервантом или без консерванта, такого как хлорид бензилалкония. Альтернативно, для применения в офтальмологии фармацевтические композиции можно готовить в виде мази, такой как вазелин.

Фармацевтические композиции данного изобретения также можно вводить с помощью назального аэрозоля или ингаляции. Такие композиции готовят по хорошо известным способам технологии приготовления лекарственного средства и могут быть приготовлены в виде растворов в физиологическом растворе с применением бензилового спирта или других приемлемых консервантов, усилителей всасывания, чтобы повысить биодоступность, фторуглеродов и/или других общепринятых солюбилизирующих или диспергирующих средств.

Наиболее предпочтительными являются фармацевтические композиции, приготовленные для перорального применения.

В другом воплощении композиции данного изобретения дополнительно содержат другое противовирусное средство, предпочтительно анти-HCV-средство. Такие противовирусные средства, не ограничиваясь, включают в себя иммуномодуляторы, такие как α-, β- и γ-интерфероны, пэгилированные соединения интерферона-α и тимозин; другие противовирусные средства, такие как рибавирин, амантадин и тельбивудин; другие ингибиторы протеаз вируса гепатита С (ингибиторы NS2-NS3 и ингибиторы NS3-NS4A); ингибиторы других мишеней в цикле жизни HCV, включая ингибиторы геликазы и полимеразы; ингибиторы функции рибосом; вирусные ингибиторы широкого спектра, такие как ингибиторы IMPDH (например, соединения из патента Соединенных Штатов 5807876, 6498178, 6344465, 6054472, WO 97/40028, WO 98/40381, WO 00/56331 и микофинольную кислоту и ее производные, включая VX-497, VX-148 и/или VX-944, не ограничиваясь перечисленным); или комбинации любых из упомянутых выше. Смотри также W. Markland et al., Antimicrobial & Antiviral Chemotherapy, 44, p. 859 (2000) и патент США 6541496.

Следующие определения использовали в описании (с торговыми названиями, относящимися к продуктам, поставляемым по мере регистрации заявки).

«Пэг-Интрон» означает PEG(ПЭГ)-Интрон®, пэгинтерферон альфа-2b, поставляемый фирмой Schering Corporation, Kenilworth, NJ; «Интрон» означает интрон-А®, интерферон альфа-2b, поставляемый фирмой Schering Corporation, Kenilworth, NJ; «рибавирин» означает рибавирин (1-бета-D-рибофуранозил-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоксамид, поставляемый фирмой ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA; описанные в указателе Merck Index, занесение 8365, двенадцатое издание, также поставляемый как ребетол® фирмой Schering Corporation, Kenilworth, NJ, или как копегус® фирмы Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ; «Пагасис» означает пагасис®, пэгинтерферон альфа 2а, поставляемый фирмой Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ; «Роферон» означает роферон®, рекомбинантный интерферон альфа 2а, поставляемый фирмой Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ; «берефор» означает берефор®, интерферон альфа 2, поставляемый фирмой Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, CT; сумиферон®, очищенная смесь природных альфа-интерферонов, такой как сумиферон, поставляемый фирмой Sumitomo, Japan; Веллферон®, интерферон альфа n1, поставляемый фирмой Glaxo-Wellcome LTd., Greit Britain; Альферон®, смесь природных альфа-интерферонов, полученный Interferon Sciences и поставляемый фирмой Purdue Frederick Co., CT.

Используемый в описании термин «интерферон» относится к представителю семейства высокогомологичных видов специфических белков, которые ингибируют репликацию вирусов и клеточную пролиферацию и модулируют иммунный ответ, таких как интерферон альфа, интерферон бета и интерферон гамма. Указатель Merck Index, занесение 5015, двенадцатое издание. Согласно одному воплощению данного изобретения интерферон представляет собой α-интерферон. В соответствии с другим воплощением в терапевтической комбинации данного изобретения применяют природный альфа-интерферон 2а. Альтернативно, в терапевтической комбинации данного изобретения применяют природный альфа-интерферон 2b. В другом воплощении, в терапевтической комбинации данного изобретения используют рекомбинантный альфа-интерферон 2а или 2b. В еще одном воплощении, интерферон представляет собой пэгилированный альфа-интерферон 2а или 2b. Интерфероны, подходящие для данного изобретения, включают в себя:

(а) Интрон (интерферон-альфа 2В, Schering Plough),

(b) Пэг-интрон,

(с) Пегасис.

(d) Роферон,

(е) Берофор,

(f) Сумиферон,

(g) Веллферон,

(h) общий альфа-интерферон, поставляемый фирмой Amgen, Inc., Newbury Park, CA,

(i) Альферон;

(j) Вираферон®;

(k) Инферген®.

Как считают практикующие врачи, протеазный ингибитор предпочтительно следует вводить перорально. Интерферон обычно не вводят перорально. Однако ничто в описании не ограничивает способы или комбинации данного изобретения для любых специальных лекарственных форм или схемы приема лекарственного средства. Так, каждый компонент комбинации согласно изобретению можно вводить отдельно, вместе или в любой их комбинации.

В одном воплощении протеазный ингибитор и интерферон вводят в отдельных лекарственных формах. В еще одном воплощении, любое дополнительное средство вводят как часть единой лекарственной формы с протеазным ингибитором или как отдельное лекарственное средство. Так как изобретение включает в себя комбинацию соединений, конкретные количества каждого соединения могут зависеть от определенных количеств каждого другого соединения в комбинации. Как признано практикующими специалистами, дозировки интерферона обычно измеряют в IU (МЕ) (например, приблизительно от 4 миллионов МЕ до 12 миллионов МЕ).

Таким образом, средства (или действующие как иммуномодуляторы или иным образом), которые можно использовать в комбинации с соединением данного изобретения, не ограничиваясь, включают в себя интерферон-альфа 2В (интрон А, Schering Plough); ребатрон (Schering Plough, интерферон-альфа 2В + рибавирин); пэгилированный интерферон альфа (Reddy, K.R. et al. “Efficacy and Safety of Pegylated (40-kd) interferon alpha-2a compared with interferon alpha-2f in noncirrhotic patients with chronic hepatitis C” (Hepatology, 33, pp. 433-438 (2001)); общий интерферон (Kao, J.H., et al., “Efficacy of Consensus Interferon in the Treatment of Chronic Hepatitis” J. Gastroenterol. Hepatol. 15, pp. 1418-1423 (2000)); интерферон-альфа 2А (роферон А; Roche), лимфобластоидный или «природный» интерферон; интерферон-тау (Clayette, P. et al., “IFN-tau, A New Interferon Type I with Antiretroviral activity” Pathol. Biol. (Paris) 47, pp. 553-559 (1999)); интерлейкин 2 (Davis, G.L. et al., “Future Options for the Management of Hepatitis C”. Seminars in Liver Disease, 19, pp. 103-112 (1999)); интерлейкин 6 (Davis et al. “Future Options for the Management of Hepatitis C”. Seminars in Liver Disease, 19, pp.103-112 (1999)); интерлейкин 12 (Davis G.L. et al. “Future Options for the Management of Hepatitis C”. Seminars in Liver Disease, 19, pp.103-112 (1999)); рибаварин и соединения, которые повышают развитие ответа Т-клеток-хелперов типа 1 (Davis et al. “Future Options for the Management of Hepatitis C”. Seminars in Liver Disease, 19, pp.103-112 (1999)); Интерфероны могут уменьшать интенсивность вирусных инфекционных заболеваний, оказывая прямое противовирусное действие и/или модифицируя иммунный ответ на инфекцию. Противовирусное действие интерферонов часто опосредуется через ингибирование приникновения вирусов или декапсидации вириона, синтеза вирусной РНК, транслокации вирусных белков и/или скопления и высвобождения вирусов.

Соединения, которые стимулируют синтез интерферона в клетках (Tazulakhova, E.B. et al., “Russian Experience in Screening, analysis, and Clinical Application of Novel Interferon Inducers” J. Interferon Cytokine Res., 21 pp. 65-73), не ограничиваясь, включают в себя двухцепочечную РНК, одну или в комбинации с тобрамицином, и имиквимод (3M Фармацевтические средства; Sauder, D.N. “Immunomodulatory and Pharmacologic Properties of Imiquimod” J. Am. Acad. Dermatol., 43 pp. S6-11 (2000)).

Другие неиммуномодулирующие и иммуномодулирующие соединения можно использовать в комбинации с соединением данного изобретения, не ограничиваясь, включающим в себя соединения, установленные в WO 02/18369, который включен в описание посредством ссылки (смотри, например, страницу 273, строки 9-22 и от страницы 274, строка 4, до страницы 276, строка 11, который включен в описание цитированием).

Соединения, которые стимулируют синтез интерферона в клетках (Tazulakhova, et al., J. Interferon Cytokine Res., 21 pp. 65-73), не ограничиваясь, включают в себя двухцепочечную РНК одну или в комбинации с тобрамицином и имиквимод (3M Фармацевтические средства) (Sauder, J. Am. Acad. Dermatol., 43 pp. S6-11 (2000)).

Известны другие соединения, которые проявляют или которые могут проявлять HCV-противовирусную активность посредством неиммуномодулирующих механизмов, не ограничиваясь, включают в себя рибаварин (ICN Pharmaceuticals), ингибиторы инозин 5'-монофосфатдегидрогеназы (формула VX-497 представлена в описании), амантадин и римантадин (Younossi et al., In Seminars in Liver Disease 19, 95-102 (1999)); LY217896 (патент США 4835168) (Colacino, et al., Antimicrobial Agents & Chemotherapy 34, 2156-2163 (1990)); и сложный метиловый эфир 9-гидроксиимино-6-метокси-1,4а-диметил1,2,3,4,4а,9,10,10а-октагидро-фенантрен-1-

карбоновой кислоты; сложный метиловый эфир 6-метокси-1,4а-диметил-9-(4-метил-пиперазин-1-илимино)-1,2,3,4,4а,9,10,10а-октагидро-фенантрен-1-карбоновой кислоты гидрохлорид; 1-(2-хлор-фенил)-3-(2,2-бифенил-этил)-мочевину (патент США 6127422).

Препараты, дозы и способы введения для вышеприведенных молекул или описывают в ссылках, цитируемых ниже, или хорошо известны в данной области, например, в F.G. Hayden, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., Eds., McGraw-Hill, New York (1996), Chapter 50, pp. 1191-1223, и ссылках, цитируемых в описании. Альтернативно, как только идентифицируют соединение, которое проявляет HCV-противовирусную активность, особенно противовирусную активность против резистентного к лекарству штамма HCV, фармацевтически эффективное количество такого соединения можно установить, используя способы, которые хорошо известны специалистам. Упоминают, например, Benet et al., in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., Eds., McGraw-Hill, New York (1996), Chapter 1, pp. 3-27, и ссылки, цитируемые в описании. Таким образом, подходящие препараты, диапазон дозы(з) и схемы приема такого соединения можно легко установить обычными способами.

Лекарственные комбинации данного изобретения можно поставлять в клетку или клетки или пациенту-человеку, или в отдельных фармацевтически подходящих препаратах, вводимых одновременно или последовательно, в препаратах, содержащих более одного терапевтического средства, или подбором препаратов с единственным средством или с многочисленными средствами. Независимо от способа введения упомянутые лекарственные комбинации составляют анти-HCV эффективное количество компонентов фармацевтически приемлемых препаратов.

Большое количество других иммуномодуляторов и иммуностимуляторов, которые можно использовать в способах данного изобретения, в настоящее время доступны и включают в себя: AA-2G; адамантиламид дипептид; аденозиндезаминазу, адъювант Энзона, Alliance; адъюванты Ribi; адъюванты Vaxcel; адъювакс; агеласфин-11; терапию AIDS (CПИДа), Chiron; алгалглюкан, SRI; альганунулин, Anutech; ангинлус; антиклеточные факторы, Yeda; антикорт; антигастрин-17 иммуноген, Ap; систему доставки антигена, Vac; препарат антигена, IDBC; антиGnRH-иммуноген, Aphton; антигерпин; арбидол; азарол; Bay-q-8939; Bay-r-1005; BCH-1393; бетафектин; биостим; BL-001; BL-009; бронкостат; кантастим; CDRI-84-246; цефодизим; ингибиторы хемокинов, ICOS; CMV-пептиды, City of Hope; CN-5888; цитокин-высвобождающее средство, St; DHEAS, Paradigm; DISC TA-HSV; J07B; I01A; I01Z; дитиокарб натрий; ECA-10-142; ELS-1; эндотоксин, Novartis; FCE-20696; FCE-24089; FCE-24578; FLT-3-лиганд, Immunex; FR-900483; FR-900494; FR-901235; FTS-Zn; G-белки, Cadus; глудапцин; глутаурин; гликофосфопептикал; GM-2; GM-53; GMDP; вакцина фактора роста, EntreM; H-BIG, NABI; H-CIG, NABI; HAB-439; вакцина Helicobacter pylori; герпес-специфический иммунный фактор; терапию HIV (ВИЧ), United Biomed; гиперGAM+CF; ImmuMax; Immun BCG; иммунную терапию, Connective; иммуномодулятор, Evans; иммуномодуляторы, Novacell; imreg-1; imreg-2; индомун; инозин пранобекс; интерферон, Dong-А (альфа2); интерферон, генентех (гамма); интерферон, новартис (альфа); интерлейкин-12, Genetics Ins; интерлейкин-15, Immunex; интерлейкин-16, Research Cor; ISCAR-1; J005X; L-644257; ликомарасминовую кислоту; LipoTher; LK-409, LK-410; LP-2307; LT (R1926); LW-50020; MAF; Shionogi; производные MDP, Merck; met-энкефалин, TNI; метилфурилбутиролактоны; MIMP; миримостим; смешанную бактериальную вакцину, Tem, MM-1; монилиастат; MPLA, Ribi; MS-705; мурабутид; марабутид, Vacsyn; мурамилдипептидное производное; мурамилпептидные производные, миелопид; -563; NACOS-6; NH-765; NISV, Proteus; NPT-16416; NT-002; PA-485; PEFA-814; пептиды, Scios; пептидогликан, Pliva; пертон, Advanced Plant; производное PGM, Pliva; фармапроекты № 1099; № 1426; № 1549; № 1585; № 1607; № 1710; № 1779; № 2002; № 2060; № 2795; № 3088, № 3111, № 3345, № 3467, № 3668, № 3998, № 3999, № 4089, № 4188, № 4451, № 4500, № 4689, № 4833, № 494, № 5217, № 530; пидотимод; пимелаутид; пинафид; PMD-589; подофиллотоксин, Conpharm; POL-509; поли-ICLC, поли-ICLC, Yamasa Shoyu; полиА-полиU; полисахарид А; белок А, Berlux Bioscience; PS34WO; Pseudomonas Mabs, Teijin; псомаглобин; PTL-78419; Pyrexol; пириферон; ретроген; ретропеп; RG-003; риностат; рифамаксил; RM-06; роллин; ромуртид; RU-40555; RU-41821; антитела к вирусу краснухи, ResCo; S-27649; SB-73; SDZ-280-636; SDZ-MRL953; SK&F-107647; SL04; SL05; SM-4333; солутеин; SRI-62-834; SRL-172; ST-570; ST-789; лизат стафага; Stimulon; суппрессин; T-150R1; T-LCEF; табилаутид; темуртид; терадигм-HBV; терадигм-HBV; терадигм-HSV; ТГФ, Pharm & Upjohn; ТГФ, Yeda; тималфазин; фракции гормонов вилочковой железы; тимокартин; тимолимфотропин; тимопентин; аналоги тимопентина; тимопентин, Peptech; фракция 5 тимозина, Alpha; тимостимулин; тимотринан; TMD-232: TO-115; фактор переноса, Viragen; туфтсин, Selavo; юбенимекс; Ulsastat; ANGG-; CD-4+, коллаг+; COLSF+; COM+; DA-A+; GAST-; GF-TH+; GP-120-; IF+; IF-A+; IF-A-2+; IF-B+; IF-G+; IF-G-1B+; IL-2+; IL-12+; IL-15+; IM+; LHRH-; LIPCOR+L LYM-B+; LYM-NK+; LYM-T+; OPI+; PEP+; PHG-MA+; RHA-SYN-; SY-CW-; TH-A-I+; TH-5+; THF+; UN.

Репрезентативные нуклеозидные и нуклеотидные соединения, используемые в данном изобретении, не ограничиваясь, включают в себя: (+)-цис-5-фтор-1-[2-(гидрокси-метил)]-[1,3-оксатиолан-5-ил]цитозин; (-)-2'-дезокси-3'-тиоцитидин-5'-трифосфат (3ТС); (-)-цис-5-фтор-1-[2(гидрокси-метил)-[I,3-оксатиолан-5-ил]цитозин (FTC); (-)2',3',дидезокси-3'-тиацитидин[(-)-SddC]; 1-(2'-дезокси-2'-фтор-бета-D-арабинофуранозил)-5-иодцитозин (FIAC); 1-(2'-дезокси-2'-фтор-бета-D-арабинофуранозил)-5-иодцитозин трифосфат (FIACTP); 1-(2'-дезокси-2'-фтор-бета-D-арабинофуранозил)-5-метилурацил (FMAU); 1-бета-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид; 2',3'-дидезокси-3'-фтор-5-метил-дексоцитидин (FddMeCyt); 2',3'-дидезокси-3'-хлор-5-метил-дексоцитидин (ClddMeCyt); 2',3'-дидезокси-3'-амино-5-метил-дексоцитидин (AddMeCyt); 2',3'-дидезокси-3'-фтор-5-метил-цитидин (FddMeCyt); 2',3'-дидезокси-3'-хлор-5-метил-цитидин (ClddMeCyt); 2',3'-дидезокси-3'-амино-5-метил-цитидин (AddMeCyt); 2',3'-дидезокси-3'-фтортимидин (FddThd); 2',3'-дидезокси-бета-L-5-фторцитидин (бета-L-FddC); 2',3'-дезокси-бета-L-5-тиацитидин; 2',3'-дидезокси-бета-L-5-цитидин (бета-L-ddC); 9-(1,3-дигидрокси-2-пропоксиметил)гуанин; 2'-дезокси-3'-тиа-5-фторцитозин; 3'-амино-5-метил-дексоцитидин (AddMeCyt); 2-амино-1,9-[(2-гидроксиметил-1-(гидроксиметил)этокси]метил]-6Н-пурин-6-он (ганцикловир); 2-[2-(2-амино-9Н-пурин-9ил)этил)-1,3-пропандил диацетат (фамцикловир); 2-амино-1,9-дигидро-9-[(2-гидрокси-этокси)метил]6H-пурин-6-он (ацикловир); 9-(4-гидрокси-3-гидроксиметил-бут-1-ил)гуанин (пенцикловир); 9-(4-гидрокси-3-гидроксиметил-бут-1-ил)-6-дезокси-гуанин диацетат (фамцикловир); 3'-азидо-3'-дезокситимидин (AZT); 3'-хлор-5-метил-дексоцитидин (ClddMeCyt); 9-(2-фосфонил-метоксиэтил)-2',6'-диаминопурин-2',3'-дидезоксирибозид; 9-(2-фосфонилметоксиэтил)аденин (PMEA); ацикловир трифосфат (ACVTP); D-карбоциклический-2'-дезоксигуанозин (CdG); дидезокси-цитидин; дидезокси-цитозин (ddC); дидезокси-гуанин (ddG); дидезокси-инозин (ddl); E-5-(2-бромвинил)-2'-дезоксиуридин трифосфат; фтор-арабинофуранозил-иодурацил; 1-(2'-дезокси-2'-фтор-1-бета-D-арабинофуранозил)-5-иод-урацил (FIAU); ставудин; 9-бета-D-арабинофуранозил-9Н-пурин-6-амин моногидрат (Ara-A); 9-бета-D-арабинофуранозил-9Н-пурин-6-амин-5'-монофосфат моногидрат (Ara-AMP); 2-дезокси-3'-тиа-5-фторцитидин; 2',3'-дидезокси-гуанин и 2',3'-дидезокси-гуанозин.

Способы синтеза для получения нуклеозидов и нуклеотидов, используемые в данном изобретении, хорошо известны в данной области и описаны в Acta Biochim Pol., 43, 25-36 (1996); Swed. Nucleosides Nucleotides 15, 361-378 (1996); Synthesis 12, 1465-1479 (1995); Carbohyd. Chem. 27, 242-276 (1995); Chena Nucleosides Nucleotides 3, 421-535 (1994); Ann. Reports in Med. Chena, Academic Press; and Exp. Opin. Invest. Drugs 4, 95-115 (1995).

Химические реакции, описываемые в цитируемых выше ссылках, обычно рассматривают с точки зрения их широчайшего применения для получения соединений данного изобретения. Иногда описанные реакции не подходят для каждого соединения из числа соединений, рассматриваемых в описании. Соединения, для которых не подходят описанные реакции, легко устанавливаются специалистами в данной области. Во всех таких случаях или реакции можно успешно проводить с помощью обычных модификаций, известных специалистам в данной области, например, соответствующей защитой мешающих групп, заменой на альтернативные обычные реагенты, обычной модификацией условий реакции и тому подобным, или другие реакции, рассматриваемые в описании, или в других отношениях подходящие следует применять при получении соответствующих соединений данного изобретения. Для всех препаративных способов все исходные материалы известны или их легко получают из сырья.

Тогда как аналоги нуклеозидов обычно применяют как противовирусные средства как они есть, нуклеотиды (нуклеозидфосфаты) иногда следует превращать в нуклеозиды для того, чтобы способствовать их транспорту через клеточные мембраны. Примером химически модифицированного нуклеотида, способного проникать в клетки, является S-1-3-гидрокси-2-фосфонилметоксипропил цитозин (HPMPC, Gilead Science). Нуклеозидные и нуклеотидные соединения, используемые в данном изобретении, которые являются кислотами, могут образовывать соли. Примеры включают в себя соли щелочных металлов или щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, кальций или магний, или соли органических оснований или основные соли четвертичного аммония.

Специалист также может предпочесть вводить ингибитор цитохром Р450 монооксигеназы. Такие ингибиторы можно применять для увеличения концентраций в печени и/или повышения уровней в крови соединений, которые подавляются цитохромом Р450.

Если воплощение данного изобретения охватывает ингибитор CYP, любой ингибитор CYP, который улучшает фармакокинетику соответствующей протеазы NS3/4A, можно использовать в способе данного изобретения. Упомянутые ингибиторы CYP, не ограничиваясь, включают в себя ритонавир (WO 94/14436), кетоконазол, тролеандомицин, 4-метилпиразол, циклоспорин, клометиазол, циметидин, итраконазол, флуконазол, миконазол, флувоксамин, флуоксетин, нефазодон, сертралин, индинавир, нельфинавир, ампренавир, фозампренавир, саквинавир, лопинавир, делавирдин, эритромицин, VX-944 и VX-497. Предпочтительные ингибиторы CYP включают в себя ритонавир, кетоконазол, тролеандомицин, 4-метилпиразол, циклоспорин и клометиазол. Относительно предпочтительных лекарственных форм ритонавира смотри патент Соединенных Штатов 6037157 и документы, цитируемые в описании: патент Соединенных Штатов 5484801, патентная заявка Соединенных Штатов 08/402690 и международные заявки WO 95/07696 и WO 95/09614.

Способы оценки способности соединения ингибировать активность цитохром Р450 монооксигеназы известны (смотри US 6037157 и Yun, et al. Drug Metabolism & Disposition, vol. 21, pp. 403-407 (1993)).

Иммуномодуляторы, иммуностимуляторы и другие средства, используемые в способах комбинированной терапии данного изобретения, можно вводить в количествах более низких, чем количества, принятые в данной области. Например, интерферон альфа обычно вводят человеку для лечения инфекционных заболеваний HCV в количестве приблизительно от 1×10⁶ единиц/субъекта три раза в неделю до 10×10⁶ единиц/субъекта три раза в неделю (Simon et al., Hepatology 25: 445-448 (1997)). В способах и композициях данного изобретения, указанная доза может находиться в диапазоне приблизительно от 0,1×10⁶ единиц/субъекта три раза в неделю до 7,5×10⁶ единиц/субъекта три раза в неделю; более предпочтительно приблизительно от 0,5×10⁶ единиц/субъекта три раза в неделю до 5×10⁶ единиц/субъекта три раза в неделю; наиболее предпочтительно приблизительно от 1×10⁶ единиц/субъекта три раза в неделю до 3×10⁶ единиц/субъекта три раза в неделю. Благодаря повышенной противовирусной против вируса гепатита С эффективности иммуномодуляторов, иммуностимуляторов или другого анти-HCV средства в присутствии ингибиторов сериновой протеазы HCV данного изобретения можно применять сниженные количества упомянутых иммуномодуляторов/иммуностимуляторов в способах лечения и композициях, рассматриваемых в описании. Аналогично, благодаря повышенной противовирусной против вируса гепатита С эффективности данных ингибиторов сериновой протеазы HCV в присутствии иммуномодуляторов и иммуностимуляторов можно применять сниженные количества названных ингибиторов сериновой протеазы HCV в способах и композициях, рассматриваемых в описании. Такие сниженные количества можно установить обычным контролем титров вируса гепатита С у инфицированных пациентов, которых лечат. Это можно осуществлять, например, контролируя РНК HCV в сыворотке пациентов методами слот-блоттинга, дот-блоттинга или ПЦР-ОТ или определением поверхностных и других антигенов HCV. Пациентов подобным образом можно контролировать во время лечения комбинированной терапии с применением ингибиторов сериновой протеазы HCV, описываемых в описании, и других соединений, проявляющих анти-HCV активность, например, нуклеозидные и/или нуклеотидные противовирусные средства, чтобы определить наиболее низкие эффективные дозы каждого соединения, используемого в комбинации.

В способах комбинированной терапии, обсуждаемой в описании, нуклеозидные или нуклеотидные противовирусные соединения или их смеси можно вводить человеку в количестве в диапазоне приблизительно от 0,1 мг/субъект/день до 500 мг/субъект/день; предпочтительно приблизительно от 10 мг/субъект/день до 300 мг/субъект/день; более предпочтительно приблизительно от 25 мг/субъект/день до 200 мг/субъект/день; еще более предпочтительно приблизительно от 50 мг/субъект/день до 150 мг/субъект/день и наиболее предпочтительно в диапазоне приблизительно от 1 мг/субъект/день до 50 мг/субъект/день.

Дозы соединений можно вводить пациенту в однократной дозе или в разделенных на части дозах. В последнем случае лекарственные стандартные композиции могут содержать такие количества их субмногократных доз, которые составят ежедневную дозу. Многократные дозы на день также могут увеличить общую ежедневную дозу, когда это требует субъект, которому назначают лекарственное средство.

Схему лечения пациента, страдающего инфекционным заболеванием, индуцированным HCV, соединениями и/или композициями данного изобретения, выбирают в соответствии с целым рядом факторов, включая возраст, вес, пол, диету и общее состояние пациента, тяжесть инфекции, способ введения, фармакологические характеристики, такие как активность, эффективность, фармакокинетический и токсикологический профили отдельных применяемых соединений, и от того, используют ли систему доставки лекарственного средства. Введение лекарственных комбинаций, описываемых здесь, обычно следует продолжать в течение периода от нескольких недель до нескольких месяцев или лет до тех пор, пока титры вируса не достигнут соответствующих уровней, указывая, что инфекция контролируется или ликвидирована. За пациентами, которых лечат лекарственными комбинациями, описываемыми здесь, обычно осуществляют непрерывный контроль, определяя РНК вируса гепатита в сыворотке пациентов методами слот-блоттинга, дот-блоттинга или ПЦР-ОТ или определяя антигены вируса гепатита С, такие как поверхностные антигены, в сыворотке, чтобы установить эффективность терапии. Постоянный анализ данных, полученных упомянутыми методами, позволяет изменять схему во время терапии с тем, чтобы вводить оптимальные количества каждого компонента в комбинации, и с тем, чтобы также установить продолжительность лечения. Таким образом, лечебную схему/схему применения лекарственного средства можно рационально изменять во время терапии с тем, чтобы вводить наименьшие количества каждого из противовирусных соединений, используемых в комбинации, которые вместе проявляют удовлетворительную эффективность против вируса гепатита С, и с тем, чтобы применение таких противовирусных соединений в комбинации продолжали, только пока это необходимо, чтобы успешно лечить инфекционное заболевание.

Данное изобретение охватывает применение ингибиторов сериновой протеазы HCV, обсуждаемых в описании, в различных комбинациях с вышеприведенными и подобными типами соединений, проявляющих анти-HCV активность, чтобы лечить или предупреждать инфекционные заболевания, вызванные HCV, у пациентов, особенно у тех пациентов, которые имеют инфекционные заболевания HCV, у которых появилась резистентность к лечению VX-950 и другими стандартными протеазными ингибиторами. Например, один или более ингибиторов сериновой протеазы HCV можно использовать в комбинации с: одним или более интерферонами или производными интерферона, проявляющими анти-HCV активность; одним или более соединениями не интерферона, проявляющими анти-HCV активность; или одним или более интерферонами или производными интерферона, проявляющими анти-HCV активность, и одним или более соединениями не интерферона, проявляющими анти-HCV активность. Когда используют в комбинации для лечения или предупреждения HCV-инфекции у человека, любой из описываемых здесь ингибиторов сериновой протеазы HCV и любое из вышеприведенных соединений, проявляющих анти-HCV активность, может присутствовать в фармацевтически или анти-HCV эффективном количестве. Благодаря их аддитивному и синергическому действиям, когда используют в описанных выше комбинациях, каждый также может присутствовать в субклиническом фармацевтически эффективном или анти-HCV эффективном количестве, то есть в количестве, которое, если применяют отдельно, обеспечивает сниженную фармацевтическую эффективность в полном ингибировании или снижении аккумуляции вирионов HCV и/или в ослаблении или уменьшении интенсивности состояний или симптомов, ассоциированных с HCV-инфекцией или патогенезом у пациентов по сравнению с такими ингибиторами сериновой протеазы HCV и соединениями, проявляющими анти-HCV активность, когда используют в фармацевтически эффективных количествах. Кроме того, данное изобретение включает в себя применение комбинаций ингибиторов сериновой протеазы HCV и соединений, проявляющих анти-HCV активность, которые рассматривают выше, чтобы лечить или предупреждать инфекционные заболевания HCV, в которых один или более названных ингибиторов или соединений присутствует в фармацевтически эффективном количестве, а другой(ие) присутствует(ют) в субклиническом фармацевтически эффективном или анти-HCV эффективном количестве(ах) благодаря их аддитивному или синергическому действию. Используемый в описании термин «аддитивное действие» описывает объединенное действие двух (или более) фармацевтически активных средств, которое равно сумме действий каждого средства, произведенных отдельно. Синергическое действие представляет собой действие, в котором объединенное действие двух (или более) фармацевтически активных средств оказывается больше, чем сумма эффектов каждого средства, произведенных отдельно.

При достижении улучшения состояния пациента можно вводить поддерживающую дозу соединения, композиции или комбинации данного изобретения, если необходимо. Впоследствии дозировку или частоту введения, или оба, можно снижать как функцию симптомов до уровня, при котором улучшенное состояние поддерживается, если симптомы купированы до желаемого уровня, лечение следует прекратить. Однако пациентам может потребоваться интермиттирующее лечение на долговременной основе при любом рецидиве симптомов заболевания.

Следует также понимать, что специальная дозировка и схема лечения для отдельного пациента будет зависеть от целого ряда факторов, включающих в себя активность определенного используемого соединения, возраста, веса тела, общего состояния, пола, диеты, времени введения, скорости экскреции, лекарственной комбинации и оценки лечащего врача и тяжести данного заболевания, которое лечат. Количество активных ингредиентов также зависит от отдельного описанного соединения и присутствия или отсутствия и природы дополнительного противовирусного средства в композиции.

Согласно другому воплощению, в изобретении предусматривают способ лечения пациента, инфицированного вирусом, характеризуемого по кодируемой вирусом сериновой протеазе, которая необходима для жизненного цикла вируса, посредством введения указанному пациенту фармацевтически приемлемой композиции данного изобретения. Предпочтительно, способы данного изобретения применяют, чтобы лечить пациента, страдающего HCV-инфекционным заболеванием. Такое лечение может полностью ликвидировать вирусную инфекцию или снизить ее тяжесть. Более предпочтительно, пациентом является человек.

В альтернативном воплощении способы данного изобретения дополнительно включают в себя стадию введения указанному пациенту противовирусного средства, предпочтительно, анти-HCV средства. Такие противовирусные средства, не ограничиваясь, включают в себя иммуномодуляторы, такие как α-, β- и γ-интерфероны, пэгилированные производные соединения α-интерферона и тимозин; другие противовирусные средства, такие как рибавирин и амантадин; другие ингибиторы протеаз вируса гепатита С (ингибиторы NS2-NS3 и ингибиторы NS3-NS4A); ингибиторы других мишеней в цикле жизни HCV, включая ингибиторы геликазы и полимеразы; ингибиторы функции рибосом; вирусные ингибиторы широкого действия, такие как ингибиторы IMPDH (например, VX-497 и другие ингибиторы IMPDH, описанные в патенте Соединенных Штатов 5807876, микофенольная кислота и ее производные) или комбинации любых из вышеупомянутых ингибиторов.

Упомянутое дополнительное средство можно вводить указанному пациенту как часть одноразовой лекарственной формы, содержащей как соединение изобретения, так и дополнительное противовирусное средство. Альтернативно, дополнительное средство можно вводить отдельно от соединения данного изобретения, как часть составной лекарственной формы, при этом названное дополнительное средство вводят до, вместе с композицией или после композиции, содержащей соединение данного изобретения.

В еще одном воплощении данное изобретение обеспечивает способ предварительной обработки биологического вещества, предназначенного для введения пациенту, включающий в себя стадию контактирования указанного биологического вещества с фармацевтически приемлемой композицией, содержащей соединение данного изобретения. Такие биологические вещества, не ограничиваясь, включают в себя кровь и ее компоненты, такие как плазма, тромбоциты, субпопуляции клеток крови и тому подобное; органы, такие как почка, печень, сердце, легкое и так далее; сперму и яйцеклетки; костный мозг и его компоненты и другие жидкости, которые должны вливать пациенту, такие как физиологический раствор, декстрозу и так далее.

Согласно другому воплощению изобретение обеспечивает способы обработки материалов, которые потенциально могут находиться в контакте с вирусом, характеризуемым по кодируемой вирусом сериновой протеазе, необходимой для его жизненного цикла. Этот способ включает стадию контактирования упомянутого материала с соединением согласно изобретению. Такие материалы, не ограничиваясь, включают в себя хирургические инструменты и одежду; лабораторные инструменты и одежду; аппаратуру и материалы для забора крови и вводимые в организм приспособления, такие как шунты и стенты, и так далее.

В другом воплощении соединения данного изобретения можно использовать как лабораторные средства, чтобы способствовать выделению кодируемой вирусом сериновой протеазы. Данный способ включает в себя стадии обеспечения присоединения соединения данного изобретения к твердой основе; контактирования указанной твердой основы с образцом, содержащим вирусную сериновую протеазу, при условиях, которые заставляют упомянутую протеазу связываться с указанной твердой основой, и элюции упомянутой сериновой протеазы с указанной твердой основой. Предпочтительно, вирусная сериновая протеаза, выделенная по описанному способу, является протеазой NS3/NS4A HCV. Точнее, она является мутантной протеазой NS3/NS4A HCV, которая резистентна к лечению VX-905 и/или BILN 2061, которые описывают в описании. Примеры таких протеаз включают в себя протеазы, рассматриваемые в описании, которые имеют мутантные остатки по положениям 156 и/или 168 белка SEQ ID NO:2.

Используемый в описании, если не указано особо, термин «содержит» и его вариации означает включение установленного элемента, а не исключение из любого другого элемента.

Обычные способы, которые известны специалистам практикам, можно использовать при практическом применении данного изобретения. Такие способы можно обнаружить в опубликованных документах. Например, стандартные способы рекомбинантных ДНК и молекулярного клонирования хорошо известны в данной области. Смотри, например, F.M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Media, PA; Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, Т., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989, и литературу, цитируемую в патенте США 6617156 и 6617130, все из которых включены в описание цитированием.

Примеры

Для более полного понимания данного изобретения представляют следующие препаративные примеры и примеры тестирования. Следующие примеры включены, чтобы продемонстрировать некоторые предпочтительные воплощения изобретения. Специалистам в данной области следует иметь в виду, что методы, описываемые в примерах, в которых следуют представляемым методам, разработанным в изобретении, оказываются эффективными при практическом применении изобретения и, таким образом, как полагают, могут составлять предпочтительные способы для их практического применения. Однако специалистам в данной области, в свете данного открытия, следует иметь в виду, что много изменений можно внести в специальные воплощения, которые описаны, и еще получить подобный или аналогичный результат без отступления от идеи и сферы действия изобретения.

Пример 1: Получение плазмид

Фрагмент ДНК, кодирующий остатки Ala¹-Ser¹⁸¹ протеазы NS3 HCV (GenBank CAB46913), получали методом ПЦР из содержащей репликон плазмиды Con1 HCV, I₃₇₇neo/NS3-3'/мас. (переименованной как pBR322-HCV-Neo в данном исследовании) [V. Lohmann et al., Science, 285, pp. 110-113 (1999)] и вставляли в pBEV11 (S. Chamber, et al., персональное сообщение) для экспрессии в белках HCV с С-концевой гексагистидиновой меткой в E. coli. Резистентные мутации против PI NS3-4A HCV вносили в эту конструкцию посредством основанного на ПЦР сайт-направленного мутагенеза. Чтобы получить репликон HCV, содержащий PI-резистентные мутации, 1,2-kb (тысяча пар оснований; т.п.о.) фрагмент Hind III/BstX I, полученный из репликона Con1 HCV, субклонировали в ТА-клонирующий вектор, pCR2.1 (Invitrogen). PI-резистентные мутации в домене сериновой протеазы NS3 вносили в вектор pCR2, содержащий фрагмент Hind III/BstX I HCV, методом ПЦР, а фрагмент BsrG I/BstX I, 579 пар оснований, содержащий мутированный остаток, субклонировали снова в содержащую репликон плазмиду Con1 второй генерации, имеющей три адаптивные мутации, pBR322-HCV-Neo-mADE (смотри ниже). Все конструкции подтвердили секвенированием.

Пример 2: Получение содержащих репликон клеток HCV

Субгеномную, содержащую репликон плазмиду Con1, pBR322-HCV-Neo [Lohmann et al., Science, 285, pp. 110-113 (1999)] расщепляли Sca I (New England Biolabs). Полноразмерную субгеномную, содержащую репликон РНК HCV получали из матрицы линеализированной ДНК, используя набор T7 Mega-script (Ambion), и обрабатывали ДН-азой, чтобы удалить матричную ДНК. Транскрипты РНК после считывания вводили электропорацией в клетки Huh-7 и стабильные линии содержащих репликон клеток HCV отбирали с 0,25 или 1 мг на мл G418 (Geneticin) в минимальную поддерживающую, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM), содержащую 10% фетальную бычью сыворотку (FBS). Стабильные содержащие репликон клетки HCV поддерживали в DMEM, 10% FBS и 0,25 мг на мл G418.

Во время получения субгеномных стабильных линий клеток, содержащих репликон, идентифицировали несколько различных типов адаптивных мутаций. Один тип имел три замещения в неструктурных белках HCV, которые вносили в исходную плазмиду pBR322-HCV-Neo методом сайт-направленного мутагенеза, чтобы получить субгеномную содержащую репликон плазмиду второй генерации, pBR322-HCV-Neo-mADE. Когда транскрипты Т7 РНК после считывания из плазмиды Sca I-линеализированной pBR322-HCV-Neo-mADE электропорацией вводили в клетки Huh7, стабильные колонии содержащих репликон клеток образовывались со значительно большей эффективностью, чем исходной РНК репликона РНК Con1. Резистентные мутации, идентифицированные в описанном исследовании, вносили в содержащую репликон плазмиду pBR322-HCV-Neo-mADE методом сайт-направленного мутагенеза. Стабильные линии клеток, содержащих репликон, получали, используя транскрипты Т7, полученные или из pBR322-HCV-Neo-mADE или типов с резистентными мутациями.

Пример 3: Протокол исследования содержащих репликон клеток HCV

Клетки, содержащие репликон вируса гепатита С (HCV), поддерживали в DMEM, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), 0,25 мг на мл G418 с соответствующими добавками (среда А).

На 1 день монослой содержащих репликон клеток обрабатывали смесью трипсин:EDTA, удаляли, а затем среду А разбавляли до конечной концентрации 100000 клеток на мл wt (дикий тип), 10000 клеток в 100 мкл помещали в каждую лунку 96-луночного планшета для культуры ткани и культивировали в течение ночи в инкубаторе для тканевой культуры при 37°С.

На 2 день соединения (в 100% DMSO) стерильно разбавляли в DMEM, содержащей 2% FBS, 0,5% DMSO с соответствующими добавками (среда В). Конечную концентрацию DMSO поддерживали при 0,5% во всей серии разведений.

Среду с монослоя содержащих репликон клеток удаляли, а затем добавляли среду В, содержащую различные концентрации соединений. Среду В без какого-либо соединения добавляли в другие лунки в качестве контролей, не содержащих никакого соединения.

Клетки инкубировали с соединением или 0,5% DMSO в среде В в течение 48 часов в инкубаторе для тканевой культуры при 37°С. В конце 48-часовой инкубации среду удаляли, а монослой содержащих репликон клеток промывали один раз PBS и хранили при -80°С до экстракции РНК.

Культуральные планшеты с обработанными монослоями содержащих репликон клеток оттаивали, и установленное количество другого, содержащего РНК вируса, такого как вирус бычьей вирусной диареи (BVDV), добавляли к клеткам в каждую лунку. Реагенты для экстракции РНК (такие как реагенты из РНКазных наборов) сразу добавляли к клеткам, чтобы избежать деградации РНК. Тотальную РНК экстрагировали в соответствии с инструкцией производителя с модификацией, чтобы улучшить эффективность экстракции и консистенцию. Наконец, тотальную клеточную РНК, включая РНК репликона HCV, элюировали и хранили при -80°С до дальнейшей обработки.

Метод количественного определения Tagman ПЦР-ОТ в реальном времени проводили с двумя сериями специфических праймеров и зондом. Одна серия для HCV, а другая - для BVDV. Экстракты тотальной РНК из обработанных, содержащих репликон клеток HCV добавляли в реакционные смеси ПЦР для количественного определения РНК как HCV, так и BVDV в той же самой ПЦР-лунке. Экспериментальную «неудачу» отмечали и признавали негодной на основании уровня РНК BVDV в каждой лунке. Уровень РНК HCV в каждой лунке рассчитывали в соответствии с пробегом стандартной кривой для того же ПЦР-планшета. Процент ингибирования или снижения уровня РНК HCV, обусловленного обработкой соединением, рассчитывали, принимая DMSO или контроль без соединения как 0% ингибирования. Цитотоксичность соединений определяли, используя анализ жизнеспособности клеток на основе митохондриального фермента, CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega). Величины IC₅₀ (концентрация, при которой наблюдали 50% ингибирование уровня РНК HCV) и СС₅₀ (концентрация, при которой наблюдали 50% снижение жизнеспособности клеток) рассчитывали по титрационной кривой любого данного соединения, используя подбор кривой с четырьмя параметрами (SoftMax Pro).

Пример 4: Отбор PI-резистентных содержащих репликон клеток HCV

Субгеномные, содержащие репликон стабильные клетки Con1 HCV серийно пассировали в присутствии 0,25 мг на мл G418 и постепенно повышающихся концентрациях VX-950 (серия А), BILN 2061 (серия В) или комбинации как VX-950, так и BILN 2061 (серии С, D и E). Концентрации VX-950 колебались от 3,5 мкМ (или

10×IC₅₀) в 48-часовом исследовании (смотри выше) до 28 мкМ (80×IC₅₀), а конечная концентрация составляла 12,5 мкМ (12500×IC₅₀). Во время отбора содержащие репликон клетки размножали дважды в неделю, когда достигали 70-90% конфлуентности. Свежий PI HCV добавляли каждые 3-4 дня независимо от того, разделяли ли клеточную культуру или нет.

Пример 5: Идентификация PI-резистентных мутантов HCV

Во время отбора PI-резистентных содержащих репликон клеток HCV клеточные осадки собирали каждый раз, когда клеточную культуру расщепляли. Тотальную клеточную РНК экстрагировали, используя РНКазный мини-преп. набор (Qiagen). Фрагмент кДНК длиной 1,7 тысяч пар оснований (т.п.о.), заключающий в себе область сериновой протеазы NS3 HCV, амплифицировали с парой HCV-специфических олигонуклеотидов (5'-CCTTCTATCGCCTTCTTG-3' (SEQ ID NO:3) и 5'-CTTGATGGTCTCGATGG-3' (SEQ ID NO:4)), используя титановый набор для одностадийной ПЦР-ОТ (Roche Applied Science). Амплифицированные продукты очищали, используя набор для очистки QIA-быстрой ПЦР (Qiagen). Чтобы контролировать появление мутаций HCV, связанных с PI, в домене сериновой протеазы NS3 HCV в ходе отбора, проводили определение последовательностей очищенных 1,7 т.п.о. ПЦР-ОТ-продуктов обработанных PI, взятых в некоторые различные временные периоды культивирования. Чтобы определить частоту встречаемости PI-резистентных мутаций, 1,7 т.п.о. продукты ПЦР-ОТ РНК HCV содержащих репликон клеток, резистентных к VX-950 или BILN 2061, лигировали в ТА-клонирующий вектор (Invitrogen). Для каждой временной точки выделяли многочисленные индивидуальные бактериальные колонии и секвенировали область, кодирующую протеазу NS3 HCV, очищенной плазмидной ДНК.

Пример 6: Экспрессия и очистка домена сериновой протеазы NS3 HCV

Каждую экспрессирующую конструкцию для домена сериновой протеазы NS3 HCV, содержащую последовательность дикого типа или резистентные мутации (A156S, D168V или D168A), трансформировали в клетки E. coli BL21/DE3 pLysS (Stratagene). Свежие трансформированные клетки росли при 37°С в среде BHI (Difco Laboratories), дополненной 100 мкг на мл карбенициллином и 35 мкг на мл хлорамфениколом, до оптической плотности 0,75 при 600 нМ. Индукцию посредством 1 мМ IPTG проводили в течение четырех часов при 24°С. Клеточные массы собирали центрифугированием и флакон замораживали при -80°С до очистки белка. Все стадии очистки проводили при 4°С. Для каждой из протеаз NS3 HCV, 100 г клеточной массы лизировали в 1,5 л буфера А {50 мМ HEPES (рН 8,0), 300 мМ NaCl, 0,1% н-октил-β-D-глюкопиранозида, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 10% (об./об.) глицерина} и перемешивали в течение 30 мин. Лизаты гомогенизировали, используя микрофлуидизер (Microfluidics, Newton, MA), с последующим ультрацентрифугированием при 54000g в течение 45 мин. Имидазол добавляли к супернатантам до конечной концентрации 5 мМ вместе с 2 мл смолы Ni-NTA, предварительно уравновешенной буфером А, содержащим 5 мМ имидазола. Смеси качали на качалке в течение трех часов и промывали 20 колоночными объемами буфера А плюс 5 мМ имидазола. Смеси качали на качалке в течение трех часов и промывали 20 колоночными объемами буфера А плюс 5 мМ имидазола. Белки NS3 HCV элюировали в буфер А, содержащий 300 мМ имидазола. Элюаты концентрировали и наносили на колонку Hi-Load 16/60 Superdex 200, предварительно уравновешенную буфером А. Соответствующие фракции очищенных белков HCV объединяли и хранили при -80°С.

Пример 7: Энзиматическое исследование домена сериновой протеазы NS3 HCV

А. Протокол исследования фермента методом ВЭЖХ

Метод ВЭЖХ-Microbore для разделения субстрата 5AB и продуктов

Субстрат:

NH2-Glu-Asp-Val-Val-(альфа)Abu-Cys-Ser-Met-Ser-Tyr-COOH

Основной раствор 20 мМ 5AB (или концентрация вашего выбора) готовили в DMSO мас./0,2 М DTT. Раствор хранили в аликвотах при -20°С.

Буфер: 50 мМ HEPES, рН 7,8; 20% глицерин; 100 мМ NaCl

Общий объем пробы составлял 100 мкл

	X1 мкл	Концентрация в исследовании
Буфер	86,5	Смотри выше
5 мM KK4А	0,5	25 мкМ
1M DTT	0,5	5 мМ
DMSO или ингибитор	2,5	2,5% об./об.
50 мкМ tNS3	0,05	25 нМ
250 мкМ 5АВ (инициирует)	20	25 мкМ

Буфер, КК4А, DTT и tNS3 смешивали, каждые 78 мкл распределяли в лунки 96-луночного планшета. Планшет инкубировали при 30°С в течение ~5-10 минут.

2,5 мкл соответствующей концентрации тестируемого соединения растворяли в DMSO (только DMSO для контроля) и добавляли в каждую лунку. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут.

Реакцию инициировали добавлением 20 мкл 250 мкМ субстрата 5АВ (25 мкМ концентрация эквивалентна или немного ниже, чем Km для 5АВ). Реакционную смесь инкубировали в течение 20 минут при 30°С, а затем реакцию завершали добавлением 25 мкл 10% TFA. Аликвоты 120 мкл конечного продукта окончательной реакции переносили в ампулы ВЭЖХ. Продукт SMSY отделяли от субстрата и КК4А следующим способом:

Microbore-способ разделения:

Аппаратура: Agilent 1100

Аппарат для дегазации G1322A

Двойной насос G1312A

Автодозатор G1313A

Колоночная термостатированная камера G1316A

Диодный матричный детектор G1315A

Колонка:

Phenomenex Jupiter; 5 микрон С18; 300 ангстрем; 150×2 мм; P/O OOF-4053-BO

Термостат колоночного типа: 40°С

Вводимый объем: 100 мкл

Растворитель А=вода, чистая для ВЭЖХ, +0,1% TFA

Растворитель В=ацетонитрил, чистый для ВЭЖХ, +0,1% TFA

Время (мин)	%B	Скорость (мл/мин)	Максимальное давление
0	5	0,2	400
12	60	0,2	400
13	100	0,2	400
16	100	0,2	400
17	5	0,2	400
Время удерживания: 17 мин.
Время после проведения: 10 мин.

В. Протокол исследования фермента с использованием FRET

Энзиматическую активность определяли, используя модификацию метода, описанного Taliani et al., [Taliani et al., Anal. Biochem. 240, pp. 60-67 (1996)]. Внутренне гасимый флуорогенный пептид (субстрат FRET), Ac-DED(EDANS)EEαAbuψ[COO]ASK(DABCYL)-NH2, приобретали у фирмы AnaSpec Incorporated (San Jose, CA). Исследование проводили непрерывным способом в формате 96-луночного титрационного микропланшета. Буфер составляли из 50 мМ HEPES (рН 7,8), 100 мМ NaCl, 20% глицерина, 5 мМ DTT и 25 мкМ пептида КК4А (KKGSVVIVGRIVLSGK; SEQ ID NO:5). Пептид КК4А представляет собой центральную область кофактора NS4A из генотипа 1а с остатками лизина, введенными для улучшения растворимости [Landro et al. Biochemistry, 36, pp. 9340-9348 (1997)]. Реакцию инициировали добавлением субстрата FRET после 10-минутной преинкубации компонентов буфера с 2 нМ протеазы NS3 при комнатной температуре. За реакцией постоянно следили при 30°С в течение 20 минут, используя флуориметрический планшет-ридер Molecular Devices fmax. Фильтрами для длин волн возбуждения и излучения были 355 нм и 495 нм соответственно. Для определения кинетических параметров субстрата концентрации пептида FRET варьировали от 0,5 до 0,7 мкМ. Межмолекулярное гашение не наблюдали в указанной области. Кинетические параметры субстрата, Km и Vmax, определяли установлением данных по уравнению Михаэлиса-Ментен. Константы ингибирования (Ki) определяли титрованием активности фермента, используя описанный выше способ, за исключением того, что соединение, растворенное в DMSO (не более 2% об./об. DMSO, один растворитель использовали как контроль), добавляли к компонентам буфера и ферменту после исходной 10-минутной преинкубации, как описано выше. Полученную смесь инкубировали в течение дополнительных 15 минут при комнатной температуре до инкубации с субстратом FRET в течение следующих 20 минут при 30°С. Исследовали от семи до девяти концентраций соединения, а полученные результаты соответствовали интегрированной форме уравнения Моррисона для ингибирования прочного связывания [J.F. Morrison, Biochem. Biophys. Acta, 185 pp. 269-286 (1969)]. Все данные относительно субстрата и ингибитора устанавливали, используя нелинейную регрессию Марквардта-Левенберга (Marquardt-Levenberg) с программным обеспечением GraphPad Prism.

Пример 8: Получение резистентности к VX-950 в содержащих репликон клетках HCV

VX-950 (Фигура 4А, химическая структура) является клиническим кандидатом на средство для лечения гепатита С. VX-950 представляет собой обратимый, ковалентный ингибитор сериновой протеазы NS3/4A HCV. Хотя ингибитор конкурирует с пептидным субстратом в активном центре, он проявляет явно неконкурентное ингибирование как результат его прочно связывающих свойств и зависимого от времени механизма ингибирования (C. Gates and Y-P. Luong). Инкубация субгеномных, содержащих репликон клеток Con1 HCV с VX-950 приводила к зависимому от концентрации падению уровня РНК HCV, что определяли методом ПЦР-ОТ (Tagman) в реальном времени (Фигура 5В). Величина IC₅₀ для VX-950 составляла 354 нМ при 48-часом исследовании.

Чтобы идентифицировать резистентные к VX-950 мутации, субгеномные, содержащие репликон клетки Con1 серийно пассировали (то есть получали субкультуры) в присутствии 0,25 мг на мл G418 и постепенно увеличивающихся концентраций VX-950 (серия А) (Фигура 5А, кривая отбора). Начальная концентрация VX-950 составляла 3,5 мкМ, или 10-кратная IC₅₀, а наивысшая концентрация составляла 28 мкМ, или в 80 раз выше IC₅₀. Содержащие репликон клетки разделяли или пополняли среду каждые 3 или 4 дня и добавляли свежий VX-950. Так как VX-950 ингибирует активность сериновой протеазы NS3 HCV и, следовательно, блокирует репликацию РНК HCV, уровень равновесного состояния белков HCV и белка неомицин-трансферазы постепенно снижался и, в конце концов, становился неопределяемым в присутствии высокой концентрации VX-950. Клетки с низким или никаким содержанием белка неомицин-трансферазы пролиферировали с постепенно снижающейся скоростью и, в конце концов, погибали в присутствии G418. Только РНК HCV с мутациями, которые резистентны к VX-950, могли реплицироваться в присутствии высокой концентрации VX-950 и поддерживать рост содержащих репликон клеток, удерживающих их. Содержащие репликон клетки в серии А росли нормально в течение первых 10 дней в присутствии 3,5 мкМ VX-950. Через 10 дней клетки серии А росли значительно медленнее, и наблюдали массовую клеточную гибель между 10 и 17 днями (Фигура 5А, кривая отбора). Нормальный рост не возобновлялся до 21 дня. Как было установлено, IC₅₀ для VX-950 относительно содержащих репликон клеток серии А составляла от 8,1 до 12,0 мкМ, что в 23-34 раза выше, чем IC₅₀ (354 нМ) для содержащих репликон клеток дикого типа (Фигура 5В, кривая IC₅₀).

Тотальные клеточные РНК из клеток серии А на 7, 21 и 56 день экстрагировали и подвергали ПЦР-ОТ, чтобы амплифицировать кодирующую область домена сериновой протеазы NS3. Продукт ПЦР-ОТ секвенировали в основной массе, чтобы идентифицировать положение(я) возможных мутаций, которые могут быть ответственными за наблюдаемое снижение чувствительности к VX-950. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности протеазы HCV дикого типа из исходных содержащих репликон клеток представлены в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:1. Никакой мутации, связанной с VX-950, не наблюдали в домене сериновой протеазы NS3 содержащих репликон клеток серии А на 7 день, когда сравнивали с содержащими репликон клетками Con1 дикого типа в отсутствие VX-950.

На 21 и 56 дни в серии А были обнаружены замещения по Ala156 в домене протеазы, позволяя предположить, что мутации по остатку 156 могут быть решающими для сниженной чувствительности к VX-950. Никакой мутации не обнаруживали в каком-либо из четырех протеолитических участков в области неструктурного белка HCV, которая расщепляется сериновой протеазой NS3/4A. Чтобы установить размеры идентичности и частоты замещений, продукт ПЦР-ОТ 1,7 т.п.о. содержащих репликон клеток серии А на 7 или 98 день субклонировали в ТА-вектор и многочисленные клоны секвенировали для обоих образцов. Все клоны, полученные из 7-дневных образцов, содержали Ala156 дикого типа. В 98-дневном образце содержащих репликон клеток серии А, которые культивировали в присутствии 28 мкМ VX-950 в течение 63 дней, 79% или 60 из 76 клонов имели замещение аланина на серин (A156S).

Кроме того, VX-950-резистентные клетки были отобраны при постоянной концентрации VX-950 и G418. В этом случае многочисленные колонии резистентных клеток обнаруживали после продолжительного периода культивирования с VX-950 и G418. Последовательности сериновых протеаз NS3 определяли из этих резистентных колоний и обнаружили подобные мутации по аминокислоте 156 сериновой протеазы HCV.

Пример 9: Получение резистентности к BILN 2061 в содержащих репликон клетках HCV

Показано, что другой ингибитор протеазы NS3/4A HCV, BILN 2061 (Фигура 4В, химическая структура) (WO 00/599929; US 6608027), является эффективным у пациентов с гепатитом С (Lamarre et al., Nature Medicine, 2003). Содержащие репликон клетки HCV, резистентные к BILN 2061 (серия В), отбирали таким же способом, как для VX-950. Снова субгеномные, содержащие репликон клетки Con1 HCV дикого типа серийно пассировали в присутствии 0,25 мг на мл G418 и постепенно возрастающей концентрации BILN 2061 (Фигура 6А, кривая отбора). Содержащие репликон клетки серии В росли нормально в течение первых 7 дней в присутствии 80 нМ BILN 2061, или в 80 раз более высокой IC₅₀. Однако после 7 дней пролиферация клеток серии В значительно замедлялась, и происходила массовая гибель клеток между 7 и 17 днем. Как прежде, нормальный рост не возобновлялся до 21 дня. Величина IC₅₀ для BILN 2061 составляла от 1,0 до 1,8 мкМ против клеток серии В на 59 день, что от 1000 до 1800 раз выше, чем IC₅₀ (1 нМ) в отношении содержащих репликон клеток дикого типа (Фигура 6В, кривая IC₅₀).

Никакой связанной с BILN 2061 мутации не наблюдали в домене сериновой протеазы NS3 на 7 день. К 24 дню целый ряд замещений установили по аминокислоте 168 белка NS3, которые позволяют предположить, что замещения по остатку 168 могут объяснять резистентность к BILN 2061. Не наблюдали никакой мутации в четырех участках области неструктурного белка HCV, которая расщепляется сериновой протеазой NS3/4A. Чтобы определить частоту замещений по остатку 168 NS3, сериновую протеазу NS3 содержащих репликон клеток серии В на 98 день, которые культивировали в присутствии 3,2 мкМ BILN 2061, секвенировали. 60 из 94 клонов или 64% имели замещение Asp168 на Val (D168V), а 23 клона или 24% имели мутацию Asp168 на Ala (D168A).

Кроме того, BILN 2061-резистентные клетки отбирали при постоянной концентрации BILN 2061 и G418. В этом случае многочисленные колонии резистентных клеток обнаруживали после продолжительного периода культивирования с BILN 2061 и G418. Последовательности сериновых протеаз NS3 HCV определяли из этих резистентных колоний и обнаружили подобные мутации по аминокислоте 168 сериновой протеазы HCV.

Пример 10: Отбор содержащих репликон клеток, резистентных как к VX-950, так и к BILN 2061

А. Получение перекрестно резистентных репликонов HCV из VX-950-резистентных клеток

Для идентификации резистентных мутаций, которые являются перекрестно резистентными как к VX-950, так и к BILN 2061, использовали несколько схем селекции. Сначала линию содержащих репликон клеток, резистентных к VX-950 [серия А у C. Lin et al., J. Biol. Chem. 279, pp. 17508-17514 (2004)], серийно пассировали в присутствии 0,25 мг/мл G418, 14 мкМ VX-950 и постепенно возрастающих концентраций BILN 2061 (серия С) (Фигура 8А). Для BILN 2061 начальная концентрация составляла 40 нМ, а конечная концентрация - 6,4 мкМ. Содержащие репликон клетки разделяли или пополняли среду каждые 3 или 4 дня и добавляли свежие VX-950 и BILN 2061. Так как PIs HCV ингибируют активность сериновой протеазы NS3/4A и, следовательно, блокируют репликацию РНК HCV, уровень равновесного состояния белков HCV и белка неомицин-трансферазы постепенно снижался и, в конце концов, становился неопределяемым в присутствии высокой концентрации PI HCV (данные не представлены). Клетки с низким содержанием белка неомицин-трансферазы пролиферировали с постепенно снижающейся скоростью и, в конце концов, погибали в присутствии G418. Полагают, что содержащие репликон клетки с основной VX-950-резистентной мутацией, A156S, погибали в присутствии возрастающих концентраций BILN 2061, так как они, как было показано, являются чувствительными к ингибированию BILN 2061 [C. Lin et al. J. Biol. Chem. 279, pp. 17508-17514 (2004)]. Только РНК HCV с мутациями, которые являются перекрестно резистентными как к VX-950, так и к BILN 2061, могли реплицироваться в присутствии высоких концентраций обоих PIs HCV и поддерживать рост содержащих репликон клеток, удерживающих их. Однако содержащие репликон клетки в серии С росли нормально во время всего процесса селекции, который продолжался в течение 56 дней. Как было установлено, IC₅₀ для BILN 2061 в отношении содержащих репликон клеток серии С на 52 день составляла ~3 мкМ, что в 300 раз выше, чем IC₅₀ для содержащих репликон клеток серии А (VX-950-резистентных) (~10 нМ) (Фигура 8В). Так как VX-950, 30 мкМ, не приводил к более чем 50% снижению РНК HCV в содержащих репликон клетках серии С к 52 дню, точные величины IC₅₀ нельзя было определить, что указывает на то, что содержащие репликон клетки серии С на 52 день оставались резистентными к VX-950 (Фигура 8С).

Тотальную клеточную РНК из клеток серии С на 32 день, которые культивировали в присутствии 14 мкМ VX-950 и 0,32 мкМ BILN 2061, экстрагировали и подвергали ПЦР-ОТ, чтобы амплифицировать кодирующую область домена сериновой протеазы NS3. Продукт ПЦР-ОТ в основной массе секвенировали, чтобы идентифицировать положение(я) возможных мутаций, которые могут быть ответственными за наблюдаемое снижение чувствительности к обоим PIs HCV. Кроме того, установили замещения по Ala156 в домене протеазы, что позволяет предположить, что мутации по остатку 156 могут быть решающими для сниженной чувствительности к обоим PIs. Эти данные являются несколько неожиданными, так как установлено, что основной VX-950-резистентной мутацией является A156S [C. Lin et al. J. Biol. Chem. 279, 17508-17514 (2004)]. Никакой мутации не обнаружено ни в одном из четырех протеолитических участков в области неструктурного белка HCV, которые расщепляются сериновой протеазой NS3/4A. Чтобы установить идентичность и частоту замещений, продукт ПЦР-ОТ 1,7 т.п.о. содержащих репликон клеток серии С на 32 день субклонировали в ТА-вектор и 10 индивидуальных колоний секвенировали. 6 клонов имели замещение Ala156 на Thr (A156T), а 3 клона имели замещение Ala156 на Val (A156V). 10-ый клон сохранял мутацию A156S.

В. Получение перекрестно резистентных репликонов HCV из BILN 2061-резистентных клеток

Вторая схема селекции включала выращивание BILN 2061-резистентных, содержащих репликон клеток в присутствии как BILN 2061, так и VX-950. В этом случае линию содержащих репликон клеток, резистентных к BILN 2061 [серия В у C. Lin et al., J. Biol. Chem. 279, pp. 17508-17514 (2004)], серийно пассировали в присутствии 0,25 мг/мл G418 и постепенно возрастающих концентраций VX-950 и BILN 2061 (серия D) (Фигура 9А). Для BILN 2061, начальная концентрация составляла 160 нМ, а конечная концентрация была 6,4 мкМ. Использовали только две концентрации VX-950: 7 мкМ и 14 мкМ. Содержащие репликон клетки с основными BILN 2061-резистентными мутациями, D168V или D168A, как предполагали, погибали в присутствии высоких концентраций VX-950, так как они, как было показано, являются чувствительными к ингибированию VX-950 [C. Lin et al. J. Biol. Chem. 279, pp. 17508-17514 (2004)]. Кроме того, только РНК HCV с мутациями, которые являются перекрестно резистентными как к VX-950, так и к BILN 2061, могли реплицироваться в присутствии высоких концентраций обоих PIs HCV и поддерживать рост содержащих репликон клеток, удерживающих их. Однако содержащие репликон клетки серии D росли нормально во время большей части процесса селекции, который также продолжался в течение 56 дней. Так как 30 мкМ VX-950 не приводили к более чем 50% снижению РНК HCV в содержащих репликон клеток серии D к 52 дню, точные величины IC₅₀ для VX-950 невозможно было определить, но они должны быть, по крайней мере, более чем в 100 раз выше, чем IC₅₀ (~0,3 мкМ) против содержащих репликон клеток серии B (BILN 2061-резистентные) (Фигура 9В). Установлено, что величины IC₅₀ для BILN 2061 относительно содержащих репликон клеток серии D к 52 дню составляли ~4 мкМ, что указывает, что содержащие репликон клетки серии D к 52 дню оставались резистентными к BILN 2061 (Фигура 9С).

Тотальную клеточную РНК из клеток серии D на 32 день, которые также культивировали в присутствии 14 мкМ VX-950 и 0,32 мкМ BILN 2061, экстрагировали и подвергали ПЦР-ОТ, чтобы амплифицировать кодирующую область домена сериновой протеазы NS3. Продукт ПЦР-ОТ в основной массе секвенировали, чтобы идентифицировать положение(я) возможных мутаций, которые могут быть ответственными за наблюдаемое снижение чувствительности к обоим PIs HCV. Кроме того, установили замещения по Ala156 в домене протеазы, что подтверждает, что мутации по остатку 156 могут быть решающими для сниженной чувствительности к обоим PIs. Никакой мутации не обнаружено ни в одном из четырех протеолитических участков в области неструктурного белка HCV, которые расщепляются сериновой протеазой NS3/4A. Чтобы установить идентичность и частоту замещений, продукт ПЦР-ОТ 1,7 т.п.о. содержащих репликон клеток серии А на 32 день субклонировали в ТА-вектор и 14 индивидуальных колоний секвенировали. 12 клонов имели замещение A156V, а 1 клон имел мутацию A156T. 14-ый клон имел две мутации, A156S и D168V.

C. Получение перекрестно резистентных репликонов HCV из наивных содержащих репликон клеток

В предварительных исследованиях мутаций, резистентных к одному PI HCV, или VX-950, или BILN 2061, клеточный рост замедлялся в течение нескольких дней, во время которых наблюдали массовую гибель клеток [C. Lin et al. J. Biol. Chem. 279, pp. 17508-17514 (2004)], что свидетельствует о появлении резистентных мутантных содержащих репликон клеток и сопутствующей гибели не резистентных репликонов. Однако никакой подобной гибели клеток или замедления клеточного роста не наблюдали при селекции перекрестно резистентных репликонов серии С или D, описанных выше. Возможно, что перекрестно резистентные мутации, A156T и A156V, уже могут находиться в VX-950-резистентных (серия А) или BILN 2061-резистентных (серия В) содержащих репликон клетках в виде минорной популяции. Если так, описанные две схемы селекции могут обеспечить склонность к мутации A156T или A156V в пределах других потенциальных перекрестно резистентных мутаций. Таким образом, третью схему селекции можно осуществлять, используя наивные содержащие репликон клетки HCV, которые чувствительны к любому ингибитору.

Субгеномные, содержащие репликон клетки Con1, полученные из pBR322-HCV-Neo-mADE [C. Lin et al. J. Biol. Chem. 279, pp. 17508-17514 (2004)], серийно пассировали в присутствии 0,25 мг/мл G418 и постепенно возрастающих концентраций VX-950 и BILN 2061 (серия Е) (Фигура 10). Начальная концентрация VX-950 составляла 3,5 мкМ, а наивысшая концентрация была 14 мкМ. Для BILN 2061 исходная концентрация составляла 80 нМ, а конечная концентрация была 3,2 мкМ. Содержащие репликон клетки разделяли или пополняли среду каждые 3 или 4 дня и добавляли свежие VX-950 и BILN 2061. Содержащие репликон клетки серии Е росли нормально в течение первых 10 дней в присутствии 3,5 мкМ VX-950 и 160 нМ BILN 2061. После 10 дней клетки серии Е росли значительно медленнее, и наблюдали массовую гибель клеток между 10 и 21 днями (Фигура 10). Нормальный рост не восстанавливался до 21 дня. Тотальную клеточную РНК из клеток серии С на 10, 21 и 48 дни экстрагировали и подвергали ПЦР-ОТ, чтобы амплифицировать кодирующую область домена сериновой протеазы NS3. Никакой мутации, связанной с PI HCV, не отмечали в домене сериновой протеазы NS3 содержащих репликон клеток серии Е на 10 день, когда сравнивали с содержащими репликон клетками Con1, культивированными в отсутствие обоих PIs HCV. Чтобы установить идентичность и частоту замещений, продукт ПЦР-ОТ 1,7 т.п.о. содержащих репликон клеток серии Е на 21 день или 48 день субклонировали в ТА-вектор и многочисленные клоны секвенировали для обоих образцов. В 21-дневном образце содержащих репликон клеток серии Е, которые культивировали в присутствии 3,5 мкМ VX-950 и 0,32 мкМ BILN 2061 в течение 14 дней, 65% или 30 из 46 клонов имели замещение Ala156 на Thr (A156T), тогда как другое замещение Ala156 на Val (A156V) обнаруживали в 35% или 16 из 46 клонов. Что касается 48-дневного образца клеток серии Е, которые культивировали в присутствии 14 мкМ VX-950 и 1,6 мкМ BILN 2061 в течение 14 дней, 80% или 35 из 44 клонов имели замещение A156T, тогда как замещение A156V обнаруживали в 20% или в 9 из 44 клонов. В любом случае, никаких других мутаций в домене сериновой протеазы NS3 не обнаруживали в более чем 10% ТА-плазмидных клонах, демонстрируя, что A156T и A156V являются единственными мутациями, которые включают перекрестную резистентность как к VX-950, так и к BILN 2061.

Пример 11: Демонстрация и подтверждение резистентных мутаций по аминокислоте 156 или 168 при энзиматическом исследовании содержащих репликон клеток

Для подтверждения, являются ли наблюдаемые мутации или по Ala156, или по Asp168 достаточными, чтобы индуцировать резистентность к VX-950 или BILN 2061 соответственно, использовали метод сайт-направленного мутагенеза, чтобы внести каждую индивидуальную мутацию по положению 156 или 168 в домен протеазы NS3 дикого типа.

Сайт-направленный мутагенез представляет собой другой метод, подходящий для получения мутантных протеазных белков, используемых в способах изобретения. В указанном методе применяют специфический мутагенез основной ДНК (которая кодирует аминокислотную последовательность, которая таргетирована для модификации). Метод, кроме того, обеспечивает возможность быстро получать и тестировать варианты последовательности, учитывая одно или более из вышеприведенных соображений, внесением одного или более изменений нуклеотидной последовательности в ДНК. Сайт-направленный мутагенез позволяет получать мутанты посредством применения специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК желаемой мутации, а также достаточное количество соседних нуклеотидов, чтобы обеспечить последовательность праймера достаточного размера и вариабельность последовательности, чтобы образовать стабильный дуплекс на обеих сторонах соединения произведенной делеции. Обычно предпочтительным является праймер приблизительно из от 17 до 25 нуклеотидов длиной приблизительно с 5-10 остатками на обеих сторонах соединения изменяемой последовательности.

В методе обычно используют бактериофагальный вектор, который существует как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной форме. Типичные векоторы, подходящие для сайт-направленного мутагенеза, включают в себя векторы, такие как фаг М13. Упомянутые фаговые векторы поставляются коммерчески, и их применение обычно хорошо известно специалистам в данной области. Двухцепочечные плазмиды также обычно используют в способе сайт-направленного мутагенеза, что устраняет стадию переноса представляющего интерес гена из фага в плазмиду.

Вообще, сайт-направленный мутагенез осуществляли сначала получением одноцепочечного вектора или плавлением двух цепей двухцепочечного вектора, который заключает в своей последовательности последовательность ДНК, кодирующую требуемый белок. Синтезировали олигонуклеотидный праймер, несущий требуемую мутантную последовательность. Полученный праймер затем отжигали при получении одноцепочечной ДНК, учитывая степень ошибочного спаривания при выборе условий гибридизации (отжига), и подвергали действию ферментов, полимеризующих ДНК, таких как фрагмент Кленова полимеразы I E. coli, для того, чтобы завершить синтез цепи, несущей мутацию. Таким образом, получали гетеродуплекс, в котором одна цепь кодирует оригинальную немутированную последовательность, а вторая цепь имеет требуемую мутацию. Полученный гетеродуплексный вектор затем использовали, чтобы трансформировать подходящие клетки, такие как клетки E. coli, и отбирали клоны, которые включают в себя рекомбинантные векторы, несущие структуру мутантной последовательности.

Конечно, описанный выше подход сайт-направленного мутагенеза не является единственным способом получения потенциально подходящих видов мутантной протеазы и, по существу, им не ограничиваются. В данном изобретении также рассматривали другие способы осуществления мутагенеза, например, такие как обработка рекомбинантных векторов, несущих ген представляющих интерес мутагенных средств, таких как гидроксиламин, чтобы получить варианты последовательности.

А. Доминантный VX-950-резистентный мутант, A156S, остается чувствительным к BILN 2061

Для подтверждения является ли наблюдаемое замещение Ala156 посредством Ser достаточным для достижения резистентности к VX-950, а не к BILN 2061, использовали сайт-направленный мутагенез, чтобы заменить Ala156 посредством Ser в домене протеазы NS3 дикого типа.

Кинетические параметры субстрата FRET в отношении доменов протеаз NS3 дикого типа из генотипов 1а и 1b были идентичными (таблица 1) при используемых условиях исследования. Хотя пептидный кофактор NS4A был из генотипа 1а HCV, не наблюдали никаких распознаваемых различий в кинетических параметрах. Это согласуется с молекулярным моделированием, что позволяет предположить, что консервативные вариации в центральной области NS4A между генотипами 1а и 1b не влияют на взаимодействие между пептидом ядра NS4A и доменом протеазы NS3. Величины Ki для VX-950 и BILN 2061 определяли, используя протеазы дикого типа генотипов 1а и 1b, и не обнаружили никаких статистически значимых различий между двумя протеазами дикого типа (Таблица 1).

Кинетические параметры субстрата FRET для мутантной протеазы A156S были фактически такими же, как параметры протеазы дикого типа (Таблица 1). Однако величина Ki для VX-950 составляла 2,9 мкМ в отношении мутантной протеазы A156S, что в 29 раз выше, чем величина Ki относительно протеазы дикого типа (0,1 мкМ) (Таблица 2). Величина Ki для BILN 2061 составляла 112 нМ в отношении мутанта A156S, что оказалось в 6 раз выше, чем величина Ki против протеазы дикого типа, 19 нМ (Таблица 2).

Уровень РНК HCV в содержащих репликон клетках, имеющих замещение A156S, был подобен уровню РНК содержащих репликон клеток дикого типа (данные не представлены), что согласуется со схожей энзиматической каталитической эффективностью мутанта A156S и сериновой протеазы NS3 дикого типа. Величина IC₅₀ для VX-950 в отношении содержащих репликон клеток A156S составляла 4,65 мкМ, что в 12 раз выше, чем величина IC₅₀ относительно содержащих репликон клеток дикого типа (0,40 мкМ) (Таблица 3). Различия в величинах IC₅₀ для BILN 2061 в отношении A156S (7 нМ) и содержащими репликон клетками дикого типа (4 нМ) не были значительными (Таблица 3).

В. Основные BILN 2061-резистентные мутанты, D168V и D168A, остаются полностью чувствительными к VX-950

Для подтверждения является ли наблюдаемое замещение Asp168 посредством Val или Ala достаточным для достижения резистентности к BILN 2061, а не к VX-950, использовали сайт-направленный мутагенез, чтобы заменить Asp168 посредством Val или Ala в домене протеазы NS3 дикого типа.

На кинетические параметры субстрата не оказывала влияние мутация D168V, и установлены только минорные изменения (менее чем в 10 раз) для мутанта D168A, что было установлено при сравнении величин kcat и kcat/Km для протеазы дикого типа и двух мутантных сериновых протеаз NS3 (Таблица 1). Аналогично, не отмечали никакого значительного влияния любого замещения по Asp168 на величину Ki VX-950 (Таблица 2). Однако замещение валина или аланина аспарагиновой кислотой по положению 168 давало в результате мутантную протеазу NS3, которая не ингибировалась при концентрациях BILN 2061 вплоть до 1,2 мкМ (Таблица 2). Полученные данные указывают, что любая мутантная протеаза является, по крайней мере, в 63 раза менее чувствительной к BILN 2061 по сравнению с протеазой дикого типа. Точную величину резистентности невозможно установить, так как BILN 2061 не растворялся при концентрациях выше 1,2 мкМ в буфере исследования, что определяли по оптической плотности при 650 нм. Мутацию D168V или D168A также вводили в репликон HCV дикого типа методом сайт-направленного мутагенеза и получали стабильную линию содержащих репликон клеток, несущих любое замещение. Величина IC₅₀ для BILN 2061 составляла 5,09 мкМ относительно содержащих репликон клеток D168V, что более чем в 1300 раз выше, чем в отношении содержащих репликон клеток дикого типа (4 нМ) (Таблица 3). Величина IC₅₀ для BILN 2061 составляла 1,86 мкМ относительно мутантного репликона D168A. Отмечено небольшое различие в величинах IC₅₀ для VX-950 в отношении D168V и содержащих репликон клеток дикого типа (Таблица 3).

В Таблице 1 представлена характеристика энзиматических свойств сериновой протеазы дикого типа или доменов мутантных сериновых протеаз NS3 HCV. Пять доменных белков сериновых протеаз NS3 HCV, включающих в себя протеазы дикого типа (wt) генотипа 1а и 1b и три мутанта (A156S, D168V и D168A) генотипа 1b, экспрессировали и очищали, как описано в разделе «Материалы и методы». Величины kcat и Km для названных протеаз определяли, используя пептид ядра KK-NS4A и субстрат FRET.

Таблица 1 Энзиматическая характеристика дикого типа или мутантных сериновых протеаз NS3 HCV
Протеаза HCV	Km (мкМ)	Ккат (сек-1)	Ккат/Кm (М-1сек-1)
Дикий тип (1a)	1,3	1,2	8,97×105
Дикий тип (1b)	1,1	1,0	9,47×105
A156S (1b)	0,9	0,6	6,64×105
D168V (1b)	1,2	0,6	4,98×105
D168A (1b)	2,0	0,3	1,50×105

В Таблице 2 представлено подтверждение резистентности в энзиматическом исследовании. Величины Ki для VX-950 и BILN 2061 определяли в отношении пяти очищенных доменов сериновых протеаз NS3 HCV, включающих в себя протеазы дикого типа (wt) из генотипа 1а или 1b, а также три мутанта (A156S, D168V и D168A) генотипа 1b, используя пептид KK-NS4A и субстрат FRET. Растворимость BILN 2061 в реакционном буфере была ограниченной при концентрациях выше 1,2 мкМ. Не наблюдали никакого ингибирования мутантной протеазы NS3, ни D168V ни D168A, в присутствии 1,2 мкМ BILN 2061.

Таблица 2 Величины Ki для VX-950 и BILN 2061 в отношении дикого типа и мутантных протеаз NS3
	Ki (мкМ)
Мутант	BILN 2061	VX-950
Дикий тип (1a)	0,006	0,047
Дикий тип (1b)	0,019	0,100
A156S	0,112	2,9
D168V	>1,2	0,043
D168A	>1,2	0,150

В Таблице 3 продемонстрировано подтверждение резистентности в репликонах HCV. Четыре субгеномные стабильные линии содержащих репликон клеток HCV, включающие в себя дикий тип (wt) и три мутанта, A156S, D168V и D168A, получали, используя транскрипты Т7 РНК после считывания из соответствующих высокоэффективных содержащих репликон плазмид Con1. Величины IC₅₀ для VX-950 и BILN определяли в отношении четырех линий содержащих репликон клеток HCV в стандартном 48-часовом исследовании.

Таблица 3 Величины IC50 для VX-950 и BILN 2061 в отношении содержащих репликон клеток HCV с протеазой NS3 дикого типа и мутантными протеазами NS3
	Репликон IC50 (мкM)
Мутант	BILN 2061	VX-950
Дикий тип	0,004	0,402
A156S	0,007	5,09
D168V	4,65	0,163
D168A	1,86	0,193

С. Мутации A156T и A156V являются перекрестно резистентными как к VX-950, так и к BILN 2061

Для подтверждения, являются ли мутации по Ala156 достаточными для достижения перекрестной резистентности как к VX-950, так и кBILN 2061, использовали сайт-направленный мутагенез, чтобы заменить Ala156 или Val или Thr в домене протеазы NS3 дикого типа.

Каталитическая эффективность (kcat/Km) A156T или A156V мутантной протеазы в отношении субстрата FRET была приблизительно в 5-7 раз ниже, чем каталитическая эффективность протеазы дикого типа (Таблица 4). Величина Ki для VX-950 составляла 9,9 мкМ или 33 мкМ в отношении мутантной протеазы A156T или A156V соответственно, что в 99 или 330 раз выше, чем величина Ki в отношении протеазы дикого типа (0,1 мкМ) соответственно (Таблица 5). Ни одна мутантная протеаза не ингибировалась при концентрации BILN 2061 вплоть до 1,2 мкМ (Таблица 5). Полученные данные указывают, что каждая мутантная протеаза была, по крайней мере, в 63 раза менее чувствительной к BILN 2061, когда сравнивали с протеазой дикого типа. Точную величину резистентности невозможно установить, так как BILN 2061 не растворялся при концентрациях выше 1,2 мкМ в буфере исследования, что определяли по оптической плотности при 650 нм (данные не представлены).

Таблица 4 Энзиматические свойства дикого типа или мутантных доменов сериновых протеаз NS3 HCV
Протеаза HCV	Кm (мкМ)	Ккaт (сек-1)	Ккaт/Km (M-1сек-1)
Дикий тип	1,1	1,0	9,47×105
A156T	1,3	0,2	1,36×105
A156V	2,6	0,6	2,34×105

Таблица 4, резюме: три доменных белка сериновых протеаз NS3 HCV штамма Con1, включающих в себя протеазы дикого типа и два мутанта, A156T и A156V, экспрессировали и очищали. Величины kcat и Km названных протеаз определяли, используя пептид ядра KK-NS4A и субстрат FRET, и представили средние величины двух независимых исследований.

Таблица 5 Подтверждение резистентности в энзиматическом исследовании
Мутант	Ki (мкМ)
	BILN 2061	VX-950
Дикий тип	0,019	0,100
A156T(n=2)	>1,2	9,9
A156V(n=1)	>1,2	33

Таблица 5, резюме: величины Ki для VX-950 и BILN 2061 определяли в отношении пяти очищенных доменов сериновых протеаз NS3 HCV, включающих в себя протеазу дикого типа, а также два мутанта, A156T и A156V, используя пептид KK-NS4A и субстрат FRET. Растворимость BILN 2061 в реакционном буфере ограничена при концентрациях свыше 1,2 мкМ. Не наблюдали никакого ингибирования любой мутантной протеазы NS3, A156T или A156V в присутствии 1,2 мкМ BILN 2061.

Уровень РНК HCV в содержащих репликон клетках, имеющих замещение A156T или A156V, был ниже, чем уровень РНК содержащих репликон клеток дикого типа (данные не представлены), что согласуется с более низкой энзиматической каталитической эффективностью двух мутантов по сравнению с энзиматической каталитической эффективностью сериновых протеаз NS3 дикого типа. Никакого снижения РНК репликона HCV при концентрации VX-950 вплоть до 30 мкМ не наблюдали в любой линии мутантных клеток, содержащих репликон, что указывает, по крайней мере, на 75-кратное снижение чувствительности, происходящее при любой мутации (Таблица 6). Величина IC₅₀ для BILN 2061 в отношении любых содержащих репликон клеток A156T составляла 1,09 мкМ, что приблизительно в 272 раза выше, чем IC₅₀ в отношении содержащих репликон клеток дикого типа (4 нМ). Для мутантных репликонов A156V BILN 2061 характеризовался величиной IC₅₀ 5,76 мкМ, указывая на более чем 1400-кратное снижение чувствительности, достигаемой при мутации A156V (Таблица 6).

Таблица 6 Подтверждение резистентности в репликонах HCV
Мутант	Репликон IС50 (мкМ)
	BILN 2061	VX-950
Дикий тип	0,004	0,402
A156T	1,09	>30
A156V	5,76	>30

Таблица 6, резюме: три субгеномные стабильные линии клеток, содержащих репликон, HCV, включающие в себя дикий тип и два мутанта, A156T и A156V, получали, используя транскрипты Т7 РНК после считывания из соответствующих высокоэффективных содержащих репликон плазмид Con1. Величины IC₅₀ для VX-950 и BILN 2061 определяли в отношении трех линий содержащих репликон клеток HCV в стандартном 48-часовом исследовании и представили средние величины двух независимых исследований.

Пример 12: Моделирование - I

VX-950 и BILN 2061 моделировали в активном центре домена сериновой протеазы NS3, используя структуру полноразмерного белка NS3 HCV, опубликованную Yao et al. [Yao., et al., Structure Fold DES., 7, pp. 1353-1363 (1999)] (сод PDB: 1CU1). Координаты протеазного домена сегмента А в этой структуре показали, что С-концевая нить белка NS3 связывается в субстрат-связывающем участке протеазы. Концевая карбоксильная группа этой нити расположена вблизи остатков His57, Asp81 и Ser139 активного центра так, что она образует водородные связи с боковыми цепями His57 и Ser139, а также амидами остова остатков 137 и 139, которые образуют оксианионное отверстие (“hole”). Дополнительно, последние шесть остатков (с 626 по 631) белка NS3 образуют протяженную антипараллельную β-нить вдоль края нити Е2 β-стержня протеазы и создают двенадцать водородных связей остов-с-остовом. Полагают, что ингибитор на основе продукта, подобный BILN 2061, связывает протеазу NS3 подобным образом. Поэтому использовали описанную кристаллическую структуру для создания модели ко-комплексов ингибитор-протеаза. Молекулу BILN 2061 встраивали в программное обеспечение молекулярного моделирования QUANTA (Accelrys Inc., San Diego, California, USA) и вручную стыковали в активный центр так, что ее карбоксильная группа покрывалась С-концевым карбоксилатом NS3 полноразмерного белка NS3. Затем молекулу ингибитора вращали так, чтобы она создавала все следующие водородные связи остова: NH PI с карбонилом Arg155, карбонил P3 с NH Ala157 и NH P3 с карбонилом Ala157. Рассматриваемый способ связывания приводил большую группу Р2 BILN 2061 в непосредственное столкновение с боковой цепью Arg155. Чтобы избежать столкновения, боковую цепь Arg155 моделировали в протяженную конформацию, которая была подсказана описанием кристаллической структуры комплекса протеазы NS3 с ингибитором, который является аналогом BILN 2061 [Y.S. Tsantrizos, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, pp.1356-1360 (2003)]. Энергию ингибитора минимизировали в две стадии. На первой стадии только ингибитору и атомам боковых цепей Arg155, Asp168 и Arg123 протеазы позволяли двигаться во время минимизации энергии в ходе 1000 операций. На второй стадии всем атомам боковых цепей активного центра позволяли двигаться вдоль ингибитора в ходе 1000 дополнительных операций. Полученная модельная структура близко имитирует опубликованную структуру аналога BILN 2061 [Y.S. Tsantrizos, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, pp.1356-1360 (2003)].

Подобную процедуру адаптировали для моделирования VX-950 в активном центре протеазы. Ингибитор моделировали как ковалентный аддукт с si-поверхностным присоединением боковой цепи Ser139 к кетокарбонилу ингибитора. Упомянутый способ связывания описан для аналогичных кетоамидных ингибиторов [Perni et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14, in press (2004)] и кетокислотных ингибиторов [Di Marco et al., J. Biol. Chem., 275, pp. 7152-7257 (2000)]. Основную цепь ингибитора покрывали остатками 626-631 С-концевой нити NS3 так, чтобы она образовала все следующие водородные связи остова: NH P1 с карбонилом Arg155, карбонил P3 с NH Ala157, NH P3 с карбонилом Ala157 и покрывающий карбонил P4 с NH Cys159. В описанном способе связывания группу P2 VX-950 помещали в карман P2 без какой-либо необходимости передвигать боковую цепь Arg155. Группы трет-бутила и циклогексила помещали в карманы S3 и S4 соответственно. Для соответствия использовали тот же самый протокол двухстадийной минимизации энергии, примененный для модели BILN 2061. Описанные две модели ко-комплексов использовали, чтобы предсказать влияние мутаций по Ala156 и Asp168 на связывание ингибиторов протеаз.

Боковую цепь Asp168 подвергали действию растворителя. Боковая цепь валина мутанта D168V может принимать три канонические конформации с χ₁=60°, -60° или 180°. Моделировали все три ориентации боковой цепи Val168. Энергию взаимодействия мутантного фермента D168V и ингибитора минимизировали, позволяя ингибитору и атомам Val168 двигаться при фиксации положений всех других атомов белковой молекулы. Во всех случаях боковая цепь Val168 не была причиной какого-либо стерического столкновения с атомами ингибитора. Сериновую мутацию по Ala156 моделировали следующим способом. Боковая цепь Ala156 находится в ван-дер-ваальсовом контакте с группой Р2 обоих ингибиторов (Фигура 9). Боковую цепь серина мутанта A156S моделировали в трех канонических конформациях с χ₁=60°, -60° или 180°, а энергию минимизировали удерживанием конформации покоя фиксированного белка. Приведенные модели использовали, чтобы исследовать влияние данной мутации на связывание ингибитора. Обнаружено, что конформация -60° имеет наиболее низкую энергию, когда она образует водородную связь с соседним карбонилом Arg155, но она вызывает максимальное количество неблагоприятных контактов с обоими ингибиторами. Конформации 60° и 180° энергетически эквивалентны, но конформация 60° характеризуется меньшим количеством неблагоприятных контактов и ее использовали в исследованиях.

Ala156 располагали на нити E2 в структуре протеазы NS3^.4A HCV [R.A. Love et al., Cell 87, pp. 331-342 (1996)]. Несколько атомов остова упомянутой нити (главным образом карбонил Arg155 и как азот основной цепи, так и карбонил Ala157) образовывали водородные связи с атомами остова субстратов или субстрат-подобных ингибиторов. В структурной модели изобретения ко-комплекса VX-950:NS3 (Фигура 9) три водородные связи образованы между NH P1 и карбонилом Arg155, карбонилом P3 и NH Ala157 и NH P3 и карбонилом Ala157. Некоторые водородные связи также формировали в модели ко-комплекса BILN 2061. Боковая цепь Ala156 находится в ван-дер-ваальсовом контакте с группой Р2 упомянутых ингибиторов. В мутантной модели A156S изобретения конечный кислород Ser156 находится слишком близко к группе циклогексила Р4 VX-950 и он также находится близко к группе концевого циклопентила BILN 2061. Так как группа циклопентила BILN 2061 находится на гибком конце ингибитора, она может быть отодвинута от этого неблагоприятного контакта без потери большей части связывания. Подобное перемещение группы циклогексила Р4 VX-950 вызывает дестабилизацию взаимодействий между ингибитором и субсайтами S4 и S5 протеазы. Поэтому предполагали более значительную потерю связывания для VX-950, чем для BILN 2061, с мутантной протеазой A156S.

Asp168 располагали в нити F2 структуры протеазы NS3 и включали во взаимодействия соль-мостиковая связь с боковыми цепями Arg123 и Arg155 (Фигура 9) [R.A. Love et al., Cell 87, pp. 331-342 (1996)]. Он также является частью связывающего кармана S4. Алифатическая часть этой боковой цепи находится в ван-дер-ваальсовом контакте с терминальной группой циклопентила BILN 2061, на которую, как полагали, не оказывает влияние мутация D168V, так как боковая цепь валина по этому положению не вызывает какого-либо стерического столкновения с ингибитором. Однако упомянутое замещение D168V приводит к потере взаимодействия соль-мостиковая связь с боковой цепью Arg155 на соседней нити Е-2 (Фигура 1), которая создает многочисленные контакты с большой группой Р2 BILN 2061 на модели, описываемой здесь. Конформация Arg155 (Фигура 9, голубой цвет) на модели комплекса BILN 2061:протеаза NS3 дикого типа не является энергетически более благоприятной у мутанта D168V по двум причинам. Первое, невозможно оставаться близко к остовам нити Е-2 в отсутствие взаимодействия между Arg155 и Asp168. Второе, некомпенсированный и экспонированный растворителем положительный заряд боковой цепи Arg155 будет стремиться к более сольватной оболочке, как наблюдали в кристаллических структурах апо-протеазы и двух комплексах протеаза:ингибитор, которые имеются в Protein Data Bank (код: 1DY8 и 1DY9) [S. Di Marco et al., J. Biol. Chem., 275, pp. 7152-7157 (2000)]. Описанная конформация Arg155 находится в непосредственном столкновении с группой хинолина Р2 BILN 2061 и дестабилизирует его связывание. Поэтому замещение Asp168 любой аминокислотой, кроме глутамина, разрушит взаимодействия соль-мостиковая связь с Arg155 и приведет к снижению связывания BILN 2061. С другой стороны, конформация Arg155 в двух опубликованных кристаллических структурах комплекса протеаза NS3:ингибитор подобна конформации в модели изобретения комплекса VX-950:протеаза (оранжевый цвет на Фигуре 9). Кроме того, упомянутая конформация Arg155 придает стабилизацию связывания VX-950, так как она допускает максимальное количество ван-дер-ваальсовых контактов между боковой цепью Arg155 и ингибитором. Поэтому полагают, что на VX-950 не оказывают влияние замещения по Asp168 по сравнению с BILN 2061.

Пример 13: Моделирование - II

Моделирование VX-950 и BILN 2061 в активном центре домена сериновой протеазы NS3 с использованием кристаллической структуры полноразмерного белка NS3 HCV [N.Yao et al., Structure Fold Des. 7, pp. 1353-1363 (1999)] (код белковой базы данных (Protein Data Base): 1CU1)) было описано ранее [C. Lin et al., J. Biol. Chem. 279, 17508-17514 (2004)]. Боковая цепь Ala156 на β-нити Е2 протеазы NS3/4A HCV разделяет карманы S4 и S2 активного центра фермента и находится в ван-дер-ваальсовом контакте с группой Р2 двух ингибиторов (Фигура 7). Val- или Thr-замещение Ala156 распространяется на боковую цепь с двумя дополнительными (метил или гидроксил) группами в компактном пространстве между ферментом дикого типа и ингибиторами. Боковую цепь Val156 или Thr156 моделировали во всех трех возможных канонических конфигурациях с χ₁=60°, -60° или 180°, следуя процедуре, обрисованной ранее для моделирования мутации A156S [C. Lin et al., J. Biol. Chem. 279, 17508-17514 (2004)]. Для конформаций боковой цепи минимизировали энергию удерживанием конформации покоя фиксированного белка. Ингибиторы, VX-950 и BILN 2061, стыковали в активных центрах указанных мутантных ферментов, чтобы выяснить влияние мутаций на связывание ингибиторов.

Из трех возможных конформаций боковой цепи Ser по положению 156 (Фигура 11), конформация χ₁=60° имела наименьшее количество неблагоприятных контактов с VX-950 и BILN 2061. Две другие конформации (с χ₁=180° и -60°) имели многочисленные неблагоприятные контакты с обоими ингибиторами или в боковой цепи Р2, или в группе карбонила Р3. В мутации A156T или A156V дополнительную группу при Сβ-атоме боковой цепи заставляли занять одно из рассматриваемых двух положений с χ₁=180° и -60°, что создавало неблагоприятные взаимодействия с ингибиторами. Три возможные конформации Thr схематически представлены на Фигуре 11. Во всех случаях при взаимодействии дополнительной группы с атомами остова ингибитора и/или фермента происходило отталкивание. При минимизиции энергии обнаружено, что конформация -60/180° характеризуется наименьшим отталкиванием при взаимодействии, и основной причиной отталкивания является близкое столкновение между терминальной метильной или гидроксильной группой мутантной боковой цепи и карбонильной группой Р3 ингибиторов. Поэтому мутации A156T и A156V являются резистентными к обоим ингибиторам.

Все из композиций и/или способов, рассмотренных и заявленных в описании, могут быть сделаны и осуществлены без чрезмерного экспериментирования в свете данного открытия. Хотя композиции и способы данного изобретения описаны (в виде предпочтительных воплощений специалистам в данной области будет ясно, что изменения могут быть внесены в композиции и/или способы и в стадии или в последовательность стадий способа, описанных в описании, без отступления от концепции, идеи и сферы действия изобретения. Точнее, будет очевидно, что некоторые средства, которые являются родственными как химически, так и физиологически, могут быть заменены средствами, рассмотренными в описании, при достижении таких же или подобных результатов. Полагают, что все такие подобные замены или модификации, очевидные специалистам в данной области, соответствуют идеи, сфере действия и концепции изобретения, которые определены прилагаемой формулой изобретения.

Ссылки, цитируемые по всему описанию, в том смысле, что они обеспечивают показательные процедурные или другие подробности дополнительно к сведениям, представленным в описании, все специально включены в описание посредством ссылки. Следующий список ссылок, цитируемых на протяжении всего описания, специально включен цитированием.

Alter, H. J., and Seeff, L. B. (2000) Semin. Liver Dis. 20, 17-35.

Alter, M.A. (1997) Hepatology 26:62. (disease)

Babine, R. E., et al. (2002) in WO 0218369, Eli Lilly and Company

Barbato et al., (1999) J. Mol. Biol. 289: 371-384 (NMR struture of NS3-4A protease)

Bartenschlager, R., et al. (1993) J. Virol. 67, 3835-3844

Bartenschlager, R., et al. (1995) J. Virol. 69, 7519-7528

Bartenschlager, R., et al., (1993) J. Virol. 3835-3844 (NS3 serine protease)

Beaulieu, P.-L. & M. Llinas-Brunet (2002) Curr. Med. Chem. 1: 163-176 (HCV NS target therapy)

Behrens, S.E. et al., (1996) EMBO J. 15: 12-22 (NS5B polymerase)

Benhamou, Y. et al., (2002) Hepatology, 36 (4), р.106А.

Benhamou, Y., et al., (2002) Hepatology 36 (4) Abst. 463 (BILN 2061 clinical)

Beyer, B.M., et al. (2001) Proteins 43: 82-88. (GT3)

Blight, et al (2000) Science 290: 1972-1974. (adaptive)

Blight, K. J., et al. (1998) Antiviral Ther. 3, Suppl. 3, 71-81

Blight, K. J., et al. (2000) Science 290, 1972-1974.

Chander, G., et al., (2002) Hepatology 36: S135-144 (HCV treatment review)

Choo, Q.L. (1989) Science 244: 359-362 (discovery of HCV sequences)

Davies, G.L., et al., (1998) N. Eng. J. Med 339: 1493-1499 (pegIFN + RBV)

De Francesco, R. et al. (2003) Antiviral Res. 58, 1-16. (HCV NS inhibitor review)

De Francesco, R. and С. Steinkuhler (2000) Curr. Top. Micriobiol. Immunol. 242: 149-169 (HCV NS3-4A protease review on structure and function)

Di Marco, S., et al., (2000) J. Biol. Chem 275: 7152-7157 (PI co-structure)

Failla, C, et al. (1995) J. Virol. 69, 1769-1777

Frese, M., et al., (2001) J. Gen. Virol. 82: 723-733.

Grakoui, A., et al. (1993) J. Virol. 67, 1385-1395

Grakoui, A., et al., (1993) J. Virol. 67: 2832-2843 (NS3 serine protease)

Grakoui, A., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10583-10587 (NS2-3 auto-protease)

Hijikata, M., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10773-10777

Hijikata, M., et al., (1993) J. Virol. 67: 4665-4675 (two HCV proteases)

Hinrichsen, H. et al., Hepatology 2002, 36 (4), р.145А

Hinrichsen, H., et al., (2002) Hepatology 36 (4) Abst. 866. (BILN 2061 clinical)

Hirsch, M. S., et al. (2003) Clin. Infect. Dis. 37, 113-128.

Houghton, M. (1996) Field Virology book, pp. 1035-1058

Kenny-Walsh, E., (2001) Clin. Liver Dis. 5: 969-977 (HepC natural history)

Kim, D.W., et al., (1995) Bichim Biophys. Res. Com. 215: 160-166 (NS3 helicase)

Kim, J.L., et al (1996) Cell 87: 343-355. (NS3-4A protease structure)

Kolykhalov A.A., et al., (1997) Science 277: 570-574 (infectious RNA in chimp)

Kolykhalov A.A., et al., (2000) J. Virol. 74: 2046-2051 (enzyme inactive mutants in chimp)

Krieger, et al., (2001) J. Virol 75: 4614-4624 (adaptive)

Lai, С L., et al. (2003) Clin. Infect. Dis. 36, 687-696.

Lamarre, D., et al. (2003) Nature 426, 186-189.

Lamarre, D., et al., (2002) Hepatology 36 (Suppl. 4) Abst. 464 (BILN 2061 discovery)

Lamarre, D., et al., (2003) Nature Medicine,

Landro, J.A., et al., (1997) Biochemistry, 36, 9340-9348. (enzyme assay)

Lin, C., and Rice, С. М. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7622-7626 (NS3-4A in vitro assay)

Lin, C., et al. (1995) J. Virol. 69, 4373-4380 (NS4A cofactor)

Lin, C., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 17508-17514

Lin, K. et al., VX-950: A Tight-Binding HCV Protease Inhibitor with a Superior Sustained Inhibitory Response in HCV Replicon Cells. Presented at the 54th Annual Meeting of the AASLD October 27, 2003 Boston, MA

Lin, K., et al., (2003) Hepatology 38 (Suppl. 1): Abst. 137

Lohmann, V., et al., (1999) Science 285: 110-113. (replicon)

Lohmann, V., et al. (2001) J. Virol. 75, 1437-1449

Love, R.A., et al., (1996) Cell 87: 331-342. (NS3-4A protease structure)

McCoy, M.A., et al., (2001) J. Mol. Biol. 305: 1099-1110 (NMR struture of NS3-4A protease)

McHuntchinson, J.G., et al., (1998) N. Eng. J. Med 339: 1485-1492 (pegIFN+RBV)

McHutchison, J.G., et al., (2002) Hepatology 36 (Suppl. 1), S245-252 (Hep С future therapy)

Migliaccio, G., et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 49164-49170

Morrison, J. F. (1969) Biochim. Biophys. Acta 185, 269-286 (enzyme assay)

Narjes, H., et al., (2002) Hepatology 36 (Suppl. 4) Abst. 800 (BILN 2061 PK)

Neumann, A. U., et al. (1998) Science 282, 103-107

Neumann, A.U., et al., (1998) Science 285: 110-113 (HCV dynamics)

Nguyen, Т. Т., et al. (2003) Antimicrob. Agents Chemother. 47, 3525-3530

Pause, A., et al., (2003) J. Biol. Chem. 278: 20374-20380. (1st PI in replicon)

Perni, В., et al., (2003) Hepatology 38 (Suppl. 1): Abst. 972

Perni, et al. (2004) Bioorg. Med. Chem. Lett. 14, in press

Perni, R. B. et al., VX-950: The Discovery of an Inhibitor of the Hepatitis С NS3-4A Protease and a Potential Hepatitis С Virus Therapeutic. Presented at the 54th Annual Meeting of the AASLD October 27, 2003 Boston, MA

Perni, R. В., et al. (2003) Hepatology 38, Abstract 972

Pietschmann, and Bartenschlager (2001) J. Virol 75: 1252-1264

Rice, CM. (1996) Field Virology book, pp. 931-959

Steinkuhler, C., et al., (2001) Curr. Med. Chem. 8: 919-932 (HCV PI review)

Taliani M, et al. 1996 Anal. Biochem. 240(1):60-67. (FRET assay)

Tanji, Y., et al. (1995) J. Virol. 69, 1575-1581.

Tomei, L., et al., (1993) J. Virol. 67: 4017-4026. (NS3 serine protease)

Trozzi, C., et al., 2003, J. Virol 77: 3669-3679. (HCV resistance)

Tsantrizos, et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1356-1360

Wasley, A. & M.J. Alter (2000) Semin. Liver Dis. 20, 1-16 (HepC epidemiology)

Yan et al., (1998) Protein Sci. 7: 837-847 (NS3-4A protease structure)

Yao, N., et al. (1999) Structure Fold Des. 7, 1353-1363.

1. Выделенный полинуклеотид HCV, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую протеазу NS3/4A HCV, или ее биологически активный фрагмент, в котором кодон, который соответствует кодону 156 полинуклеотида дикого типа, мутирован так, что он не кодирует аланин, и, необязательно, кодон, который соответствует кодону 168 полинуклеотида дикого типа, мутирован так, что он не кодирует аспарагиновую кислоту.

2. Выделенный полинуклеотид HCV по п.1, причем полинуклеотид кодирует протеазу NS3/4A HCV, или ее биологически активный фрагмент, которые резистентны к по меньшей мере одному ингибитору протеазы.

3. Выделенный полинуклеотид HCV по п.1, в котором кодон указанного полинуклеотида, который соответствует кодону 156 полинуклеотида дикого типа, кодирует серии.

4. Выделенный полинуклеотид HCV по п.1, в котором кодон указанного полинуклеотида, который соответствует кодону 156 полинуклеотида дикого типа, кодирует валин.

5. Выделенный полинуклеотид HCV по п.1, в котором кодон указанного полинуклеотида, который соответствует кодону 156 полинуклеотида дикого типа, кодирует треонин.

6. Выделенный полинуклеотид HCV по п.1, в котором кодон, который соответствует кодону 168 полинуклеотида дикого типа, мутирован так, что он не кодирует аспарагиновую кислоту.

7. Выделенный полинуклеотид HCV по п.1, в котором код он указанного полинуклеотида, который соответствует кодону 156 полинуклеотида дикого типа, кодирует валин или треонин, и кодон указанного полинуклеотида, который соответствует кодону 168 полинуклеотида дикого типа, кодирует аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту.

8. Выделенный полинуклеотид HCV по п.6, в котором кодон указанного полинуклеотида, который соответствует кодону 168 полинуклеотида дикого типа, кодирует валин.

9. Выделенный полинуклеотид HCV по п.6, в котором кодон 168 полинуклеотида кодирует аланин, глицин или тирозин.

10. Выделенный полинуклеотид HCV по п.1, где полинуклеотид содержит последовательность SEQ ID NO: 1, при условии, что кодон 156 SEQ ID NO: 1 мутирован таким образом, что он не кодирует аланин, и, необязательно, кодон 168 SEQ ID NO: 1 мутирован таким образом, что он не кодирует аспарагиновую кислоту.

11. Выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует биологически активный фрагмент протеазы NS3/4A HCV, в котором кодон, который кодирует аминокислоту 156 протеазы NS3/4A HCV дикого типа, мутирован так, что он не кодирует аланин, и, необязательно, кодон, который кодирует аминокислоту 168 протеазы NS3/4A HCV дикого типа, мутирован так, что он не кодирует аспарагиновую кислоту.

12. Выделенный полинуклеотид по п.11, причем полинуклеотид кодирует биологически активный фрагмент протеазы NS3/4A HCV, который резистентен к по меньшей мере одному ингибитору протеазы.

13. Выделенный полинуклеотид по п.11, в котором кодон 156 кодирует остаток валина, треонина или серина.

14. Выделенный полинуклеотид по п.11, в котором кодон 156 кодирует валин или треонин.

15. Выделенный полинуклеотид по п.11, в котором кодон, который соответствует кодону 168 полинуклеотида дикого типа, мутирован так, что он не кодирует аспарагиновую кислоту.

16. Выделенный полинуклеотид по п.15, причем полинуклеотид содержит кодон, который соответствует кодону 168 домена протеазы NS3/4A HCV, в котором кодон 168 кодирует валин.

17. Выделенный полинуклеотид по п.15, причем полинуклеотид содержит кодон, который соответствует кодону 168 домена протеазы NS3/4A HCV, где кодон 168 кодирует аланин, глицин или тирозин.

18. Выделенный полинуклеотид HCV по п.11, причем полинуклеотид содержит последовательность SEQ ID NO: 1 при условии, что кодон 156 SEQ ID NO: 1 мутирован таким образом, что он не кодирует аланин, и, необязательно, кодон 168 SEQ ID NO: 1 мутирован таким образом, что он не кодирует аспарагиновую кислоту.

19. Выделенный белок протеазы NS3/4A HCV или его биологически активный фрагмент, содержащий последовательность, в которой остаток аминокислоты, который соответствует аминокислоте 156 протеазы NS3/4A HCV дикого типа, не является остатком аланина, и, необязательно, остаток аминокислоты, который соответствует аминокислоте 168 протеазы NS3/4A HCV дикого типа, не является аспарагиновой кислотой.

20. Выделенный белок протеазы NS3/4A HCV или его биологически активный фрагмент по п.19, причем выделенный белок протеазы NS3/4A HCV, или его биологически активный фрагмент резистентны к по меньшей мере одному ингибитору протеазы.

21. Выделенный белок протеазы NS3/4A HCV или его фрагмент по п.19, в котором аминокислота, которая соответствует аминокислоте 156 протеазы дикого типа, представляет собой валин, треонин или серин.

22. Выделенный белок протеазы NS3/4A HCV или его фрагмент по п.19, содержащий аминокислотную последовательность, в которой аминокислота, которая соответствует аминокислоте 168 протеазы NS3/4A HCV дикого типа, не является аспарагиновой кислотой.

23. Выделенный белок протеазы NS3/4A HCV или его фрагмент по п.19, в котором аминокислота, которая соответствует аминокислоте 156 протеазы, представляет собой серин, валин или треонин, и аминокислота 168 является аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой.

24. Выделенный белок протеазы NS3/4A HCV или его фрагмент по п.22, в котором аминокислота, которая соответствует аминокислоте 168 протеазы дикого типа, представляет собой валин.

25. Выделенный белок протеазы NS3/4A HCV или его фрагмент по п.22, в котором аминокислота, которая соответствует аминокислоте 168 протеазы дикого типа, представляет собой аланин, глицин или тирозин.

26. Выделенный белок протеазы NS3/4A HCV по п.19, причем белок протеазы NS3/4A HCV содержит последовательность SEQ ID NO: 2, при условии, что аминокислота 156 SEQ ID NO: 2 не является аланином, и, необязательно, аминокислота 168 SEQ ID NO: 2 не является аспарагиновой кислотой.

27. Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп.1-18.

28. Клетка хозяина, содержащая полинуклеотид по любому из пп.1-18, для получения белка протеазы NS3/4A HCV или его фрагмента, кодируемого указанным полинуклеотидом.

29. Клеточная линия, содержащая полинуклеотид по любому из пп.1-18, для получения белка протеазы NS3/4A HCV или его фрагмента, кодируемого указанным полинуклеотидом.

30. Клеточная линия, трансформированная или трансфицированная вектором по п.27, для получения белка протеазы NS3/4A HCV или его фрагмента, кодируемого полинуклеотидом вектора.

31. Клетка хозяина, трансформированная или трансфицированная вектором по п.27, для получения белка протеазы NS3/4A HCV или его фрагмента, кодируемого полинуклеотидом вектора.

32. Выделенный мутант HCV, содержащий полинуклеотид по любому из пп.1-18.

33. Выделенный мутант HCV, содержащий белок по любому из пп.19-26.

34. Композиция для обнаружения лекарственного средства против HCV или/и для мониторинга соответствующих терапий HCV, которая содержит полинуклеотид по любому из пп.1-18.

35. Композиция для обнаружения лекарственного средства против HCV или/и для мониторинга соответствующих терапий HCV, которая содержит полинуклеотид по любому из пп.1-5 или 9-13 и полинуклеотид по любому из пп.7, 8, 14 или 16.

36. Композиция для обнаружения лекарственного средства против HCV или/и для мониторинга соответствующих терапий HCV, которая содержит белок по любому из пп.19-26.

37. Способ определения присутствия HCV, резистентного к лекарственным средствам против HCV, в биологическом образце, включающий в себя определение присутствия полинуклеотида по любому из пп.1-18 в указанном биологическом образце, за исключением случая, когда мутация представляет собой A156S (кодон указанного полинуклеотида, который соответствует кодону 156 полинуклеотида дикого типа, кодирует серин), а лекарственное средство представляет собой BILN 2061.

38. Способ по п.37, включающий в себя:
a) получение указанного полинуклеотида из указанного образца;
b) определение последовательности полинуклеотида;
c) определение, являются ли в указанном полинуклеотиде кодоны указанного полинуклеотида, соответствующие кодону 156 и, необязательно, кодону 168 полинуклеотида протеазы HCV дикого типа, кодонами недикого типа, в том отношении, что кодон 156 не кодирует аланин, и кодон 168 не кодирует аспарагиновую кислоту.

39. Способ по п.37, при котором указанные кодоны недикого типа кодируют серии, валин или треонин в остатке, который соответствует остатку 156 протеазы NS3/4A HCV дикого типа, и/или кодируют глутаминовую кислоту, валин, аланин, глицин или тирозин в остатке, который соответствует остатку 168 протеазы NS3/4A HCV дикого типа.

40. Способ определения, является ли инфекция, опосредованная HCV, у пациента резистентной к лекарственному средству против HCV, включающий в себя:
a) забор биологического образца у пациента, инфицированного HCV; и
b) оценку, содержит ли образец нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантную протеазу NS3/4A HCV, где нуклеиновая кислота содержит мутацию в кодоне, соответствующем кодону 156 полинуклеотида протеазы NS3/4A HCV дикого типа, при этом присутствие указанной мутантной протеазы NS3/4A HCV указывает, что у упомянутого пациента имеется резистентная к лекарственному средству инфекция HCV, за исключением случая, когда мутация представляет собой A156S (кодон указанного полинуклеотида, который соответствует кодону 156 полинуклеотида дикого типа, кодирует серин), а лекарственное средство представляет собой BILN 2061.

41. Способ по п.40, где нуклеиновая кислота содержит мутацию в кодоне, соответствующем кодону 168 полинуклеотида протеазы NS3/4A HCV дикого типа, где присутствие мутантной протеазы NS3/4A HCV, содержащей аминокислоту, которая не является аланином, в аминокислотном положении 156 NS3/4A HCV дикого типа и аминокислоту, которая не является аспарагиновой кислотой в аминокислотном положении 168 NS3/4A HCV дикого типа, указывает, что у указанного пациента имеется резистентная к лекарству инфекция HCV.

42. Способ по п.40 или 41, где указанная мутантная протеаза NS3/4A HCV содержит серин, валин или треонин в аминокислотном положении 156 протеазы NS3/4A HCV дикого типа.

43. Способ по п.41, где мутантная протеаза NS3/4A HCV содержит валин, аланин, глицин или тирозин в аминокислотном положении 168 протеазы NS3/4A HCV дикого типа.

44. Способ по п.40, где нуклеиновая кислота, кодирующая мутантную протеазу NS3/4A HCV, присутствующая в указанном биологическом образце, содержит вторую мутацию в кодоне, соответствующем кодону 168 полинуклеотида протеазы NS3/4A HCV дикого типа; где вторая мутация приводит к замещению аспарагиновой кислоты в аминокислотном положении 168 глутаминовой кислотой.

45. Способ по п.40, где нуклеиновая кислота, кодирующая протеазу NS3/4A HCV, присутствующая в указанном биологическом образце, содержит вторую мутацию в кодоне 168; где вторая мутация приводит к замещению аспарагиновой кислоты аланином, глицином, валином или тирозином.

46. Способ оценки, имеет ли инфицированный HCV пациент сниженную чувствительность или восприимчивость к VX-950, включающий в себя определение, присутствует ли у указанного пациента ДНК протеазы NS3/4A вируса гепатита С, имеющая мутацию в кодоне, который кодирует аминокислоту 156 протеазы NS3/4A вируса гепатита С дикого типа.

47. Способ оценки, имеет ли инфицированный HCV пациент сниженную чувствительность или восприимчивость к ингибитору протеазы, включающий в себя определение, присутствует ли у указанного пациента ДНК протеазы NS3/4A вируса гепатита С, имеющая мутацию в кодоне, который кодирует аминокислоту 156 протеазы NS3/4A вируса гепатита С дикого типа, за исключением случая, когда мутация представляет собой A156S (кодон указанного полинуклеотида, который соответствует кодону 156 полинуклеотида дикого типа, кодирует серин), а лекарственное средство представляет собой BILN 2061.

48. Способ по любому из пп.46 и 47, при котором мутация коррелирует с или приводит к сниженной чувствительности или восприимчивости к BILN 2061.

49. Способ по любому из пп.46 и 47, где мутация коррелирует с или приводит к сниженной чувствительности или восприимчивости к VX-950 и BILN 2061.

50. Способ исследования кандидата на ингибитор или потенциального ингибитора HCV, включающий в себя:
a) введение вектора, содержащего полинуклеотид по любому из пп.1-18, и ген-индикатор, кодирующий индикатор, в клетку хозяина;
b) культивирование клетки хозяина; и
c) количественное определение индикатора в присутствии ингибитора и в отсутствие ингибитора.

51. Способ исследования кандидата на ингибитор или потенциального ингибитора HCV в отношении активности против HCV, включающий в себя:
a) обеспечение протеазой по любому из пп.19-26 и протеазным субстратом;
b) контактирование протеазы с кандидатом на ингибитор или потенциальным ингибитором в присутствии субстрата; и
c) оценка или количественное определение ингибирования протеолитической активности протеазы.

52. Способ идентификации соединения, эффективного в качестве ингибитора протеазы по любому из пп.19-26, включающий в себя:
a) исследование активности протеазы по любому из пп.19-26 в отсутствие соединения;
b) исследование активности протеазы в присутствии соединения;
c) сравнение результатов а) и результатов b).

53. Способ по п.52, который включает в себя:
d) исследование активности протеазы дикого типа в отсутствие соединения;
e) исследование активности протеазы дикого типа в присутствии соединения;
f) сравнение результатов d) и результатов е).

54. Способ по п.53, который включает в себя сравнение результатов из а) и/или b) и результатов d) и/или е).

55. Способ по п.52, который включает в себя:
d) исследование в отсутствие соединения активности второй протеазы NS3/4A, при этом указанная вторая протеаза содержит аминокислоту, которая соответствует остатку 168 протеазы дикого типа, где указанная аминокислота мутирована в валин, аланин, глицин или тирозин;
e) исследование активности второй протеазы в присутствии соединения; и
f) сравнение результатов d) и е).

56. Способ по п.55, который включает в себя:
g) исследование активности протеазы дикого типа в отсутствие соединения;
h) исследование активности протеазы дикого типа в присутствии соединения;
i) сравнение результатов g) и результатов h).

57. Способ по п.56, который включает в себя сравнение результатов из а) и/или b) и результатов d) и/или е); и/или результатов из g) и/или h).

58. Способ идентификации соединения, способного восстанавливать активность VX-950, где протеаза NS3/4A становится резистентной к VX-950, включающий в себя:
a) контактирование протеазы по любому из пп.19-26 с соединением;
b) исследование способности VX-950 ингибировать активность протеазы из а).

59. Способ идентификации соединения, эффективного в качестве ингибитора протеазы по любому из пп.19-26, который включает в себя:
a) получение трехмерной модели протеазы по любому из пп.19-26;
b) конструирование или выбор соединения;
c) оценку способности соединения связываться или взаимодействовать с протеазой.

60. Способ по п.59, где трехмерная модель основана на рентгеновской кристаллической структуре протеазы NS3/4A (Фигура 1 и Фигура 2).

61. Способ по п.60, где модель получают способами, выполняемыми на компьютере.

62. Способ по п.59, где трехмерную модель получают методом рентгеновской кристаллографии белка по любому из пп.19-26.

63. Способ по любому из пп.59-62, где оценку осуществляют путем молекулярного моделирования.

64. Способ по любому из пп.59-62, где соединение контактирует с протеазой дикого типа.

65. Способ по любому из пп.59-62, где соединение контактирует с белком по любому из пп.19-25.

66. Способ по любому из пп.59-62, где указанное соединение является соединением, идентифицированным из комбинаторной химической библиотеки.

67. Способ по любому из пп.59-62, где указанное соединение представляет собой соединение, полученное методом рационального конструирования лекарственного средства.

68. Способ по любому из пп.59-62, где указанное соединение представляет собой соединение, полученное методом рационального конструирования лекарственного средства и полученное из структуры VX-950.
Приоритет по пунктам:

27.10.2003 по пп.1-65, 67;

13.04.2004 по пп.66, 68;

26.11.2003 по пп.1-68.